CN116249789A - 生物体起源的基于dna甲基化的质量控制 - Google Patents
生物体起源的基于dna甲基化的质量控制 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于鉴定个体测试受试者或测试受试者的个体群组的地理起源的方法,所述方法包括将从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组材料获得的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为不同地理起源所特有。
Description
技术领域
本发明基于特定的基因小组提供产生特异于生物体的地理起源的DNA甲基化分布谱的来源的发现。特别地,DNA甲基化分布谱可用于鉴定动物(包括饲养动物,也称为家畜),例如螃蟹、鱼或鸡的遗传起源。本发明的方法可应用于鉴定生物体(包括饲养动物)的地理起源、控制生物体(包括饲养动物)样品的假定的地理起源,以及用于评估生物体(包括饲养动物)的栖息地的环境参数。此外,本发明提供质量控制方法和用于研发用于各种生物体(包括饲养动物)的新测试系统的过程。
背景技术
可持续的食品生产目前被认为是全球最重要的社会需求之一。由于农业和水产养殖业的价值链高度复杂,已建立证书以加强消费者关系和信任。然而,证书是以特定农场的审核为基础且可轻易地通过将家畜从未经认证的农场转移至经认证的农场来篡改。此外,对可持续的农业操作的监测参差不齐且主要局限于审核。由于“不良”农业操作普遍存在于该行业中,因此迫切需要防篡改的证书。
畜牧业和食品加工业已大量参与食品安全领域的鉴定、追踪和风险管理策略的发展,并参与发展用于消费者信息(透明价值链)的策略。健康、安全和动物福祉方面的考虑要求动物产品(特别是肉类产品)的来源应为可追溯的,从而可有效且可靠地进行质量保证审核和监控程序。
在DNA水平对全基因组甲基化和变异模式的比较表明很大一部分表观遗传变异可能与健康差异和饲养条件(例如鲑鱼圈养)有关(Le Luyer J等人.2017PNAS vol 114,no49)。
在大理石纹螯虾(Procambarus virginalis)中进行的全基因组甲基化的研究观察到动物和组织之间大部分基因组的稳定甲基化,而为约700个基因的亚群经证明在其甲基化方面为高度可变(Gatzmann,F.DNA methylation in the marbled crayfishProcambarus virginalis.PhD thesis,Faculty of Biosciences,University ofHeidelberg,2018)。
鉴于上述情况,迫切需要提供用于鉴定和质量控制生物体(特别是食物,更特别地,源自饲养家畜的动物材料)的地理起源的方式。
发明内容
上述目标是通过本发明的不同方面来解决。本发明基于以下发现:对环境暴露,例如压力、气候、光或饮食的恢复力是生物学的基本概念,从而使生物体适应其环境。适应环境和维持适应的生物模式的能力取决于表观遗传机制,包括DNA甲基化。
本发明人意外发现可利用该特性来鉴定基因组上的环境特异性“表观遗传特征”,并将生物体与其源自的生态系统进行比对。基于这些发现,本发明提供鉴定生物体(包括饲养动物,也称为家畜)的地理起源的方法、控制生物体(包括饲养动物)的样品的假定地理起源的方法,以及用于评估生物体(包括饲养动物)的栖息地的环境参数的方法。此外,本发明提供质量控制方法和用于开发用于各种生物体(包括饲养动物)的新测试系统的过程。
一般而言且通过简要描述,本发明的主要方面可如下文的描述:
在第一方面中,本发明涉及用于鉴定个体测试受试者或测试受试者的个体群组的地理起源的方法,所述方法包括将从个体测试受试者的基因组材料或测试受试者的个体群组的基因组材料获得的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为不同地理起源所特有。
在第二方面中,本发明涉及用于质量控制个体测试受试者或测试受试者的个体群组的怀疑的地理起源的方法,所述方法包括下列步骤:
a.测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个预先选定的甲基化位点的甲基化状态;
b.从(a)中测定的甲基化状态测定所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的测试甲基化分布谱;以及
c.将(b)中测定的测试甲基化分布谱与预定的参考甲基化分布谱进行比较,其中所述预定的参考甲基化分布谱为与所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为相同生物分类群(优选为物种)的个体受试者或受试者的个体群组所特有;
其中如果所述测试甲基化分布谱与所述预定的参考甲基化分布谱明显相似,则所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组通过质量控制且所述怀疑的地理起源被指明为真正的地理起源。
在第三方面中,本发明涉及用于评估个体测试受试者或测试受试者的个体群组的栖息地的一个或多个环境参数的方法,所述方法包括下列步骤:
(a)测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个预先选定的甲基化位点的甲基化状态;
(b)从(a)中测定的甲基化状态测定所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的测试甲基化分布谱;以及
(c)将(b)中测定的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,其中所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为与所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为相同生物分类群(优选为物种)的个体受试者或受试者的个体群组所特有,且其各自从不同地理起源获得;并且其中所述不同地理起源是通过一种或多种环境参数与其他不同地理起源区分;
其中如果所述测试甲基化分布谱与所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱中的一种明显相似,则所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组是源自其环境参数与具有所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱中的一种的受试者或受试者的群组的地理起源的环境参数相似或优选地相等的地理起源。
在第四方面中,本发明涉及用于确认或否决个体测试受试者或测试受试者的个体群组的假定地理起源的方法,所述方法包括将从个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组材料获得的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为不同地理起源所特有。
在第五方面中,本发明涉及用于开发用于确认个体测试受试者或测试受试者的个体群组的假定地理起源的测试系统的方法,所述方法包括下列步骤:
(a)测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个甲基化位点的甲基化状态;
(b)从所述一个或多个甲基化位点选择一组参考甲基化位点,所述一组参考甲基化位点的特征为每一个已知的地理起源的特有并且不同的差异甲基化分布谱;
(c)通过为每一个已知的地理起源(或位置)指定一个参考甲基化分布谱以获得测试系统;以及
其中将从测试样品获得的测试甲基化分布谱与(c)中获得的参考甲基化分布谱进行比较可允许确认从其获得测试样品的个体测试受试者的假定地理起源。
发明详述
下文中将描述本发明的元素。这些元素与特定的实施方案和/或实施例一起列出;然而,应理解的是,这些元素可以任何方式以及以任何数量组合以创建另外的实施方案和/或实施例。不同描述的实施例和优选的实施方案不应被解释为仅将本发明限制在明确描述的实施方案和/或实施例。该描述应被理解为支持和包含由两个或更多个明确描述的实施方案组合或由一个或多个明确描述的实施方案或实施例与任何数量的公开的和/或优选的元素组合而成的实施方案和/或实施例。此外,除非上下文另有说明,否则本申请中所有描述的元素的任何排列和组合均应被视为由本申请的描述公开。
