JP2023536120A - Ｄｎａ－メチル化に基づく、生物の起源の品質管理 - Google Patents

Ｄｎａ－メチル化に基づく、生物の起源の品質管理 Download PDF

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Abstract

本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノム材料から得られた試験メチル化プロファイルと、それぞれ明確な地理的起源に対して特異的である１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップを有する、個別の試験対象または個別の試験対象群の地理的起源を同定する方法に関する。

Description

本発明は、遺伝子の特異的なパネルが、生物の地理的起源に対して特異的であるＤＮＡメチル化プロファイルを生成するための原型を提供するという知見に基づく。特に、ＤＮＡメチル化プロファイリングは、カニ、魚またはニワトリのような家畜として公知の飼育動物を含む動物の遺伝的起源を同定するために使用することができる。本発明の方法は、飼育動物を含む生物の地理的起源を同定するため、飼育動物を含む生物のサンプルの想定された地理的起源を管理するため、および飼育動物を含む生物の生息域の環境パラメータを評価するために適用することができる。さらに、本発明は、飼育動物を含む多様な生物のための品質管理方法および新規試験システムを開発するためのプロセスを提供する。
発明の背景
持続可能な食料生産は、現在、世界的に最重要な社会的ニーズの１つであると考えられている。農業および水産養殖産業のバリューチェーンは、高度に複雑であるため、消費者との関係および消費者の信頼を強化するために、証明書が発行されている。しかしながら、証明書は、特定の農場での監査に基づいていて、家畜を非認証の農場から認証された農場に移動することにより容易に改竄することができてしまう。さらに、持続可能な農業慣行の監視はむらがあり、主に監査に限られる。この産業内で「悪い」農業慣行が蔓延しているため、耐改竄性の証明書が緊急に必要である。
家畜産業および食品加工産業は、食品安全の分野におけるリスクの同定、追跡および管理の戦略の開発、ならびに消費者情報（透明なバリューチェーン）のための戦略の開発に大きく関与してきた。健康、安全、および動物福祉の考慮は、品質保証監査および監視手順を効果的かつ確実に実施することができるように、動物製品の、特に肉製品の起源を追跡可能にすべきであることを必要としている。
ＤＮＡレベルでのメチル化および変異のゲノムワイドなパターンの比較は、後成的変異の極めて有意な割合は、サケにおける健康状態の差異および捕獲のような飼育条件と関連している可能性があることを明らかにした（Le Luyer J et al. 2017 PNAS vol 114, no 49）。
ミステリークレイフィッシュ（Procambarus virginalis）におけるゲノムワイドなメチル化の研究は、動物と組織との間で大部分のゲノムの安定したメチル化が観察されたが、約７００の遺伝子のサブセットは、これらのメチル化において極めて変異しやすいことを明らかにした（Gatzmann, F. DNA methylation in the marbled crayfish Procambarus virginalis. PhD thesis, Faculty of Biosciences, University of Heidelberg, 2018）。
上記のことを考慮して、生物、特に食品、より特別には飼育家畜に由来する動物材料の地理的起源を同定しかつ品質管理するための手段を提供することが緊急に必要である。
発明の概要
上述の課題は、本発明の多様な態様により解決される。本発明は、ストレス、気候、光または食餌のような環境暴露に対する回復力が生物学の基本的概念であり、かつ生物の環境への適応が生じるという知見に基づく。環境へ適応する能力および適応された生物学的パターンの維持は、ＤＮＡメチル化を含む後成的なメカニズムに依存する。
本発明者らは、意外にも、この特性が、ゲノム上の環境特異的な「後成的フィンガープリント」を同定し、生物をその起源に由来する生態系に整列させるために利用できることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明は、家畜として公知のような飼育動物を含む生物の地理的起源を同定する方法、飼育動物を含む生物のサンプルの想定された地理的起源を管理する方法、および飼育動物を含む生物の生息域の環境パラメータを評価する方法を提供することである。さらに、本発明は、飼育動物を含む多様な生物のための品質管理方法および新規試験システムを開発するためのプロセスを提供する。
一般的にかつ簡単な説明により、本発明の主要な態様は、以下のように説明することができる。
第１の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の地理的起源を同定する方法であって、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノム材料から得られた試験メチル化プロファイルと、それぞれ明確な地理的起源に対して特異的である１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップを有する、方法に関する。
第２の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の疑わしい地理的起源を品質管理する方法であって、
ａ． 個別の試験対象または個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上の事前に選択されたメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
ｂ． （ａ）で決定されたメチル化状態から、個別の試験対象または個別の試験対象群の試験メチル化プロファイルを決定するステップと、
ｃ． （ｂ）で決定された試験メチル化プロファイルと、所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップであって、所定の参照メチル化プロファイルは、個別の試験対象または個別の試験対象群の同じ生物学的分類群（好ましくは種）の、疑わしい地理的起源から得られた個別の対象または個別の対象群に対して特異的である、比較するステップと
を有し、
試験メチル化プロファイルが、所定の参照メチル化プロファイルと有意に類似する場合、個別の試験対象または個別の試験対象群は、品質管理に合格し、疑わしい地理的起源は、真の地理的起源として示される、
方法に関する。
第３の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の生息域の１つ以上の環境パラメータを評価する方法であって、
（ａ） 個別の試験対象または個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上の事前に選択されたメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
（ｂ） （ａ）で決定されたメチル化状態から、個別の試験対象または個別の試験対象群の試験メチル化プロファイルを決定するステップと、
（ｃ） （ｂ）で決定された試験メチル化プロファイルと、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップであって、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルはそれぞれ、個別の試験対象または個別の試験対象群の同じ生物学的分類（好ましくは種）の、それぞれ明確な地理的起源から得られた個別の対象または個別の対象群に対して特異的であり、かつ明確な地理的起源は、１つ以上の環境パラメータにより他の明確な地理的起源と区別される、比較するステップと
を有し、
試験メチル化プロファイルが、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの１つと有意に類似する場合、個別の試験対象または個別の試験対象群は、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの１つの、個別の試験対象または個別の試験対象群の地理的起源と類似の、または好ましくは等しい環境パラメータを有する地理的起源に由来する、
方法に関する。
第４の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の想定された地理的起源を確認または否定する方法であって、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノム材料から得られた試験メチル化プロファイルと、それぞれ明確な地理的起源に対して特異的な１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップを有する、方法に関する。
第５の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の想定された地理的起源を確認するための試験システムを開発する方法であって、
（ａ） 個別の試験対象または個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上のメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
（ｂ） １つ以上のメチル化部位から、既知の地理的起源のそれぞれに対して特異的でかつ明確な差次的メチル化プロファイルにより特徴付けられるメチル化部位の参照パネルを選択するステップと、
（ｃ） 既知の地理的起源（またはロケーション）のそれぞれに参照メチル化プロファイルを割り当てることにより試験システムを得るステップと
を有し、
試験サンプルから得られた試験メチル化プロファイルと、（ｃ）で得られた参照メチル化プロファイルとの比較は、試験サンプルが得られた個別の試験対象の想定された地理的起源を確認することを可能にする、
方法に関する。
発明の詳細な説明
以下に、本発明の要素を説明する。これらの要素は、特別な実施形態および／または実施例と共に列挙されているが、これらの要素は、任意の方法でかつ任意の数で組み合わせて、付加的実施形態および／または実施例を作り出してよいと解釈されるべきである。多様に記載された実施例および好ましい実施形態は、明示的に説明された実施形態または実施例にすぎず、本発明を限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明された実施形態の２つ以上を組み合わせたか、または明示的に説明された実施形態もしくは実施例の１つ以上を、任意の数の開示された要素および／または好ましいとされた要素と組み合わせた実施形態および実施例をサポートしかつ包含すると解釈されるべきである。さらに、本出願において記載された全ての要素の任意の入れ替えおよび組合せは、文脈が他のことを指摘していない限り、本出願の説明により開示されていると見なすべきである。
