KR20230043917A - 유기체 기원의 dna-메틸화-기반 품질 관리 - Google Patents
유기체 기원의 dna-메틸화-기반 품질 관리 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230043917A KR20230043917A KR1020237006113A KR20237006113A KR20230043917A KR 20230043917 A KR20230043917 A KR 20230043917A KR 1020237006113 A KR1020237006113 A KR 1020237006113A KR 20237006113 A KR20237006113 A KR 20237006113A KR 20230043917 A KR20230043917 A KR 20230043917A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- methylation
- individual
- test
- subjects
- group
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
- G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
- G16H20/40—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to mechanical, radiation or invasive therapies, e.g. surgery, laser therapy, dialysis or acupuncture
Abstract
본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 지리적 기원의 확인을 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈 재료로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일을 각각이 별개의 지리적 기원에 특이적인 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 유전자의 특별한 패널이 유기체의 지리적 기원에 특이적인 DAN 메틸화 프로파일의 생성을 위한 공급원을 제공한다는 발견을 기반으로 한다. 특히, DNA 메틸화 프로파일링은 가축, 예컨대 게, 어류 또는 닭으로도 알려진 사육 동물을 포함한, 동물의 유전적 기원을 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 사육 동물을 포함한 유기체의 샘플의 추정 지리적 기원을 관리하고, 사육 동물을 포함한 유기체의 서식지의 환경적 매개변수를 평가하기 위해, 사육 동물을 포함한 유기체의 지리적 기원을 확인하는데 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 사육 동물을 포함한 다양한 유기체의 새로운 시험 시스템을 개발하기 위한 방법 및 품질 관리 방법을 제공한다.
지속가능한 식량 생산은 전세계적으로 가장 중요한 사회적 요구 중 하나로서 현재 간주되고 있다. 농업 및 양식 산업의 가치 사슬이 고도로 복잡하므로, 소비자 관계 및 신뢰를 강화하기 위한 인증서가 확립되었다. 그러나, 인증서는 특정 농장에서의 감사를 기반으로 하고 가축을 비인증 농장에서 인증 농장으로 이동시켜서 쉽게 변조할 수 있다. 더 나아가서, 지속가능한 농업 관행의 감시는 오점이 많고 대체로 감사에 제한된다. "나쁜" 농업 관행이 산업계에 만연하므로, 변조 방지 인증서에 대한 시급한 요구가 존재한다.
가축 및 식품 가공 산업은 식품 안전 분야에서 위험을 확인, 추적 및 관리하는 전략의 개발, 및 소비자 정보 (투명한 가치 사슬)를 위한 전략 개발에 크게 관여해 왔다. 건강, 안전성, 및 또한 동물 복지 고려 사항은 동물 제품, 특히 육류 제품의 기원은 품질 보증 감사, 및 모니터링 절차가 효율적이고 신뢰할만하게 수행될 수 있도록, 추적가능해야 한다는 것을 요구한다.
DNA 수준에서 변이 및 메틸화의 게놈-와이드 패턴의 비교는 후생유전적 변이의 고도로 유의한 비율이 적합도 차이 및 연어 구금같은 사육 조건과 연관될 수 있다는 것을 밝혀주었다 (Le Luyer J et al. 2017 PNAS vol 114, no 49).
마블 가재 (프로캄바루스 비르기날리스 (Procambarus virginalis))에서 게놈 와이드 메틸화의 연구는 동물 및 조직 간에 게놈의 대부분에서 안정한 메틸화를 관찰한 반면 약 700개 유전자의 서브세트는 그들 메틸화에서 고도로 가변적인 것으로 입증되었다 (Gatzmann, F. DNA methylation in the marbled crayfish Procambarus virginalis. PhD thesis, Faculty of Biosciences, University of Heidelberg, 2018).
상기 관점에서, 유기체, 특히 식품 및 보다 특히 사육 가축으로부터 유래된 동물 재료의 지리적 기원을 확인하고 품질을 제어하기 위한 수단을 제공하려는 급박한 요구가 존재한다.
상기 언급된 목적은 본 발명의 상이한 양태를 통해서 해결된다. 본 발명은 환경 노출 예컨대 스트레스, 기후, 빛, 또는 식이에 대한 회복력이 생물학의 기본 개념이고, 이의 환경에 대해 유기체를 적응시키게 된다는 발견을 기반으로 한다. 환경에 적응하고 적응된 생물학적 패턴을 유지하는 능력은 DNA 메틸화를 포함하여, 후생유전적 기전에 의존한다.
본 발명자는 이러한 성질이 게놈 상에서 환경-특이적 "후생유전적 지문"을 확인하고 유기체를 그들이 기원한 생태계에 배치시키는데 이용될 수 있다는 것을 예상치 않게 발견하였다. 이들 발견을 기반으로, 본 발명은 가축이라고도 알려진 사육 동물을 포함한 유기체의 지리적 기원을 확인하기 위한 방법, 사육 동물을 포함한 유기체의 샘플의 추정 지리적 기원을 관리하는 방법, 및 사육 동물을 포함한 유기체의 서식지의 환경적 매개변수를 평가하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 사육 동물을 포함한 다양한 유기체를 위한 신규 시험 시스템을 개발하기 위한 방법 및 품질 관리 방법을 제공한다.
일반적으로, 간략한 설명을 통해서, 본 발명의 주요 양태는 하기와 같이 설명될 수 있다:
제1 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 지리적 기원의 확인을 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈 재료로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일을 각각이 별개의 지리적 기원에 특이적인 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일(들)과 비교하는 단계를 포함한다.
제2 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 의심되는 지리적 기원을 품질 관리하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은
a. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내에서 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
b. (a)에서 결정된 메틸화 상태로부터 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 시험 메틸화 프로파일을 결정하는 단계; 및
c. (b)에서 결정된 시험 메틸화 프로파일을 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계로서, 사전결정된 기준 메틸화 프로파일은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 동일 생물학적 분류군 (바람직하게 종)의 개별 대상체 또는 대상체의 개별 그룹에 특이적이고, 의심되는 지리적 기원으로부터 수득된 것인 단계
를 포함하고,
시험 메틸화 프로파일이 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 유의하게 유사하면, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 품질 관리를 통과하고 의심되는 지리적 기원은 진정한 지리적 기원으로 표시된다.
제3 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 서식지의 하나 이상의 환경적 매개변수를 평가하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은
(a) 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 사전 선택된 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
(b) (a)에서 결정된 메틸화 상태로부터 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 시험 메틸화 프로파일을 결정하는 단계; 및
(c) (b)에서 결정된 시험 메틸화 프로파일을 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일은 각각이 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 동일한 생물학적 분류군 (바람직하게 종)의 개별 대상체 또는 대상체의 개별 그룹에 특이적이고, 각각이 별개의 지리적 기원으로부터 수득되었고, 별개의 지리적 기원은 다른 별개의 지리적 기원과 하나 이상의 환경 매개변수에 의해 구별되는 것인 단계
를 포함하고,
시험 메틸화 프로파일이 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일 중 하나와 유의하게 유사하면, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일 중 하나의 대상체 또는 대상체 그룹의 지리적 기원과 유사하거나, 또는 바람직하게 동등한 환경적 매개변수를 갖는 지리적 기원으로부터 유래된다.
제4 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 추정 지리적 기원을 확정하거나 또는 거부하는 방법에 관한 것으로서, 방법은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈 재료로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일을 각각이 별개의 지리적 기원에 특이적인 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계를 포함한다.
제5 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 추정 지리적 기원을 확정하기 위한 시험 시스템을 개발하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은
(a) 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
(b) 기지의 지리적 기원의 각각에 대해 특이적인 별개의 차별적인 메틸화 프로파일을 특징으로 하는 메틸화 부위의 기준 패널을 하나 이상의 메틸화 부위로부터 선택하는 단계;
(c) 기지의 지리적 기원 (또는 장소)의 각각에 대해 기준 메틸화 프로파일을지정하여 시험 시스템을 수득하는 단계
를 포함하고,
시험 샘플로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일과 (c)에서 수득된 기준 메틸화 프로파일의 비교는 시험 샘플이 수득된 개별 시험 대상체의 추정 지리적 기원의 확정을 허용한다.
하기에서, 본 발명의 구성요소가 기술된다. 이들 구성요소는 특정한 구현예 및/또는 예에서 열거되지만, 이들 구성요소는 임의 방식으로 임의 수로 조합되어서 추가의 구현예 및/또는 예를 생성할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 다양하게 기술된 예 및 바람직한 구현예는 본 발명을 단지 명시적으로 기술된 구현예 또는 예에 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 설명은 명시적으로 기술된 구현예 중 둘 이상을 조합하거나 또는 명시적으로 기술된 구현예 또는 예 중 하나 이상을 임의 수의 개시되고/되거나 바람직한 구성요소와 조합하는 구현예 및 예를 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해해야 한다. 더 나아가서, 본 출원에서 모든 기술된 구성요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥에서 달리 표시하지 않으면 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "본 발명의", "본 발명에 따른", "본 발명에 따라서"등의 용어는 본 명세서에서 기술되고/되거나 청구된 본 발명의 모든 양태, 구현예 및 예를 언급하고자 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 "포괄하는" 및 "이루어지는" 둘 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 하고, 둘 모두의 의미는 구체적으로 의도되고, 따라서 본 발명에 따른 개별적으로 개시된 구현예이다. 본 명세서에서 사용하는 경우, "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 없이 두개의 명시된 특성 또는 성분의 각각의 특별한 개시로서 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 개별적으로 본 명세서에 기재되는 바와 같이, (i) A, (ii) B, 및 (iii) A 및 B의 각각의 특별한 개시로서 간주되어야 한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "약" 및 "대략"은 당업자가 대상 특성의 기술적 효과를 여전히 보장하기 위해 이해하게 되는 정확도의 간격을 의미한다. 이 용어는 전형적으로 ±20%, ±15%, ±10%, 및 예를 들어 ±5% 만큼 표시된 수치값으로부터의 편차를 의미한다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 소정 기술적 효과에 대한 수치값에 대한 특정한 편차는 기술적 효과의 성질에 의존하게 된다. 예를 들어, 자연적 또는 생물학적 기술적 효과는 일반적으로 인공적 또는 공학적 기술 효과에 대한 것에 비해서 더 큰 그러한 편차를 가질 수 있다. 정관사 또는 부정 관사가 단수 명사를 언급할 때 사용되는 경우, 예를 들어, "한", "하나", 또는 "그"는 이것이 다른 것을 구체적으로 명시하지 않으면 그 명사의 복수를 포함한다.