如本文所使用的术语“本发明”、“依据本发明”、“根据本发明”等意图指本文描述和/或主张的本发明的所有方面、实施方案和实施例。
如本文所使用的术语“包含”应解释为涵盖“包括”和“由……组成”两者,两种含义均为专门指且因此单独公开的根据本发明的实施方案。当用于本文时,“和/或”将被视为具体公开两种具体指定的特性或组分中的带有或不带有另一者的每一特性或组分。例如,“A和/或B”将被视为具体公开下列每一种:(i)A、(ii)B和(iii)A和B,就如同本文中单独列出每一种。在本发明的背景下,术语“约”和“近似”表示准确度的区间,本领域的技术人员将理解在该准确度的区间仍能确保所讨论的特性的技术效果。该术语通常表示与指示的数值偏差±20%、±15%、±10%,以及例如±5%。如本领域的普通技术人员将理解的,指定的技术效果的数值的特定偏差将取决于该技术效果的质量。例如相较于人造或工程技术效果的偏差,自然或生物技术效果可能通常具有较大的这些偏差。除非另外具体指明,否则当提及单数名词时,使用的不定冠词或定冠词,例如“一(a、an)”或“该(the)”包括该名词的复数形式。
应理解的是,本领域的普通技术人员鉴于本文所包含的教导将有能力将根据本发明的任何方面的教导应用在特定问题或环境,并根据本发明的任何方面或其附加特征(例如其他方面和实施方案或实施例)包含变化。
除非上下文另有说明,本说明书中阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
本文所引用的所有参考文献、专利和出版物的全文均以引用方式并入本文。
在本文定义的发明的背景下,术语“地理起源”应涉及地理位置,该地理位置通过受试者或受试者群组的一种或多种环境参数与其他地理位置区别。这些环境参数取决于该受试者或受试者群组的栖息地,且在该受试者或受试者群组生活或培养在水中、土壤上或土壤中的情况下可能有差异,或者这些环境参数可能选自食物或空气参数等。作为本发明的非限制性实例,在淡水蟹(例如大理石纹螯虾)方面,环境参数可选自pH、水硬度、锰含量、铁含量和铝含量,如所提及的,这些参数虽然优选,仍应被理解为非限制性说明性实例且可根据受试者或受试者群组的分类群或物种而有很大差异。因此,作为生活在水中的受试者或受试者群组的栖息地,这些栖息地可选自静水或流动水,例如湖泊、河流、水产养殖场、其他水池、或水体、或池塘。地理起源应理解是被认为是栖息地的地理位置,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组经繁衍和/或培养、或在它们的生命期期间至少培养一段显著时间。
本公开内容中与术语受试者结合使用的术语“测试”是指经受根据本发明的任何方面的方法的实体或活生物体,且为本发明的分析应用的基础。因此,“(个体)测试受试者”、“测试受试者的(个体)群组”或“测试分布谱”为根据本发明进行测试的(个体)受试者或受试者群组,或在此背景下获得或产生的分布谱。相反地,术语“参考”应表示,主要为预定的用于与测试实体相比较的实体。
在本发明的背景下,受试者或受试者群组可为任何活生物体。例如,根据本发明的任何方面的受试者可为任何种类的植物或动物,优选为饲养动物(或饲养家畜)或家畜,其可为脊椎动物或无脊椎动物。可用于作为根据本发明的任何方面的受试者的无脊椎动物的典型实例可为虾或螃蟹,例如大理石纹螯虾(marbled crayfish)。可用于作为根据本发明的任何方面的受试者的脊椎动物的典型实例可为鱼或陆生动物,例如可经培养的鸡或其他家畜。
术语“基因组材料”应指受试者或受试者群组的基因组的核酸分子或片段。优选地,这些核酸分子或片段为DNA或RNA或其杂交体,并且最优选地,为受试者或受试者群组的DNA基因组的分子。
在本发明的背景下,本文所使用的术语“甲基化分布谱”、“甲基化模式”、“甲基化状态(state)”或“甲基化状态(status)”描述基因组序列的甲基化状态、情况或状况,并且这些术语是指与甲基化相关的特定基因组位点的DNA片段的特征。这些特征包括但不限于该DNA序列中的任何胞嘧啶(C)残基是否被甲基化、甲基化的C残基的位置、任何特定残基段的甲基化的C的百分比,以及由于例如等位基因起源的差异导致的等位基因甲基化的差异。
术语“甲基化状态”是指特定甲基化位点的状态(即,甲基化的与非甲基化的),其意味着残基或甲基化位点经甲基化或未经甲基化。然后,以一个或多个甲基化位点的甲基化状态为基础,可测定甲基化分布谱。因此,术语“甲基化分布谱”或还有“甲基化模式”是指生物样品的基因组材料中任何特定残基段的甲基化C残基或未经甲基化C残基的相对或绝对浓度。例如,如果DNA序列中通常未甲基化的胞嘧啶(C)残基被甲基化,则其可被称为“超甲基化”;而如果DNA序列中通常甲基化的胞嘧啶(C)残基未被甲基化,则其可被称为“低甲基化”。同样地,与来自不同区域或来自不同个体的另一序列相比较时(例如相对于正常核酸或相对于参考序列的标准核酸),如果DNA序列(例如来自测试受试者的样品核酸的DNA)中的胞嘧啶(C)残基被甲基化,则该序列被认为相较于另一序列超甲基化。或者,与来自不同区域或来自不同个体的另一序列相比较时,如果DNA序列中的胞嘧啶(C)残基未被甲基化,则该序列被认为相较于另一序列低甲基化。这些序列被称为“差异甲基化”。差异甲基化水平可通过本领域的技术人员已知的多种方式进行测量。一种非限制性实例的方法是测量通过亚硫酸氢盐测序法所测定的个体查询的CpG位点的甲基化水平。
如本文所使用的“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指核苷酸碱基上存在甲基部分,其中该甲基部分通常不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如,为其通常形式的胞嘧啶在其嘧啶环上不含有甲基部分,但5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的位置5含有甲基部分。因此,为其通常形式的胞嘧啶可能不被认为是甲基化的核苷酸,而5-甲基胞嘧啶可能被认为是甲基化的核苷酸。在另一实例中,胸腺嘧啶可在其嘧啶环的位置5含有甲基部分,然而,就本文的目的而言,当存在于DNA中时胸腺嘧啶可能不被认为是甲基化的核苷酸。用于DNA的典型核苷酸碱基为胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。用于RNA的典型碱基为尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。相对应地,“甲基化位点”为靶基因核酸区域中可能发生甲基化的位置。例如,含有CpG的位置为甲基化位点,其中该胞嘧啶可能甲基化或可能未甲基化。特别地,术语“甲基化的核苷酸”是指携带甲基的核苷酸,该甲基基团连接至可进行甲基化的核苷酸位置。这些甲基化的核苷酸通常在自然界中发现,且迄今为止大部分出现在二核苷酸CpG的背景下,但在CpNpG和CpNpN序列的背景下也可能被认为是最常见的。原则上,其他天然存在的核苷酸也可被甲基化,但相对于本发明的任何方面,不考虑这些。
如本文所使用的“CpG位点”或“甲基化位点”是核酸(DNA或RNA)内易于甲基化的核苷酸,该甲基化通过体内自然发生的事件或通过体外创造的使核苷酸化学甲基化的事件发生。
如本文所使用的“甲基化的核酸分子”是指含有一个多个经甲基化的核苷酸的核酸分子。
如本文所使用的“CpG岛”描述包含功能或结构上偏离的CpG密度的DNA序列节段。例如Yamada等人已描述了一组用于测定CpG岛的标准:其长度必须为至少400个核苷酸、GC含量大于50%且OCF/ECF比大于0.6(Yamada等人,2004,Genome Research,14,247-266)。其他人已较不严格地将CpG岛定义为长度为至少200个核苷酸、GC含量大于50%且OCF/ECF比大于0.6的序列(Takai等人,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99,3740-3745)。
