CN111621572A - 一种cd45基因表达检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CD45基因表达检测试剂盒，其包括捕获探针以及信号放大系统，所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和标记探针；所述捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、能与CD45基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述预扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：能与P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：能与P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述标记探针具有与P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有荧光基团。所述试剂盒还包含快速杂交缓冲液。上述试剂盒具有灵敏度高、准确率高、检测时间短的优点，可快速准确地检测出生物样本中CD45基因的表达水平。

Description

一种CD45基因表达检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种CD45基因表达检测试剂盒。
背景技术
CD45，即白细胞共同抗原，是一种广泛表达在造血细胞(血小板和成熟红细胞除外)表面的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP ase)。CD45由定位于染色体1q31.3-1q32.1的PTPRC基因编码，是调节T细胞和B细胞活化成熟和胸腺选择的重要因子，在淋巴细胞发育和活化、细胞因子受体介导的信号转导、骨髓细胞功能中起着重要作用。随着对CD45分子基因结构和功能的不断研究和深入认识，CD45已作为重要的分子靶点，用于免疫治疗和抗癌策略研究。在循环肿瘤细胞(CTCs)的研究中，CD45常被作为白细胞标志物，用于CTCs的分离与鉴定。研究发现，联合CD45的荧光原位杂交(FISH)法可显著改善癌症患者血液样本中CTCs检测的敏感性和特异性，该方法检出的CTCs数量与癌症患者的疾病状态、预后有关。另有研究也发现，EpCAM+CK+CD45－循环物质数量与去势抵抗性前列腺癌患者的总生存率有关，而EpCAM+CK+CD45+循环物质数量与患者总生存率无关。鉴于CD45表达与肿瘤临床特点和预后的相关性及其在CTCs研究中的应用价值，促使我们开发一种CD45基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于进一步深入研究CD45基因的表达在各种肿瘤发生、发展及预后方面的临床意义。
目前CD45表达检测多采用流式细胞术和原位杂交法。流式细胞术是在细胞分子水平上通过CD45单克隆抗体对单细胞悬液进行多参数、快速的定量分析，从而实现CD45表达的检测，但其检测结果的准确性受多方因素影响，且该方法涉及的仪器成本高，需要训练有素的人员来操作系统和制样。原位杂交法是将标记的CD45基因探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，从而实现对CD45基因表达的检测。该方法常应用于CTCs研究中，可检测单个细胞中CD45基因的定位和表达情况；但是，该方法的检测结果受多方面影响，如样本前处理方法、探针灵敏度和特异性、杂交液等；另外，原位杂交法步骤繁多，容易造成荧光信号丢失，可能导致假阴性结果。针对现有检测技术的不足，中国专利申请CN201710217573.3公开了一种基因表达检测试剂盒，所述试剂盒在用于基因原位杂交检测时具有特异性高和灵敏度好的优点。但进一步的研究发现，上述检测试剂盒的信号放大系统和检测时长需要进一步优化，以达到更好的检测效果。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种准确率高、检测时间短的CD45基因表达检测试剂盒，可快速地、准确地检测出生物样本中CD45基因的表达水平，提供临床相关辅助信息。
具体技术方案如下：
一种CD45基因表达检测试剂盒，包括针对CD45基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针为茎环状，用于连接CD45基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与CD45基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述预扩增探针连接捕获探针与扩增探针，每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；
所述扩增探针连接预扩增探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有荧光基团。
在其中一些实施例中，优选所述P3序列的长度为24～26bp，GC含量为25％～30％。
在其中一些实施例中，优选所述P4序列的长度为24～26bp，GC含量为25％～30％。
在其中一些实施例中，针对CD45基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.10中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQ ID NO.21，P2序列为SEQID NO.23；
和/或，针对CD45基因mRNA的预扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.25，P4序列为SEQID NO.27；
和/或，针对CD45基因mRNA的扩增探针中，P5序列为SEQ ID NO.29，P6序列为SEQID NO.31；
和/或，针对CD45基因mRNA的标记探针中，P7序列为SEQ ID NO.33。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针为茎环状，用于连接内参基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与内参基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述预扩增探针连接捕获探针与扩增探针，每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；