本明細書で使用される「本発明の」、「本発明に従って」、「本発明による」等の用語は、本明細書で説明されたおよび／または特許請求の範囲に記載された本発明の全ての態様、実施形態および実施例を指すことを意図する。
本明細書で使用される「有する（comprising）」という用語は、「含む（including）」と「からなる（consisting of）」との両方を包含し、両方の意味が特に意図されていると解釈されるべきであり、よって本発明に従って個別に開示された実施形態である。本明細書で使用される場合、「および／または（and/or）」は、２つの特別な特徴または構成要素のそれぞれが他方のものを伴うかまたは伴わないかの特別な開示と見なすべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの特別な開示として、本明細書においてそれぞれが個別に記載されているかのように見なすべきである。本発明の文脈で、「約」および「ほぼ」という用語は、当業者が問題の特徴の技術的効果を依然として保証すると解釈するであろう精度の範囲を示す。この用語は、一般に、示された数値から±２０％、±１５％、±１０％、例えば±５％の偏差を示す。当業者により認識されるように、所与の技術的効果に対する数値の特別な偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、自然のまたは生物学的な技術的効果は、一般に、人工的または工学的な技術的効果の偏差よりも大きな偏差を有することがある。不定冠詞または定冠詞が単数名詞を言及する際に使用される場合、例えば「a」、「an」または「the」は、特に何かが言及されていない限り、その名詞の複数形を含む。
本発明の任意の態様による教示を、特別な課題または環境に適用すること、および本発明の任意の態様またはそれに対する付加的態様（例えば、更なる態様および実施態様または実施例）による変形態様を含むことは、本明細書に含まれる教示に照らして、当業者の能力の範囲内にあるであろう。
文脈が他のことを指示していない限り、この説明内に記載された特徴の説明および定義は、本発明の任意の特別な態様または実施形態を制限するものではなく、記載された全ての態様および実施形態に等しく適用される。
本明細書で引用される全ての参考文献、特許および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で定義される本発明の文脈における「地理的起源」という用語は、対象または対象群の１つ以上の環境パラメータにより他の地理的ロケーションとは区別される地理的ロケーションに関する。このような環境パラメータは、対象または対象群の生息域に依存し、対象または対象群が、水中、土壌上または土壌中に生息または養殖される場合に異なってよく、または食餌または空気パラメータなどから選択されてよい。本発明の非限定的な例として、淡水ガニ（例えばミステリークレイフィッシュ（marbled crayfish））について、環境パラメータは、ｐＨ、水の硬度、マンガン含有率、鉄含有率、およびアルミニウム含有率から選択されてよく、言及されたように、これらのパラメータは、好ましいとはいえ、非限定的に示される例と解釈されるべきであり、対象または対象群の分類群または種に依存して大きく変化してよい。このように、水中に生息する対象または対象群についての生息域は、静水または流水、例えば湖、川、養殖場、他の溜池または水域または沼から選択することができる。地理的起源は、個別の試験対象または個別の試験対象群が、産まれたかおよび／または養殖されたか、または少なくともその寿命の間のかなりの時間養殖された生息域であると考えられる地理的ロケーションであると解釈されるべきである。
本開示において対象の用語と関連して使用される「試験」という用語は、本発明の任意の態様による方法に供されかつ本発明の分析用途の基礎となる実在生物または生存生物を指す。したがって、「（個別の）試験対象」、「（個別の）試験対象群」または「試験プロファイル」は、本発明により試験される（個別の）対象または対象群またはこの文脈で得られるかまたは生成されるプロファイルである。逆に、「参照」という用語は、この試験存在との比較のために使用される、ほとんどが所定の存在を示す。
本発明の文脈における対象または対象群は、任意の生存生物であってよい。例えば、本発明の任意の態様による対象は、任意の種類の植物または動物、好ましくは飼育動物（または飼育家畜）または家畜であってよく、これらは脊椎動物または無脊椎動物であってよい。本発明の任意の態様による対象について有用であってよい無脊椎動物の典型的な例は、エビまたはカニ、例えばミステリークレイフィッシュであってよい。本発明の任意の態様による対象について有用であってよい脊椎動物の典型的な例は、養殖することができる魚または陸上動物、例えばニワトリまたは他の家畜であってよい。
「ゲノム材料」という用語は、対象または対象群の核酸分子またはゲノムの断片を指す。好ましくは、このような核酸分子または断片は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのハイブリッドであり、最も好ましくは、対象または対象群のＤＮＡゲノムの分子である。
本発明の文脈において、「メチル化プロファイル」、「メチル化パターン」、「メチル化状況」または「メチル化状態」という用語は、本明細書では、ゲノム配列のメチル化の状況、状態または条件を説明するために使用され、このような用語は、メチル化に関連する特別な遺伝子座でのＤＮＡ断片の特徴を言及する。このような特徴は、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のいずれかがメチル化されているかどうか、メチル化されたＣ残基のロケーション、残基の任意の特別な拡がりでのメチル化されたＣのパーセンテージ、および例えば対立遺伝子の起源における差異によるメチル化における対立遺伝子の差異を含むが、これらに限定されるものではない。
「メチル化状態」という用語は、残基またはメチル化部位がメチル化されたかまたはメチル化されていないことを意味する特別なメチル化部位の状態（すなわちメチル化されたまたはメチル化されていない）を指す。よって、１つ以上のメチル化部位のメチル化状態に基づき、メチル化プロファイルを決定することができる。したがって、「メチル化プロファイル」または「メチル化パターン」という用語は、生物学的サンプルのゲノム材料中の残基の任意の特別な拡がりでのメチル化されたＣ残基またはメチル化されていないＣ残基の相対的または絶対的な濃度を指す。例えば、ＤＮＡ配列内で典型的にはメチル化されていないシトシン（Ｃ）残基がメチル化されている場合、これは、「高メチル化された」ということができ、ＤＮＡ配列内で典型的にメチル化されているシトシン（Ｃ）残基がメチル化されていない場合、これは、「低メチル化された」ということができる。同様に、ＤＮＡ配列（例えば、試験対象からのサンプル核酸からのＤＮＡ）内のシトシン（Ｃ）残基が、異なる領域からまたは異なる個体からの別の配列と比較して（例えば、正常な核酸に対してまたは参照配列の標準的核酸に対して）メチル化されている場合、この配列は、他の配列と比較して高メチル化されていると見なされる。あるいは、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基が、異なる領域からまたは異なる個体からの別の配列と比較してメチル化されていない場合、この配列は、他の配列と比較して低メチル化されていると見なされる。これらの配列は、「差次的にメチル化された」といわれる。差次的メチル化のレベルの測定は、当業者に公知の多様な方法により行われてよい。１つの方法は、非限定的な例として、バイサルファイトシーケンシング法により決定された個別に調査されたＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定するものである。
本明細書で使用される場合、「メチル化されたヌクレオチド」または「メチル化されたヌクレオチド塩基」は、ヌクレオチド塩基上でのメチル基の存在を指し、このメチル基は、通常、認識されている典型的なヌクレオチド塩基内では存在しない。例えば、シトシンは、その通常の形ではそのピリミジン環上にメチル基を含まないが、５－メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル基を含む。したがって、シトシンは、その通常の形では、メチル化されたヌクレオチドとは見なすことができないが、５－メチルシトシンは、メチル化されたヌクレオチドと見なすことができる。別の例では、チミンは、そのピリミジン環の５位にメチル基を含むことができるが、本明細書の目的では、チミンはＤＮＡ中に存在する場合、メチル化されたヌクレオチドと見なすことができない。ＤＮＡについての典型的なヌクレオチド塩基は、チミン、アデニン、シトシンおよびグアニンである。ＲＮＡについての典型的な塩基は、ウラシル、アデニン、シトシンおよびグアニンである。相応して、「メチル化部位」は、メチル化が起こる可能性がある標的遺伝子核酸領域内のロケーションである。例えば、ＣｐＧを含むロケーションは、シトシンがメチル化されていてもよくまたはメチル化されていなくてもよいメチル化部位である。特に、「メチル化されたヌクレオチド」という用語は、メチル化が可能であるヌクレオチドの位置に取り付けられたメチル基を有するヌクレオチドを指す。これらのメチル化されたヌクレオチドは、通常自然界で見られ、現在まで、ジヌクレオチドＣｐＧの文脈で主に生じるメチル化されたシトシンは、ＣｐＮｐＧ配列およびＣｐＮｐＮ配列の文脈でも、最も一般的であると考えられてよい。原則として、他の天然に生じるヌクレオチドはメチル化されていてもよいが、これらは本発明の任意の態様に関して考慮に入れられない。
本明細書で使用される場合、「ＣｐＧ部位」または「メチル化部位」は、ｉｎ ｖｉｖｏで自然に生じる事象によるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでヌクレオチドを化学的にメチル化するために起こされた事象によりメチル化を受けやすい核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）内のヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「メチル化された核酸分子」は、メチル化されている１つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子を指す。