특정 문제 또는 환경에 대한 본 발명의 임의 양태에 따른 교시의 적용, 및 본 발명의 임의 양태에 따른 변동 또는 이의 추가 특성 (예컨대 추가 양태 및 구현예 또는 예)의 포함은 본 명세서에 함유된 교시의 관점에서 당분야의 통상의 기술을 갖는 자의 능력 내에 있을 것임을 이해해야 한다.
문맥에서 달리 명시하지 않으면, 이 설명 내에 기재된 특성의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정한 양태 또는 구현예에 제한되지 않고 기술된 모든 양태 및 구현예에 동등하게 적용된다.
본 명세서에서 인용되는 모든 참조, 특허, 및 공개물은 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다.
본 명세서에 정의된 발명의 문맥에서 용어 "지리적 기원"은 대상체 또는 대상체 그룹의 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해서 다른 지리적 장소와 구별되는 지리적 장소와 관련된다. 이러한 환경적 매개변수는 대상체 또는 대상체 그룹의 서식지에 의존하고, 대상체 또는 대상체 그룹이 물에서, 토양 위에서 또는 토양에서 살거나 또는 사육되는 경우에 상이할 수 있거나, 또는 식품 또는 공기 매개변수 등으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 비제한적인 예로서, 단물게 (예컨대 마블 가재) 경우, 환경적 매개변수는 pH, 물 경도, 망간 함량, 철 함량, 및 알루미늄 함량으로부터 선택될 수 있고 - 언급한 바와 같이 이들 매개변수는 바람직하지만 비제한적인 예시적인 예로서 이해되고 대상체 또는 대상체 그룹의 분류군 또는 종에 따라서 상당히 가변적일 수 있다. 이와 같이, 물에 사는 대상체 또는 대상체 그룹의 서식지, 이들 서식지는 정수 또는 유수 예컨대 호수, 강, 양식장, 다른 풀 또는 수역 또는 연못으로부터 선택될 수 있다. 지리적 기원은 서식지로서 간주되는 지리적 장소로 이해해야 하는데, 여기서 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹이 산란 및/또는 사육되었거나, 또는 적어도 그들 생애 동안 상당 시간 동안 사육되었다.
본 개시에서 용어 대상체와 함께 사용되는 용어 "시험"은 본 발명의 임의 양태에 따라서 방법이 수행되고 본 발명의 분석 적용을 위해 기초가 되는 독립체 또는 살아있는 유기체를 의미한다. 그러므로, "(개별) 시험 대상체", "시험 대상체의 (개별) 그룹" 또는 "시험 프로파일"은 본 발명에 따라 시험되는 (개별) 대상체 또는 대상체 그룹 또는 이 문맥에서 수득되거나 또는 생성되는 프로파일이다. 반대로, 용어 "기준"은 시험 독립체와 비교를 위해 사용되는 대부분 사전결정된 독립체를 의미한다.
본 발명의 문맥에서 대상체 또는 대상체 그룹은 임의의 살아있는 유기체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 임의 양태에 따른 대상체는 임의 종류의 식물 또는 동물, 바람직하게 척추동물 또는 무척추동물일 수 있는, 사육 동물 (또는 사육 가축) 또는 가축일 수 있다. 본 발명의 임의 양태에 따라서 대상체로 유용할 수 있는 무척추동물의 전형적인 예는 새우 또는 게 예컨대 마블 가재일 수 있다. 본 발명의 임의 양태에 따라서 대상체로서 유용할 수 있는 척추동물의 전형적인 예는 어류 또는 육상 동물 예컨대 닭 또는 사육할 수 있는 다른 가축일 수 있다.
용어 "게놈 재료"는 대상체 또는 대상체 그룹의 게놈의 핵산 분자 또는 단편을 의미한다. 바람직하게 이러한 핵산 분자 또는 단편은 DNA 또는 RNA 또는 이의 하이브리드이고, 가장 바람직하게 대상체 또는 대상체 그룹의 DNA 게놈의 분자이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "메틸화 프로파일", "메틸화 패턴", "메틸화 양상" 또는 "메틸화 상태"는 게놈 서열의 메틸화의 양상, 상황 또는 상태를 설명하고자 본 명세서에서 사용되고, 이러한 용어는 메틸화와 관련된 특정 게놈 유전자좌에서 DNA 절편의 특징을 의미한다. 이러한 특징은 이러한 DNA 서열 내 임의 시토신 (C) 잔기가 메틸화되는지 여부와 무관하게, 메틸화된 C 잔기(들)의 위치, 임의의 특정 잔기 스트레치에서 메틸화된 C의 비율, 및 예를 들어, 대립유전자의 기원 차이에 기인한 메틸화의 대립유전자 차이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "메틸화 상태"는 잔기 또는 메틸화 부위가 메틸화되거나 또는 메틸화되지 않은 것을 의미하는 특별한 메틸화 부위의 상태 (즉, 메틸화 대 비-메틸화)를 의미한다. 그 다음에, 하나 이상의 메틸화 부위의 메틸화 상태를 기반으로, 메틸화 프로파일을 결정할 수 있다. 따라서, 용어 "메틸화 프로파일" 또는 또한 "메틸화 패턴"은 생물학적 샘플의 게놈 재료에서 잔기의 임의의 특정 스트레치에서 메틸화된 C 잔기 또는 비메틸화 C 잔기의 상대적 또는 절대적 농도를 의미한다. 예를 들어, DNA 서열 내 전형적으로 메틸화되지 않은 시토신 (C) 잔기(들)가 메틸화되면, "과메틸화"라고 할 수 있는 한편, DNA 서열 내에서 전형적으로 메틸화되는 시토신 (C) 잔기(들)가 메틸화되지 않으면, "저메틸화"라고 할 수 있다. 유사하게, DNA 서열 (예를 들어, 시험 대상체 유래 샘플 핵산으로부터의 DNA) 내 시토신 (C) 잔기(들)가 상이한 영역 또는 상이한 개체로부터의 다른 서열과 비교하여 (예를 들어, 정상 핵산 또는 기준 서열의 표준 핵산에 비해서), 메틸화되면, 그 서열은 다른 서열과 비교하여 과메틸화로 간주된다. 대안적으로, DNA 서열 내 시토신 (C) 잔기(들)가 상이한 영역 또는 상이한 개체로부터의 다른 서열과 비교하여 메틸화되지 않으면, 그 서열은 다른 서열과 비교하여 저메틸화된 것으로 간주된다. 이들 서열은 "차별적으로 메틸화"된다고 한다. 차별적 메틸화 수준의 측정은 당업자에게 공지된 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 한 방법은 비제한적인 예로서, 바이술파이트 시퀀싱 방법을 통해서 결정된 개별 검토된 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "메틸화된 뉴클레오티드" 또는 "메틸화된 뉴클레오티드 염기"는 뉴클레오티드 염기 상에 메틸 모이어티의 존재를 의미하고, 여기서 메틸 모이어티는 일반적으로 인식되는 전형적인 뉴클레오티드 염기에 존재하지 않는다. 예를 들어, 이의 일반 형태의 시토신은 이의 피리미딘 고리 상에 메틸 모이어티를 함유하지 않지만, 5-메틸시토신은 이의 피리미딘 고리의 위치 5에 메틸 모이어티를 함유한다. 그러므로, 이의 일반 형태의 시토신은 메틸화된 뉴클레오티드로 간주되지 않을 수 있고 5-메틸시토신은 메틸화된 뉴클레오티드로 간주될 수 있다. 다른 예에서, 티민은 이의 피리미딘 고리의 위치 5에 메틸 모이어티를 함유할 수 있지만, 본 명세서의 목적을 위해서, 티민은 DNA에 존재할 때 메틸화된 뉴클레오티드로 간주되지 않을 수 있다. DNA에 대한 전형적인 뉴클레오티드 염기는 티민, 아데닌, 시토신 및 구아닌이다. RNA에 대한 전형적인 염기는 우라실, 아데닌, 시토신 및 구아닌이다. 상응하게, "메틸화 부위"는 메틸화가 일어날 가능성을 갖는 표적 유전자 핵산 영역 내 위치이다. 예를 들어, CpG를 함유하는 위치는 메틸화 부위로서, 시토신은 메틸화될 수 있거나 또는 메틸화되지 않을 수 있다. 특히, 용어 "메틸화된 뉴클레오티드"는 메틸화에 접근가능한 뉴클레오티드의 위치에 부착된 메틸 기를 보유하는 뉴클레오티드를 의미한다. 이들 메틸화된 뉴클레오티드는 일반적으로 자연계에서 발견되며, 현재까지, 대부분 디뉴클레오티드 CpG의 상황을 비롯하여, 또한 CpNpG- 및 CpNpN-서열의 상황에서도 발생되는 메틸화된 시토신은 가장 일반적인 것으로 간주될 수 있다. 원칙적으로, 다른 천연 발생 뉴클레오티드는 또한 메틸화될 수 있지만 그들은 본 발명의 임의 양태와 관련하여 고려되지 않을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "CpG 부위" 또는 "메틸화 부위"는 생체내에서 천연 발생 사건에 의해서 또는 시험관내에서 뉴클레오티드를 화학적으로 메틸화시키기 위해 시작된 사건에 의해서 메틸화에 감수성인 핵산 (DNA 또는 RNA) 내 뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용되는, "메틸화된 핵산 분자"는 메틸화된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "CpG 섬"은 기능적으로 또는 구조적으로 일탈된 CpG 밀도를 포함하는 DNA 서열의 절편을 기술한다. 예를 들어, Yamada 등은 CpG 섬을 결정하기 위한 표준 세트를 기술하였고, 이것은 적어도 400 뉴클레오티드 길이여야 하고, 50% 초과의 GC 함량 및 0.6 초과의 OCF/ECF 비율을 갖는다 (Yamada et al., 2004, Genome Research, 14, 247-266). 다른 이들은 덜 엄격하게 50% 초과의 GC 함량, 및 0.6 초과의 OCF/ECF 비율을 갖는, 적어도 200 뉴클레오티드 길이의 서열로서 CpG 서열을 정의하였다 (Takai et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 3740-3745).