所述扩增探针连接预扩增探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有与荧光基团，所述荧光基团与针对CD45基因mRNA的标记探针的荧光基团互不相同。
在其中一些实施例中，优选所述内参基因为ACTB基因。
在其中一些实施例中，所述针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQ ID NO.22，P2序列为SEQ ID NO.24；针对ACTB基因mRNA的预扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.26，P4序列为SEQ ID NO.28；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P5序列为SEQ ID NO.30，P6序列为SEQ IDNO.32；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P7序列为SEQ ID NO.34。
在其中一些实施例中，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基。
在其中一些实施例中，优选所述间隔臂序列为5～10个T。
优选所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LCRED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括快速杂交缓冲液，所述快速杂交缓冲液为包含以下浓度组分的无核酸酶水溶液：甲酰胺25～35v/v％、硫酸葡聚糖25～30w/v％、异硫氰酸胍0.5～1.5mol/L、Cot1 DNA0.1～1mg/mL、氯化钠8.5～9.0g/L、柠檬酸钠4.2～4.6g/L。
在其中一些实施例中，所述快速杂交缓冲液为包含以下浓度组分的无核酸酶水溶液：甲酰胺28～31v/v％、硫酸葡聚糖27～29w/v％、异硫氰酸胍0.8～1.2mol/L、Cot1 DNA0.1～0.2mg/mL、氯化钠8.6～8.8g/L、柠檬酸钠4.3～4.5g/L。
在其中一些实施例中，优选所述快速杂交缓冲液为包含以下浓度组分的无核酸酶水溶液：甲酰胺30v/v％、硫酸葡聚糖28w/v％、异硫氰酸胍1mol/L、Cot1 DNA 0.1mg/mL、氯化钠8.75g/L、柠檬酸钠4.4g/L。发明人经过研究发现，此配方制备得到的快速杂交缓冲液可以更有效地提高本发明检测探针的杂交效率，缩短杂交时间。
在其中一些实施例中，所述快速杂交缓冲液的pH值为7.3～7.5；优选地，所述快速杂交缓冲液的pH值为7.4。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种快速的CD45基因mRNA原位检测体系，所述检测体系由包括茎环状捕获探针、预扩增探针、扩增探针和标记探针等多探针组成。经发明人研究，在多探针检测体系中引入预扩增探针并对各探针的组成进行了优化，使得检测体系中探针的杂交特异性、杂交难度和杂交效率之间可以达到很好的平衡，有效实现检测。本发明所述预扩增探针作为一级信号放大探针，扩增探针和标记探针依次作为二级、三级信号放大探针，组成了一个三级信号放大系统，信号放大效果更佳，能够更有效地更好地实现信号放大检测，从而在保证检测准确率的同时有效缩短检测时间。所述检测系统中所使用的各种探针，是发明人经大量试验进行综合评估、改进优化分析后得出的，其能在均一的条件下进行反应，且各探针之间不存在非特异性结合，检测特异性好、信噪比高，从而使检测试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
进一步地，本发明还优化得到了一种非常适用于本发明所述捕获探针的快速杂交缓冲液，所述快速杂交缓冲液通过组分之间的相互配合，能有效提高本发明捕获探针与目标mRNA的原位杂交效率，缩短原位杂交时间，并且杂交后仍然具有信号亮度强、特异性好的特点。
本发明通过检测探针和杂交缓冲液的优化，克服了多重探针检测系统中探针之间的不均一性和非特异性反应，可有效缩短探针杂交时间，提高原位杂交法检测效率，使本发明试剂盒具有准确率高和检测时间短等优点，能快速准确地对CD45基因的表达进行检测。
附图说明
图1为本发明CD45基因表达阴性和阳性检测结果示意图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明还涉及了一种生物样本中CD45基因表达的检测方法，主要包括以下步骤：
(1)得到待检测生物样本；
(2)红细胞裂解液处理生物样本，去除无核红细胞，富集有核细胞；
(3)膜过滤去除白细胞，富集待检测细胞；
(4)对待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(5)检测CD45基因是否表达。
所述步骤(5)包括以下步骤：
a)捕获探针与CD45基因mRNA序列和预扩增探针结合；每条捕获探针从5’端到3’端的碱基序列组成依次为：茎部结构序列、能与CD45基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和CD45基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基序列组成依次为：能与相应茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列，间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
b)所述预扩增探针的P4序列与扩增探针结合；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
c)所述扩增探针的P6序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；
d)通过荧光检测仪检测。
实施例1CD45基因表达检测试剂盒(原位杂交法)
本实施例所述的CD45基因表达检测试剂盒，包含针对CD45基因和内参基因ACTB的原位杂交法检测试剂，主要包括有：
1.捕获探针
捕获探针由四部分碱基序列组成，从5’端到3’端依次是茎部结构序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、能与扩增探针P3序列结合的P2序列，同一目标mRNA的捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T。针对每个mRNA分别设计10条捕获探针，在保证整个检测系统的稳定性的基础上，再提高检测的特异性(具体使用时，针对每个目标基因，选择5条或5条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。本实施例优选针对相应的目标mRNA捕获探针的特异性P1序列见表1，不同类型的目标mRNA的捕获探针的茎部结构序列见表2，P2序列见表3。