本明細書で使用される「ＣｐＧアイランド」は、機能的にまたは構造的に逸脱したＣｐＧ密度を有するＤＮＡ配列のセグメントを表す。例えば、Yamada et al.は、ＣｐＧアイランドを決定する一連の標準を説明している：これは、長さが少なくとも４００ヌクレオチドでなければならず、５０％超のＧＣ含有率を有し、０．６超のＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する（Yamada et al., 2004, Genome Research, 14, 247-266）。他には、ＣｐＧアイランドは、それほど厳密でなく、長さが少なくとも２００ヌクレオチドで、５０％超のＧＣ含有率を有し、０．６超のＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する配列として定義されている（Takai et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 3740-3745）。
本明細書で使用される「バイサルファイト」という用語は、亜硫酸水素塩の任意の適切なタイプ、例えば亜硫酸水素ナトリウムを包含するか、またはメチル化されたシトシンを化学的に修飾することなくシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に化学的に変換することができ、それによりＤＮＡのメチル化状態に基づきＤＮＡ配列を差次的に修飾するために使用することができる別の化学薬品を包含する、例えば米国特許出願公開第２０１０／０１１２５９５号明細書（Menchen et al.）。本明細書で使用する場合、メチル化されたまたはメチル化されていないＤＮＡを「差次的に修飾する」試薬は、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡから識別可能な生成物を生じるプロセスにおいて、メチル化されたおよび／またはメチル化されていないＤＮＡを修飾し、それによりＤＮＡメチル化状態の同定を可能にする任意の試薬を包含する。このようなプロセスは、化学反応（例えばバイサルファイトによるＣからＵへの変換）および酵素処理（例えばメチル化に依存するエンドヌクレアーゼによる切断）を含んでよいが、これらに限定されるものではない。したがって、メチル化されたＤＮＡを優先して切断または消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化されている場合、ＤＮＡ分子を極めて高い効率で切断または消化することが可能であるが、メチル化されていないＤＮＡを優先して切断または消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化されていない場合、著しく高い効率を示す。
本発明の文脈において、任意の「非バイサルファイトに基づく方法」および「非バイサルファイトに基づく定量的方法」は、試験されるべき任意の所与のメチル化部位でのメチル化状態について試験することを有する。このような用語は、バイサルファイトを用いる必要がないメチル化された核酸またはメチル化されていない核酸を定量化する任意の方法を指す。これらの用語は、バイサルファイト処理を必要としない定量化されるべき核酸を調製する方法も指す。非バイサルファイトに基づく方法の例は、１つ以上のメチル化感受性酵素を用いて核酸を消化する方法およびメチル化状態に基づき核酸に結合する薬剤を用いて核酸を分離する方法を含むが、これらに限定されるものではない。「メチル化感受性酵素」および「メチル化感受性制限酵素」という用語は、活性がそれらのＤＮＡ認識部位のメチル化状態に依存するＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼである。例えば、メチル化されていない場合にだけそのＤＮＡ認識配列を切断または消化するメチル感受性酵素が存在する。したがって、メチル化されていないＤＮＡサンプルは、メチル化されたＤＮＡサンプルよりも小さな断片に切り離される。同様に、高メチル化されたＤＮＡサンプルは、切断されない。対照的に、メチル化されている場合にだけそのＤＮＡ認識配列を切断するメチル化感受性酵素も存在する。本明細書で使用される場合、「切断」、「切り離し」および「消化」という用語は、交換可能に用いられる。
本発明の文脈において「生物学的サンプル」は、対象または対象群から得られた、ゲノム材料を含む任意の生物学的材料を有してよく、液体、固体またはその両方であってよく、組織もしくは骨、または体液、例えば血液、リンパ液などであってよい。特に、本発明に有用な生物学的サンプルは、生物学的細胞またはその断片を有してよい。
本明細書で使用される場合、「事前に選択されたメチル化部位」という用語は、この方法の訓練の間に最も高い程度のメチル化変動を示しかつ≧５ｘの最小シーケンシングカバレッジが考慮されかつ≧５の適格なＣｐＧ部位についてのような一定の品質基準を満たす遺伝子または領域から選択されたメチル化部位を指す。さらに、平均メチル化レベル＜０．１または平均メチル化レベル＞０．９を有する遺伝子は、その制限されたダイナミックレンジのために除外することができる。「参照メチル化プロファイル」は、例えば主成分分析または多次元スケーリングのような多変量統計法を用いる多重訓練サンプルに基づいて定義されてよい。
本開示の文脈において、特にメチル化プロファイルの比較（例えば、（試験対象からの）試験プロファイルと参照プロファイルとの比較）との文脈において「有意に類似する」という用語は、統計的手段により（すなわち生物情報学を用いることにより）および／または肉眼を用いて観察することにより観察された類似性を意味する。有意な類似性は、例えば、試験プロファイルが、主成分分析または多次元スケーリングのような多変量統計法を通じた多重訓練サンプルにより定義される参照プロファイルと重複する場合に観察される。特に、試験プロファイルは、メチル化パターン／プロファイルの５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％より多くが参照プロファイルと重複する場合に、所定の参照プロファイルと有意に類似する。１つより多く、例えば２つ、３つまたは全ての参照プロファイルに対する試験プロファイルの類似性は、この類似性の有意性を低下させる。
本発明の文脈において使用される「所定の参照プロファイル」という用語は、特異的な地理的起源を有する生存生物のゲノム材料の典型的なまたは標準的なメチル化プロファイルを指す。この所定の参照プロファイルは、対照対象から得られてよい。例えば、対照対象は、既知の地理的起源を有する試験対象と同種の生存生物であってよい。あるいは、この所定の参照プロファイルは、特異的な地理的起源に生息する多様な生物から得られてよい。特異的な地理的起源の異なる生物のメチル化プロファイルは、同じであってよい。幾つかの所定の参照プロファイルの編集があってよく、この編集において試験対象のメチル化プロファイルとの所定の参照プロファイルとの比較が、試験対象のメチル化プロファイルと類似する特異的な所定の参照プロファイルを同定することを可能にしてよく、次いで試験対象の地理的起源が、所定の参照プロファイルの地理的起源と推論されてよい。
地理的起源との関連で使用される「類似」という用語は、所定の参照プロファイルが得られた生物の生息域または地理的起源に基づく試験対象の生息域または地理的起源を指す。この「類似」という用語は、生息域のタイプ、生息域の環境パラメータ、生息域が位置する国などを指してよい。試験対象の地理的起源は、「地理的起源」の元で先に定義された少なくとも１つ以上の環境パラメータに基づく所定の参照プロファイルの地理的起源のそれと５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％類似してよい。
第１の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の地理的起源を同定する方法であって、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノム材料から得られた試験メチル化プロファイルと、それぞれ明確な地理的起源に対して特異的な１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップを有する、方法に関する。
本発明は、１つの種の個体の明確な地理的起源にとって特徴的なこの種内にある、動物を含む生存生物の遺伝子のサブセット内のメチル化プロファイルの意想外な同定に基づく。異なる地理的ロケーションに由来するこの種の他の個体は、遺伝子の同じサブセットについて異なるメチル化プロファイルまたはその中のメチル化部位によって区別することができる。
本発明の任意の態様の一実施例では、この方法は、好ましくは、
（ａ） 個別の試験対象または個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上の事前に選択されたメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
（ｂ） （ａ）で決定されたメチル化状態から、個別の試験対象または個別の試験対象群の試験メチル化プロファイルを決定するステップと、
（ｃ） （ｂ）で決定された試験メチル化プロファイルと、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップであって、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルのそれぞれは、個別の試験対象または個別の試験対象群の同じ生物学的分類群の対象または対象群の明確な地理的起源に対して特異的である、比較するステップと
を有してよく、
試験メチル化プロファイルが、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの１つと有意に類似する場合、個別の試験対象または個別の試験対象群は、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの対象または対象群と類似する地理的起源を有する。
個別の試験対象または個別の試験対象群は、ＤＮＡゲノムおよびＤＮＡゲノムメチル化を有する任意の生物学的存在であってよい。好ましくは、メチル化部位は、ＣｐＧ部位である。個別の試験対象または個別の試験対象群は、原核生物または真核生物、例えば単細胞もしくは多細胞の植物、真菌または動物から選択されてよい。
本発明の一態様では、（ａ）における１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、組織特異的遺伝子発現に関連するメチル化部位である。好ましくは、事前に選択されたメチル化部位は、１つの明確な組織の遺伝子発現に関連する。
組織は、
（ｉ） 代謝組織、例えば腸組織、好ましくは回腸または空腸、
（ｉｉ） 筋肉組織、
（ｉｉｉ） 皮膚または羽組織、および
（ｉｖ） 器官組織、好ましくは肝臓組織および／または膵臓組織
から選択されてよい。
個別の試験対象または個別の試験対象群は、好ましくは動物、例えば無脊椎動物、例えばカニである。あるいは、個別の試験対象または個別の試験対象群は、脊椎動物、例えば鳥類または哺乳類、好ましくはニワトリ、エビまたはザリガニであってよい。
明確な地理的起源は、個別の試験対象または個別の試験対象群が、産まれたかおよび／または養殖されたか、または少なくともその寿命の間のかなりの時間養殖された生息域（農業環境、例えば養殖場を含む）であると考えられる地理的ロケーションであってよい。