本文所使用的术语“亚硫酸氢盐”包含任何合适类型的亚硫酸氢盐,例如亚硫酸氢钠,或另一种能够将胞嘧啶(C)化学转化为尿嘧啶(U)的化学试剂,该化学试剂不会对甲基化的胞嘧啶进行化学修饰,因此可以DNA的甲基化状态为基础,用于对DNA序列进行差异修饰,例如美国专利公开US 2010/0112595(Menchen等人)。如本文所使用的,“差异修饰”甲基化或非甲基化DNA的试剂包含在过程中修饰甲基化和/或未甲基化的DNA的任何试剂,通过该过程可从甲基化和非甲基化的DNA产生可区分的产物,从而允许鉴定DNA甲基化状态。这些过程可包括但不限于化学反应(例如通过亚硫酸氢盐将C转化为U)和酶处理(例如通过甲基化依赖性核酸内切酶裂解)。因此,优先裂解或分解甲基化的DNA的酶为能够在DNA被甲基化时以高出许多的效率裂解或分解DNA分子的酶,而优先裂解或分解未甲基化的DNA的酶在DNA未甲基化时表现出明显较高的效率。
在本发明的背景下还包括任何“非以亚硫酸氢盐为基础的方法”和“非以亚硫酸氢盐为基础的定量方法”以测试在任何指定的待测甲基化位点处的甲基化状态。这些术语是指任何不需要使用亚硫酸氢盐的定量甲基化或非甲基化核酸的方法。该术语还指不需要亚硫酸氢盐处理的用于制备待定量的核酸的方法。非以亚硫酸氢盐为基础的方法的实例包括但不限于使用一种或多种甲基化敏感酶来分解核酸的方法和使用基于甲基化状态结合核酸的作用剂来分离核酸的方法。术语“甲基敏感酶”和“甲基化敏感限制酶”为DNA限制性内切核酸酶,其活性依赖其DNA识别位点的甲基化状态。例如,甲基敏感酶仅在DNA识别序列未被甲基化的情况下才裂解或分解其DNA识别序列。因此,未甲基化的DNA样品将被切割成较甲基化DNA样品更小的片段。类似地,超甲基化的DNA样品将不会被裂解。相反地,甲基敏感酶仅在其DNA识别序列被甲基化时才裂解其DNA识别序列。如本文所使用的术语“裂解”、“切割”和“分解”可互换使用。
在本发明的背景下,“生物样品”可包含从受试者或受试者群组获得的任何含有基因组材料的生物物质,且可以是液体、固体或两者、可以是组织或骨骼、或体液,例如血液、淋巴等。特别地,用于本发明的生物样品可包含生物细胞或它们的片段。
如本文所使用的,术语“预先选定的甲基化位点”是指选自方法训练期间表现出最高程度甲基化变异并满足某些质量标准,例如考虑最小测序覆盖率≥5x和≥5个合格的CpG位点的基因或区域的甲基化位点。此外,由于其动态范围有限,其平均甲基化水平<0.1或平均甲基化水平>0.9的基因可排除。“参考甲基化分布谱”可基于多个训练样品,使用多变量统计方法,例如主成分分析或多元尺度法(multi-dimensional scaling)来定义。
在本公开内容的背景下,特别地,在与甲基化分布谱相比较(例如测试分布谱(来自测试受试者)和参考分布谱之间的比较)的背景下,术语“明显相似”应指通过统计方式(即,通过使用生物信息学)观察和/或还有通过使用眼睛观察到的相似性。例如,如果测试分布谱与通过多个训练样品、通过多变量统计方法定义的参考分布谱重叠时则观察到明显的相似性,该多变量统计方法为例如主成分分析或多元尺度法(Multi-DimensionalScaling)。特别地,如果超过50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%的甲基化模式/分布谱与参考分布谱重叠,则测试分布谱与预定的参考分布谱明显相似。测试分布谱与多于一个(例如两个、三个、或甚至所有)参考分布谱相似会降低该相似性的显著性。
本发明的背景下所使用的术语“预定的参考分布谱”是指具有特定地理起源的活生物体的基因组材料的典型或标准甲基化分布谱。预定的参考分布谱可从对照受试者获得。例如,该对照受试者可为与具有已知地理起源的测试受试者为相同物种的活生物体。或者,该预定的参考分布谱可从生活在特定的地理起源的多种生物体获得。该特定的地理起源的不同生物体的甲基化分布谱可能相一致。可汇集数个预定的参考分布谱,将测试受试者的甲基化分布谱与汇集的预定的参考分布谱相比较可鉴定与该测试受试者的甲基化分布谱相似的特定的预定的参考分布谱,然后可推断该测试受试者的地理起源为该预定的参考分布谱的地理起源。
关于地理起源所使用的术语“相似”是指测试受试者的栖息地或地理起源是基于获得预定的参考分布谱的生物体的栖息地或地理起源。术语“相似”可指栖息地的类型、栖息地的环境参数、栖息地所在的国家等。测试受试者的地理起源可与预定的参考分布谱的地理起源具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%相似性,该预定的参考分布谱基于上文“地理起源”定义下的至少一个或多个环境参数。
在第一方面中,本发明涉及用于鉴定个体测试受试者或测试受试者的个体群组的地理起源的方法,所述方法包括将从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组材料获得的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为不同地理起源所特有。
本发明基于对一个物种内的活生物体(包括动物)的基因亚组的甲基化分布谱的惊人鉴定,所述物种的特征为所述物种的个体具有不同地理起源。源自不同地理位置的物种的其他个体可通过相同基因亚组(或其中的甲基化位点)的不同甲基化分布谱来区分。
在本发明的任一方面的一个实例中,所述方法可优选地包括下列方法步骤:
(a)测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个预先选定的甲基化位点的甲基化状态;
(b)从(a)中测定的甲基化状态测定所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的测试甲基化分布谱;以及
(c)将(b)中测定的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,其中所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为与所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为相同生物分类群的不同地理起源的受试者或受试者群组所特有;
其中如果所述测试甲基化分布谱与所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱中的一种明显相似,则所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组具有与具有所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱的受试者或受试者群组相似的地理起源。
所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为任何具有DNA基因组和DNA基因组甲基化的生物实体。优选地,所述甲基化位点为CpG位点。所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可选自原核生物或真核生物,例如单细胞或多细胞植物、真菌或动物。
在本发明的一方面中,在(a)中所述一个或多个预先选定的甲基化位点为与组织特异性基因表达相关的甲基化位点。优选地,所述预先选定的甲基化位点与一种不同组织的基因表达相关。
所述组织可选自:
(i)代谢组织,例如肠道组织,所述肠道组织优选为回肠或空肠,
(ii)肌肉组织,
(iii)皮肤或羽毛组织,以及
(iv)器官组织,所述器官组织优选为肝和/或胰腺组织。
所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组优选为动物,例如无脊椎动物,例如螃蟹。可替代地,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为脊椎动物,例如鸟类或哺乳动物;并且优选为鸡、虾或螯虾。
所述不同的地理起源可以是被认为是栖息地的地理位置(包括农业环境,例如养殖场),其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组经繁衍和/或培养、或在它们的生命期期间至少培养一段显著时间。
优选地,所述一个或多个预先选定的甲基化位点在所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组的20%最大差异甲基化基因内。