表1目标mRNA捕获探针的P1序列
Figure BDA0002573656890000051
Figure BDA0002573656890000061
表2捕获探针的茎部结构序列
mRNA 捕获探针茎部结构序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CD45 GATAACAC 21
ACTB GTTCTGTA 22
表3捕获探针的P2序列
mRNA 捕获探针P2序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CD45 GTATGATATGAGTTATGTGTTATC 23
ACTB TTAATGATGAATAGTATACAGAAC 24
2.预扩增探针
预扩增探针是连接捕获探针与扩增探针之间的序列，预扩增探针由三部分碱基序列组成，从5’端到3’端依次是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列、5个T的间隔臂序列、能与扩增探针互补配对的P4序列。所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％。本实施例优选针对相应的目标mRNA的预扩增探针的P3序列见表4，P4序列见表5。
表4预扩增探针的P3序列
mRNA 预扩增探针P3序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CD45 GATAACACATAACTCATATCATAC 25
ACTB GTTCTGTATACTATTCATCATTAA 26
表5预扩增探针的P4序列
mRNA 预扩增探针P4序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CD45 TATGTGATGATATTGAGTTATTAG 27
ACTB TAAGGAATGTTATTAGATGAATAG 28
3.扩增探针
扩增探针是连接预扩增探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分碱基序列组成，从5’端到3’端依次是能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、5个T的间隔臂序列、能与标记探针互补配对的P6序列。所述目标mRNA的扩增探针的P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和CD45 mRNA之间不存在特异性结合的序列。本实施例优选针对相应的目标mRNA的扩增探针的P5序列见表6，P6序列见表7。
表6扩增探针的P5序列
mRNA 扩增探针P5序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CD45 CTAATAACTCAATATCATCACATA 29
ACTB CTATTCATCTAATAACATTCCTTA 30
表7扩增探针的P6序列
mRNA 扩增探针P6序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CD45 TGATATGAGTAAGATATTGTAGTA 31
ACTB TGAATATGTGTAAGTAGTATGTAT 32
4.标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针序列P6互补配对的P7序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P6序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。标记探针的荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，不同类型目标mRNA的标记探针选择的荧光基团互不相同，且选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便区分不同类型的目标mRNA。
表8标记探针的P7序列
mRNA 标记探针P7序列(5’-3’) SEQ ID NO. 荧光基团
CD45 TACTACAATATCTTACTCATATCA 33 Alexa Fluor 488(绿色荧光信号)
ACTB ATACATACTACTTACACATATTCA 34 Cy3(红色荧光信号)
本实施例所述的CD45基因表达检测试剂盒(原位杂交法)，还提供了快速杂交缓冲液，用于探针杂交，以提高杂交效率。
5.快速杂交缓冲液
快速杂交缓冲液是与捕获探针混合液组成捕获工作液用于探针杂交，快速杂交缓冲液为包含以下试剂组分的无核酸酶水溶液：甲酰胺、硫酸葡聚糖、异硫氰酸胍、Cot1 DNA、氯化钠、柠檬酸钠和无核酸酶水，pH为7.3～7.5。所述甲酰胺的体积浓度为25％～35％，硫酸葡聚糖的质量浓度为25％～30％，异硫氰酸胍的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L，Cot1 DNA浓度为0.1～1mg/mL，氯化钠的浓度为8.5～9.0g/L，柠檬酸钠的浓度为4.2～4.6g/L，无核酸酶水作为溶剂；本实施例优选快速杂交缓冲液pH为7.4，甲酰胺的体积浓度为30％，硫酸葡聚糖的质量浓度为28％，异硫氰酸胍的浓度为1mol/L，Cot1 DNA浓度为0.1mg/mL，氯化钠的浓度为8.75g/L，柠檬酸钠的浓度为4.4g/L。所述快速杂交缓冲液能有效促进所述捕获探针与目标mRNA的杂交效率，缩短杂交时间，能够实现快速杂交、短时杂交；并且杂交后仍然具有信号亮度强、特异性好的特点。
本实施例所述的CD45基因表达检测试剂盒(原位杂交法)，还可以包括红细胞裂解液，用于对生物样本进行红细胞裂解处理，去除红细胞，富集有核细胞，再经膜过滤去除白细胞以达到富集待检测细胞的目的。所述红细胞裂解液的组成为：氯化铵0.31M，碳酸氢钾0.021M，乙二胺四乙酸二钠0.0042M，0.1％甲醛。所述生物样本包括但并不局限于以下来源：血液、具有红细胞作为“污染物”的活检样本、骨髓、尿、体液、培养的人或动物细胞等。
实施例2运用实施例1所述试剂盒对样本进行检测
所述各种溶液的配方如下表9：
表9溶液的配方