好ましくは、１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノムの２０％の最も差次的にメチル化された遺伝子内にある。
本発明の第１の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ミステリークレイフィッシュである。この点で、明確な地理的起源は、好ましくは湖、川および養殖場からなる群から選択された地理的に明確な水である。これらの地理的に明確な水は、ｐＨ、水の硬度、マンガン含有率、鉄含有率およびアルミニウム含有率から選択される１つ以上の環境パラメータによって他の水域とは区別可能になってよい。
ミステリークレイフィッシュのための前述の方法は、有利に、ゲノムワイドメチル化分析またはメチル化部位の事前に選択されたパネルのメチル化分析を有する。メチル化部位のこれらの事前に選択されたパネルは、好ましくは、約５００～１０００内の、好ましくは約７００の遺伝子のメチル化部位を含む。表２による遺伝子または遺伝子領域が特に好ましい。
本発明の第１の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ニワトリである。その点で、明確な地理的起源は、地理的に明確な養鶏場である。これらの地理的に明確な養鶏場は、給餌パラメータまたは空気パラメータ（例えば、温度、湿度、換気）のような１つ以上の環境パラメータにより、他の養鶏場とは区別可能であると見なされてよい。
好ましくは、本発明の第１の態様による方法におけるメチル化部位のパネルは、一貫してメチル化されたまたはメチル化されていないメチル化部位を有しない。
第２の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の疑わしい地理的起源を品質管理する方法であって、
ａ） （ａ）で決定されたメチル化状態から、個別の試験対象または個別の試験対象群の試験メチル化プロファイルを決定するステップと、
ｂ） （ｂ）で決定された試験メチル化プロファイルと、所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップであって、所定の参照メチル化プロファイルは、個別の試験対象または個別の試験対象群の同じ生物学的分類群の、疑わしい地理的起源から得られた個別の対象または個別の対象群に対して特異的である、比較するステップと
を有し、
試験メチル化プロファイルが、所定の参照メチル化プロファイルと有意に類似する場合、個別の試験対象または個別の試験対象群は、品質管理に合格し、疑わしい地理的起源は、真の地理的起源として示される、
方法に関する。
ゲノム材料を含む生物学的サンプルは、先に定義されたものであってよい。
また、本発明のこの態様について、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ＤＮＡゲノムおよびＤＮＡゲノムメチル化を有する任意の生物学的存在であってよい。好ましくは、メチル化部位は、ＣｐＧ部位である。個別の試験対象または個別の試験対象群は、原核生物、または真核生物、例えば単細胞もしくは多細胞の植物、真菌または動物から選択されてよい。（ａ）における１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、組織特異的遺伝子発現に関連するメチル化部位であってよい。好ましくは、事前に選択されたメチル化部位は、１つの明確な組織の遺伝子発現と関連している。適切な組織は、本発明の第１の態様で先に定義されたものである。
個別の試験対象または個別の試験対象群は、植物または動物であってよく、好ましくは動物、例えば無脊椎動物、例えばカニである。あるいは、個別の試験対象または個別の試験対象群は、脊椎動物、例えば鳥類または哺乳類、好ましくはニワトリ、エビまたはザリガニであってよい。
明確な地理的起源は、個別の試験対象または個別の試験対象群が、産まれたかおよび／または養殖されたか、または少なくともその寿命の間のかなりの時間養殖された生息域（農業環境、例えば養殖場を含む）であると考えられる地理的なロケーションであってよい。
好ましくは、１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノムの２０％の最も差次的にメチル化された遺伝子内にある。
本発明の第２の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ミステリークレイフィッシュである。この点で、明確な地理的起源は、好ましくは湖、川および養殖場からなる群から選択された地理的に明確な水である。これらの地理的に明確な水は、ｐＨ、水の硬度、マンガン含有率、鉄含有率およびアルミニウム含有率から選択される１つ以上の環境パラメータによって他の水とは区別可能であると見なされてよい。
ミステリークレイフィッシュのための前述の方法は、有利に、ゲノムワイドメチル化分析またはメチル化部位の事前に選択されたパネルのメチル化分析を有する。メチル化部位のこれらの事前に選択されたパネルは、好ましくは、約５００～１０００内の、好ましくは約７００の遺伝子のメチル化部位を含む。表２による遺伝子または遺伝子領域が特に好ましい。
本発明の第１の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ニワトリである。この点で、明確な地理的起源は、地理的に明確な養鶏場である。これらの地理的に明確な養鶏場は、給餌パラメータまたは空気パラメータ（例えば、温度、湿度、換気）のような１つ以上の環境パラメータにより、他の養鶏場とは区別可能であると見なされてよい。
好ましくは、本発明の第２の態様による方法におけるメチル化部位のパネルは、一貫してメチル化されたまたはメチル化されていないメチル化部位を有しない。
第３の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の生息域の１つ以上の環境パラメータを評価する方法であって、
（ａ） 個別の試験対象または個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上の事前に選択されたメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
（ｂ） （ａ）で決定されたメチル化状態から、個別の試験対象または個別の試験対象群の試験メチル化プロファイルを決定するステップと、
（ｃ） （ｂ）で決定された試験メチル化プロファイルと、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップであって、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルはそれぞれ、個別の試験対象または個別の試験対象群の同じ生物学的分類（好ましくは種）の、それぞれ明確な地理的起源から得られた個別の対象または個別の対象群に対して特異的であり、かつ明確な地理的起源は、１つ以上の環境パラメータにより他の明確な地理的起源と区別される、比較するステップと
を有し、
試験メチル化プロファイルが、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの１つと有意に類似する場合、個別の試験対象または個別の試験対象群は、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの１つの、対象または対象群の地理的起源と類似の、または好ましくは等しい環境パラメータを有する地理的起源に由来する、
方法に関する。
ゲノム材料を含む生物学的サンプルは、先に定義されたものであってよい。
また、本発明のこの態様について、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ＤＮＡゲノムおよびＤＮＡゲノムメチル化を有する任意の生物学的存在であってよい。好ましくは、メチル化部位は、ＣｐＧ部位である。個別の試験対象または個別の試験対象群は、原核生物、または真核生物、例えば単細胞もしくは多細胞の植物、真菌または動物から選択されてよい。（ｂ）における１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、組織特異的遺伝子発現に関連するメチル化部位であってよい。好ましくは、事前に選択されたメチル化部位は、１つの明確な組織の遺伝子発現と関連している。適切な組織は、本発明の第１の態様で先に定義されたものである。
個別の試験対象または個別の試験対象群は、植物または動物であってよく、好ましくは動物、例えば無脊椎動物、例えばカニである。あるいは、個別の試験対象または個別の試験対象群は、脊椎動物、例えば鳥類または哺乳類であってよく、好ましくはニワトリ、エビまたはザリガニである。
明確な地理的起源は、個別の試験対象または個別の試験対象群が、産まれたかおよび／または養殖されたか、または少なくともその寿命の間のかなりの時間養殖された生息域（農業環境、例えば養殖場を含む）であると考えられる地理的なロケーションであってよい。
好ましくは、１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノムの２０％の最も差次的にメチル化された遺伝子内にある。
本発明の第３の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ミステリークレイフィッシュである。この点で、明確な地理的起源は、好ましくは湖、川および養殖場からなる群から選択された地理的に明確な水である。これらの地理的に明確な水は、ｐＨ、水の硬度、マンガン含有率、鉄含有率およびアルミニウム含有率から選択される１つ以上の環境パラメータによって他の水域とは区別可能であると見なされてよい。
ミステリークレイフィッシュのための前述の方法は、有利に、ゲノムワイドメチル化分析またはメチル化部位の事前に選択されたパネルのメチル化分析を有する。メチル化部位のこれらの事前に選択されたパネルは、好ましくは、約５００～１０００内の、好ましくは約７００の遺伝子のメチル化部位を含む。表２による遺伝子または遺伝子領域が特に好ましい。
本発明の第１の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ニワトリである。その点で、明確な地理的起源は、地理的に明確な養鶏場である。これらの地理的に明確な養鶏場は、給餌パラメータまたは空気パラメータ（例えば、温度、湿度、換気）のような１つ以上の環境パラメータにより、他の養鶏場とは区別可能であると見なされてよい。
好ましくは、本発明の第３の態様による方法におけるメチル化部位のパネルは、一貫してメチル化されたまたはメチル化されていないメチル化部位を有しない。
第４の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の想定された地理的起源を確認または否定する方法であって、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノム材料から得られた試験メチル化プロファイルと、それぞれ明確な地理的起源に対して特異的な１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップを有する、方法に関する。