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이술파이트"는 임의의 적합한 유형의 바이술파이트, 예컨대 소듐 바이술파이트, 또는 메틸화된 시토신을 화학적으로 변형시키지 않고 시토신 (C)을 우라실 (UA)로 화학적으로 전환시킬 수 있고 따라서 DNA의 메틸화 상태를 기반으로 DNA 서열을 차별적으로 변형시키는데 사용될 수 있는 다른 화학제를 포괄하며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2010/0112595호 (Menchen et al.)가 있다. 본 명세서에서 사용되는, 메틸화 또는 비-메틸화 DNA를 "차별적으로 변형시키는" 시약은 구별가능한 생성물이 메틸화 및 비-메틸화 DNA로부터 생성되어서, DNA 메틸화 상태의 확인을 허용하는 과정에서 메틸화 및/또는 비메틸화 DNA를 변형시키는 임의 시약을 포괄한다. 이러한 과정은 화학 반응 (예컨대 바이술파이트에 의한 C에서 U로의 전환) 및 효소 처리 (예컨대 메틸화-의존적 엔도뉴클레아제에 의한 절단)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 메틸화된 DNA를 우선적으로 절단하거나 또는 분해하는 효소는 DNA가 메틸화될 때 훨씬 더 높은 효율로 DNA 분자를 절단 또는 분해할 수 있는 것인 반면, 비메틸화된 DNA를 우선적으로 절단 또는 분해하는 효소는 DNA가 메틸화되지 않을 때 유의하게 더 높은 효율을 나타낸다.
본 발명의 문맥에서, 또한 임의의 "비-바이술파이트-기반 방법" 및 "비-바이술파이트-기반 정량적 방법"은 시험하려는 임의의 소정 메틸화 부위에서 메틸화 상태에 대해 시험하기 위해 포함된다. 이러한 용어는 바이술파이트의 사용을 요구하지 않는 메틸화 또는 비-메틸화된 핵산을 정량하기 위한 임의 방법을 의미한다. 이 용어는 또한 바이술파이트 처리를 요구하지 않는 정량하려는 핵산을 제조하기 위한 방법을 의미한다. 비-바이술파이트-기반 방법의 예는 하나 이상의 메틸화 민감성 효소를 사용해 핵산을 분해하기 위한 방법 및 메틸화 상태를 기반으로 핵산에 결합하는 작용제를 사용해 핵산을 분리하기 위한 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "메틸-민감성 효소" 및 "메틸화 민감성 제한 효소"는 활성을 위한 그들 DNA 인식 부위의 메틸화 양상에 의존하는 DNA 제한 엔도뉴클레아제이다. 예를 들어, 메틸화되지 않은 경우에만 그들 DNA 인식 서열에서 절단 또는 분해되는 메틸-민감성 효소가 존재한다. 따라서, 비메틸화된 DNA 샘플은 메틸화된 DNA 샘플에 비해서 더 작은 단편으로 절개될 것이다. 유사하게, 과메틸화된 DNA 샘플은 절단되지 않을 것이다. 대조적으로, 메틸화되는 경우에만 그들 DNA 인식 서열에서 절단되는 메틸-민감성 효소가 존재한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "절단", "절개" 및 "분해"는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 문맥에서 "생물학적 샘플"은 게놈 재료를 함유하는 대상체 또는 대상체 그룹으로부터 수득된 임의의 생물학적 재료를 포함할 수 있고, 액체, 고체, 또는 둘 모두일 수 있고, 조직 또는 뼈, 또는 체액 예컨대 혈액, 림프 등일 수 있다. 특히, 본 발명에 유용한 생물학적 샘플은 생물학적 세포 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사전-선택된 메틸화 부위"는 방법의 훈련 동안 메틸화 변이의 최고 정도를 보인 유전자 또는 영역으로부터 선택되고 일정 품질 기준 예컨대 ≥5x의 최소 시퀀싱 커버리지가 고려되고 ≥5 적격한 CpG 부위를 충족하는 메틸화 부위를 의미한다. 추가로, <0.1의 평균 메틸화 수준 또는 >0.9의 평균 메틸화 수준을 갖는 유전자는 그들의 제한된 동적 범위로 인해 배제될 수 있다. "기준 메틸화 프로파일"은 다변량 통계 방법, 예컨대 주요 성분 분석 또는 다차원 스케일링을 사용하는 다수 훈련 샘플을 기반으로 정의될 수 있다.
본 개시의 문맥에서, 특히 메틸화 프로파일의 비교 (예컨대 시험 프로파일 (시험 대상체(들) 유래) 및 기준 프로파일 간 비교) 문맥에서 용어 "유의하게 유사한"은 통계 수단 (즉, 생물정보학 사용에 의함) 및/또는 또한 육안을 사용한 관찰을 통해서 관찰된 유사성을 의미한다. 유의한 유사성은 예를 들어, 시험 프로파일이 다변량 통계 방법, 예컨대 주요 성분 분석 또는 다차원 스케일링을 통해 다수 훈련 샘플에 의해 정의된 기준 프로파일과 중복되면 관찰된다. 특히, 시험 프로파일은 메틸화 패턴/프로파일 중 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 초과가 기준 프로파일의 것과 중복되면 사전-결정된 기준 프로파일과 유의하게 유사하다. 1 초과, 예컨대 2, 3 또는 심지어 모든 기준 프로파일에 대한 시험 프로파일의 유사성은 유사성의 유의도를 감소시킨다.
본 발명의 문맥에서 사용되는 용어 "사전-결정된 기준 프로파일"은 특정 지리적 기원을 갖는 살아있는 유기체의 게놈 재료의 전형적 또는 표준 메틸화 프로파일을 의미한다. 사전-결정된 기준 프로파일은 대조 대상체로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 대조 대상체는 기지의 지리적 기원을 갖는 시험 대상체와 동일한 종의 살아있는 유기체일 수 있다. 대안적으로, 사전-결정된 기준 프로파일은 특정 지리적 기원에서 사는 다양한 유기체로부터 수득될 수 있다. 특정 지리적 기원의 상이한 유기체의 메틸화 프로파일은 동일할 수 있다. 몇개의 사전-결정된 기준 프로파일의 모음집이 존재할 수 있고 모음집 중 사전-결정된 기준 프로파일과 시험 대상체의 메틸화 프로파일의 비교는 시험 대상체의 메틸화 프로파일과 유사한 특정 사전-결정된 기준 프로파일을 확인할 수 있게 하고 그 다음에 시험 대상체의 지리적 기원은 사전-결정된 기준 프로파일의 것으로 추론될 수 있다.
지리적 기원과 관련하여 사용되는 용어 "유사한"은 사전-결정된 기준 프로파일이 수득된 유기체의 지리적 기원 또는 서식지를 기반으로 시험 대상체(들)의 지리적 기원 또는 서식지를 의미한다. 용어 '유사한'은 서식지의 유형, 서식지의 환경적 매개변수, 서식지가 위치하는 국가 등을 의미할 수 있다. 시험 대상체의 지리적 기원은 '지리적 기원' 하에서 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나 이상의 환경적 매개변수를 기반으로 사전-결정된 기준 프로파일의 지리적 기원의 것과 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 유사할 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 지리적 기원의 확인을 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈 재료로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일을 각각이 별개의 지리적 기원에 특이적인 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명은 한 종의 개체의 별개의 지리적 기원을 특징으로 하는 상기 종 내 동물을 포함한 살아있는 유기체의 유전자 서브세트 내에서 메틸화 프로파일의 놀라온 확인을 근거로 한다. 상이한 지리적 장소로부터 기원하는 종의 다른 개체는 유전자의 동일한 서브세트에 대한 상이한 메틸화 프로파일 - 또는 그 안의 메틸화 부위에 의해 구별가능하다.
본 발명의 임의 양태의 일례에서, 방법은 바람직하게 하기 단계를 포함한다:
(a) 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
(b) (a)에서 결정된 메틸화 상태로부터 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 시험 메틸화 프로파일을 결정하는 단계; 및
(c) (b)에서 결정된 시험 메틸화 프로파일을 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일의 각각은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 동일한 생물학적 분류군인 대상체 또는 대상체 그룹의 별개의 지리적 기원에 특이적인 것인 단계
를 포함하고,
시험 메틸화 프로파일이 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일 중 하나와 유의하게 유사하면, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일의 대상체 또는 대상체 그룹과 유사한 지리적 기원을 갖는다.
개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 DNA 게놈 및 DNA 게놈 메틸화를 갖는 임의의 생물학적 독립체일 수 있다. 바람직하게 메틸화 부위는 CpG 부위이다. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 원핵생물 또는 진핵생물, 예컨대 단세포 또는 다세포 식물, 진균 또는 동물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, (a)에서 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 조직 특이적 유전자 발현과 연관된 메틸화 부위이다. 바람직하게, 사전-선택된 메틸화 부위는 하나의 별개 조직의 유전자 발현과 연관된다.
조직은 하기로부터 선택될 수 있다:
(i) 대사 조직 예컨대 내장 조직, 상기 내장 조직은 바람직하게 회장 또는 공장임,
(ii) 근육 조직,
(iii) 피부 또는 깃털 조직, 및
(iv) 기관 조직, 상기 기관 조직은 바람직하게 간 및/또는 췌장 조직임.