Figure BDA0002573656890000081
本实施例优选肿瘤患者血液样本，对样本中CTCs的CD45基因表达水平进行检测，其中捕获探针混合液、预扩增探针混合液、扩增探针混合液、显色探针混合液均使用实施例1试剂盒的全部探针，快速杂交缓冲液、红细胞裂解液均使用实施例1中所述配方。
1、样本前处理，待检测细胞过滤至滤膜上
(1)取患者静脉中血液5mL，加入到含有10mL红细胞裂解液的分离管中，混合1分钟，600×g离心5分钟，弃上清液体保留细胞沉淀；
(2)在细胞沉淀中加入1～2mL红细胞裂解液，混匀重悬沉淀，600×g离心5分钟，弃上清液体保留细胞沉淀，即得到去除红细胞之后的细胞样本。
(3)向上述获得的细胞沉淀中加入4mL PBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8分钟。
(4)样本过滤：将步骤(3)所述的液体转移至过滤器，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mL PBS，洗涤管壁后抽滤液体。
(5)将滤膜转移至24孔板中，加入400μL的4％甲醛溶液，室温固定1小时。
(6)去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
2、透化处理
(1)在新的24孔板中每孔加入50μL透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余液体，将滤膜倒扣在透化剂上，室温孵育5分钟。
(2)去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤2次，每次浸泡2分钟。
3、消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交
(1)配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75μL的PBS、1.25μL的消化酶，总体积50μL。
(2)按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μL。
(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，室温静置1小时。
(4)去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
4、探针杂交，形成目标mRNA序列-捕获探针-预扩增探针复合体
(1)快速杂交缓冲液、扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。
(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获探针工作液组成如下：8μL捕获混合液、42μL快速杂交缓冲液(40℃预热)，总体积50μL。按实验需要配制一定体积的捕获工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μL。
(3)配制预扩增工作液：对于每个样本，预扩增工作液组成如下：2μL预扩增混合液、48μL扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50μL。按实验需要配制一定体积的预扩增工作液，涡旋混匀，分装至已含有捕获工作液的24孔板中，每孔50μL。
(4)将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上(同时包含捕获探针和预扩增探针)，盖上24孔板盖，40±1℃孵育2小时(可参考实施例6)。
(5)去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
5、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大
(1)扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。
(2)配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2μL扩增混合液、48μL扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50μL。按实验需要配制一定体积的扩增工作液，涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μL。
(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，盖上24孔板盖，40±1℃孵育30分钟。
(4)去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
6、显色，荧光标记目标信号
(1)显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；整个显色操作过程需避光操作。
(2)配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成如下：2μL显色混合液、48μL显色缓冲液(40℃预热)，总体积50μL。按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μL。
(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，盖上板盖，40±1℃避光孵育30分钟。
(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
7、荧光显微镜观察CD45基因的表达
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μL含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于－20℃保存。
(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量。
(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
(4)然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察并记录实验结果。
(5)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表10荧光基团的激发波长和发射波长如下表：
荧光基团 激发波长(Excitation filter) 发射波长(Emission filter)