ゲノム材料を含む生物学的サンプルは、先に定義されたものであってよい。
また、本発明のこの態様について、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ＤＮＡゲノムおよびＤＮＡゲノムメチル化を有する任意の生物学的存在であってよい。好ましくは、メチル化部位は、ＣｐＧ部位である。個別の試験対象または個別の試験対象群は、原核生物、または真核生物、例えば単細胞もしくは多細胞の植物、真菌または動物から選択されてよい。（ｂ）における１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、組織特異的遺伝子発現と関連するメチル化部位であってよい。好ましくは、事前に選択されたメチル化部位は、１つの明確な組織の遺伝子発現と関連している。適切な組織は、本発明の第１の態様で先に定義されたものである。
個別の試験対象または個別の試験対象群は、植物または動物であってよく、好ましくは動物、例えば無脊椎動物、例えばカニである。あるいは、個別の試験対象または個別の試験対象群は、脊椎動物、例えば鳥類または哺乳類であってよく、好ましくはニワトリ、エビまたはザリガニである。
明確な地理的起源は、個別の試験対象または個別の試験対象群が、産まれたかおよび／または養殖されたか、または少なくともその寿命の間のかなりの時間養殖された生息域（農業環境、例えば養殖場を含む）であると考えられる地理的なロケーションであってよい。
好ましくは、１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノムの２０％の最も差次的にメチル化された遺伝子内にある。
本発明の第４の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ミステリークレイフィッシュである。この点で、明確な地理的起源は、好ましくは湖、川および養殖場からなる群から選択された地理的に明確な水である。これらの地理的に明確な水は、ｐＨ、水の硬度、マンガン含有率、鉄含有率およびアルミニウム含有率から選択される１つ以上の環境パラメータによって他の水域とは区別可能であると見なされてよい。
ミステリークレイフィッシュのための前述の方法は、有利に、ゲノムワイドメチル化分析またはメチル化部位の事前に選択されたパネルのメチル化分析を有する。メチル化部位のこれらの事前に選択されたパネルは、好ましくは、約５００～１０００内の、好ましくは約７００の遺伝子のメチル化部位を含む。表２による遺伝子または遺伝子領域が特に好ましい。
本発明の第１の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ニワトリである。その点で、明確な地理的起源は、地理的に明確な養鶏場である。これらの地理的に明確な養鶏場は、給餌パラメータまたは空気パラメータ（例えば、温度、湿度、換気）のような１つ以上の環境パラメータにより、他の養鶏場とは区別可能であると見なされてよい。
好ましくは、本発明の第４の態様による方法におけるメチル化部位のパネルは、一貫してメチル化されたまたはメチル化されていないメチル化部位を有しない。
第５の態様では、本発明は、個別の試験対象または個別の試験対象群の想定された地理的起源を確認するための試験システムを開発する方法であって
ａ． 個別の試験対象または個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上のメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
ｂ． １つ以上のメチル化部位から、既知の地理的起源のそれぞれに対して特異的でかつ明確な差次的メチル化プロファイルにより特徴付けられるメチル化部位の参照パネルを選択するステップと、
ｃ． 既知の地理的起源（またはロケーション）のそれぞれに参照メチル化プロファイルを割り当てることにより試験システムを得るステップと
を有し、
試験サンプルから得られた試験メチル化プロファイルと、（ｃ）で得られた参照メチル化プロファイルとの比較は、試験サンプルが得られた個別の試験対象または個別の試験対象群の想定された地理的起源を確認することを可能にする、
方法に関する。
ゲノム材料を含む生物学的サンプルは、先に定義されたものであってよい。
また、本発明のこの態様について、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ＤＮＡゲノムおよびＤＮＡゲノムメチル化を有する任意の生物学的存在であってよい。好ましくは、メチル化部位は、ＣｐＧ部位である。個別の試験対象または個別の試験対象群は、原核生物、または真核生物、例えば単細胞もしくは多細胞の植物、真菌または動物から選択されてよい。１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、組織特異的遺伝子発現に関連するメチル化部位であってよい。好ましくは、事前に選択されたメチル化部位は、１つの明確な組織の遺伝子発現と関連している。適切な組織は、本発明の第１の態様で先に定義されたものである。
個別の試験対象または個別の試験対象群は、好ましくは動物、例えば無脊椎動物、例えばカニである。あるいは、個別の試験対象または個別の試験対象群は、脊椎動物、例えば鳥類または哺乳類であってよく、好ましくはニワトリ、エビまたはザリガニである。
明確な地理的起源は、個別の試験対象または個別の試験対象群が、産まれたかおよび／または養殖されたか、または少なくともその寿命の間のかなりの時間養殖された生息域（農業環境、例えば養殖場を含む）であると考えられる地理的なロケーションであってよい。
好ましくは、１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、個別の試験対象または個別の試験対象群のゲノムの２０％の最も差次的にメチル化された遺伝子内にある。
本発明の第２の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ミステリークレイフィッシュである。この点で、明確な地理的起源は、好ましくは湖、川および養殖場からなる群から選択された地理的に明確な水である。これらの地理的に明確な水は、ｐＨ、水の硬度、マンガン含有率、鉄含有率およびアルミニウム含有率から選択される１つ以上の環境パラメータによって他の水域とは区別可能であると見なされてよい。
ミステリークレイフィッシュのための前述の方法は、有利に、ゲノムワイドメチル化分析またはメチル化部位の事前に選択されたパネルのメチル化分析を有する。メチル化部位のこれらの事前に選択されたパネルは、好ましくは、約５００～１０００内の、好ましくは約７００の遺伝子のメチル化部位を含む。表２による遺伝子または遺伝子領域が特に好ましい。
本発明の第１の態様の特別な実施例では、個別の試験対象または個別の試験対象群は、ニワトリである。その点で、明確な地理的起源は、地理的に明確な養鶏場である。これらの地理的に明確な養鶏場は、給餌パラメータまたは空気パラメータ（例えば、温度、湿度、換気）のような１つ以上の環境パラメータにより、他の養鶏場とは区別可能であると見なすことができる。
好ましくは、本発明の第５の態様による方法におけるメチル化部位のパネルは、一貫してメチル化されたまたはメチル化されていないメチル化部位を有しない。
４つのミステリークレイフィッシュ個体群生息域の特異的水パラメータを示す。 ミステリークレイフィッシュ個体群におけるコンテキスト特異的な差次的メチル化を示す。（Ａ） 組織特異的なメチル化の差異を有する５６の遺伝子のメチル化レベルに基づく、Singlisからの腹筋（mus.、四角形記号）サンプルおよび肝膵臓（hep.、円形記号）サンプルの主成分分析。（Ｂ） 組織特異的なメチル化の差異を有する３５の遺伝子のメチル化レベルに基づく、Reilingenからの腹筋（mus.、四角形記号）サンプルおよび肝膵臓（hep.、円形記号）サンプルの主成分分析。（Ｃ） ロケーション特異的なメチル化の差異を有する１２２の遺伝子のメチル化レベルに基づく、全てのロケーションからの肝膵臓サンプルの主成分分析。（Ｄ） ロケーション特異的なメチル化の差異を有する２２の遺伝子のメチル化レベルに基づく、全てのロケーションからの腹筋サンプルの主成分分析。 ミステリークレイフィッシュにおけるコンテキスト依存性の差次的メチル化の検証を示す。４つの異なるゲノム領域について、キャプチャーベースのシーケンシングおよびアンプリコンシーケンシングを用いる対応する検証実験についての結果を示す。塗りつぶされていない形状：腹筋；塗りつぶされた形状：肝膵臓；正方形：Reilingen；星型：Singlis；円形：Andragnaroa；三角形：Ihosy。 Reduced representation bisulfite sequencing（RRBS）データに関してR package MethylKitからの「calculate DiffMeth」関数を用いたニワトリ内の差次的にメチル化されたＣｐＧ部位の結果を示す。同定された差次的にメチル化されたＣｐＧ部位は、主成分分析において３つのロケーションのロバストな選別を可能にする。ＳＮＰについてのフィルタリング後：２３０万～３６０万のＣｐＧ部位。全てのサンプルにおける最小カバレッジ１０でのＣｐＧ部位：６２３，６５７、差次的にメチル化されたＣｐＧ：１２７４（ｐ値＜０．０５）。 Reduced representation bisulfite sequencing（RRBS）データに関してR package MethylKitからの「calculate DiffMeth」関数を用いたギンザケ（soho salmon）内の差次的にメチル化されたＣｐＧ部位の結果を示す。同定された差次的にメチル化されたＣｐＧ部位は、主成分分析において２つのロケーションのロバストな選別を可能にする。ＳＮＰフィルタリング後の全てのサンプルにおける最小カバレッジ１０でのＣｐＧ部位：６１０，３９７、有意なＤＭＲ：４４０（ｐ値＜０．０５、メチル化における差異＞＝１０％）
実施例
ここで、本発明の一定の態様および実施形態を、実施例により、ならびに本明細書に記載された説明、図面および表を参照して説明する。本発明の方法、使用および他の態様のこのような実施例は、典型的なものにすぎず、本発明の範囲がこのような典型的な実施例だけに限定されると解釈すべきではない。
実施例１
４つの無関係なミステリークレイフィッシュ個体群の生息域プロファイル