개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 바람직하게 동물, 예컨대 무척추동물 예컨대 게이다. 대안적으로, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 척추동물 예컨대 새 또는 포유동물일 수 있고, 바람직하게 닭, 새우 또는 가재이다.
별개의 지리적 기원은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹이 산란 및/또는 사육되거나, 또는 적어도 그들 생애 동안 상당한 시간 동안 사육되는, 서식지 (농업 환경 예컨대 사육 농장 포함)로 간주되는 지리적 장소일 수 있다.
바람직하게, 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈의 20%의 대부분의 차별적으로 메틸화된 유전자 내에 있다.
본 발명의 제1 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 마블 가재이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적 별개의 물로서, 바람직하게 호수(들), 강(들) 및 양식장으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 지리적 별개의 물은 pH, 물 경도, 망간 함량, 철 함량, 및 알루미늄 함량으로부터 선택되는 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해서 다른 수역과 구별될 수 있다.
상기 언급된 마블 가재에 대한 방법은 유리하게 게놈 와이드 메틸화 분석 또는 메틸화 부위의 사전-선택된 패널의 메틸화 분석을 포함한다. 메틸화 부위의 이들 사전-선택된 패널은 바람직하게 약 500 내지 1000 유전자, 및 바람직하게 약 700 유전자 내에 메틸화 부위를 함유한다. 표 2에 따른 유전자 또는 유전자 영역이 특히 바람직하다.
본 발명의 제1 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 닭이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적으로 별개의 닭 농장이다. 이들 지리적으로 별개의 닭 농장은 하나 이상의 환경적 매개변수, 예컨대 사료 매개변수 또는 공기 매개 변수 (예를 들어, 온도, 습도, 환기)에 의해 다른 닭 농장과 별개인 것으로 간주될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 제1 양태에 따른 방법에서 메틸화 부위의 패널은 일관적으로 메틸화되거나 또는 비메틸화된 메틸화 부위를 포함하지 않는다.
제2 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 의심되는 지리적 기원을 품질 관리하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은
a) (a)에서 결정된 메틸화 상태로부터 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 시험 메틸화 프로파일을 결정하는 단계; 및
b) (b)에서 결정된 시험 메틸화 프로파일을 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계로서, 사전결정된 기준 메틸화 프로파일은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 동일한 생물학적 분류군의 개별 대상체 또는 대상체의 개별 그룹에 특이적이고, 의심되는 지리적 기원으로부터 수득된 것인 단계
를 포함하고,
시험 메틸화 프로파일이 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 유의하게 유사하면, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 품질 관리를 통과하고 의심되는 지리적 기원은 진정한 지리적 기원으로서 표시된다.
게놈 재료를 함유하는 생물학적 샘플은 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
또한, 본 발명의 이러한 양태 경우에, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 DNA 게놈 및 DNA 게놈 메틸화를 갖는 임의의 생물학적 독립체일 수 있다. 바람직하게, 메틸화 부위는 CpG 부위이다. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 원핵생물 또는 진핵생물, 예컨대 단세포 또는 다세포 식물, 진균 또는 동물로부터 선택될 수 있다. (a)에서 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 조직 특이적 유전자 발현과 연관된 메틸화 부위일 수 있다. 바람직하게, 사전-선택된 메틸화 부위는 하나의 별개 조직의 유전자 발현과 연관된다. 적합한 조직은 본 발명의 제1 양태에 대해 상기 정의된 바와 같다.
개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 식물 및 동물일 수 있고, 바람직하게 동물, 예컨대 무척추동물 예컨대 게이다. 대안적으로, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 척추동물 예컨대 새 또는 포유동물일 수 있고, 바람직하게 닭, 새우 또는 가재이다.
별개의 지리적 기원은 서식지 (농업 환경 예컨대 사육 농장 포함)로 간주되는 지리적 장소일 수 있고, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹이 산란되고/되거나 사육되었거나, 또는 적어도 그들 생애 동안 상당한 시간 동안 사육되었다.
바람직하게, 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈의 20%의 대부분의 차별적으로 메틸화된 유전자 내에 있다.
본 발명의 제2 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 마블 가재이다. 여기서, 별개의 지리적 기원 지리적 별개의 물로서, 바람직하게 호수(들), 강(들) 및 양식장으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 지리적 별개의 물은 pH, 물 경도, 망간 함량, 철 함량, 및 알루미늄 함량으로부터 선택되는 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해 다른 물과 별개로 간주될 수 있다.
마블 가재에 대해 상기 언급된 방법은 유리하게 게놈 와이드 메틸화 분석 또는 메틸화 부위의 사전-선택된 패널의 메틸화 분석을 포함한다. 메틸화 부위의 이들 사전-선택된 패널은 바람직하게 약 500 내지 1000 유전자, 및 바람직하게 약 700 유전자 내 메틸화 부위를 함유한다. 표 2에 따른 유전자 또는 유전자 영역이 특히 바람직하다.
본 발명의 제1 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 닭이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적으로 별개의 닭 농장이다. 이들 지리적으로 별개의 닭 농장은 하나 이상의 환경적 매개변수, 예컨대, 사료 매개변수 또는 공기 매개변수 (예를 들어, 온도, 습도, 환기)에 의해서 다른 닭 농장과 별개로 간주될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 제2 양태에 따른 방법에서 메틸화 부위의 패널은 일관적으로 메틸화되거나 또는 비메틸화된 메틸화 부위를 포함하지 않는다.
제3 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 서식지의 하나 이상의 환경적 매개변수를 평가하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은
(a) 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
(b) (a)에서 결정된 메틸화 상태로부터 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 시험 메틸화 프로파일을 결정하는 단계; 및
(c) (b)에서 결정된 시험 메틸화 프로파일을 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일은 각각이 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 동일한 생물학적 분류군 (바람직하게, 종)의 개별 대상체 또는 대상체의 개별 그룹에 특이적이고, 각각이 별개의 지리적 기원으로부터 수득되었고, 별개의 지리적 기원은 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해 다른 별개의 지리적 기원과 구별되는 것인 단계
를 포함하고,
시험 메틸화 프로파일이 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일 중 하나와 유의하게 유사하면, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일 중 하나의 대상체 또는 대상체 그룹의 지리적 기원과 유사하거나, 또는 바람직하게 동일한, 환경적 매개변수를 갖는 지리적 기원으로부터 유래된다.
게놈 재료를 함유하는 생물학적 샘플은 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
또한, 본 발명의 이러한 양태 경우에, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 DNA 게놈 및 DNA 게놈 메틸화를 갖는 임의의 생물학적 독립체일 수 있다. 바람직하게 메틸화 부위는 CpG 부위이다. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 원핵생물 또는 진핵생물, 예컨대 단세포 또는 다세포 식물, 진균 또는 동물로부터 선택될 수 있다. (b)에서 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 조직 특이적 유전자 발현과 연관된 메틸화 부위일 수 있다. 바람직하게, 사전-선택된 메틸화 부위는 하나의 별개 조직의 유전자 발현과 연관된다. 적합한 조직은 본 발명의 제1 양태에 대해 상기 정의된 바와 같다.
개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 식물 또는 동물일 수 있고, 바람직하게 동물, 예컨대 무척추동물 예컨대 게이다. 대안적으로, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 척추동물 예컨대 새 또는 포유동물일 수 있고; 바람직하게 닭, 새우 또는 가재이다.
별개의 지리적 기원은 서식지 (농업 환경 예컨대 사육 농장 포함)로 간주되는 지리적 장소일 수 있고, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹이 산란되었고/되었거나 사육되었거나, 또는 적어도 그들 생애 동안 상당한 시간 동안 사육되었다.
바람직하게, 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈의 20%의 대부분의 차별적으로 메틸화된 유전자 내에 있다.
본 발명의 제3 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 마블 가재이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적 별개의 물로서, 바람직하게 호수(들), 강(들) 및 양식장으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 지리적 별개의 물은 pH, 물 경도, 망간 함량, 철 함량, 및 알루미늄 함량으로부터 선택되는 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해서 다른 수역과 별개로 간주될 수 있다.
마블 가재에 대해 상기 언급된 방법은 유리하게 게놈 와이드 메틸화 분석 또는 메틸화 부위의 사전-선택된 패널의 메틸화 분석을 포함한다. 메틸화 부위의 이들 사전-선택된 패널은 바람직하게 약 500 내지 1000 유전자, 및 바람직하게 약 700 유전자 내에 메틸화 부위를 함유한다. 표 2에 따른 유전자 또는 유전자 영역이 특히 바람직하다.
본 발명의 제1 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 닭이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적으로 별개의 닭 농장이다. 이들 지리적으로 별개의 닭 농장은 하나 이상의 환경적 매개변수, 예컨대, 사료 매개변수 또는 공기 매개변수 (예를 들어, 온도, 습도, 환기)에 의해서 다른 닭 농장과 별개로 간주될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 제3 양태에 따른 방법에서 메틸화 부위의 패널은 일관적으로 메틸화되거나 또는 비메틸화된 메틸화 부위를 포함하지 않는다.
제4 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 추정 지리적 기원을 확정하거나 또는 거부하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈 재료로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일을 각각의 별개의 지리적 기원에 특이적인 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계를 포함한다.
게놈 재료를 함유하는 생물학적 샘플은 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
또한, 본 발명의 이러한 양태 경우에, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 DNA 게놈 및 DNA 게놈 메틸화를 갖는 임의의 생물학적 독립체일 수 있다. 바람직하게 메틸화 부위는 CpG 부위이다. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 원핵생물 또는 진핵생물, 예컨대 단세포 또는 다세포 식물, 진균 또는 동물로부터 선택될 수 있다. (b)에서 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 조직 특이적 유전자 발현과 연관된 메틸화 부위일 수 있다. 바람직하게, 사전-선택된 메틸화 부위는 하나의 별개 조직의 유전자 발현과 연관된다. 적합한 조직은 본 발명의 제1 양태에 대해 상기 정의된 바와 같다.
