TW202223100A - 生物體起源的ｄｎａ甲基化為基礎之性質控制 - Google Patents

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吉薩 凡卡堤
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伊米卡 伊格維
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Abstract

本發明關於用於鑑定個別測試個體或測試個體之個別群組的地理起源之方法，該方法包含使從該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體物質獲得之測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為不同地理起源所特有。

Description

生物體起源的ＤＮＡ甲基化為基礎之性質控制
本發明係基於發現特定之基因小組提供產生特異於生物體之地理起源的DNA甲基化輪廓之來源。特別是，DNA甲基化輪廓剖析可用於鑑定動物(包括飼養動物，亦稱為家畜)，諸如螃蟹、魚或雞之遺傳起源。本發明之方法可應用來鑑定生物體，包括飼養動物之地理起源、控制生物體(包括飼養動物)樣品之假定的地理起源、及用於評估生物體(包括飼養動物)之棲息地的環境參數。此外，本發明提供性質控制方法和用於研發用於各種生物體(包括飼養動物)之新測試系統的過程。
可持續之糧食生產目前被認為是全球最重要的社會需求之一。由於農業和水產養殖業的價值鏈高度複雜，已建立證書以加強消費者關係和信任。然而，證書係以特定農場之審核為基礎且可輕易地經由將家畜從未經認證之農場轉移至經認證之農場來篡改。此外，對可持續之農業操作的監測參差不齊且主要侷限於審計。由於“不良”農業操作普遍存在於該行業中，因此迫切需要防篡改之證書。
畜牧業和食品加工業已大量參與食品安全領域之鑑定、追蹤和風險管理策略的發展，並參與發展用於消費者信息(透明價值鏈)之策略。健康、安全及動物福祉方面的考量要求動物產品(尤其是肉類產品)之來源應為可追溯的，從而可有效且可靠地進行品質保證審核及監控程序。
在DNA層級對全基因體甲基化和變異模式的比較表明很大一部分表觀遺傳變異可能與健康差異和飼養條件(諸如鮭魚圈養)有關(Le Luyer J et al. 2017 PNAS vol 114, no 49)。
在大理石紋螯蝦( Procambarus virginalis)中進行之全基因體甲基化的研究觀察到動物和組織之間大部分基因體的穩定甲基化，而約為700個基因之亞群經證明在其甲基化方面為高度可變(Gatzmann, F. DNA methylation in the marbled crayfish Procambarus virginalis. PhD thesis, Faculty of Biosciences, University of Heidelberg, 2018)。
鑑於上述情況，迫切需要提供用於鑑定和性質控制生物體(尤其是食物，更特別地，源自飼養家畜之動物材料)的地理起源之方式。
上述目標係藉由本發明之不同態樣來解決。本發明係基於發現對環境暴露，諸如壓力、氣候、光或飲食之復原力為生物學之基本概念，從而使生物體適應其環境。適應環境和維持適應之生物模式的能力取決於表觀遺傳機制，包括DNA甲基化。
本發明者意外發現可利用該特性來鑑定基因體上之環境特異性“表觀特徵”，並將生物體與其源起之生態系統比對。基於該等發現，本發明提供鑑定生物體(包括飼養動物，亦稱為家畜)之地理起源的方法、控制生物體(包括飼養動物)之樣品的假定地理起源的方法、及用於評估生物體(包括飼養動物)之棲息地的環境參數之方法。此外，本發明提供性質控制方法和用於發展用於各種生物體(包括飼養動物)之新測試系統的過程。
一般而言且藉由簡要描述，本發明之主要態樣可如下文之描述：
於第一態樣中，本發明關於用於鑑定個別測試個體或測試個體之個別群組的地理起源之方法，該方法包含使從個別測試個體之基因體物質或測試個體之個別群組之基因體物質獲得的測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為不同地理起源所特有。
於第二態樣中，本發明關於用於性質控制個別測試個體或測試個體之個別群組的懷疑之地理起源的方法，該方法包含下列步驟： a. 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品所含有的基因體物質內之一或多個預先選定的甲基化位點之甲基化狀態； b. 從(a)所測定之甲基化狀態測定該個別測試個體或測試個體之個別群組之測試甲基化輪廓；及 c. 使(b)所測定之測試甲基化輪廓與預定之參考甲基化輪廓相比較，其中該預定之參考甲基化輪廓為與該個別測試個體或測試個體之個別群組為相同生物分類群(較佳為物種)之個別個體或個體之個別群組所特有； 其中若該測試甲基化輪廓與該預定之參考甲基化輪廓明顯相似，則該個別測試個體或測試個體之個別群組通過性質控制且該懷疑之地理起源被指明為真正的地理起源。
於第三態樣中，本發明關於用於評估個別測試個體或測試個體之個別群組之棲息地的一或多個環境參數之方法，該方法包含下列步驟： (a) 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品所含有的基因體物質內之一或多個預先選定的甲基化位點之甲基化狀態； (b) 從(a)所測定之甲基化狀態測定該個別測試個體或測試個體之個別群組的測試甲基化輪廓；及 (c) 使(b)所測定之測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，其中該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為與該個別測試個體或測試個體之個別群組為相同生物分類群(較佳為物種)之不同地理起源的個體或個體群組所特有，且其各自從不同地理起源獲得；且其中該不同地理起源係藉由一或多種環境參數與其他不同地理起源區分； 其中若該測試甲基化輪廓與該一或多種預定之參考甲基化輪廓中一者明顯相似，則該個別測試個體或測試個體之個別群組係源自其環境參數與具有該一或多種預定之參考甲基化輪廓中一者的個體或個體群組之地理起源的環境參數相似，或較佳地相等的地理起源。
於第四態樣中，本發明關於用於確認或否決個別測試個體或測試個體之個別群組的假定地理起源之方法，該方法包含使從個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體物質獲得之測試甲基化輪廓與一或多種預定的參考甲基化輪廓相比較，該一或多種參考甲基化輪廓各自為不同地理起源所特有。
於第五態樣中，本發明關於用於發展用於確認個別測試個體或測試個體之個別群組的假定地理起源之測試系統的方法，該方法包含下列步驟： (a) 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得的生物樣品所含有之基因體物質內的一或多個甲基化位點之甲基化狀態； (b) 從該一或多個甲基化位點選擇一組參考甲基化位點，該一組參考甲基化位點之特徵為該每一個已知之地理起源的特有且不同的差異甲基化輪廓； (c) 藉由對每一個已知之地理起源指定一個參考甲基化輪廓以獲得測試系統；及 其中使從測試樣品獲得之測試甲基化輪廓與(c)獲得之參考甲基化輪廓相比較可允許確認為獲得該測試樣品之個別測試個體或測試個體之個別群組的假定地理起源。 發明之詳細描述