在本发明的第一方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为大理石纹螯虾。其中,所述不同地理起源为地理上不同的水域,优选选自:湖泊、河流和水产养殖场。这些地理上不同的水域可通过一种或多种选自下列的环境参数与其他水体区分:pH、水硬度、锰含量、铁含量和铝含量。
用于大理石纹螯虾的上述方法有利地包含全基因组甲基化分析或一组预先选定的甲基化位点的甲基化分析。所述一组预先选定的甲基化位点优选为含有约500至1000个基因且优选约700个基因内的甲基化位点。根据表2的基因或遗传区域是特别优选的。
在本发明的第一方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为鸡。其中,所述不同地理起源为地理上不同的养鸡场。这些地理上不同的养鸡场可通过一种或多种环境参数被认为与其他养鸡场不同,例如饲养参数或空气参数(例如温度、湿度、通风)。
优选地,根据本发明的第一方面的方法中的一组甲基化位点不包含一致性甲基化或未甲基化的甲基化位点。
在第二方面中,本发明涉及用于质量控制个体测试受试者或测试受试者的个体群组的怀疑的地理起源的方法,所述方法包括下列步骤:
(a)从(a)中测定的甲基化状态测定所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的测试甲基化分布谱;以及
(b)将(b)中测定的测试甲基化分布谱与预定的参考甲基化分布谱进行比较,其中所述预定的参考甲基化分布谱为与获自所述怀疑的地理起源的个体测试受试者或测试受试者的个体群组为相同生物分类群的个体受试者或受试者的个体群组所特有;
其中如果所述测试甲基化分布谱与所述预定的参考甲基化分布谱明显相似,则所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组通过质量控制且所述怀疑的地理起源被指明为真正的地理起源。
含有基因组材料的生物样品可为如上文所定义的。
此外,在本发明的这些方面,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为任何具有DNA基因组和DNA基因组甲基化的生物实体。优选地,所述甲基化位点为CpG位点。所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可选自原核生物或真核生物,例如单细胞或多细胞植物、真菌或动物。(a)中的一个或多个预先选定的甲基化位点可为与组织特异性基因表达相关的甲基化位点。优选地,所述预先选定的甲基化位点与一种不同组织的基因表达相关。合适的组织为如上文中对本发明的第一方面所定义的。
所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为植物和动物,优选为动物,例如无脊椎动物,例如螃蟹。可替代地,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为脊椎动物,例如鸟类或哺乳动物;且优选为鸡、虾或螯虾。
所述不同的地理起源为可被认为是栖息地(包括农业环境,例如养殖场)的地理位置,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组经繁衍和/或培养、或在它们的生命期期间至少培养一段显著时间。
优选地,所述一个或多个预先选定的甲基化位点在所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组的20%最大差异甲基化基因内。
在本发明的第二方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为大理石纹螯虾。其中,所述不同的地理起源为地理上不同的水域,这类水域优选选自:湖泊、河流和水产养殖场。这些地理上不同的水域通过一种或多种选自下列的环境参数被认为与其他水域不同:pH、水硬度、锰含量、铁含量和铝含量。
用于大理石纹螯虾的上述方法有利地包含全基因组甲基化分析或一组预先选定的甲基化位点的甲基化分析。所述一组预先选定的甲基化位点优选含有约500至1000个基因且优选约700个基因内的甲基化位点。根据表2的基因或遗传区域是特别优选的。
在本发明的第一方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为鸡。其中,所述不同的地理起源为地理上不同的养鸡场。这些地理上不同的养鸡场可通过一种或多种环境参数被认为与其他养鸡场不同,例如饲养参数或空气参数(例如温度、湿度、通风)。
优选地,根据本发明第二方面的方法中的一组甲基化位点不包含一致性甲基化或未甲基化的甲基化位点。
在第三方面中,本发明涉及用于评估个体测试受试者或测试受试者的个体群组的栖息地的一个或多个环境参数的方法,所述方法包括下列步骤:
(a)测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品中所含有的基因组材料内的一个或多个预先选定的甲基化位点的甲基化状态;
(b)从(a)中测定的甲基化状态测定所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的测试甲基化分布谱;以及
(c)将(b)中测定的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,其中所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为与所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为相同生物分类群(优选为物种)的个体受试者或受试者的个体群组所特有,且其各自从不同地理起源获得;且其中所述不同的地理起源通过一个或多个环境参数与其他不同的地理起源区别;
其中如果所述测试甲基化分布谱与所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱中的一种明显相似,则所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组是源自其环境参数与具有所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱中的一种的受试者或受试者群组的地理起源的环境参数相似或优选地相等的地理起源。
含有基因组材料的生物样品可为如上文所定义的。
此外,在本发明的这些方面,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为任何具有DNA基因组和DNA基因组甲基化的生物实体。优选地,所述甲基化位点为CpG位点。所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可选自原核生物或真核生物,例如单细胞或多细胞植物、真菌或动物。(b)中所述一个或多个预先选定的甲基化位点可为与组织特异性基因表达相关的甲基化位点。优选地,所述预先选定的甲基化位点与一种不同组织的基因表达相关。合适的组织为如上文中对本发明的第一方面所定义的。
所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为植物或动物,优选为动物,例如无脊椎动物,例如螃蟹。可替代地,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为脊椎动物,例如鸟类或哺乳动物;且优选为鸡、虾或螯虾。
所述不同的地理起源可为被认为是栖息地(包括农业环境,例如养殖场)的地理位置,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组经繁衍和/或培养、或在它们的生命期期间至少培养一段显著时间。
优选地,所述一个或多个预先选定的甲基化位点在所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组的20%最大差异甲基化基因内。
在本发明的第三方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为大理石纹螯虾。其中,所述不同的地理起源为地理上不同的水域,这类水域优选选自:湖泊、河流和水产养殖场。这些地理上不同的水域可通过一种或多种选自下列的环境参数被认为与其他水体不同:pH、水硬度、锰含量、铁含量和铝含量。