ミステリークレイフィッシュにおけるコンテキスト依存性のＤＮＡメチル化の可能性を調査するため、４つの異なる安定した個体群から動物を集めた。Reilingen（ドイツ）は、環境保護区域内の小さな富栄養湖のタイプの産地を表す。Singlis（ドイツ）個体群は、以前の褐炭採掘区域内の比較的大きな貧栄養湖からのものである。Andragnaroa（マダガスカル）個体群は、比較的高い標高（１１５６ｍ）の森林区域を通って流れる、軟質の山岳水の川に位置する。最後のIhosy（マダガスカル）個体群は、近くの採掘活動からの高い汚染レベルを有する極めて濁った水中に見られる。物理化学的な水パラメータの分析は、Reilingenでは、きれいで、僅かに塩基性（ｐＨ８．４）の水を示し、Singlisでは、高レベルのマンガン（４７９２μｇ／ｌ）を有するやや酸性（ｐＨ５．２）の水を示す。Andragnaroaにおける水は、特に低い硬度（０．３°ｄＨ）を示すが、Ihosyにおける水は、高レベルのアルミニウム（２９６７μｇ／ｌ）および鉄（２２４９μｇ／ｌ）により特徴付けられた。したがって、全体的に、この研究は、異なる気候帯からの、異なる水パラメータを有する４つの異なる生息域に生息する個体群をカバーする。これらの結果を図１に示す。
Figure 2023536120000001
実施例２
可変にメチル化された遺伝子セットの同定
以前に、ミステリークレイフィッシュにおけるＤＮＡメチル化は、遺伝子本体を標的とし、比較的安定でありかつ十分に組織不変性であることを示した（Gatzmann et al., 2018）。しかしながら、異なる動物、異なる組織および異なる発育段階からの８つの全ゲノムバイサルファイトシーケンシングデータセットの比較は、より可変のメチル化レベルを示す遺伝子の小さな群についての可能性も示した（Gatzmann et al., 2018）。これは、メチル化分散の体系的な分析により確認された。＞０．００６の分散カットオフは、８４６の遺伝子を同定し、一貫してメチル化されたまたはメチル化されていない１４９は（それぞれ、平均比＞０．８または＜０．２）は更なる分析から除外されるので、６９７の可変にメチル化された遺伝子のコアセットが定義された。これらの遺伝子のメチル化レベルに基づく計量多次元分析は、腹筋サンプルから肝膵臓サンプルを分離し、以前では認識されなかった組織特異的メチル化パターンの存在を示唆した。
これらの遺伝子のメチル化パターンをより多数のサンプル中でかつより高いカバレッジのメチル化で分析するために、ビーズベースのキャプチャーアッセイが開発された。このアッセイについて、２つの異なる組織からのＤＮＡサンプルを調製した：ザリガニの主要な代謝器官を表す肝膵臓、腹部の尾を形成する主要な筋組織を表す腹筋。肝膵臓ＤＮＡは、Ｎ＝４７の動物（ロケーション当たり１１～１２）から調製し、腹筋ＤＮＡは、同じ動物のサブセット（Ｎ＝２６、ロケーション当たり１２～４）から調製した。サブゲノムキャプチャーは、両方とも有効でかつ特異的であることが見出され、ストリンジェントな条件下でサンプル当たり１０００万のマッピングされたリードの最小値を提供した。
引き続くステップでは、その配列内に５０％超のＮｓを有する遺伝子を除外し、この分析に６２３の遺伝子が残った。さらに、≧５ｘのシーケンシングカバレッジを有する全てのサンプル中に存在したこれらのＣｐＧ部位だけを考慮し、平均メチル化レベルを、遺伝子が≧５の適格なＣｐＧ部位を有する場合にだけ計算した。これらの基準を、４６３の遺伝子が満たした。本発明者らはまた、不変の遺伝子、すなわちメチル化分散について下位の１０％の遺伝子ならびに平均メチル化レベル＜０．１または＞０．９を有する遺伝子を除外し、３６１の可変にメチル化された遺伝子のコアセットを得た（表２）。
Figure 2023536120000002
Figure 2023536120000003
Figure 2023536120000004
Figure 2023536120000005
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Figure 2023536120000007
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Figure 2023536120000009
Figure 2023536120000010
重要なことに、可変にメチル化された遺伝子のこのセットの背後にある根本的なメカニズムをよりよく理解するために、遺伝子オントロジー解析を行った。ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質とも言われる）に関連する機能的特徴を有する遺伝子のかなりの富化が観察された。細胞活性の広い多様性を調節するＧタンパク質、およびとりわけ、転写／翻訳調節、ストレスに対する応答、ＲＮＡ代謝、および病原体に対する免疫応答の役割を果たす可変にメチル化された遺伝子を検出した。したがって、これらの３２１の可変にメチル化された遺伝子中に観察された機能的不均質性は、異なる環境圧力下で生存するミステリークレイフィッシュにとって潜在的に柔軟性を与えることができる。
実施例３
ミステリークレイフィッシュ個体群におけるコンテキスト依存性のメチル化パターン
付加的ステップでは、３６１の可変にメチル化された遺伝子のコアセット内の特異的なコンテキスト依存性メチル化パターンを同定しようとした。組織特異的なメチル化の差異を同定するために、肝膵臓と腹筋との間の差次的（Benjamini-Hochberg補正後にｐ＜０．０５）メチル化のためのWilcoxon順位和検定を適用した。単一のロケーションからの最大のデータセット（Singlis、Ｎ＝２４）について、主成分分析において２つの組織のロバストな選別を可能にする５６の遺伝子を同定した。同じアプローチを２番目に大きいデータセット（Reilingen、Ｎ＝１９）に適用した場合、主成分分析において２つの組織のロバストな選別を再び可能にする３５の差次的にメチル化された遺伝子（Singlisと２８の重複）を同定した。組織特異的なメチル化の差異は、平均遺伝子メチル化レベルについてやや中程度で生じるが、ＣｐＧレベルではより明白であった。注目すべきは、組織特異的なメチル化の差異は、異なる個体群の間で極めて安定であった。総合すると、これらの知見は、ミステリークレイフィッシュにおける局在化された組織特異的メチル化パターンの存在を示唆している。
ロケーション特異的なメチル化の差異を同定するために、４つのロケーションの間での差次的（Benjamini-Hochberg補正後にｐ＜０．０５）メチル化についてKruskal-Wallis検定を適用した。より大きな肝膵臓データセット（Ｎ＝４７）について、主成分分析において４つのロケーションのロバストな選別を可能にする１２２の遺伝子を同定した。同じアプローチをより小さい腹筋データセット（Ｎ＝２６）に適用した場合、主成分分析において４つのロケーションのロバストな選別を再び可能にする２２の差次的にメチル化された遺伝子（肝膵臓と２１の重複）を同定した。組織特異性のメチル化に対する知見と同様に、ロケーション特異的なメチル化の差異は、平均遺伝子メチル化レベルにとって中程度で生じるが、ＣｐＧレベルではより明白であった。また、ロケーション特異的なメチル化の差異は、異なるロケーションの間で極めて安定であった。この知見は、ミステリークレイフィッシュ個体群内で定義されたロケーション特異的なメチル化の差異の存在を示唆している。
実施例４
コンテキスト依存性メチル化パターンの検証
組織特異的およびロケーション特異的メチル化パターンについての結果を検証するため、サンプルの選別につながる、同定された遺伝子内の、差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）に基づくマーカーを設計した。組織特異的マーカー（ｎ＝２）とロケーション特異的マーカー（ｎ＝２）の両方を、同じ２つの組織（肝膵臓および腹筋）ならびに同じ４つのロケーション（Reilingen、Singlis、AndragnaroaおよびIhosy）から集めるが、最初のサンプリングの２年後に集めた新規サンプルからのサンプルで試験した。これらのサンプルを、アンプリコンのＰＣＲベースのディープシーケンシングで分析した。この結果は、キャプチャーベースのサブゲノムシーケンシングからの知見を確認した。選択されたマーカーを用いて、これらの組織ならびにロケーションの間の選別は、ＣｐＧ当たりの平均メチル化比に基づいて可能であった。配列決定されたアンプリコンについての平均ＣｐＧ比は、さらに、ビーズベースのキャプチャ結果の平均ＣｐＧ比に匹敵した。特に、これはまた、ロケーション特異的なメチル化が、ミステリークレイフィッシュ個体群の間で経時的に安定であることを確認し、その結果、個体群の起源を同定するためのロケーション特異的マーカーを定義し、そのためのフィンガープリントとしてメチル化パターンを使用する可能性が生じる。これらの結果を図２および図３に示す。
材料および方法
ビーズベースのキャプチャーアッセイについてのサンプリングは、Reilingenについては２０１７年８月に、Singlisについては２０１７年１０月に、Adriantsoa et al., 2019に言及されているように、マダガスカルで２０１７年１０月から２０１８年３月まで実施した。検証実験のためのサンプリングは、ドイツとマダガスカルとで２０１９年３月から５月まで実施した。サンプルは、１００％エタノール中に保存し、ＤＮＡが抽出されるまで－８０℃で貯蔵した。
ゲノムＤＮＡを、Tissue Ruptor（Qiagen）を用いて腹筋および肝膵臓組織から単離および精製し、引き続き、プロテイナーゼＫ消化およびイソプロパノール沈殿を行った。単離されたゲノムＤＮＡの品質を、2200 TapeStation（Agilent）で評価した。
ライブラリー調製を、SureSelectXT Methyl-Seq Target Enrichment System for Illumina Multiplexed Sequencing Protocol, Version D0, July 2015に記載されているように実施した。品質管理を実施し、サンプル濃度を、2200 TapeStation（Agilent）で測定した。多重化されたサンプルを、ＨｉＳｅｑＸ ｔｅｎシステム（Illumina）で配列決定した。
リードペアを上質にトリミングし、BSMAP（Xi and Li, 2009）を用いて、全ゲノムバイサルファイトシーケンシングデータセット（Gatzmann et al., 2018）内に可変メチル化を示した６９７の遺伝子をマッピングした。引き続き、各ＣｐＧ部位についてのメチル化比を、BSMAPで提供されるPythonを用いて算出した。≧５ｘのカバレッジを有する全てのサンプル中に存在するこれらのＣｐＧ部位だけを、更なる分析のために考慮した。各遺伝子についての平均メチル化レベルを、遺伝子が、≧５ｘのカバレッジを有する少なくとも５つのＣｐＧ部位を有する場合にだけ計算した。さらに、次の基準を有する遺伝子を、引き続く分析から除外した：ｉ）メチル化分散の観点から下位１０％にある遺伝子、ｉｉ）＜０．１または＞０．９の平均メチル化レベルを有する遺伝子、およびｉｉ）その配列において５０％超のＮｓを有する遺伝子。