下文中將描述本發明之元素。該等元素與特定之實施態樣和/或實施例一起列出；然而，應理解的是，該等元素可以任何方式及以任何數量組合以創建另外之實施態樣和/或實施例。不同描述之實施例和較佳之實施態樣不應被解釋為僅將本發明限制在明確描述之實施態樣和/或實施例。該描述應被理解為支持和包含由二或更多個明確描述之實施態樣組合或由一或多個明確描述之實施態樣或實施例與任何數量之揭示的和/或較佳之元素組合而成的實施態樣和/或實施例。此外，除非上下文另有說明，否則本申請案中所有描述之元素的任何排列和組合均應被視為由本申請案之描述揭示。
如本文所使用之術語“本發明”、“依據本發明”、“根據本發明”等意圖指本文描述和/或主張之本發明的所有態樣、實施態樣和實施例。
如本文所使用之術語“包含”應解釋為涵蓋“包括”和“由……組成”二者，該二者均為專門指且個別揭示根據本發明之實施態樣。當用於本文時，“和/或”將被視為具體揭示二種具體指定之特性或組分中的帶有或不帶有另一者的每一特性或組分。例如，“A和/或B”將被視為具體揭示下列每一者：(i) A、(ii) B和(iii) A和B，就如同本文中個別列出每一者。在本發明之背景下，術語“約”和“近似”表示準確度之區間，本技藝之技術熟習人士將可理解在該準確度之區間仍能確保所討論之特性的技術效果。該術語通常表示與指示之數值偏差±20%、±15%、±10%，及例如±5%。如一般技術人士將理解的，指定之技術效果的數值之特定偏差將取決於該技術效果的性質。例如相較於人造或工程技術效果的偏差，自然或生物技術效果可能通常具有較大之該等偏差。則除非另外具體指明，否則當提及單數名詞時，使用之不定冠詞或定冠詞，例如“一(a、an)”或“該(the)”係包括該名詞之複數形式。
應理解的是，本技藝一般技術人士鑑於本文所包含之教示將有能力將根據本發明之任何態樣的教示應用在特定問題或環境，並根據本發明之任何態樣或其附加特徵(諸如其他態樣、實施態樣或實施例)包含變化。
除非上下文另有說明，本說明書中闡述之特徵的描述和定義不限於本發明之任何特定態樣或實施態樣且同樣適用於所描述之所有態樣和實施態樣。
本文所引用之所有參考資料、專利案和出版物之全文均以引用方式併入本文。
在本文定義之發明的背景下，術語“地理起源”應關於地理位置，該地理位置藉由個體或個體群組之一或多種環境參數與其他地理位置區別。該等環境參數取決於該個體或個體群組之棲息地，且當該個體或個體群組係生活或培養在水中、土壤上或土壤中的情況下可能有差異，或者該等環境參數可能選自食物或空氣參數，等。作為本發明之非限制性實例，在甜水蟹(諸如大理石紋螯蝦)方面，環境參數可選自pH、水硬度、錳含量、鐵含量和鋁含量--如所提及者，該等參數雖然較佳，仍應被理解為非限制性說明性實例且可根據個體或個體群組之分類群或物種而有很大差異。因此，作為生活在水中之個體或個別群組的棲息地，該等棲息地可選自靜水或流動水，諸如湖泊、河流、水產養殖場、其他水池、或水體、或池塘。地理起源應理解為被認為是棲息地之地理位置，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組經繁衍和/或培養、或在彼等之壽命期間至少經培養一段顯著時間。
本揭示中與術語個體結合使用之術語“測試”係指經受根據本發明之任何態樣的方法之實體或活生物體，且為本發明之分析應用的基礎。因此，“(個別)測試個體”、“測試個體之(個別)群組”或“測試輪廓”為根據本發明進行測試之(個別)個體或個體群組，或在此背景下獲得或產生之輪廓。相反地，術語“參考”應表示，主要為預定之用於與測試實體相比較的實體。
在本發明之背景下，個體或個體群組可為任何活生物體。例如，根據本發明之任何態樣的個體可為任何種類之植物或動物，較佳為飼養動物(或飼養家畜)或家畜，其可為脊椎動物或無脊椎動物。可用於作為根據本發明之任何態樣的個體之無脊椎動物的典型實例可為蝦或螃蟹，諸如大理石紋螯蝦(marbled crayfish)。可用於作為根據本發明之任何態樣的個體之脊椎動物的典型實例可為魚或陸生動物，諸如可經培養之雞或其他家畜。
術語“基因體物質”應指個體或個體群組之基因體的核酸分子或片段。較佳地，該等核酸分子或片段為DNA或RNA或其雜交體，且最佳地，為個體或個體群組之DNA基因體的分子。
在本發明之背景下，本文所使用之術語“甲基化輪廓”、“甲基化模式”、“甲基化狀態(state)”或“甲基化狀態(status)”係描述基因體序列之甲基化狀態、情況或狀況，且該等術語係指與“甲基化”相關之特定基因體位點的DNA片段之特徵。該等特徵包括，但不限於該DNA序列中之任何胞嘧啶(C)殘基是否被甲基化、甲基化之C殘基的位置、任何特定殘基段之甲基化的C之百分比，以及由於，例如等位基因起源之差異導致的等位基因甲基化之差異。
術語“甲基化狀態”係指特定甲基化位點之狀態(即，甲基化的與非甲基化的)，其意味著殘基或甲基化位點經甲基化或未經甲基化。然後，以一或多個甲基化位點之甲基化狀態為基礎，可測定甲基化輪廓。因此，術語“甲基化輪廓”或還有“甲基化模式”係指生物樣品之基因體物質中任何特定殘基段的甲基化C殘基或未經甲基化C殘基之相對或絕對濃度。例如，若DNA序列中通常未甲基化之胞嘧啶(C)殘基被甲基化，則其可被稱為“超甲基化”；而若DNA序列中通常甲基化之胞嘧啶(C)殘基未被甲基化，則其可被稱為“低甲基化”。同樣地，與來自不同區域或來自不同個體之另一序列相比較時(例如相對於正常核酸或相對於參考序列之標準核酸)，若DNA序列(例如來自測試個體之樣品核酸的DNA)中之胞嘧啶(C)殘基被甲基化，則該序列被認為相較於另一序列超甲基化。或者，與來自不同區域或來自不同個體之另一序列相比較時，若DNA序列中之胞嘧啶(C)殘基未被甲基化，則該序列被認為相較於另一序列低甲基化。該等序列被稱為“差異甲基化”。差異甲基化水準可藉由本技藝之技術熟習人士已知的多種方式進行測量。一種非限制性實例之方法係測量藉由亞硫酸氫鹽測序法所測定之個別查詢的CpG位點之甲基化水準。
如本文所使用之“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸鹼基”係指核苷酸鹼基上存在甲基部分，其中該甲基部分通常不存在於公認之典型核苷酸鹼基中。例如，為其通常形式之胞嘧啶在其嘧啶環上不含有甲基部分，但5-甲基胞嘧啶在其嘧啶環之位置5含有甲基部分。因此，為其通常形式之胞嘧啶可能不被認為是甲基化之核苷酸，而5-甲基胞嘧啶可能被認為是甲基化之核苷酸。於另一實例中，胸腺嘧啶可在其嘧啶環之位置5含有甲基部分，然而，就本文之目的而言，當存在於DNA中時胸腺嘧啶可能不被認為是甲基化之核苷酸。用於DNA之典型核苷酸鹼基為胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤。用於RNA之典型鹼基為尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤。相對應地，“甲基化位點”為靶基因核酸區域中可能發生甲基化之位置。例如，含有CpG之位置為甲基化位點，其中該胞嘧啶可能甲基化或可能未甲基化。特別地，術語“甲基化之核苷酸”係指攜帶甲基之核苷酸，該甲基基團係連接可進行甲基化之核苷酸位置。該等甲基化之核苷酸通常係在自然界中發現，且迄今為止大部分出現在二核苷酸CpG之背景下，但在CpNpG和CpNpN序列之背景下亦可能被認為是最常見的。原則上，其他天然存在之核苷酸亦可被甲基化，至於本發明之任何態樣則不會考慮彼等。