用于大理石纹螯虾的上述方法有利地包含全基因组甲基化分析或一组预先选定的甲基化位点的甲基化分析。所述一组预先选定的甲基化位点优选含有约500至1000个基因且优选约700个基因内的甲基化位点。根据表2的基因或遗传区域是特别优选的。
在本发明的第一方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为鸡。其中,所述不同的地理起源为地理上不同的养鸡场。这些地理上不同的养鸡场可通过一种或多种环境参数被认为与其他养鸡场不同,例如饲养参数或空气参数(例如温度、湿度、通风)。
优选地,根据本发明的第三方面的方法中的一组甲基化位点不包含一致性甲基化或未甲基化的甲基化位点。
在第四方面中,本发明涉及用于确认或否决个体测试受试者或测试受试者的个体群组的假定地理起源的方法,所述方法包括将从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组材料获得的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为不同地理起源所特有。
含有基因组材料的生物样品可为如上文所定义的。
此外,在本发明的这些方面,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为任何具有DNA基因组和DNA基因组甲基化的生物实体。优选地,所述甲基化位点为CpG位点。所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可选自原核生物或真核生物,例如单细胞或多细胞植物、真菌或动物。(b)中所述一个或多个预先选定的甲基化位点可为与组织特异性基因表达相关的甲基化位点。优选地,所述预先选定的甲基化位点与一种不同组织的基因表达相关。合适的组织为如上文中对本发明的第一方面所定义的。
所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为植物或动物,优选为动物,例如无脊椎动物,例如螃蟹。可替代地,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为脊椎动物,例如鸟类或哺乳动物;且优选为鸡、虾或螯虾。
所述不同的地理起源可为被认为是栖息地(包括农业环境,例如养殖场)的地理位置,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组经繁衍和/或培养、或在它们的生命期期间至少培养一段显著时间。
优选地,所述一个或多个预先选定的甲基化位点在所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组的20%最大差异甲基化基因内。
在本发明的第四方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为大理石纹螯虾。其中,所述不同的地理起源为地理上不同的水域,这类水域优选选自:湖泊、河流和水产养殖场。这些地理上不同的水域可通过一种或多种选自下列的环境参数被认为与其他水体不同:pH、水硬度、锰含量、铁含量和铝含量。
用于大理石纹螯虾的上述方法有利地包含全基因组甲基化分析或一组预先选定的甲基化位点的甲基化分析。所述一组预先选定的甲基化位点优选含有约500至1000个基因且优选约700个基因内的甲基化位点。根据表2的基因或遗传区域是特别优选的。
在本发明的第一方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为鸡。其中,所述不同的地理起源为地理上不同的养鸡场。这些地理上不同的养鸡场可通过一种或多种环境参数被认为与其他养鸡场不同,例如饲养参数或空气参数(例如温度、湿度、通风)。
优选地,根据本发明的第四方面的方法中的一组甲基化位点不包含一致性甲基化或未甲基化的甲基化位点。
在第五方面中,本发明涉及用于开发用于确认或否决个体测试受试者或测试受试者的个体群组的假定地理起源的方法,所述方法包括下列步骤:
a.测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个甲基化位点的甲基化状态;
b.从所述一个或多个甲基化位点选择一组参考甲基化位点,所述一组参考甲基化位点的特征为每一个已知的地理起源的特有并且不同的差异甲基化分布谱;
c.通过为每一个已知的地理起源(或位置)指定一个参考甲基化分布谱以获得测试系统;以及
其中将从测试样品获得的测试甲基化分布谱与(c)中获得的参考甲基化分布谱进行比较可允许确认从其获得测试样品的个体测试受试者或测试受试者的个体群组的假定地理起源。
含有基因组材料的生物样品可为如上文所定义的。
此外,在本发明的这些方面,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为任何具有DNA基因组和DNA基因组甲基化的生物实体。优选地,所述甲基化位点为CpG位点。所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可选自原核生物或真核生物,例如单细胞或多细胞植物、真菌或动物。所述一个或多个预先选定的甲基化位点可为与组织特异性基因表达相关的甲基化位点。优选地,所述预先选定的甲基化位点与一种不同组织的基因表达相关。合适的组织为如上文针对本发明的第一方面所定义的。
所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组优选为动物,例如无脊椎动物,例如螃蟹。可替代地,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组可为脊椎动物,例如鸟类或哺乳动物;且优选为鸡、虾或螯虾。
所述不同的地理起源可为被认为是栖息地(包括农业环境,例如养殖场)的地理位置,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组经繁衍和/或培养、或在它们的生命期期间至少培养一段显著时间。
优选地,所述一个或多个预先选定的甲基化位点在所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组的20%最大差异甲基化基因内。
在本发明的第二方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为大理石纹螯虾。其中,所述不同的地理起源为地理上不同的水域,这类水域优选选自:湖泊、河流和水产养殖场。这些地理上不同的水域可通过一种或多种选自下列的环境参数被认为与其他水体不同:pH、水硬度、锰含量、铁含量和铝含量。
用于大理石纹螯虾的上述方法有利地包含全基因组甲基化分析或一组预先选定的甲基化位点的甲基化分析。所述一组预先选定的甲基化位点优选含有约500至1000个基因且优选约700个基因内的甲基化位点。根据表2的基因或遗传区域是特别优选的。
在本发明的第一方面的特定实例中,所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为鸡。其中,所述不同的地理起源为地理上不同的养鸡场。这些地理上不同的养鸡场可通过一种或多种环境参数被认为与其他养鸡场不同,例如饲养参数或空气参数(例如温度、湿度、通风)。
优选地,根据本发明的第五方面的方法中的一组甲基化位点不包含一致性甲基化或未甲基化的甲基化位点。
附图简述
图1显示了四种大理石纹螯虾种群栖息地的特定水参数。
图2显示了大理石纹螯虾种群的背景特异性差异甲基化。(A)基于具有组织特异性甲基化差异的56个基因的甲基化水平,对来自Singlis的腹肌(mus.,方形符号)和肝胰腺(hep.,圆形符号)的样品进行主成分分析。(B)基于具有组织特异性甲基化差异的35个基因的甲基化水平,对来自Reilingen的腹肌(mus.,方形符号)和肝胰腺(hep.,圆形符号)的样品进行主成分分析。(C)基于具有位置特异性甲基化差异的122个基因的甲基化水平,对来自所有位置的肝胰腺样品进行主成分分析。(D)基于具有位置特异性甲基化差异的22个基因的甲基化水平,对来自所有位置的腹肌样品进行主成分分析。
图3显示了在大理石纹螯虾中验证背景依赖性差异甲基化。显示的结果为对4个不同的基因组区进行的基于捕获的测序和使用扩增子测序的对应的验证实验。未填充形状:腹肌;填充形状:肝胰腺;正方形:Reilingen;星形:Singlis;圆形:Andragnaroa;三角形:Ihosy。