개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 식물 또는 동물일 수 있고, 바람직하게 동물, 예컨대 무척추동물 예컨대 게이다. 대안적으로, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 척추동물 예컨대 새 또는 포유동물일 수 있고, 바람직하게 닭, 새우 또는 가재이다.
별개의 지리적 기원은 서식지 (농업 환경 예컨대 사육 농장 포함)로 간주되는 지리적 장소일 수 있고, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹이 산란되었고/되었거나 사육되었거나, 또는 적어도 그들 생애 동안 상당한 시간 동안 사육되었다.
바람직하게, 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈의 20%의 대부분의 차별적으로 메틸화된 유전자 내에 있다.
본 발명의 제4 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 마블 가재이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적 별개의 물로서, 바람직하게 호수(들), 강(들) 및 양식장으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 지리적 별개의 물은 pH, 물 경도, 망간 함량, 철 함량, 및 알루미늄 함량으로부터 선택되는 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해 다른 수역과 별개로 간주될 수 있다.
마블 가재에 대해 상기 언급된 방법은 유리하게 게놈 와이드 메틸화 분석 또는 메틸화 부위의 사전-선택된 패널의 메틸화 분석을 포함한다. 메틸화 부위의 이들 사전-선택된 패널은 바람직하게 약 500 내지 1000 유전자, 및 바람직하게 약 700 유전자 내에 메틸화 부위를 함유한다. 표 2에 따른 유전자 또는 유전자 영역이 특히 바람직하다.
본 발명의 제1 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 닭이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적으로 별개의 닭 농장이다. 이들 지리적으로 별개의 닭 농장은 하나 이상의 환경적 매개변수, 예컨대, 사료 매개변수 또는 공기 매개변수 (예를 들어, 온도, 습도, 환기)에 의해서 다른 닭 농장과 별개로 간주될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 제4 양태에 따른 방법에서 메틸화 부위의 패널은 일관적으로 메틸화되거나 또는 비메틸화된 메틸화 부위를 포함하지 않는다.
제5 양태에서, 본 발명은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 추정 지리적 기원을 확정하기 위한 시험 시스템을 개발하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은
a. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득되는 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
b. 하나 이상의 메틸화 부위로부터 각각의 기지의 지리적 기원에 대한 특이적이고 별개인 차별적 메틸화 프로파일을 특징으로 하는 기준 메틸화 부위의 패널을 선택하는 단계;
c. 각각의 기지의 지리적 기원 (또는 장소)에 대해 기준 메틸화 프로파일을 지정하여 시험 시스템을 수득하는 단계
를 포함하고,
시험 샘플로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일과 (c)에서 수득된 기준 메틸화 프로파일의 비교는 시험 샘플이 수득된 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 추정 지리적 기원의 확정을 허용한다.
게놈 재료를 함유하는 생물학적 샘플은 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
또한, 본 발명의 이러한 양태 경우에, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 DNA 게놈 및 DNA 게놈 메틸화를 갖는 임의의 생물학적 독립체일 수 있다. 바람직하게 메틸화 부위는 CpG 부위이다. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 원핵생물 또는 진핵생물, 예컨대 단세포 또는 다세포 식물, 진균 또는 동물로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 조직 특이적 유전자 발현과 연관된 메틸화 부위일 수 있다. 바람직하게, 사전-선택된 메틸화 부위는 하나의 별개 조직의 유전자 발현과 연관된다. 적합한 조직은 본 발명의 제1 양태에 대해 상기 정의된 바와 같다.
개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 바람직하게 동물, 예컨대 무척추동물 예컨대 게이다. 대안적으로, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 척추동물 예컨대 새 또는 포유동물일 수 있고, 바람직하게 닭, 새우 또는 가재이다.
별개의 지리적 기원은 서식지 (농업 환경 예컨대 사육 농장 포함)로 간주되는 지리적 장소일 수 있고, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹이 산란되었고/되었거나 사육되었거나, 또는 적어도 그들 생애 동안 상당한 시간 동안 사육 되었다.
바람직하게, 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈의 20%의 대부분의 차별적으로 메틸화된 유전자 내에 있다.
본 발명의 제2 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 마블 가재이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적 별개의 물로서, 바람직하게 호수(들), 강(들) 및 양식장으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 지리적 별개의 물은 pH, 물 경도, 망간 함량, 철 함량, 및 알루미늄 함량으로부터 선택되는 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해서 다른 수역과 별개로 간주될 수 있다.
마블 가재에 대해 상기 언급된 방법은 유리하게 게놈 와이드 메틸화 분석 또는 메틸화 부위의 사전-선택된 패널의 메틸화 분석을 포함한다. 메틸화 부위의 이들 사전-선택된 패널은 바람직하게 약 500 내지 1000 유전자, 및 바람직하게 약 700 유전자 내에 메틸화 부위를 함유한다. 표 2에 따른 유전자 또는 유전자 영역이 특히 바람직하다.
본 발명의 제1 양태의 특정 예에서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 닭이다. 여기서, 별개의 지리적 기원은 지리적으로 별개의 닭 농장이다. 이들 지리적으로 별개의 닭 농장은 하나 이상의 환경적 매개변수, 예컨대, 사료 매개변수 또는 공기 매개변수 (예를 들어, 온도, 습도, 환기)에 의해서 다른 닭 농장과 별개로 간주될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 제5 양태에 따른 방법에서 메틸화 부위의 패널은 일관적으로 메틸화되거나 또는 비메틸화된 메틸화 부위를 포함하지 않는다.
도면 의 간단한 설명
도 1은 4개의 마블 가재 개체군 서식지의 특정 물 매개변수를 도시한다.
도 2는 마블 가재 개체군에서 상황-특이적 차별적 메틸화를 도시한다. (A) 조직-특이적 메틸화 차이를 갖는 56개 유전자의 메틸화 수준을 기반으로, 싱글리스로부터의 복근 (mus., 정사각형 기호) 및 간췌장 (hep., 원형 기호) 샘플의 주요 성분 분석. (B) 조직-특이적 메틸화 차이를 갖는 35개 유전자의 메틸화 수준을 기반으로, 레일링겐으로부터의 복근 (mus., 정사각형 기호) 및 간췌장 (hep., 원형 기호) 샘플의 주요 성분 분석. (C) 장소-특이적 메틸화 차이를 갖는 122개 유전자의 메틸화 수준을 기반으로, 모든 장소로부터의 간췌장 샘플의 주요 성분 분석. (D) 장소-특이적 메틸화 차이를 갖는 22개 유전자의 메틸화 수준을 기반으로, 모든 장소로부터의 복근 샘플의 주요 성분 분석.
도 3은 마블 가재에서 상황-의존적 차별적 메틸화의 검증을 도시한다. 4개의 상이한 게놈 영역에 대한, 캡처-기반 시퀀싱 및 앰플리콘 시퀀싱에 의한 상응하는 검증 실험에 대한 결과가 도시된다. 비충전형: 복근; 충전형: 간췌장; 사각형: 레일링겐; 별표: 싱글리스; 원형: 안드라그나로아; 삼각형: 이오시.
도 4는 RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing) 데이터 상에서 R 패키지 MethylKit의 "calculate DiffMeth" 기능을 사용한 닭에서 차별적 메틸화 CpG 부위의 결과이다. 확인된 차별적 메틸화 CpG 부위는 주요 성분 분석에서 3개 장소의 강력한 분리를 허용하였다. SNP에 대한 필터링 후: 230만 - 360만 CpG 부위. 모든 샘플에서 최소 커버리지 10을 갖는 CpG 부위: 623,657, 차별적 메틸화 CpGs:1274 (p-값 <0.05).
도 5는 RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing) 데이터 상에서 R 패키지 MethylKit의 "calculate DiffMeth" 기능을 사용한 소호 연어에서 차별적 메틸화 CpG 부위의 결과이다. 확인된 차별적 메틸화 CpG 부위는 주요 성분 분석에서 2개 장소의 강력한 분리를 허용하였다. SNP 필터링 후 모든 샘플에서 최소 커버리지 10을 갖는 CpG 부위: 610,397, 유의한 DMR: 440 (p-값 <0.05, 메틸화 차이 >=10%).
실시예
본 발명의 일정 양태 및 구현예를 이제 실시예를 통해서, 본 명세서에 기재된 설명, 도면 및 표를 참조하여 예시할 것이다. 본 발명의 방법, 용도 및 다른 양태의 이러한 실시예는 단지 대표적인 것이며, 이러한 대표적인 실시예에만 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주해서는 안된다.
실시예 1
4개의 독립적 마블 가재 개체군의 서식지 프로파일
마블 가재에서 상황-의존적 DNA 메틸화의 가능성을 조사하기 위해서, 4종의 다양한 안정한 개체군으로부터의 동물을 수집하였다. 레일링겐 (독일)은 환경 보호 지역의 작은 부영양호로서, 표식지에 해당된다. 싱글리스 (독일) 개체군은 이전 갈탄 광산 지역의 보다 큰 빈영양호 유래이다. 안드라그나로아 (마다가스카르) 개체군은 산 연수가 존재하는 비교적 높은 고도 (1156 m)의 산림 지대를 통해 흐르는 강에 위치한다. 마지막으로, 이오시 (마다가스카르) 개체군은 인근 채굴 활동으로 오염 수준이 높은, 매우 탁한 물에서 발견된다. 물리-화학적 물 매개변수의 분석은 레일링겐에서 깨끗하고, 약간 염기성 (pH 8.4)인 물, 및 싱글리스에서 고수준의 망간 (4792 μg/l)이 존재하는 다소 산성 (pH 5.2)인 물을 나타냈다. 안드라그나로아의 물은 특히 낮은 경도 (0.3 °dH)를 보인 반면, 이오시의 물은 높은 수준의 알루미늄 (2967 μg/l) 및 철 (2249 μg/l)을 특징으로 하였다. 전체적으로, 따라서, 우리 연구는 상이한 기후대 및 상이한 물 매개변수를 갖는 4개의 다양한 서식지에 서식하는 개체군을 포괄하였다. 이들 결과는 도 1에 표시된다.