如本文所使用之“CpG位點”或“甲基化位點”為核酸(DNA或RNA)內易於甲基化之核苷酸，該甲基化係藉由體內自然發生之事件或藉由體外創造之使核苷酸化學甲基化的事件發生。
如本文所使用之“甲基化之核酸分子”係指含有一個多個經甲基化之核苷酸的核酸分子。
如本文所使用之“CpG島”描述包含功能或結構上偏離之CpG密度的DNA序列節段。例如Yamada等人已描述一組用於測定CpG島之標準：其長度必須為至少400個核苷酸、GC含量大於50%且OCF/ECF比大於0.6(Yamada et al., 2004, Genome Research, 14, 247-266)。其他人已較不嚴格地將CpG島定義為長度為至少200個核苷酸、GC含量大於50%且OCF/ECF比大於0.6之序列(Takai et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 3740-3745)。
本文所使用之術語“亞硫酸氫鹽”包含任何合適類型之亞硫酸氫鹽，諸如亞硫酸氫鈉，或另一種能夠將胞嘧啶(C)化學轉化為尿嘧啶(U)之化學試劑，該化學試劑不會對甲基化之胞嘧啶進行化學修飾，因此可以DNA之甲基化狀態為基礎，對DNA序列進行差異修飾，例如美國專利案發表物US 2010/0112595(Menchen等人)。如本文所使用者，“差異修飾”甲基化或非甲基化DNA之試劑包含在過程中修飾甲基化和/或未甲基化之DNA的任何試劑，透過該過程可從甲基化和非甲基化之DNA產生可區分的產物，從而允許鑑定DNA甲基化狀態。該等過程可包括，但不限於化學反應(諸如藉由亞硫酸氫鹽將C轉化為U)和酶處理(諸如藉由甲基化依賴性核酸內切酶裂解)。因此，優先裂解或分解甲基化之DNA的酶為能夠在DNA被甲基化時以高出許多之效率裂解或分解DNA分子者，而優先裂解或分解未甲基化之DNA的酶在DNA未甲基化時表現出明顯較高之效率。
本發明之背景下亦包含任何“非以亞硫酸氫鹽為基礎之方法”和“非以亞硫酸氫鹽為基礎之定量方法”以測試在任何指定之待測甲基化位點處的甲基化狀態。該等術語係指任何不需要使用亞硫酸氫鹽之定量甲基化或非甲基化核酸的方法。該術語亦指不需要亞硫酸氫鹽處理之用於製備待定量之核酸的方法。非以亞硫酸氫鹽為基礎之方法的實例包括，但不限於使用一或多種甲基化敏感酶來分解核酸之方法和使用基於甲基化狀態結合核酸之作用劑來分離核酸的方法。術語“甲基敏感酶”和“甲基化敏感限制酶”為DNA限制性內切核酸酶，其活性係依賴其DNA識別位點的甲基化狀態。例如，甲基敏感酶僅在DNA識別序列未被甲基化之情況下才裂解或分解其DNA識別序列。因此，未甲基化之DNA樣品將被切割成較甲基化DNA樣品更小的片段。類似地，超甲基化之DNA樣品將不會被裂解。相反地，甲基敏感酶僅在其DNA識別序列被甲基化時才裂解其DNA識別序列。如本文所使用之術語“裂解”、“切割”和“分解”可互換使用。
在本發明之背景下，“生物樣品”可包含從個體或個體群組獲得之任何含有基因體物質的生物物質，且可為液體、固體或二者、可為組織或骨骼、或體液，諸如血液、淋巴，等。尤其是，用於本發明之生物樣品可包含生物細胞或彼等之片段。
如本文所使用者，術語“預先選定之甲基化位點”係指選自方法訓練期間表現出最高程度甲基化變異並滿足某些性質標準，諸如考慮最小測序覆蓋率≥5x和≥5個合格之CpG位點的基因或區域之甲基化位點。此外，由於其動態範圍有限，其平均甲基化水準＜0.1或平均甲基化水準＞0.9之基因可排除。“參考甲基化輪廓”可基於多個訓練樣品，使用多變量統計方法，諸如主成分分析或多元尺度法(multi-dimensional scaling)來定義。
在本揭示之背景下，特別是，在與甲基化輪廓相比較(諸如測試輪廓(來自測試個體)和參考輪廓之間的比較)之背景下，術語“明顯相似”應指藉由統計方式(即，藉由使用生物資訊學)觀察和/或還有藉由使用眼睛觀察到的相似性。例如，若測試輪廓與藉由多個訓練樣品，透過多變量統計方法定義之參考輪廓重疊時則觀察到明顯之相似性，該多變量統計方法為，諸如主成分分析或多元尺度法(Multi-Dimensional Scaling)。特別是，若超過50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%之甲基化模式/輪廓與參考輪廓重疊，則測試輪廓與該預定之參考輪廓明顯相似。測試輪廓與多於一個(諸如二個、三個、或甚至所有)參考輪廓相似會降低該相似性之顯著性。
本發明之背景下所使用之術語“預定之參考輪廓”係指具有特定地理起源之活生物體的基因體物質之典型或標準甲基化輪廓。預定之參考輪廓可從對照個體獲得。例如，該對照個體可為與具有已知地理起源之測試個體為相同物種之活生物體。或者，該預定之參考輪廓可從生活在特定之地理起源的多種生物體獲得。該特定之地理起源的不同生物體之甲基化輪廓可能相一致。可彙集數個預定之參考輪廓，並將測試個體之甲基化輪廓與彙集之預定的參考輪廓相比較可鑑定與該測試個體之甲基化輪廓相似的特定之預定的參考輪廓，然後可推斷該測試個體之地理起源為該預定之參考輪廓的地理起源。
相關於地理起源所使用之術語“相似”係指該測試個體之棲息地或地理起源係基於獲得該預定之參考輪廓的生物體之棲息地或地理起源。術語“相似”可指棲息地之類型、棲息地之環境參數、棲息地所在之國家，等。該測試個體之地理起源可與該預定之參考輪廓的地理起源具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%相似性，該預定之參考輪廓係基於上文“地理起源”定義下的至少一或多個環境參數。
於第一態樣中，本發明關於用於鑑定個別測試個體或測試個體之個別群組的地理起源之方法，該方法包含使從該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體物質獲得之測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為不同地理起源所特有。
本發明係基於對一個物種內之活生物體(包括動物)的基因亞組之甲基化輪廓的驚人鑑定，該物種之特徵為該物種之個體具有不同地理起源。源自不同地理位置之該物種的其他個體可藉由相同基因亞組(或其中之甲基化位點)的不同甲基化輪廓來區分。
於本發明之任一態樣的一個實例中，該方法可較佳地包含下列方法步驟： (a) 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品所含有的基因體物質內之一或多個預先選定的甲基化位點之甲基化狀態； (b) 從(a)所測定之甲基化狀態測定該個別測試個體或測試個體之個別群組之測試甲基化輪廓；及 (c) 使(b)所測定之測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，其中該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為與該個別測試個體或測試個體之個別群組為相同生物分類群之不同地理起源的個體或個體群組所特有； 其中若該測試甲基化輪廓與該一或多種預定之參考甲基化輪廓中一者明顯相似，則該個別測試個體或測試個體之個別群組具有與具有該一或多種預定之參考甲基化輪廓的個體或個體群組相似之地理起源。
該個別測試個體或測試個體之個別群組可為任何具有DNA基因體和DNA基因體甲基化之生物實體。較佳地，該甲基化位點為CpG位點。該個別測試個體或測試個體之個別群組可選自原核生物或真核生物，諸如單細胞或多細胞植物、真菌或動物。