图4为对简化代表性亚硫酸氢盐测序(Reduced representation bisulfitesequencing,RRBS)数据使用来自R包MethylKit的函数“计算DiffMeth”所得到的鸡的差异甲基化CpG位点的结果。所鉴定的差异甲基化CpG位点允许在主成分分析中稳固分离三个位置。过滤SNP后:230至360万个CpG位点。所有样品中最小覆盖率为10的CpG位点:623,657,差异甲基化的CpG:1274(p值<0.05)。
图5为对简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)数据使用来自R包MethylKit的函数“计算DiffMeth”所得到的银鲑鱼的差异甲基化CpG位点的结果。所鉴定的差异甲基化CpG位点允许在主成分分析中稳固分离两个位置。过滤SNP后所有样品中最小覆盖率为10的CpG位点:610,397,显著DMR:440(p值<0.05,甲基化差异>=10%)。
实施例
现在将通过实施例和参考本文的描述、所列出的图片和表格来说明本发明的某些方面和实施方案。本发明的这些方法的实施例、用途和其他方面仅作为代表,而不应将本发明的范围仅限制在这些代表性实施例。
实施例1
四种独立的大理石纹螯虾种群的栖息地分布谱
为了探索大理石纹螯虾的背景依赖性DNA甲基化的可能性,收集来自四个互异的稳定种群的动物。Reilingen(德国)代表标准产地,环境保护区内的小的富营养(eutrophic)湖泊。Singlis(德国)种群来自较大的贫营养(oligotrophic)湖泊,其前身为褐煤矿区。Andragnaroa(马达加斯加)种群位于流经高海拔(1156m),具有柔软山水的森林区域的河流中。最后,Ihosy(马达加斯加)种群存在于高度浑浊,具有来自附近的采矿活动的高度污染的水中。理化水参数的分析显示Reilingen的水干净、呈微碱性(pH 8.4),而Singlis的水相当酸(pH5.2),锰的含量高(4792μg/l)。Andragnaroa的水显示出硬度特别低(0.3°dH),而Ihosy的水的特征为铝(2967μg/l)和铁(2249μg/l)的含量高。总体而言,我们的研究因此涵盖栖息在四个来自不同气候带且具有不同水参数的互异栖息地的种群。这些结果显示于图1中。
表1:分析的大理石纹螯虾种群的概况。
实施例2
可变甲基化基因集的鉴定
先前显示大理石纹螯虾的DNA甲基化靶向基因组,相对稳定且很大程度地为组织不变的(Gatzmann等人,2018)。然而,对来自不同动物、不同组织和不同发育阶段的8个全基因组亚硫酸氢盐测序数据集的比较还表明较小的基因群组可能显示出较多变的甲基化水平(Gatzmann等人,2018)。这通过甲基化变异的系统性分析确认。变异截断值>0.006鉴定846个基因,其中149个基因为一致性甲基化或未甲基化(平均比率分别为>0.8或<0.2)被排除在进一步分析之外,从而定义具有697个可变甲基化基因的核心集。基于这些基因的甲基化水平的多元尺度分析将肝胰腺样品与腹肌样品分开,这表明存在先前未被识别的组织特异性甲基化模式。
为了分析这些基因在较多样品数和较高的甲基化覆盖率下的甲基化模式,开发了以珠粒为基础的捕获分析。对于该分析,制备来自2种不同组织的DNA样品:肝胰腺(其代表螯虾的主要代谢器官)和腹肌(形成腹尾的主要肌肉组织)。从N=47只动物(每个位置11至12)制备肝胰腺DNA,而腹肌DNA从相同动物的亚群(N=26,每个位置12-4)制备。结果发现亚基因组捕获既有效又具特异性,在严格条件下每一样品提供至少1000万个比对的读数。
在随后的步骤中,排除其序列中具有多于50%的Ns的基因,在我们的分析中留下623个基因。此外,仅考虑那些存在于所有样品中,测序覆盖率≥5x的CpG位点,且仅当基因具有≥5个合格的CpG位点时才计算平均甲基化水平。有463个基因满足这些标准。本发明人还排除了不变基因(即,甲基化变异位于底部10%的基因以及其平均甲基化水平<0.1或>0.9的基因),从而产生361个可变甲基化基因的核心集(表2)。
表2:适合作为大理石纹螯虾的甲基化标记物的基因组区域。
重要的是,进行基因本体分析以更充分了解我们的可变甲基化基因集背后的潜在机制。观察到具有与GTP结合蛋白(也称为G蛋白)相关的功能特性的基因显著富集。G蛋白调节多种不同的细胞活性,其中,我们检测在转录/翻译调控、响应压力、RNA代谢和对病原体的免疫反应中发挥作用的可变甲基化基因。总之,在这些321个可变甲基化基因中所观察到的功能异质性可能潜在地赋予大理石纹螯虾生活在不同环境压力下的可塑性。
实施例3
大理石纹螯虾种群的背景依赖性甲基化模式
在额外的步骤中,我们试图在我们的361个可变甲基化基因核心集中鉴定特定的背景依赖性甲基化模式。为了鉴定组织特异性甲基化差异,我们应用用于肝胰腺和腹肌之间差异(Benjamini-Hochberg校正后p<0.05)甲基化的Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon ranksum test)。从我们来自单一位置的最大数据集(Singlis,N=24)鉴定出56个允许在主成分分析中将两种组织稳固分离的基因。当将相同方法应用在第二大数据集(Reilingen,N=19)时,鉴定出35个差异甲基化基因(28个与Singlis重叠),这些基因还允许在主成分分析中将两种组织稳固分离。对平均基因甲基化水平而言,组织特异性甲基化差异似乎相当温和,但在CpG水平方面则较明显。值得注意的是,组织特异性甲基化差异在不同种群之间高度稳定。总之,这些研究结果表明大理石纹螯虾中存在局部组织特异性甲基化模式。
为了鉴定位置特异性甲基化差异,我们应用用于四个位置之间的差异(Benjamini-Hochberg校正后p<0.05)甲基化的Kruskal-Wallis检验。对于较大的肝胰腺数据集(N=47),鉴定出122个允许在主成分分析中将四个位置稳固分离的基因。当将相同方法应用在较小的腹肌数据集(N=26)时,鉴定出22个再次允许在主成分分析中将四个位置稳固分离的差异甲基化基因(21个与肝胰腺重叠)。类似于我们对组织特异性甲基化的发现,对于平均基因甲基化水平,位置特异性甲基化差异似乎温和,但在CpG水平方面则较明显。还有,不同位置之间的位置特异性甲基化差异高度稳定。这些发现表明大理石纹螯虾种群之间存在界定的位置特异性甲基化差异。
实施例4
背景依赖性甲基化模式的验证
为了验证组织特异性和位置特异性甲基化模式的结果,基于所鉴定的导致样品分离的基因内的差异甲基化区域(DMR)来设计标记物。组织特异性标记物(n=2)和位置特异性标记物(n=2)两者都使用来自相同的两种组织(肝胰腺和腹肌)和相同的四个位置(Reilingen、Singlis、Andragnaroa和Ihosy),但来自第一次采样后一至两年所收集的新样品的样品进行测试。在PCR上,基于扩增子的深度测序分析该样品。结果证实来自基于捕获的亚基因组测序的发现。通过所选择的标记物可能基于每一CpG的平均甲基化比率将不同组织和位置分开。另外,经测序的扩增子的平均CpG比率与以珠粒为基础的捕获结果的平均CpG比率相当。值得注意的是,这也证实位置特异性甲基化在大理石纹螯虾种群间随时间推移仍保持稳定,因而定义位置特异性标记来鉴定种群起源并使用甲基化模式作为它们的特征是可能的。这些结果显示于图2和3中。
材料和方法
在2017年8月为Reilingen、2017年10月为Singlis,以及在2017年10月至2018年3月依Adriantsoa等人(2019年)的描述在马达加斯加进行以珠粒为基础的捕获分析的采样。在2019年3月至5月在德国和马达加斯加进行验证实验的采样。将样品保存在100%乙醇中并储存在-80℃中直到萃取DNA。
使用Tissue Ruptor(Qiagen)从腹肌和肝胰腺组织分离并纯化基因组DNA,接着进行蛋白酶K分解和异丙醇沉淀。在2200TapeStation(Agilent)上评估经分离的基因组DNA的质量。
根据SureSelectXT Methyl-Seq Target Enrichment System for IlluminaMultiplexed Sequencing Protocol,Version D0,July 2015中的描述进行文库制备。施行质量控制并在2200TapeStation(Agilent)上测量样品浓度。在HiSeqX 10系统(Illumina)上进行多重样品测序。