표 1: 분석된 마블 가재 개체군의 개요.
실시예 2
가변적으로 메틸화된 유전자 세트의 확인
마블 가재에서 DNA 메틸화는 상대적으로 안정하고 대체로 조직-불변인, 유전자체를 표적으로 한다는 것이 이전에 확인되었다 (Gatzmann et al., 2018). 그러나, 상이한 동물, 상이한 조직 및 상이한 발생 단계로부터 8개의 전체-게놈 바이술파이트 시퀀싱 데이터세트의 비교는 보다 가변적인 메틸화 수준을 나타낸 더 작은 유전자 그룹에 대한 가능성을 나타냈다 (Gatzmann et al., 2018). 이것은 메틸화 분산의 체계적 분석을 통해서 확정되었다. >0.006의 분산 컷오프는 846개 유전자를 확인하였고, 이들 중에서 149개는 일관적으로 메틸화되었거나 또는 비메틸화되었고 (각각 평균 비율 >0.8 또는 <0.2), 추가 분석에서 배제되어서, 697개의 가변적으로 메틸화된 유전자의 핵심 세트로 한정되었다. 이들 유전자의 메틸화 수준을 기반으로 하는 메트릭 다차원 분석은 간췌장 샘플을 복근 샘플로부터 분리시켰고, 이것은 이전에 인식되지 않은 조직-특이적 메틸화 패턴의 존재를 시사하였다.
더 많은 수의 샘플에서 더 높은 커버리지 메틸화로 이들 유전자의 메틸화 패턴을 분석하기 위해서, 비드-기반 캡처 어세이를 개발하였다. 이러한 어세이 경우에, 2종의 상이한 조직으로부터의 DNA 샘플을 제조하였다: 가재의 주요 대사 기관에 해당하는 간췌장, 및 복부 꼬리를 형성하는 주요 근육 조직인 복근. 간췌장 DNA는 N=47 동물 (장소 당 11-12마리)로부터 제조되었고, 한편 복근 DNA는 동일 동물의 서브세트 (N=26, 장소 당 12-4마리)로부터 제조되었다. 서브게놈 캡처는 효율적이고 특이적인 것으로 확인되었고, 엄격 조건 하에서 샘플 당 최소 천만개의 맵핑된 판독치를 제공한다.
후속 단계에서, 그들 서열에 50% 초과의 N을 갖는 유전자를 배제하여, 우리 분석에 623개 유전자가 남았다. 또한, 시퀀싱 커버리지가 ≥5x인 모든 샘플에 존재하는 CpG 부위만을 고려하였고, 평균 메틸화 수준은 유전자가 ≥5의 적격한 CpG 부위를 갖는 경우에만 계산되었다. 이들 기준은 463개 유전자 경우에 충족되었다. 본 발명자들은 또한 불변 유전자, 즉 메틸화 분산의 경우 하위 10%에 존재한 유전자를 비롯하여 평균 메틸화 수준이 <0.1 또는 >0.9인 유전자를 배제하여, 361개의 가변적으로 메틸화된 유전자의 핵산 세트가 생성되었다 (표 2).
표 2: 마블 가재에서 메틸화 마커로서 적합한 게놈 영역
중요하게, 유전자 온톨로지 분석이 가변적으로 메틸화된 유전자의 우리 세트 배후의 기본 기전을 더욱 잘 이해하기 위해 수행되었다. GTP-결합 단백질 (G 단백질이라고도 함)과 관련된 기능적 특징을 갖는 유전자에 대한 상당한 농축이 관찰되었다. 다양한 세포 활성을 조절하는 G 단백질 중에서, 우리는 전사/번역 조절, 스트레스에 대한 반응, RNA 대사, 및 병원체에 대한 면역 반응에서 역할을 하는 가변적으로 메틸화된 유전자를 검출하였다. 함께, 321개의 가변적으로 메틸화된 유전자 내에서 관찰된 기능적 불균질성은 잠재적으로 상이한 환경 압력 하에서 사는 마블 가재에 대해 가소성을 부여할 수 있었다.
실시예 3
마블 가재 개체군에서 상황-의존적 메틸화 패턴
추가 단계에서, 우리는 우리의 361개의 가변적으로 메틸화된 유전자의 핵심 세트에서 특이적 상황-의존적 메틸화 패턴을 확인하고자 하였다. 조직-특이적 메틸화 차이를 확인하기 위해서, 우리는 간췌장 및 복근간 차별적 (Benjamini-Hochberg 보정 이후 p<0.05) 메틸화에 대해 Wilcoxon 순위 합계 검정을 적용하였다. 단일 장소 (싱글리스, N=24)로부터의 우리의 가장 큰 데이터세트 경우에, 이것은 주요 성분 분석에서 2개 조직의 강력한 분리를 허용한 56개 유전자를 확인하였다. 두번째로 큰 데이터세트 (레일링겐, N=19)에 동일한 접근법을 적용했을 때, 주요 성분 분석에서 2개 조직의 강력한 분리를 다시 허용한 35개의 차별적 메틸화 유전자 (싱글리스와 28개 중복)를 확인하였다. 조직-특이적 메틸화 차이는 평균 유전자 메틸화 수준에 대해 다소 적당한 것으로 보였지만, CpG 수준에서 훨씨 더 현저하였다. 특히, 조직-특이적 메틸화 차이는 상이한 개체군 간에 매우 안정하였다. 종합하면, 이들 발견은 마블 가재에서 국재화된 조직-특이적 메틸화 패턴의 존재를 시사한다.
장소-특이적 메틸화 차이를 확인하기 위해서, 우리는 4개 장소 간 차별적 (Benjamini-Hochberg 보정 후 p<0.05) 메틸화에 대해 Kruskal-Wallis 검정을 적용하였다. 더 큰 간췌장 데이터세트 (N=47) 경우에, 이것은 주요 성분 분석에서 4개 장소의 강력한 분리를 허용한 122개 유전자를 확인하였다. 동일한 접근법이 더 작은 복근 데이터세트 (N=26)에 적용되었을 때, 주요 성분 분석에서 4개 장소의 강력한 분리를 역시 허용한 22개의 차별적 메틸화 유전자 (간췌장과 21개 중복)를 확인하였다. 조직-특이적 메틸화에 대한 우리의 발견과 유사하게, 장소-특이적 메틸화 차이는 평균 유전자 메틸화 수준에 대해 적당한 것으로 보였지만, CpG 수준에서 보다 더 현저하였다. 또한, 장소-특이적 메틸화 차이는 상이한 장소 간에 매우 안정하였다. 이들 발견은 마블 가재 개체군 간에 한정된 장소-특이적 메틸화 차이의 존재를 시사한다.
실시예 4
상황 의존적 메틸화 패턴의 검증
조직-특이적 및 장소-특이적 메틸화 패턴에 대한 결과를 검증하기 위해서, 샘플의 분리를 야기하는, 확인된 유전자 내 차별적 메틸화 영역 (DMR)을 기반으로 하는 마커가 디자인되었다. 조직-특이적 마커 (n=2) 및 장소-특이적 마커 (n=2)는 동일한 2종 조직 (간췌장 및 복근) 및 동일한 4개 장소 (레일링겐, 싱글리스, 안드라그나로아 및 이오시)로부터의 샘플과, 제1 샘플 채취 이후 1년 내지 2년에 수집된 새로운 샘플에서 시험되었다. 샘플은 PCR 기반 앰플리콘 심층 시퀀싱으로 분석되었다. 결과는 캡처 기반 서브게놈 시퀀싱으로부터의 발견을 확정하였다. 선택된 마커를 사용하여, CpG 당 평균 메틸화 비율을 기반으로, 조직을 비롯하여 장소 간 분리가 가능하였다. 시퀀싱된 앰플리콘에 대한 평균 CpG 비율은 추가적으로 비드-기반 캡처 결과의 평균 CpG 비율과 비슷하였다. 특히, 이것은 또한 장소-특이적 메틸화가 마블 가재 개체군 중에서 시간 경과에 따라 안정한 것으로 확정되어서, 개체군의 기원을 확인하고 그들에 대한 지문으로서 메틸화 패턴을 사용하기 위해 장소 특이적 마커를 한정하는 가능성을 제공한다. 이들 결과는 도 2 및 3에 도시된다.
재료 및 방법
비드-기반 캡처 어세이를 위한 샘플 채취는 레일링겐 경우 2017년 8월, 싱글리스 경우 2017년 10월, 및 [Adriantsoa et al., 2019]에 언급된 바와 같이, 마다가스카르에서 2017년 10월부터 2018년 3월에 수행되었다. 검증 실험을 위한 샘플 채취는 독일 및 마다가스카르에서 2019년 3월부터 5월까지 수행되었다. 샘플은 100% 에탄올에 보존하였고 DNA를 추출하기까지 -80℃에 저장하였다.
게놈 DNA는 Tissue Ruptor (Qiagen)를 사용해 복근 및 간췌장 조직으로부터 단리 및 정제한 다음에, 프로테이나제 K 분해 및 이소프로판올 침전을 후속하였다. 단리된 게놈 DNA의 품질은 2200 TapeStation (Agilent)에서 평가하였다.
라이브러리 제조는 [SureSelectXT Methyl-Seq Target Enrichment System for Illumina Multiplexed Sequencing Protocol, Version D0, July 2015]에 기술된 대로 수행하였다. 품질 관리를 수행하였고, 샘플 농도는 2200 TapeStation (Agilent)에서 측정하였다. 다중화된 샘플은 HiSeqX ten system (Illumina)에서 시퀀싱하였다.