於本發明之一態樣中，於(a)中該一或多個預先選定之甲基化位點為與組織特異性基因表現相關之甲基化位點。較佳地，該預先選定之甲基化位點與一種不同組織之基因表現相關。
該組織可選自 (i) 代謝組織，諸如腸道組織，該腸道組織較佳為迴腸或空腸， (ii) 肌肉組織， (iii) 皮膚或羽毛組織，及 (iv) 器官組織，該器官組織較佳為肝和/或胰臟組織。
該個別測試個體或測試個體之個別群組較佳為動物，諸如無脊椎動物，諸如螃蟹。或者，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為脊椎動物，諸如鳥類或哺乳動物；且較佳為雞、蝦或螯蝦。
該不同的地理起源可為被認為是棲息地之地理位置(包括農業環境，諸如養殖場)，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組經繁衍和/或培養、或在彼等之壽命期間至少經培養一段顯著時間。
較佳地，該一或多個預先選定之甲基化位點係在該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體之20%最大差異甲基化基因內。
於本發明之第一態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體的個別群組為大理石紋螯蝦。其中，該不同地理起源為地理上不同之水域，較佳為選自由下列所組成之群組：湖泊、河流和水產養殖場。該等地理上不同之水域可藉由一或多種選自下列之環境參數與其他水體區分：pH、水硬度、錳含量、鐵含量和鋁含量。
用於大理石紋螯蝦之上述方法有利地包含全基因體甲基化分析或一組預先選定之甲基化位點的甲基化分析。該一組預先選定之甲基化位點較佳為含有約500至1000個基因，且較佳地約700個基因內之甲基化位點。根據表2之基因或遺傳區域為特佳的。
於本發明之第一態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體的個別群組為雞。其中，該不同地理起源為地理上不同之養雞場。該等地理上不同之養雞場可藉由一或多種環境參數被認為與其他養雞場不同，諸如飼養參數或空氣參數(例如溫度、濕度、通風)。
較佳地，根據本發明之第一態樣的方法中之一組甲基化位點不包含一致性甲基化或未甲基化之甲基化位點。
於第二態樣中，本發明關於用於性質控制個別測試個體或測試個體之個別群組之懷疑的地理起源之方法，該方法包含下列步驟： (a) 從(a)所測定之甲基化狀態測定該個別測試個體或測試個體之個別群組的測試甲基化輪廓；及 (b) 使(b)所測定之測試甲基化輪廓與預定之參考甲基化輪廓相比較，其中該預定之參考甲基化輪廓為與該個別測試個體或測試個體之個別群組為相同生物分類群之個別個體或個體之個別群組所特有，且其係從懷疑的地理起源獲得； 其中若該測試甲基化輪廓與該預定之參考甲基化輪廓明顯相似，則該個別測試個體或測試個體之個別群組通過性質控制且該懷疑之地理起源被指明為真正之地理起源。
該含有基因體物質之生物樣品可如上文所定義。
此外，在本發明之該態樣方面，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為任何具有DNA基因體和DNA基因體甲基化之生物實體。較佳地，該甲基化位點為CpG位點。該個別測試個體或測試個體之個別群組可選自原核生物或真核生物，諸如單細胞或多細胞植物、真菌或動物。(a)中之一或多個預先選定之甲基化位點可為與組織特異性基因表現相關之甲基化位點。較佳地，該預先選定之甲基化位點與一種不同組織之基因表現相關。合適之組織為如上文中對本發明之第一態樣所定義者。
該個別測試個體或測試個體之個別群組可為植物和動物，較佳為動物，諸如無脊椎動物，諸如螃蟹。或者，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為脊椎動物，諸如鳥類或哺乳動物；且較佳為雞、蝦或螯蝦。
該不同的地理起源為可被認為是棲息地(包括農業環境，諸如養殖場)之地理位置，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組經繁衍和/或培養、或在彼等之壽命期間至少經培養一段顯著時間。
較佳地，該一或多個預先選定之甲基化位點係在該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體之20%最大差異甲基化基因內。
於本發明之第二態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體之個別群組為大理石紋螯蝦。其中，該不同的地理起源為地理上不同之水域，該等水域較佳為選自由下列所組成之群組：湖泊、河流和水產養殖場。該等地理上不同之水域係藉由一或多種選自下列之環境參數被認為與其他水域不同：pH、水硬度、錳含量、鐵含量和鋁含量。
用於大理石紋螯蝦之上述方法有利地包含全基因體甲基化分析或預先選定之一組甲基化位點的甲基化分析。該一組預先選定之甲基化位點較較佳為含有約500至1000個基因，且較佳地約700個基因內之甲基化位點。根據表2之基因或遺傳區域為特佳的。
於本發明之第一態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體的個別群組為雞。其中，該不同的地理起源為地理上不同之養雞場。該等地理上不同之養雞場可藉由一或多種環境參數被認為與其他養雞場不同，諸如飼養參數或空氣參數(例如溫度、濕度、通風)。
較佳地，根據本發明第二態樣之方法中的一組甲基化位點不包含一致性甲基化或未甲基化之甲基化位點。
於第三態樣中，本發明關於用於評估個別測試個體或測試個體之個別群組的棲息地之一或多個環境參數的方法，該方法包含下列步驟： (a) 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品中所含有的基因體物質內之一或多個預先選定的甲基化位點之甲基化狀態； (b) 從(a)所測定之甲基化狀態測定該個別測試個體或測試個體之個別群組之測試甲基化輪廓；及 (c) 使(b)所測定之測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，其中該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為與該個別測試個體或測試個體之個別群組為相同生物分類群(較佳為物種)之個別個體或個體之個別群組所特有，且其各自從不同地理起源獲得；且其中該不同之地理起源藉由一或多個環境參數與其他不同之地理起源區別； 其中若該測試甲基化輪廓與該一或多種預定之參考甲基化輪廓中一者明顯相似，則該個別測試個體或測試個體之個別群組係源自其環境參數與具有該一或多種預定之參考甲基化輪廓的個體或個體群組的地理起源之環境參數相似或較佳地相等的地理起源。
含有基因體物質的生物樣品可如上文所定義。 此外，在本發明之該態樣方面，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為任何具有DNA基因體和DNA基因體甲基化之生物實體。較佳地，該甲基化位點為CpG位點。該個別測試個體或測試個體之個別群組可選自原核生物或真核生物，諸如單細胞或多細胞植物、真菌或動物。(b)中該一或多個預先選定之甲基化位點可為與組織特異性基因表現相關之甲基化位點。較佳地，該預先選定之甲基化位點與一種不同組織之基因表現相關。合適之組織為如上文中對本發明之第一態樣所定義者。