使用BSMAP(Xi和Li,2009)对读数对进行质量修整并比对至在全基因组亚硫酸氢盐测序数据集(Gatzmann等人,2018)中显示可变甲基化的697个基因。随后,使用BSMAP提供的Python计算各CpG位点的甲基化比率。只有那些存在于所有样品中且覆盖率≥5x的CpG位点才被考虑用于进一步分析。仅在基因具有至少5个CpG位点,覆盖率≥5x时才计算各基因的平均甲基化水平。此外,将具有下列标准的基因排除在后续分析之外:i)就甲基化变异而言,位于底部10%的基因,ii)平均甲基化水平<0.1或>0.9的基因,以及iii)其序列中Ns超过50%的基因。
为了鉴定组织特异性甲基化差异,应用Wilcoxon秩和检验(来自Singlis和Reilingen的肝胰腺相对于腹肌样品)并使用Benjamini-Hochberg方法校正多次测试的p值。同样地,为了鉴定位置特异性甲基化差异,使用Kuskal-Wallis检验并使用Benjamini-Hochberg方法校正多次测试的p值。此外,使用dmrseq(Korthauer等人,2018)鉴定各个基因集内的组织特异性和位置特异性差异甲基化区域。
依照制造商的说明,利用EZ DNA甲基化-Gold试剂盒(Zymo Research)将基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化。使用区域特异性引物(表3)进行PCR扩增标靶区。使用QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen)将PCR产物进行凝胶纯化。随后,使用Nextera XT索引试剂盒v2 A组(Illumina)进行样品索引。使用成对末端150bp纳米方案在MiSeqV2系统上为汇集的文库测序。使用BisAMP(BisAMP:A web-based pipeline for targeted RNA cytosine-5methylation analysis,Bormann F,Tuorto F,Cirzi C,Lyko F,LegrandC.Methods.2019Mar1;156:121-127.)分析测序数据。
表3:用于验证的引物
引物 | 序列 | |
Loc88_R1_fwd | 5‘-TTATAATATATTAATGGTTTTGATGA-3‘ | SEQ.ID.NO.:1 |
Loc88_R1_rev | 5‘-CACAAAAAACAAAAACTACAAACTC-3‘ | SEQ.ID.NO.:2 |
Loc88_R2_fwd | 5‘-ATTATATTTATATTGGATGGATTTAATTTA-3‘ | SEQ.ID.NO.:3 |
Loc88_R2_rev | 5‘-AAACAAACATCTTATACAATTCTTCTC-3‘ | SEQ.ID.NO.:4 |
Loc_460_fwd | 5‘-GGGTAGATAGAATTATTTTTTTT-3‘ | SEQ.ID.NO.:5 |
Loc_460_rev | 5‘-TTTCCTAAAAACCACATTAAAACAC-3‘ | SEQ.ID.NO.:6 |
Tis_595_fwd | 5‘-TGGAGATAAGTTAGTTTAATTAGGTTATAT-3‘ | SEQ.ID.NO.:7 |
Tis_595_rev | 5‘-AATCATCTTAAAAATTCAAAAAAAA-3‘ | SEQ.ID.NO.:8 |
Tis_173_fwd | 5‘-GAATTATTTTATTTGTGATATTTTTTTAAT-3‘ | SEQ.ID.NO.:9 |
Tis_173_rev | 5‘-ATTAATCCACATAATATTTCACCAC-3‘ | SEQ.ID.NO.:10 |
实施例5
鉴定鸡的差异甲基化的CpG位点
为了鉴定鸡的差异甲基化的CpG位点,对简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)数据使用来自R包MethylKit的函数“计算DiffMeth”。鉴定出1274个差异甲基化的CpG(p值<0.05)。在此分析之前,将数据中的SNP过滤掉并应用每一CpG位点最小覆盖截止值为10。所鉴定的差异甲基化CpG位点允许在主成分分析中稳固分离三个位置,如图4所示。
材料和方法
从乳房肌肉组织分离和纯化的基因组DNA由样品来源的相应国家的不同服务实验室提供。使用2200TapeStation(Agilent)检查质量。
根据Zymo-Seq RRBSTMLibrary试剂盒说明手册1.0.0版的描述进行RRBS文库制备。进行质量控制,并在2200TapeStation(Agilent)上测量样品的浓度。在HiSeq 4000系统(Illumina)上进行多重样品测序。
使用trimmomatic 0.38版对读数进行质量修整,并使用BSMAP 2.90比对至鸡(Gallus gallus)基因组组装5.0版。使用随BSMAP包分发的python脚本(methratio.py)计算甲基化比率。将鸡(Gallus gallus)基因组中所有与性染色体相关的CpG位点和与SNP重叠的CpG位点从进一步的分析过滤掉。使用R包MethylKit(Akalin等人.(2012),GenomeBiology,13(10),R87)进行差异甲基化分析。
实施例6
鉴定银鲑鱼(coho salmon)的差异甲基化的CpG位点
为了鉴定银鲑鱼的RRBS数据中的差异甲基化区域,使用来自R包MethylKit的函数“计算DiffMeth”。鉴定出440个差异甲基化区域(p值<0.05,甲基的差异>=10%)。在此分析之前,将数据中的SNP过滤掉并应用每一CpG位点最小覆盖截止值为10。所鉴定的差异甲基化区域允许在主成分分析中将两个位置稳固分离,如图5所示。
材料和方法
从美国国家生物技术信息中心序列读取档案下载由Le Luyer等人于2017年发布的RRBS数据。使用BSMAP 2.90将读数对比对至Okis_V2(GCF_002021735.2),并使用随BSMAP包分发的python脚本(methratio.py)测定甲基化比率。将所有与SNP重叠的CpG位点从进一步分析中过滤掉。以繁殖环境和性别作为共变量,使用R包MethylKit(Akalin等人.(2012),Genome Biology,13(10),R87)进行差异甲基化分析。
序列表
<110> 赢创运营有限公司, 公众权益基金会德国癌症研究中心
<120> 生物体起源的基于DNA甲基化的质量控制
<130> 201900368
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 1
ttataatata ttaatggttt tgatga 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 2
cacaaaaaac aaaaactaca aactc 25
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 3
attatattta tattggatgg atttaattta 30
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 4
aaacaaacat cttatacaat tcttctc 27
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 5
gggtagatag aattattttt ttt 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 6
tttcctaaaa accacattaa aacac 25
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 7
tggagataag ttagtttaat taggttatat 30
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 8
aatcatctta aaaattcaaa aaaaa 25
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 9