組織特異的なメチル化の差異を同定するために、Wilcoxon順位和検定を適用し（SinglisおよびReilingenからの肝膵臓対腹筋サンプル）、ｐ値を、Benjamini-Hochberg法を用いて多重試験用に修正した。同様に、ロケーション特異的なメチル化の差異を同定するために、Kuskal-Wallis検定を使用し、ｐ値を、Benjamin-Hochberg法を用いて多重試験用に修正した。さらに、dmrseq（Korthauer et al., 2018）を、それぞれの遺伝子内の組織特異的およびロケーション特異的に差次的メチル化された領域を同定するために使用した。
ゲノムＤＮＡを、製造元の指示に従ってEZ DNA Methylation-Gold Kit（Zymo Research）を用いてバイサルファイト変換した。標的領域を、領域特異的プライマー（表３）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いてゲル精製した。引き続き、サンプルを、Nextera XT index Kit v2 Set A（Illumina）を用いてインデックス作成した。プールされたライブラリーを、paired-end 150 bp nanoプロトコルを用いるMiSeqV2システムで配列決定した。配列決定データを、BisAMP（BisAMP：標的ＲＮＡシトシン－５メチル化分析のためのウェブベースのパイプライン、Bormann F, Tuorto F, Cirzi C, Lyko F, Legrand C. Methods. 2019 Mar 1;156:121-127.）を用いて分析した。
Figure 2023536120000011
実施例５
ニワトリにおける差次的にメチル化されたＣｐＧ部位の同定
ニワトリにおける差次的にメチル化されたＣｐＧ部位を同定するために、R package MethylKitからの「calculate DiffMeth」関数を、Reduced representation bisulfite sequencing（RRBS）データに関して使用した。１２７４の差次的にメチル化されたＣｐＧを同定した（ｐ値＜０．０５）。この分析の前に、このデータをＳＮＰでフィルタリングし、ＣｐＧ部位当たり最小１０のカバレッジカットオフを適用した。図４に示すように、同定された差次的にメチル化されたＣｐＧ部位は、主成分分析において３つのロケーションのロバストな選別を可能にした。
材料および方法
胸筋組織からの単離されかつ精製されたゲノムＤＮＡが、サンプルソースのそれぞれの国における異なるサービスラボラトリーにより提供された。品質は、2200 TapeStation（Agilent）を用いて調査した。
RRBSライブラリー調製を、Zymo-Seq RRBS（商標） Library Kit取扱説明書Ver. 1.0.0に記載されたように実施した。品質管理を実施し、サンプル濃度を、2200 TapeStation（Agilent）で測定した。多重化されたサンプルを、HiSeq 4000システム（Illumina）で配列決定した。
リードを、trimmomatic version 0.38を用いて上質にトリミングし、BSMAP 2.90でGallus gallus genome assembly version 5.0にマッピングした。メチル化比を、BSMAPパッケージで配布されたpython script（methratio.py）を用いて計算した。性染色体に関連する全てのＣｐＧ部位とGallus gallusゲノムについてのＳＮＰと重複するＣｐＧ部位をフィルタリングして更なる分析から除外した。差次的なメチル化分析を、R package MethylKit（Akalin et al. (2012), Genome Biology, 13(10), R87）を用いて実施した。
実施例６
ギンザケにおける差次的にメチル化されたＣｐＧ部位の同定
ギンザケRRBSデータにおける差次的にメチル化された領域を同定するために、R package MethylKitからの「calculate DiffMeth」関数を使用した。４４０の差次的にメチル化された領域を同定した（ｐ値＜０．０５、メチル化における差異＞＝１０％）。この分析の前に、このデータをＳＮＰでフィルタリングし、ＣｐＧ部位当たり最小１０のカバレッジカットオフを適用した。図５に示すように、同定された差次的にメチル化された領域は、主成分分析において２つのロケーションのロバストな選別を可能にした。
材料および方法
Le Luyer et al., 2017により公開されたRRBSデータを、National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archiveからダウンロードした。リードを、BSMAP 2.90 to Okis_V2（GCF_002021735.2）を用いてマッピングし、メチル化比を、BSMAPパッケージで配布されたpython script（methratio.py）を用いて決定した。ＳＮＰと重複する全てのＣｐＧ部位をフィルタリングして更なる分析から除外した。共変量として飼育環境と性別を用いる差次的なメチル化分析を、R package MethylKit（Akalin et al. (2012), Genome Biology, 13(10), R87）を用いて実施した。

Claims (17)

  1. 個別の試験対象または個別の試験対象群の地理的起源を同定する方法であって、
    － 前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群のゲノム材料から得られた試験メチル化プロファイルと、それぞれ明確な地理的起源に対して特異的な１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップを有する、方法。
  2. ａ． 前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上の事前に選択されたメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
    ｂ． （ａ）で決定された前記メチル化状態から、前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群の試験メチル化プロファイルを決定するステップと、
    ｃ． （ｂ）で決定された前記試験メチル化プロファイルと、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップであって、前記１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルのそれぞれは、前記個別の試験対象または個別の試験対象群の同じ生物学的分類群の対象または対象群の明確な地理的起源に対して特異的である、比較するステップと
    を有し、
    前記試験メチル化プロファイルが、前記１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの１つと有意に類似する場合、前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群は、前記１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの前記対象または対象群と類似する地理的起源を有する、
    請求項１記載の方法。
  3. 前記個別の試験対象または個別の試験対象群は、ＤＮＡゲノムおよびＤＮＡゲノムメチル化を有する任意の生物学的実体物であり、好ましくは、前記メチル化部位は、ＣｐＧ部位である、請求項１または２記載の方法。
  4. 前記個別の試験対象または個別の試験対象群は、原核生物または真核生物から選択される、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
  5. （ａ）における前記１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、組織特異性遺伝子発現に関連するメチル化部位であり、好ましくは、前記事前に選択されたメチル化部位は、１つの明確な組織の遺伝子発現に関連する、請求項２から４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 前記組織は、
    （ｉ） 代謝組織、好ましくは腸組織、
    （ｉｉ） 筋肉組織、
    （ｉｉｉ） 皮膚または羽組織、および
    （ｉｖ） 器官組織、好ましくは肝臓組織および／または膵臓組織
    からなる群から選択される、請求項５記載の方法。
  7. 前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群は、動物である、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. 前記明確な地理的起源は、前記個別の試験対象または個別の試験対象群が、産まれたかおよび／または養殖されたか、または少なくともその寿命の間のかなりの時間養殖された生息域であると考えられる地理的ロケーションである、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
  9. 前記１つ以上の事前に選択されたメチル化部位は、前記個別の試験対象または個別の試験対象群の前記ゲノムの２０％の最も差次的にメチル化された遺伝子内にある、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
  10. 個別の試験対象または個別の試験対象群の疑わしい地理的起源を品質管理する方法であって、
    ａ． 前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上の事前に選択されたメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
    ｂ． （ａ）で決定された前記メチル化状態から、前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群の試験メチル化プロファイルを決定するステップと、
    ｃ． （ｂ）で決定された前記試験メチル化プロファイルと、所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップであって、前記所定の参照メチル化プロファイルは、前記個別の試験対象または個別の試験対象群の同じ生物学的分類群の、前記疑わしい地理的起源から得られた個別の対象または個別の対象群に対して特異的である、比較するステップと
    を有し、
    前記試験メチル化プロファイルが、前記所定の参照メチル化プロファイルと有意に類似する場合、前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群は、前記品質管理に合格し、前記疑わしい地理的起源は、真の地理的起源として示される、
    方法。
  11. 個別の試験対象または個別の試験対象群の生息域の１つ以上の環境パラメータを評価する方法であって、
    ａ． 前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれる前記ゲノム材料内の１つ以上の事前に選択されたメチル化部位の前記メチル化状態を決定するステップと、