該個別測試個體或測試個體之個別群組可為植物或動物，較佳為動物，諸如無脊椎動物，諸如螃蟹。或者，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為脊椎動物，諸如鳥類或哺乳動物；且較佳為雞、蝦或螯蝦。
該不同的地理起源可為被認為是棲息地(包括農業環境，諸如養殖場)之地理位置，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組經繁衍和/或培養、或在彼等之壽命期間至少經培養一段顯著時間。
較佳地，該一或多個預先選定之甲基化位點係在該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體之20%最大差異甲基化基因內。
於本發明之第三態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體的個別群組為大理石紋螯蝦。其中，該不同的地理起源為地理上不同之水域，該等水域較佳為選自由下列所組成之群組：湖泊、河流和水產養殖場。該等地理上不同之水域可藉由一或多種選自下列之環境參數被認為與其他水體不同：pH、水硬度、錳含量、鐵含量和鋁含量。
用於大理石紋螯蝦之上述方法有利地包含全基因體甲基化分析或一組預先選定之甲基化位點的甲基化分析。該一組預先選定之甲基化位點較佳為含有約500至1000個基因，且較佳地約700個基因內之甲基化位點。根據表2之基因或遺傳區域為特佳的。
於本發明之第一態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體的個別群組為雞。其中，該不同的地理起源為地理上不同之養雞場。該等地理上不同之養雞場可藉由一或多種環境參數被認為與其他養雞場不同，諸如飼養參數或空氣參數(例如溫度、濕度、通風)。較佳地，根據本發明之第三態樣的方法中之一組甲基化位點不包含一致性甲基化或未甲基化之甲基化位點。
於第四態樣中，本發明關於用於確認或否決個別測試個體或測試個體之個別群組的假定地理起源之方法，該方法包含使從該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體物質獲得之測試甲基化輪廓與各自為不同地理起源所特有之一或多個預定之參考甲基化輪廓相比較。
該含有基因體物質之生物樣品可如上文所定義。
此外，在本發明之該態樣方面，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為任何具有DNA基因體和DNA基因體甲基化之生物實體。較佳地，該甲基化位點為CpG位點。該個別測試個體或測試個體之個別群組可選自原核生物或真核生物，諸如單細胞或多細胞植物、真菌或動物。(b)中該一或多個預先選定之甲基化位點可為與組織特異性基因表現相關之甲基化位點。較佳地，該預先選定之甲基化位點與一種不同組織之基因表現相關。合適之組織為如上文中對本發明之第一態樣所定義者。
該個別測試個體或測試個體之個別群組可為植物或動物，較佳為動物，諸如無脊椎動物，諸如螃蟹。或者，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為脊椎動物，諸如鳥類或哺乳動物；且較佳為雞、蝦或螯蝦。
該不同的地理起源可為被認為是棲息地(包括農業環境，諸如養殖場)之地理位置，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組經繁衍和/或培養、或在彼等之壽命期間至少經培養一段顯著時間。
較佳地，該一或多個預先選定之甲基化位點係在該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體之20%最大差異甲基化基因內。
於本發明之第四態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體的個別群組為大理石紋螯蝦。其中，該不同的地理起源為地理上不同之水域，該等水域較佳為選自由下列所組成之群組：湖泊、河流和水產養殖場。該等地理上不同之水域可藉由一或多種選自下列之環境參數被認為與其他水體不同：pH、水硬度、錳含量、鐵含量和鋁含量。
用於大理石紋螯蝦之上述方法有利地包含全基因體甲基化分析或一組預先選定之甲基化位點的甲基化分析。該一組預先選定之甲基化位點較佳為含有約500至1000個基因，且較佳地約700個基因內之甲基化位點。根據表2之基因或遺傳區域為特佳的。
於本發明之第一態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體的個別群組為雞。其中，該不同的地理起源為地理上不同之養雞場。該等地理上不同之養雞場可藉由一或多種環境參數被認為與其他養雞場不同，諸如飼養參數或空氣參數(例如溫度、濕度、通風)。
較佳地，根據本發明之第四態樣的方法中之一組甲基化位點不包含一致性甲基化或未甲基化之甲基化位點。
於第五態樣中，本發明關於用於發展用於確認或否決個別測試個體或測試個體之個別群組的假定地理起源之方法，該方法包含下列步驟： a. 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品所含有的基因體物質內之一或多個甲基化位點之甲基化狀態； b. 從該一或多個甲基化位點選擇一組參考甲基化位點，該一組參考甲基化位點之特徵為該每一個已知之地理起源的特有且不同的差異甲基化輪廓； c. 藉由對每一個已知之地理起源(或位置)指定一個參考甲基化輪廓以獲得測試系統；及 其中使從測試樣品獲得之測試甲基化輪廓與(c)獲得之參考甲基化輪廓相比較可允許確認獲得該測試樣品之個別測試個體或測試個體之個別群組的假定地理起源。
該含有基因體物質之生物樣品可為如上文所定義。
此外，在本發明之該態樣方面，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為任何具有DNA基因體和DNA基因體甲基化之生物實體。較佳地，該甲基化位點為CpG位點。該個別測試個體或測試個體之個別群組可選自原核生物或真核生物，諸如單細胞或多細胞植物、真菌或動物。該一或多個預先選定之甲基化位點可為與組織特異性基因表現相關之甲基化位點。較佳地，該預先選定之甲基化位點與一種不同組織之基因表現相關。合適之組織為如上文針對本發明之第一態樣所定義者。
該個別測試個體或測試個體之個別群組較佳為動物，諸如無脊椎動物，諸如螃蟹。或者，該個別測試個體或測試個體之個別群組可為脊椎動物，諸如鳥類或哺乳動物；且較佳為雞、蝦或螯蝦。
該不同的地理起源可為被認為是棲息地(包括農業環境，諸如養殖場)之地理位置，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組經繁衍和/或培養、或在彼等之壽命期間至少經培養一段顯著時間。
較佳地，該一或多個預先選定之甲基化位點係在該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體之20%最大差異甲基化基因內。
於本發明之第二態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體的個別群組為大理石紋螯蝦。其中，該不同之地理起源為地理上不同的水域，該等水域較佳為選自由下列所組成之群組：湖泊、河流和水產養殖場。該等地理上不同之水域可藉由一或多種選自下列之環境參數被認為與其他水體不同：pH、水硬度、錳含量、鐵含量和鋁含量。