판독치 쌍은 BSMAP (Xi and Li, 2009)를 사용한 전체-게놈 바이술파이트 시퀀싱 데이터세트 (Gatzmann et al., 2018)에서 가변적 메틸화를 보인 697개 유전자에 대해 품질 트리밍 및 맵핑되었다. 후속하여, 각각의 CpG 부위에 대한 메틸화 비율은 BSMAP에서 제공하는 Python을 사용해 계산되었다. ≥5x의 커버리지로 모든 샘플에 존재한 CpG 부위만을 추가 분석에 고려하였다. 각 유전자에 대한 평균 메틸화 수준은 유전자가 ≥5x 커버리지로 적어도 5 CpG 부위를 갖는 경우에만 계산하였다. 또한, 하기 기준에 따른 유전자는 후속 분석에서 배제하였다: i) 메틸화 분산 측면에서 하위 10%에 있는 유전자, ii) < 0.1 또는 > 0.9의 평균 메틸화 수준의 유전자, 및 ii) 그들 서열에 50% 초과의 N을 갖는 유전자.
조직-특이적 메틸화 차이를 확인하기 위해서, Wilcoxon 순위 합계 검정을 적용하였고 (싱글리스 및 레일링겐 유래 간췌장 대 복근 샘플), p-값은 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 검정을 위해 보정되었다. 유사하게, 장소-특이적 메틸화 차이를 확인하기 위해서, Kuskal-Wallis 검정을 사용하였고, p-값은 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 검정을 위해 보정되었다. 추가로, dmrseq (Korthauer et al., 2018)를 사용해 각각의 유전자 세트 내 조직-특이적 및 장소-특이적 차별적 메틸화 영역을 확인하였다.
게놈 DNA는 제조사 설명서에 따라서 EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research)를 사용해 바이술파이트 전환하였다. 표적 영역은 영역-특이적 프라이머 (표 3)를 사용해 PCR 증폭되었다. PCR 생성물은 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen)를 사용해 겔-정제되었다. 후속하여, 샘플은 Nextera XT index Kit v2 Set A (Illumina)를 사용해 색인을 만들었다. 풀링된 라이브러리는 페어드-엔드 150 bp 나노 프로토콜을 사용해 MiSeqV2 시스템에서 시퀀싱되었다. 시퀀싱 데이터는 BisAMP (BisAMP: A web-based pipeline for targeted RNA cytosine-5 methylation analysis, Bormann F, Tuorto F, Cirzi C, Lyko F, Legrand C.Methods. 2019 Mar 1;156:121-127)를 사용해 분석되었다.
표 3: 검증용
프라이머
실시예
5
닭에서 차별적 메틸화된 CpG 부위의 확인
닭에서 차별적 메틸화된 CpG 부위를 확인하기 위해서, R 패키지 MethylKit의 "calculate DiffMeth" 기능이 RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing) 데이터에 대해 사용되었다. 1274개의 차별적 메틸화된 CpG를 확인하였다 (p-값 < 0.05). 이러한 분석 전에, 데이터는 SNP에 대해 필터링되었고, CpG 부위 당 최소 10의 커버리지 컷오프가 적용되었다. 확인된 차별적 메틸화된 CpG 부위는 도 4에 도시된 바와 같은 주요 성분 분석에서 3개 장소의 강력한 분리를 허용하였다.
재료 및 방법
유방 근육 조직으로부터 단리 및 정제된 게놈 DNA는 각각의 샘플 공급원 국가의 다양한 서비스 실험실에서 제공되었다. 품질은 2200 TapeStation (Agilent)을 사용해 검토하였다.
RRBS 라이브러리 제조는 [Zymo-Seq RRBS™ Library Kit Instruction Manual Ver. 1.0.0]에 기술된 대로 수행되었다. 품질 관리를 수행하였고, 샘플 농도는 2200 TapeStation (Agilent)에서 측정되었다. 다중화 샘플은 HiSeq 4000 시스템 (Illumina)에서 시퀀싱되었다.
판독치는 trimmomatic 버전 0.38을 사용해 품질 트리밍하였고 갈루스 갈루스 (Gallus gallus) 게놈 어셈블리 버전 5.0에 대해서 BSMAP 2.90으로 맵핑하였다. 메틸화 비율은 BSMAP 패키지와 배포하는 python script (methratio.py)를 사용해 계산되었다. 성 염색체와 연관된 모든 CpG 부위 및 갈루스 갈루스 게놈에 대한 SNP와 중복된 CpG 부위는 추가 분석에서 필터링하였다. 차별적 메틸화 분석은 R 패키지 MethylKit (Akalin et al. (2012), Genome Biology, 13(10), R87)를 사용해 수행되었다.
실시예 6
코호 연어에서 차별적 메틸화된 CpG 부위의 확인
코호 연어의 RRBS 데이터에서 차별적 메틸화된 영역을 확인하기 위해서, R 패키지 MethylKit의 "calculate DiffMeth" 기능을 사용하였다. 440개의 차별적 메틸화된 영역을 확인하였다 (p-값 < 0.05, 메틸화 편차 >= 10%). 이러한 분석 전에, 데이터는 SNP에 대해 필터링되었고 CpG 부위 당 최소 10의 커버리지 컷오프를 적용하였다. 확인된 차별적 메틸화된 영역은 도 5에 도시된 바와 같이 주요 성분 분석에서 2개 장소의 강력한 분리를 허용하였다.
재료 및 방법
[Le Luyer et al., 2017]가 공개한 RRBS 데이터는 National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive에서 다운로드하였다. 판독치는 BSMAP 2.90로 Okis_V2 (GCF_002021735.2)에 대해 맵핑하였고 메틸화 비율은 BSMAP 패키지에서 배포하는 python script (methratio.py)를 사용해 결정되었다. SNP와 중복된 모든 CpG 부피는 추가 분석에서 필터링되었다. 공변량으로서 번식 환경 및 성별을 사용한, 차별적 메틸화 분석은 R 패키지 MethylKit (Akalin et al. (2012), Genome Biology, 13(10), R87)를 사용해 수행되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Evonik Operations GmbH, Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Oeffentlichen Rechts
<120> DNA-METHYLATION-BASED QUALITY CONTROL OF THE ORIGIN OF REARING
STOCK
<130> 201900368
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 1
ttataatata ttaatggttt tgatga 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 2
cacaaaaaac aaaaactaca aactc 25
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 3
attatattta tattggatgg atttaattta 30
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 4
aaacaaacat cttatacaat tcttctc 27
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 5
gggtagatag aattattttt ttt 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 6
tttcctaaaa accacattaa aacac 25
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 7
tggagataag ttagtttaat taggttatat 30
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 8
aatcatctta aaaattcaaa aaaaa 25
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 9
gaattatttt atttgtgata tttttttaat 30
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 10
attaatccac ataatatttc accac 25
Claims (17)
- 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 지리적 기원의 확인을 위한 방법으로서, 방법은
- 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈 재료로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일을 각각이 별개의 지리적 기원에 특이적인 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계
를 포함하는 것인 확인 방법. - 제1항에 있어서,
a. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
b. (a)에서 결정된 메틸화 상태로부터, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 시험 메틸화 프로파일을 결정하는 단계; 및
c. (b)에서 결정된 시험 메틸화 프로파일을 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일의 각각은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 동일한 생물학적 분류군의 대상체 또는 대상체 그룹의 별개의 지리적 기원에 특이적인 것인 단계
를 포함하고,
시험 메틸화 프로파일이 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일 중 하나와 유의하게 유사하면, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일의 대상체 또는 대상체 그룹과 유사한 지리적 기원을 갖는 것인 확인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 DNA 게놈 및 DNA 게놈 메틸화를 갖는 임의의 생물학적 독립체이고, 바람직하게 메틸화 부위는 CpG 부위인 확인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 원핵생물 또는 진핵생물로부터 선택되는 것인 확인 방법.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, (a)에서 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 조직 특이적 유전자 발현과 연관된 메틸화 부위이고, 바람직하게 사전-선택된 메틸화 부위는 하나의 별개 조직의 유전자 발현과 연관된 것인 확인 방법.
- 제5항에 있어서, 조직은
(i) 대사 조직으로서, 바람직하게 내장 조직,
(ii) 근육 조직,
(iii) 피부 또는 깃털 조직, 및
(iv) 기관 조직으로서, 바람직하게 간 및/또는 췌장 조직인 상기 기관 조직
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 확인 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 동물인 확인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 별개의 지리적 기원은 서식지로 간주되는 지리적 장소로서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹이 산란되었고/되었거나 사육되었거나, 또는 적어도 그들 생애 동안 상당한 시간 동안 사육된 것인 확인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위는 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈의 20%의 대부분의 차별적으로 메틸화된 유전자 내에 있는 것인 확인 방법.