gaattatttt atttgtgata tttttttaat 30
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 10
attaatccac ataatatttc accac 25
Claims (17)
1.一种用于鉴定个体测试受试者或测试受试者的个体群组的地理起源的方法,所述方法包括:
-将从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组材料获得的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为不同地理起源所特有。
2.权利要求1的方法,其包括下列步骤:
a.测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个预先选定的甲基化位点的甲基化状态;
b.从(a)中测定的甲基化状态测定所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的测试甲基化分布谱;以及
c.将(b)中测定的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,其中所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为与所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为相同生物分类群的不同地理起源的受试者或受试者群组所特有;
其中如果所述测试甲基化分布谱与所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱中的一种明显相似,则所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组具有与具有所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱的受试者或受试者群组相似的地理起源。
3.权利要求1或2的方法,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为任何具有DNA基因组和DNA基因组甲基化的生物实体,优选地所述甲基化位点为CpG位点。
4.前述权利要求中任一项的方法,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组选自原核生物或真核生物。
5.权利要求2至4中任一项的方法,其中在(a)中所述一个或多个预先选定的甲基化位点为与组织特异性基因表达相关的甲基化位点,优选地其中所述预先选定的甲基化位点与一种不同组织的基因表达相关。
6.权利要求5的方法,其中所述组织选自:
(i)代谢组织,优选为肠道组织;
(ii)肌肉组织;
(iii)皮肤或羽毛组织;以及
(iv)器官组织,所述器官组织优选为肝脏和/或胰腺组织。
7.前述权利要求中任一项的方法,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为动物。
8.前述权利要求中任一项的方法,其中所述不同的地理起源是被认为是栖息地的地理位置,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组经繁衍和/或培养、或在它们的生命期期间至少培养一段显著时间。
9.前述权利要求中任一项的方法,其中所述一个或多个预先选定的甲基化位点在所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组的20%最大差异甲基化基因内。
10.一种用于质量控制个体测试受试者或测试受试者的个体群组的怀疑的地理起源的方法,所述方法包括下列步骤:
a.测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个预先选定的甲基化位点的甲基化状态;
b.从(a)中测定的甲基化状态测定所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的测试甲基化分布谱;以及
c.将(b)中测定的测试甲基化分布谱与预定的参考甲基化分布谱进行比较,其中所述预定的参考甲基化分布谱为与获自所述怀疑的地理起源的个体测试受试者或测试受试者的个体群组为相同生物分类群的个体受试者或受试者的个体群组所特有;
其中如果所述测试甲基化分布谱与所述预定的参考甲基化分布谱明显相似,则所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组通过质量控制且所述怀疑的地理起源被指明为真正的地理起源。
11.一种用于评估个体测试受试者或测试受试者的个体群组的栖息地的一种或多种环境参数的方法,所述方法包括下列步骤:
a.测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个预先选定的甲基化位点的甲基化状态;
b.从(a)中测定的甲基化状态测定所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的测试甲基化分布谱;以及
c.将(b)中测定的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,其中所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为与个体测试受试者或测试受试者的个体群组为相同生物分类群的个体受试者或受试者的个体群组所特有,且其各自从不同地理起源获得;并且其中所述不同地理起源是通过一种或多种环境参数与其他不同地理起源区分;
其中如果所述测试甲基化分布谱与所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱中的一种明显相似,则所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组是源自其环境参数与具有所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱的个体测试受试者或测试受试者的个体群组的地理起源的环境参数相似或优选地相等的地理起源。
12.一种用于确认或否决个体测试受试者或测试受试者的个体群组的假定地理起源的方法,所述方法包括:
-将从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组的基因组材料获得的测试甲基化分布谱与一种或多种预定的参考甲基化分布谱进行比较,所述一种或多种预定的参考甲基化分布谱各自为不同地理起源所特有。
13.一种用于开发用于确认个体测试受试者或测试受试者的个体群组的假定地理起源的测试系统的方法,所述方法包括下列步骤:
a.测定从所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组获得的生物样品所含有的基因组材料内的一个或多个甲基化位点的甲基化状态;
b.从所述一个或多个甲基化位点选择一组参考甲基化位点,所述一组参考甲基化位点的特征为每一个已知的地理起源的特有并且不同的差异甲基化分布谱;以及
c.通过为每一个已知的地理起源指定一个参考甲基化分布谱以获得测试系统;
其中将从测试样品获得的测试甲基化分布谱与(c)中获得的参考甲基化分布谱进行比较可允许确认从其获得测试样品的个体测试受试者或测试受试者的个体群组的假定地理起源。
14.前述权利要求中任一项的方法,其中所述个体测试受试者或测试受试者的个体群组为大理石纹螯虾和/或其中所述不同地理起源为地理上不同的水域,这类水域优选选自:湖泊、河流和水产养殖场。
15.权利要求14的方法,其中所述地理上不同的水域通过一种或多种选自以下的环境参数区分:pH、水硬度、锰含量、铁含量和铝含量。
16.权利要求14或15中任一项的方法,其中所述方法包括全基因组甲基化分析或一组预先选定的甲基化位点的甲基化分析,所述一组预先选定的甲基化位点优选为含有约500至1000个基因且优选约700个基因内的甲基化位点。
17.权利要求16的方法,其中所述一组甲基化位点不包含一致性甲基化或未甲基化的甲基化位点。
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