用於大理石紋螯蝦之上述方法有利地包含全基因體甲基化分析或一組預先選定之甲基化位點的甲基化分析。該一組預先選定之甲基化位點較佳為含有約500至1000個基因，且較佳地約700個基因內之甲基化位點。根據表2之基因或遺傳區域為特佳的。
於本發明之第一態樣的特定實例中，該個別測試個體或測試個體之個別群組為雞。其中，該不同的地理起源為地理上不同之養雞場。該等地理上不同之養雞場可藉由一或多種環境參數被認為與其他養雞場不同，諸如飼養參數或空氣參數(例如溫度、濕度、通風)。
較佳地，根據本發明之第五態樣的方法中之一組甲基化位點不包含一致性甲基化或未甲基化之甲基化位點。
現在將藉由實施例和參考本文之描述、所列出之圖形和表格來說明本發明之某些態樣和實施態樣。本發明之該等方法的實施例、用途和其他態樣僅作為代表，而不應將本發明之範圍僅限制在該等代表性實施例。 實施例 1 四種獨立之大理石紋螯蝦群的棲息地輪廓
為了探索大理石紋螯蝦之背景倚賴性DNA甲基化的可能性，收集來自四個互異之穩定種群的動物。Reilingen(德國)代表標準產地，環境保護區內之小的富營養(eutrophic)湖泊。Singlis(德國)種群來自較大之貧營養(oligotrophic)湖泊，其前身為褐煤礦區。Andragnaroa(馬達加斯加)種群位於流經高海拔(1156 m)，具有柔軟山水之森林區域的河流中。最後，Ihosy(馬達加斯加)種群係在高度渾濁，具有來自附近之採礦活動的高度污染的水中找到。理化水參數之分析顯示Reilingen的水乾淨、微鹼性(pH 8.4)水，而Singlis之水相當酸(pH5.2)，錳之含量高(4792 µg/l)。Andragnaroa之水顯示出硬度特別低(0.3°dH)，而Ihosy之水的特徵為鋁(2967 µg/l)和鐵(2249 µg/l)之含量高。總括而言，我們的研究因此涵蓋棲息在四個來自不同氣候帶且具有不同水參數之互異棲息地的種群。該等結果顯示於圖1中，
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實施例 2 可變甲基化基因集之鑑定
先前顯示大理石紋螯蝦之DNA甲基化係靶向基因體，相對穩定且很大程度地為組織不變的(Gatzmann等人，2018)。然而，對來自不同動物、不同組織和不同發育階段之8個全基因體亞硫酸氫鹽測序數據集的比較亦表明較小之基因群組可能顯示出較多變之甲基化水準(Gatzmann等人，2018)。此係藉由甲基化變異數之系統性分析確認。變異數截斷值＞0.006鑑定846個基因，其中149個基因為一致性甲基化或未甲基化(平均比率分別為＞0.8或＜0.2)且其被排除在進一步分析之外，從而定義具有697個可變甲基化基因之核心集。基於該等基因之甲基化水準的多元尺度分析將肝胰臟樣品與腹肌樣品分開，此表明存在先前未被識別之組織特異性甲基化模式。
為了分析該等基因在較多樣品數和較高之甲基化覆蓋率下的甲基化模式，發展以珠粒為基礎之捕獲分析。在該分析方面，製備來自2種不同組織之DNA樣品：肝胰臟(其代表螯蝦之主要代謝器官)和腹肌(形成腹尾之主要肌肉組織)。從N=47隻動物(每個位置11至12)製備肝胰臟DNA，而腹肌DNA係從相同動物之亞群(N=26，每個位置12-4)。結果發現亞基因體捕獲既有效又具特異性，在嚴格條件下每一樣品提供至少1000萬個比對之序列片段(mapped read)。
在隨後之步驟中，排除其序列中具有多於50%之Ns的基因，此可在我們的分析中留下623個基因。此外，僅考慮那些存在於所有樣品中，測序覆蓋率≥5x之CpG位點，且僅當基因具有≥5個合格之CpG位點時才計算平均甲基化水準。有463個基因滿足該等標準。本發明者亦排除不變基因(即，甲基化變異位於底部10%之基因以及其平均甲基化水準＜0.1或＞0.9之基因)，從而產生361個可變甲基化基因之核心集(表2)。
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重要的是，進行基因本體分析以更充分了解我們的可變甲基化基因集背後之潛在機制。觀察到具有與GTP結合蛋白(亦稱為G蛋白)相關之功能特性的基因顯著富集。G蛋白調節多種不同之細胞活性，等，我們檢測在轉錄/翻譯調控、回應壓力、RNA代謝及對病原體之免疫反應上發揮作用的可變甲基化基因。總之，在該等321個可變甲基化基因中所觀察到之功能異質性可能賦予大理石螯蝦生活在不同環境壓力下的可塑性。 實施例 3 大理石螯蝦種群之背景依賴性甲基化模式
在額外的步驟中，我們試圖在我們的361個可變甲基化基因核心集中鑑定特定之背景依賴性甲基化模式。為了鑑定組織特異性甲基化差異，我們應用用於肝胰臟和腹肌之間差異(Benjamini-Hochberg校正後p＜0.05)甲基化的Wilcoxon秩和檢定(Wilcoxon rank sum test)。在我們來自單一位置(Singlis，N=24)之最大數據集方面，此鑑定出56個允許在主成分分析中將二種組織穩固分離的基因。當將相同方法應用在第二大數據集(Reilingen，N=19)時，其鑑定出35個差異甲基化基因(28個與Singlis重疊)，該等基因亦允許在主成分分析中將二種組織穩固分離。對平均基因甲基化水準而言，組織特異性甲基化差異似乎相當溫和，但在CpG水準方面則較明顯。值得注意的是，組織特異性甲基化差異在不同種群之間高度穩定。總之，該等研究結果表明大理石螯蝦中存在局部組織特異性甲基化模式。
為了鑑定位置特異性甲基化差異，我們應用用於四個位置之間的差異(Benjamini-Hochberg校正後p＜0.05)甲基化之Kruskal-Wallis檢定。對較大之肝胰臟數據集(N=47)而言，此鑑定出122個允許在主成分分析中將四個位置穩固分離的基因。當將相同方法應用在較小之腹肌數據集(N=26)時，其鑑定出22個再次允許在主成分分析中將四個位置穩固分離的差異甲基化基因(21個與肝胰臟重疊)。類似於我們對組織特異性甲基化的發現，對平均基因甲基化水準而言，位置特異性甲基化差異似乎溫和，但在CpG水準方面則較明顯。還有，不同位置之間的位置特異性甲基化差異高度穩定。該等發現表明大理石螯蝦種群之間存在界定之位置特異性甲基化差異。 實施例 4 背景依賴性甲基化模式之驗證
為了驗證組織特異性和位置特異性甲基化模式之結果，基於所鑑定之導致樣品分離的基因內之差異甲基化區域(DMR)來設計標記物。組織特異性標記物(n=2)和位置特異性標記物(n=2)係使用來自相同的二種組織(肝胰臟和腹肌)和相同的四個位置(Reilingen、Singlis、Andragnaroa和Ihosy)，但來自第一次採樣後一至二年所收集之新樣品的樣品進行測試。在PCR上，基於擴增子之深度測序分析該樣品。結果證實來自基於捕獲之亞基因體測序的發現。藉由所選擇之標記物可能基於每一CpG之平均甲基化比率將不同組織和位置分開。另外，該經測序之擴增子的平均CpG比率與以珠粒為基礎之捕獲結果的平均CpG比率相當。值得注意的是，此亦證實位置特異性甲基化在大理石螯蝦種群間隨時間推移仍保持穩定，因而定義位置特異性標記來鑑定種群起源並使用甲基化模式作為彼等之特徵是可能的。該等結果顯示於圖2和3中。 材料和方法
在2017年8月為Reilingen、2017年10月為Singlis，及在2017年10月至2018年3月依Adriantsoa等人(2019年)之描述在馬達加斯加進行以珠粒為基礎之捕獲分析的採樣。於2019年3月至5月在德國和馬達加斯加進行驗證實驗之採樣。將樣品保存在100%乙醇中並儲存在-80℃中直到萃取DNA。