    ｂ． （ａ）で決定された前記メチル化状態から、前記個別の試験対象または個別の試験対象群の試験メチル化プロファイルを決定するステップと、
    ｃ． （ｂ）で決定された前記試験メチル化プロファイルと、１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップであって、前記１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルはそれぞれ、前記個別の試験対象または個別の試験対象群の同じ生物学的分類の、それぞれ明確な地理的起源から得られた個別の対象または個別の対象群に対して特異的であり、かつ前記明確な地理的起源は、１つ以上の環境パラメータにより他の明確な地理的起源と区別される、比較するステップと
    を有し、
    前記試験メチル化プロファイルが、前記１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの１つと有意に類似する場合、前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群は、前記１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルの１つの、前記個別の試験対象または個別の試験対象群の前記地理的起源と類似の、または好ましくは等しい環境パラメータを有する地理的起源に由来する、
    方法。
  12. 個別の試験対象または個別の試験対象群の想定された地理的起源を確認または否定する方法であって、
    － 前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群のゲノム材料から得られた試験メチル化プロファイルと、それぞれ明確な地理的起源に対して特異的な１つ以上の所定の参照メチル化プロファイルとを比較するステップ
    を有する、方法。
  13. 個別の試験対象または個別の試験対象群の想定された地理的起源を確認するための試験システムを開発する方法であって、
    ａ． 前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群から得られた生物学的サンプル中に含まれるゲノム材料内の１つ以上のメチル化部位のメチル化状態を決定するステップと、
    ｂ． 前記１つ以上のメチル化部位から、既知の地理的起源のそれぞれに対して特異的でかつ明確な差次的メチル化プロファイルにより特徴付けられるメチル化部位の参照パネルを選択するステップと、
    ｃ． 前記既知の地理的起源のそれぞれに参照メチル化プロファイルを割り当てることにより試験システムを得るステップと
    を有し、
    試験サンプルから得られた試験メチル化プロファイルと、（ｃ）で得られた前記参照メチル化プロファイルとの比較は、前記試験サンプルが得られた前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群の前記想定された地理的起源を確認することを可能にする、
    方法。
  14. 前記個別の試験対象または前記個別の試験対象群は、ミステリークレイフィッシュであり、および／または前記明確な地理的起源は、地理的に明確な水であり、好ましくは湖、川および養殖場からなる群から選択された地理的に明確な水である、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
  15. 前記地理的に明確な水は、ｐＨ、水の硬度、マンガン含有率、鉄含有率およびアルミニウム含有率からなる群から選択される１つ以上の環境パラメータによって区別可能になる、請求項１４記載の方法。
  16. ゲノムワイドメチル化分析またはメチル化部位の事前に選択されたパネルのメチル化分析を有し、メチル化部位の前記事前に選択されたパネルは、好ましくは約５００～１０００内の、好ましくは約７００の遺伝子のメチル化部位を含む、請求項１４または１５記載の方法。
  17. 前記メチル化部位のパネルは、一貫してメチル化されたまたはメチル化されていないメチル化部位を有しない、請求項１６記載の方法。
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McManus et al. Inference of gorilla demographic and selective history from whole-genome sequence data
Limborg et al. Signatures of natural selection among lineages and habitats in Oncorhynchus mykiss
Hemmer-Hansen et al. Conserving marine biodiversity: insights from life-history trait candidate genes in Atlantic cod (Gadus morhua)
Zueva et al. Footprints of directional selection in wild Atlantic salmon populations: evidence for parasite-driven evolution?
Vilas et al. A genome scan for candidate genes involved in the adaptation of turbot (Scophthalmus maximus)
Huete-Pérez et al. Genomic approaches in marine biodiversity and aquaculture
Zieliński et al. Single nucleotide polymorphisms reveal genetic structuring of the Carpathian newt and provide evidence of interspecific gene flow in the nuclear genome
Van de Putte et al. High genetic diversity and connectivity in a common mesopelagic fish of the Southern Ocean: the myctophid Electrona antarctica
Aramburu et al. Genomic signatures after five generations of intensive selective breeding: Runs of homozygosity and genetic diversity in representative domestic and wild populations of turbot (Scophthalmus maximus)
Khoshkholgh et al. The genetic diversity and differentiation of narrow-clawed crayfish Pontastacus leptodactylus (Eschscholtz, 1823)(Decapoda: Astacidea: Astacidae) in the Caspian Sea Basin, Iran as determined with mitochondrial and microsatellite DNA markers
Khan et al. NextGen sequencing reveals short double crossovers contribute disproportionately to genetic diversity in Toxoplasma gondii
Eimanifar et al. Genetic differentiation of Artemia urmiana from various ecological populations of Urmia Lake assessed by PCR amplified RFLP analysis
Lo et al. Selection and utility of single nucleotide polymorphism markers to reveal fine-scale population structure in human malaria parasite Plasmodium falciparum
Abdul Muneer et al. Comparative assessment of genetic variability in the populations of endemic and endangered Yellow Catfish, Horabagrus brachysoma (Teleostei: Horabagridae), based on allozyme, RAPD, and microsatellite markers
Gupta et al. Characterization of polymorphic microsatellite markers and genetic diversity in wild bronze featherback, Notopterus notopterus (Pallas, 1769)
Baillie et al. Small-scale intraspecific patterns of adaptive immunogenetic polymorphisms and neutral variation in Lake Superior lake trout
Agostini et al. Putative selected markers in the Chionodraco genus detected by interspecific outlier tests
Saini et al. Molecular discrimination of six species of Bagrid catfishes from Indus river system using randomly amplified polymorphic DNA markers
Yu et al. Characterization of 11 novel polymorphic microsatellite loci in the threatened Korean loach, Iksookimia koreensis, isolated using a next-generation sequencing method
Smith et al. A Chromosome-Scale Assembly of the En ormous (32 Gb) Axolotl Genome

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