- 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 의심되는 지리적 기원을 품질 관리하기 위한 방법으로서, 방법은
a. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
b. (a)에서 결정된 메틸화 상태로부터 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 시험 메틸화 프로파일을 결정하는 단계; 및
c. (b)에서 결정된 시험 메틸화 프로파일을 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계로서, 사전결정된 기준 메틸화 프로파일은 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 동일한 생물학적 분류군의 개별 대상체 또는 대상체의 개별 그룹에 대해 특이적이고, 의심되는 지리적 기원으로부터 수득된 것인 단계
를 포함하고,
시험 메틸화 프로파일이 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 유의하게 유사하면, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 품질 관리를 통과하고 의심되는 지리적 기원은 진정한 지리적 기원으로서 표시되는 것인 품질 관리 방법. - 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 서식지의 하나 이상의 환경적 매개변수를 평가하기 위한 방법으로서, 방법은
a. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 사전-선택된 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
b. (a)에서 결정된 메틸화 상태로부터 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 시험 메틸화 프로파일을 결정하는 단계; 및
c. (b)에서 결정된 시험 메틸화 프로파일을 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일은 각각이 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 동일한 생물학적 분류군의 개별 대상체 또는 대상체의 개별 그룹에 특이적이고, 각각이 별개의 지리적 기원으로부터 수득되었고, 별개의 지리적 기원은 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해 다른 별개의 지리적 기원과 구별되는 것인 단계
를 포함하고,
시험 메틸화 프로파일이 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일 중 하나와 유의하게 유사하면, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일 중 하나의 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 지리적 기원과 유사하거나, 또는 바람직하게 동등한 환경적 매개변수를 갖는 지리적 기원으로부터 유래되는 것인 평가 방법. - 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 추정 지리적 기원을 확정하거나 또는 거부하기 위한 방법으로서, 방법은
- 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 게놈 재료로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일을 각각이 별개의 지리적 기원에 특이적인 하나 이상의 사전결정된 기준 메틸화 프로파일과 비교하는 단계
를 포함하는 것인 확정 또는 거부 방법. - 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 추정 지리적 기원을 확정하기 위한 시험 시스템을 개발하기 위한 방법으로서, 방법은
a. 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹으로부터 수득된 생물학적 샘플에 함유된 게놈 재료 내 하나 이상의 메틸화 부위의 메틸화 상태를 결정하는 단계;
b. 하나 이상의 메틸화 부위로부터 기지의 지리적 기원의 각각에 대한 특이적인 별개의 차별적 메틸화 프로파일을 특징으로 하는 메틸화 부위의 기준 패널을 선택하는 단계;
c. 기지의 지리적 기원의 각각에 대해 기준 메틸화 프로파일을 지정하여 시험 시스템을 수득하는 단계
를 포함하고,
시험 샘플로부터 수득된 시험 메틸화 프로파일과 (c)에서 수득된 기준 메틸화 프로파일의 비교는 시험 샘플이 수득된 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹의 추정 지리적 기원의 확정을 허용하는 것인 개발 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 개별 시험 대상체 또는 시험 대상체의 개별 그룹은 마블 가재이고/이거나, 별개의 지리적 기원은 지리적 별개의 물이고, 이들 물은 바람직하게 호수(들), 강(들) 및 양식장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 지리적 별개의 물은 pH, 물 경도, 망간 함량, 철 함량, 및 알루미늄 함량으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환경적 매개변수에 의해서 구별되는 것인 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 방법은 게놈 와이드 메틸화 분석 또는 메틸화 부위의 사전-선택된 패널의 메틸화 분석을 포함하고, 메틸화 부위의 사전-선택된 패널은 바람직하게 약 500 내지 1000 유전자, 및 바람직하게 약 700 유전자 내에 메틸화 부위를 함유하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 메틸화 부위의 패널은 일관적으로 메틸화되거나 또는 비메틸화된 메틸화 부위를 포함하지 않는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20188761 | 2020-07-30 | ||
| EP20188761.9 | 2020-07-30 | ||
| PCT/EP2021/070683 WO2022023208A1 (en) | 2020-07-30 | 2021-07-23 | Dna-methylation-based quality control of the origin of organisms |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230043917A true KR20230043917A (ko) | 2023-03-31 |
Family
ID=71894752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237006113A KR20230043917A (ko) | 2020-07-30 | 2021-07-23 | 유기체 기원의 dna-메틸화-기반 품질 관리 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230257829A1 (ko) |
| EP (1) | EP4189116A1 (ko) |
| JP (1) | JP2023536120A (ko) |
| KR (1) | KR20230043917A (ko) |
| CN (1) | CN116249789A (ko) |
| AR (1) | AR123067A1 (ko) |
| AU (1) | AU2021316473A1 (ko) |
| BR (1) | BR112023001688A2 (ko) |
| CA (1) | CA3186915A1 (ko) |
| CL (1) | CL2023000233A1 (ko) |
| MX (1) | MX2023001155A (ko) |
| TW (1) | TW202223100A (ko) |
| WO (1) | WO2022023208A1 (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024046838A1 (en) | 2022-09-01 | 2024-03-07 | Evonik Operations Gmbh | Multi-species chip to detect dna-methylation |
| WO2024046841A1 (en) * | 2022-09-01 | 2024-03-07 | Evonik Operations Gmbh | Identifying breeding conditions of livestock using epigenetics |
| WO2024046839A1 (en) | 2022-09-01 | 2024-03-07 | Evonik Operations Gmbh | Dna-methylation detection in animal-derived products |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040122857A1 (en) * | 2002-12-18 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Secondary structure defining database and methods for determining identity and geographic origin of an unknown bioagent in forensic studies thereby |
| US7658288B2 (en) | 2004-11-08 | 2010-02-09 | Applied Biosystems, Llc | Bisulfite conversion reagent |
| CN108319984B (zh) * | 2018-02-06 | 2019-07-02 | 北京林业大学 | 基于dna甲基化水平的木本植物叶片表型特征和光合特性预测模型的构建方法及预测方法 |
-
2021
- 2021-07-23 JP JP2023505929A patent/JP2023536120A/ja active Pending
- 2021-07-23 CN CN202180059780.5A patent/CN116249789A/zh active Pending
- 2021-07-23 MX MX2023001155A patent/MX2023001155A/es unknown
- 2021-07-23 WO PCT/EP2021/070683 patent/WO2022023208A1/en active Application Filing
- 2021-07-23 CA CA3186915A patent/CA3186915A1/en active Pending
- 2021-07-23 EP EP21749575.3A patent/EP4189116A1/en active Pending
- 2021-07-23 AU AU2021316473A patent/AU2021316473A1/en active Pending
- 2021-07-23 KR KR1020237006113A patent/KR20230043917A/ko unknown
- 2021-07-23 BR BR112023001688A patent/BR112023001688A2/pt unknown
- 2021-07-23 US US18/018,398 patent/US20230257829A1/en active Pending
- 2021-07-27 TW TW110127503A patent/TW202223100A/zh unknown
- 2021-07-28 AR ARP210102094A patent/AR123067A1/es unknown
-
2023
- 2023-01-25 CL CL2023000233A patent/CL2023000233A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116249789A (zh) | 2023-06-09 |
| AU2021316473A1 (en) | 2023-02-16 |
| EP4189116A1 (en) | 2023-06-07 |
| WO2022023208A1 (en) | 2022-02-03 |
| CA3186915A1 (en) | 2022-02-03 |
| TW202223100A (zh) | 2022-06-16 |
| AR123067A1 (es) | 2022-10-26 |
| MX2023001155A (es) | 2023-04-11 |
| US20230257829A1 (en) | 2023-08-17 |
| JP2023536120A (ja) | 2023-08-23 |
| CL2023000233A1 (es) | 2023-07-14 |
| BR112023001688A2 (pt) | 2023-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abdul-Muneer | Application of microsatellite markers in conservation genetics and fisheries management: recent advances in population structure analysis and conservation strategies | |
| KR20230043917A (ko) | 유기체 기원의 dna-메틸화-기반 품질 관리 | |
| Zagalska-Neubauer et al. | 454 sequencing reveals extreme complexity of the class II Major Histocompatibility Complex in the collared flycatcher | |
| Houston et al. | Development and validation of a high density SNP genotyping array for Atlantic salmon (Salmo salar) | |
| McManus et al. | Inference of gorilla demographic and selective history from whole-genome sequence data | |
| Konczal et al. | Accuracy of allele frequency estimation using pooled RNA‐Seq | |
| Mickett et al. | Assessing genetic diversity of domestic populations of channel catfish (Ictalurus punctatus) in Alabama using AFLP markers | |
| Herdegen et al. | Selective pressures on MHC class II genes in the guppy (Poecilia reticulata) as inferred by hierarchical analysis of population structure | |
| Zueva et al. | Genomic signatures of parasite-driven natural selection in north European Atlantic salmon (Salmo salar) | |
| Huang et al. | Genome-wide association study on chicken carcass traits using sequence data imputed from SNP array | |
| Aramburu et al. | Genomic signatures after five generations of intensive selective breeding: Runs of homozygosity and genetic diversity in representative domestic and wild populations of turbot (Scophthalmus maximus) | |
| Yetsko et al. | Mutational, transcriptional and viral shedding dynamics of the marine turtle fibropapillomatosis tumor epizootic | |
| Ricardo et al. | Mitochondrial DNA intra-individual variation in a bumblebee species: A challenge for evolutionary studies and molecular identification | |
| Abdul Muneer et al. | Comparative assessment of genetic variability in the populations of endemic and endangered Yellow Catfish, Horabagrus brachysoma (Teleostei: Horabagridae), based on allozyme, RAPD, and microsatellite markers | |
| CN105441536A (zh) | 用于区别牙鲆中的性别的snp标志物 | |
| Baillie et al. | Small-scale intraspecific patterns of adaptive immunogenetic polymorphisms and neutral variation in Lake Superior lake trout | |
| Agostini et al. | Putative selected markers in the Chionodraco genus detected by interspecific outlier tests | |
| Matallanas et al. | A genetic approach to Spanish populations of the threatened Austropotamobius italicus located at three different scenarios | |
| Timoshkina et al. | Molecular-genetic markers in studies of intra-and interspecies polymorphism in sturgeon (acipenseriformes) | |
| Prado et al. | How much epigenetics and quantitative trait loci (QTL) mapping tell us about parasitism maintenance and resistance/susceptibility to hosts | |
| Jiang et al. | The genetic diversity of wild and cultivated Manila clam (Ruditapes philippinarum) revealed by 29 novel microsatellite markers | |
| Smith et al. | A Chromosome-Scale Assembly of the En ormous (32 Gb) Axolotl Genome | |
| Liu | Genomic analysis of species identity and hybridization within a species complex of Salvelinus (Pisces: Salmonidae) in western North America | |
| De Cahsan et al. | Introgression of Austrian fire-bellied toads (Bombina bombina) into northern German populations confirmed by complete mitochondrial genomes and transcriptome-wide Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) | |
| Keinath | Characterization of a Large Vertebrate Genome and Homomorphic Sex Chromosomes in the Axolotl, Ambystoma mexicanum |