使用Tissue Ruptor(Qiagen)從腹肌和肝胰臟組織分離並純化基因體DNA，接著進行蛋白酶K分解和異丙醇沉澱。在2200 TapeStation(安捷倫)上評估經分離之基因體DNA的性質。
依SureSelectXT Methyl-Seq Target Enrichment System for Illumina Multiplexed Sequencing Protocol, Version D0, July 2015中之描述進行集合庫製備。施行性質控制並在2200 TapeStation(安捷倫)上測量樣品濃度。在HiSeqX 10系統(Illumina)上進行多樣樣品測序。
使用BSMAP(Xi和Li，2009)將序列片段進行性質修整並比對至在全基因體亞硫酸氫鹽測序數據集(Gatzmann等人，2018)中顯示可變甲基化的697個基因。隨後，使用BSMAP提供之Python計算各CpG位點之甲基化比率。僅有那些存在於所有樣品中且覆蓋率≥5x之CpG位點才被考慮用於進一步分析。僅在基因具有至少5個CpG位點，覆蓋率≥5x時才計算各基因之平均甲基化水準。此外，將具有下列標準之基因排除在後續分析之外：i) 就甲基化變異而言，位於底部10%之基因，ii)平均甲基化水準＜0.1或＞0.9之基因，及iii) 其序列中Ns超過50%之基因。
為了鑑定組織特異性甲基化差異，應用Wilcoxon秩和檢定(來自Singlis和Reilingen之肝胰臟相對於腹肌樣品)並使用Benjamini-Hochberg方法校正多次測試之p值。同樣地，為了鑑定位置特異性甲基化差異，使用Kuskal-Wallis檢定並使用Benjamini-Hochberg方法校正多次測試之p值。此外，使用dmrseq(Korthauer et al., 2018)鑑定各別基因集內之組織特異性和位置特異性差異甲基化區域。
依照製造商之說明，利用EZ DNA甲基化-Gold套組(Zymo Research)將基因體DNA進行亞硫酸氫鹽轉化。使用區域特異性引物(表3)進行PCR擴增標靶區。使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen)將PCR產物進行凝膠純化。隨後，使用Nextera XT索引套組v2 A組(Illumina)進行樣品索引。使用雙端150bp奈米方案在MiSeqV2系統上為匯集之集合庫測序。使用BisAMP(BisAMP: A web-based pipeline for targeted RNA cytosine-5 methylation analysis, Bormann F, Tuorto F, Cirzi C, Lyko F, Legrand C.Methods. 2019 Mar 1;156:121-127.)分析測序數據。
Figure 02_image021
實施例 5 鑑定雞之差異甲基化的 CpG 位點
為了鑑定雞之差異甲基化的CpG位點，對簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(RRBS)數據使用來自R包MethylKit之函數“計算DiffMeth”。鑑定出1274個差異甲基化之CpG(p值＜0.05)。在此分析之前，將數據中之SNP過濾掉並應用每一CpG位點最小覆蓋截止值為10。所鑑定之差異甲基化CpG位點允許在主成分分析中穩固分離三個位置，如圖4所示。 材料和方法
從乳房肌肉組織分離和純化之基因體DNA係由樣品來源之各別國家的不同服務實驗室提供。使用2200 TapeStation(Agilent)檢查性質。
依Zymo-Seq RRBS™ Library套組說明手冊1.0.0版之描述進行RRBS集合庫製備。進行性質控制，並在2200 TapeStation(安捷倫) 上測量樣品之濃度。在HiSeq 4000系統(Illumina)上進行多樣樣品測序。
使用trimmomatic 0.38 版對序列片段進行性質修整，並使用BSMAP 2.90比對至雞(Gallus gallus)基因體組裝5.0版。使用隨BSMAP包分發之python腳本(methratio.py)計算甲基化比率。將雞(Gallus gallus)基因體中所有與性染色體相關之CpG位點及與SNP重疊的CpG位點從進一步之分析過濾掉。使用R包MethylKit(Akalin et al. (2012), Genome Biology, 13(10), R87)進行差異甲基化分析。 實施例 6 鑑定銀鮭魚 (coho salmon) 之差異甲基化的 CpG 位點
為了鑑定銀鮭魚之RRBS數據中的差異甲基化區域，使用來自R包MethylKit之函數“計算DiffMeth”。鑑定出440個差異甲基化區域(p值＜0.05，甲基之差異＞=10%)。在此分析之前，將數據中之SNP過濾掉該並應用每一CpG位點最小覆蓋截止值為10。所鑑定之差異甲基化區域允許在主成分分析中將二個位置穩固分離，如圖5所示。 材料和方法
從國家生物技術信息中心序列讀取檔案下載由Le Luyer等人於2017年發布之RRBS數據。使用BSMAP 2.90將序列片段比對至Okis_V2(GCF_002021735.2)，並使用隨BSMAP包分發之python腳本(methratio.py)測定甲基化比率。將所有與SNP重疊之CpG位點從進一步分析中過濾掉。以繁殖環境和性別作為共變量，使用R包MethylKit (Akalin et al. (2012), Genome Biology, 13(10), R87)進行差異甲基化分析。
[圖1]顯示四種大理石螯蝦種群棲息地之特定水參數。
[圖2]顯示大理石紋螯蝦種群之背景特異性差異甲基化。(A) 基於具有組織特異性甲基化差異之56個基因的甲基化水準，對來自Singlis之腹肌(mus.，方形符號)和肝胰臟(hep.，圓形符號)樣品進行主成分分析。(B) 基於具有組織特異性甲基化差異之35個基因的甲基化水準，對來自Reilingen之腹肌(mus.，方形符號)和肝胰臟(hep.，圓形符號)樣品進行主成分分析。(C) 基於具有組織特異性甲基化差異之122個基因的甲基化水準，對來自所有位置之肝胰臟樣品進行主成分分析。(D) 基於具有位置特異性甲基化差異之22個基因的甲基化水準，對來自所有位置之腹肌樣品進行主成分分析。
[圖3]顯示在大理石紋螯蝦種群中驗證背景倚賴性差異甲基化。顯示之結果為對4個不同之基因體區進行的基於捕獲之測序及使用擴增子測序之對應的驗證實驗。未填充形式：腹肌；填充形式：肝胰臟；正方形：Reilingen；星形：Singlis；圓形：Andragnaroa；三角形：Ihosy。
[圖4]為對簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(Reduced representation bisulfite sequencing)(RRBS)數據使用來自R包MethylKit之函數“計算DiffMeth”所得到之雞的差異甲基化CpG位點之結果。所鑑定之差異甲基化CpG位點允許在主成分分析中穩固分離三個位置。過濾SNP後：230至360萬個CpG位點。所有樣品中最小覆蓋率為10之CpG位點：623,657，差異甲基化之CpG：1274(p值＜0.05)。
[圖5]為對簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(RRBS)數據使用來自R包MethylKit之函數“計算DiffMeth”所得到之銀鮭魚的差異甲基化CpG位點之結果。所鑑定之差異甲基化CpG位點允許在主成分分析中穩固分離二個位置。過濾SNP後所有樣品中最小覆蓋率為10之CpG位點：610,397，顯著DMR：440(p值＜0.05，甲基化差異＞=10%)。
 
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Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (17)

  1. 一種用於鑑定個別測試個體或測試個體之個別群組的地理起源之方法，該方法包含 - 使從該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體物質獲得之測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為不同地理起源所特有。
  2. 如請求項1之方法，其包含下列步驟： a. 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品所含有的基因體物質內之一或多個預先選定的甲基化位點之甲基化狀態； b. 從(a)所測定之甲基化狀態測定該個別測試個體或測試個體之個別群組之測試甲基化輪廓；及 c. 使(b)所測定之測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，其中該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為與該個別測試個體或測試個體之個別群組為相同生物分類群之不同地理起源的個體或個體群組所特有； 其中若該測試甲基化輪廓與該一或多種預定之參考甲基化輪廓中一者明顯相似，則該個別測試個體或測試個體之個別群組具有與具有該一或多種預定之參考甲基化輪廓的個體或個體群組相似之地理起源。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組為任何具有DNA基因體和DNA基因體甲基化之生物實體，較佳地該甲基化位點為CpG位點。
  4. 如前述請求項中任一項之方法，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組係選自原核生物或真核生物。
  5. 如請求項2至4中任一項之方法，其中於(a)中該一或多個預先選定之甲基化位點為與組織特異性基因表現相關之甲基化位點，較佳地其中該預先選定之甲基化位點與一種不同組織之基因表現相關。
  6. 如請求項5之方法，其中該組織係選自由下列所組成之群組： (i) 代謝組織，較佳為腸道組織； (ii) 肌肉組織； (iii) 皮膚或羽毛組織；及 (iv) 器官組織，該器官組織較佳為肝臟和/或胰臟組織。
  7. 如前述請求項中任一項之方法，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組為動物。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該不同的地理起源為被認為是棲息地之地理位置，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組經繁衍和/或培養、或在彼等之壽命期間至少經培養一段顯著時間。
  9. 如前述請求項中任一項之方法，其中該一或多個預先選定之甲基化位點係在該個別測試個體或測試個體之個別群組的基因體之20%最大差異甲基化基因內。
  10. 一種用於性質控制個別測試個體或測試個體之個別群組之懷疑的地理起源之方法，該方法包含下列步驟： a. 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品所含有的基因體物質內之一或多個預先選定的甲基化位點之甲基化狀態； b. 從(a)所測定之甲基化狀態測定該個別測試個體或測試個體之個別群組的測試甲基化輪廓；及 c. 使(b)所測定之測試甲基化輪廓與預定之參考甲基化輪廓相比較，其中該預定之參考甲基化輪廓為與該懷疑的地理起源獲得之個別測試個體或測試個體之個別群組為相同生物分類群之個別個體或個體之個別群組所特有； 其中若該測試甲基化輪廓與該預定之參考甲基化輪廓明顯相似，則該個別測試個體或測試個體之個別群組通過性質控制且該懷疑之地理起源被指明為真正之地理起源。
  11. 一種用於評估個別測試個體或測試個體之個別群組的棲息地之一或多種環境參數之方法，該方法包含下列步驟： a. 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品所含有的基因體物質內之一或多個預先選定之甲基化位點的甲基化狀態； b. 從(a)所測定之甲基化狀態測定該個別測試個體或測試個體之個別群組的測試甲基化輪廓；及 c. 使(b)所測定之測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，其中該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為與該各自從不同地理起源獲得之個別測試個體或測試個體之個別群組為相同生物分類群的個別個體或個體之個別群組所特有；且其中該不同地理起源係藉由一或多種環境參數與其他不同地理起源區分； 其中若該測試甲基化輪廓與該一或多種預定之參考甲基化輪廓中一者明顯相似，則該個別測試個體或測試個體之個別群組係源自其環境參數與具有該一或多種預定之參考甲基化輪廓的個別測試個體或測試個體之個別群組的地理起源之環境參數相似或較佳地相等的地理起源。
  12. 一種用於確認或否決個別測試個體或測試個體之個別群組之假定地理起源之方法，該方法包含 - 使從該個別測試個體或測試個體之個別群組之基因體物質獲得的測試甲基化輪廓與一或多種預定之參考甲基化輪廓相比較，該一或多種預定之參考甲基化輪廓各自為不同地理起源所特有。
  13. 一種用於發展用於確認個別測試個體或測試個體之個別群組之假定地理起源的測試系統之方法，該方法包含下列步驟： a. 測定從該個別測試個體或測試個體之個別群組獲得之生物樣品所含有的基因體物質內之一或多個甲基化位點之甲基化狀態； b. 從該一或多個甲基化位點選擇一組參考甲基化位點，該一組參考甲基化位點之特徵為該每一個已知之地理起源的特有且不同的差異甲基化輪廓；及 c. 藉由對每一個已知之地理起源指定一個參考甲基化輪廓以獲得測試系統； 其中使從測試樣品獲得之測試甲基化輪廓與(c)獲得之參考甲基化輪廓相比較可允許確認為獲得該測試樣品之個別測試個體或測試個體之個別群組的假定地理起源。
  14. 如前述請求項中任一項之方法，其中該個別測試個體或測試個體之個別群組為大理石紋螯蝦和/或其中該不同地理起源為地理上不同之水域，該等水域較佳為選自由下列所組成之群組：湖泊、河流和水產養殖場。
  15. 如請求項14之方法，其中該地理上不同之水域係藉由一或多種選自由下列所組成之群組的環境參數區分：pH、水硬度、錳含量、鐵含量和鋁含量。
  16. 如請求項14或15中任一項之方法，其中該方法包含全基因體甲基化分析或一組預先選定之甲基化位點的甲基化分析，該一組預先選定之甲基化位點較佳為含有約500至1000個基因且較佳地約700個基因內之甲基化位點。
  17. 如請求項16之方法，其中該一組甲基化位點不包含一致性甲基化或未甲基化之甲基化位點。
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