DAPI 330～385nm 420nm
Alexa Fluor 488 460～495nm 510～550nm
Cy3 545～580nm 610nm
8、检测结果判断及分析
(1)CD45基因表达判定标准
在滤膜上，富集有待检测细胞，本试剂盒阳性表达判定标准(参见图1)：
a)样本中有1个或1个以上细胞表达CD45基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。
b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对CD45基因mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否为表达CD45。
(2)使用上述检测方法，对15例肿瘤患者外周血样本(编号1～15)进行检测，同时选用市售CD45阴性肺癌细胞株NCl-H1975和CD45阳性细胞株CCRF-HSB-2淋巴母细胞作为阴阳性对照。分别各取约1000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为5份编号16～20和21～25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果如表11所示：
表11样本检测结果
Figure BDA0002573656890000101
Figure BDA0002573656890000111
检测发现，每个标本的每次检测结果相同，且由上述检测结果可知，本发明CD45基因表达检测试剂盒具有很高的准确性，能实现临床样本的检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对患者循环肿瘤细胞中CD45基因的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3预扩增探针的运用
1、试剂盒制备的设计(预扩增探针的运用)
本发明试剂盒的信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，与传统的由扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针组成的信号放大系统相比，本发明试剂盒的信号放大系统通过预扩增探针的运用进一步提高了荧光信号强度，进一步提高了RNA原位杂交的检测灵敏度。
为了考察预扩增探针的运用对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-2，其中实验组1的信号放大系统使用预扩增探针，实验组2的信号放大系统不使用预扩增探针。实验组1相应目标mRNA的所述捕获探针、预扩增探针、扩增探针和标记探针数量和组成如实施例1所述，检测方法如实施例2所述；实验组2相应目标mRNA的所述捕获探针P1序列、扩增探针和标记探针如实施例1所述，捕获探针茎部结构序列、P2序列的碱基组成根据扩增探针P5序列进行调整，即P2序列变更为与扩增探针P5序列互补配对的P4序列，茎部结构序列变更为与P4序列3’端互补配对的序列，检测方法省略预扩增步骤，其余如实施例2所述。
每组相应目标mRNA的所述捕获探针数量、扩增探针和标记探针的组成如实施例1和实施例2所述。具体设计如表12所示。
表12预扩增探针的运用
Figure BDA0002573656890000112
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，实验组2的样本检测过程中省去预扩增步骤，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表13试剂盒运用预扩增探针与不运用预扩增探针的检测结果比较
Figure BDA0002573656890000121
从上述检测结果可知，当使用本发明设计的预扩增探针(实验组1)时，所有阳性细胞都能被检出，而当不使用预扩增探针(实验组2)时，存在个别阳性细胞未能被检出的现象；与不使用预扩增探针(实验组2)相比，使用本发明设计的预扩增探针(实验组1)检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；说明本发明试剂盒信号放大系统预扩增探针的运用进一步提高了信号放大效果和荧光信号强度，提高了检测灵敏度，为试剂盒检测效果的稳定性提供了保障，使得本发明试剂盒在更短的杂交时间(2h)内即可保证检测结果的准确性。
实施例4预扩增探针碱基序列长度对试剂盒检测效果的影响
为了考察预扩增探针碱基序列长度对试剂盒检测效果的影响，以预扩增探针的P3序列为例，设计实验组1-5，实验组1选用的P3序列为本发明实施例1预扩增探针的P3序列3’端减少2个碱基后的序列，序列长度为22bp；实验组2选用本发明实施例1预扩增探针的P3序列，序列长度为24bp；实验组3-5选用的P3序列为本发明实施例1预扩增探针的P3序列3’端分别增加2、4、6个碱基后的序列，序列长度分别为26bp、28bp和30bp。各实验组除了预扩增探针的P3序列长度不同以及能与预扩增探针P3序列互补配对的P2序列相应改变之外，P3序列的GC含量控制在25％～30％，其它组分均相同，对比其检测效果。试剂盒具体设计参见表14。
表14预扩增探针P3序列长度的选择
Figure BDA0002573656890000122
Figure BDA0002573656890000131
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约5000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为25份，依次编号1～25和26～50。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～50进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表15试剂盒选用不同长度的预扩增探针P3序列的检测结果比较
Figure BDA0002573656890000132
通过五组实验对比可知，使用序列长度为24bp、26bp和28bp的预扩增探针P3序列均可完成检测，所有阳性细胞均能有效被检出；但当预扩增探针P3序列为24bp时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。当使用序列长度为22bp的预扩增探针P3序列时，虽然检测到的荧光信号点数很多，但由于序列过短导致一些非特异性杂交，从而导致一些CD45阴性细胞被检测为CD45阳性。当使用序列长度为30bp的预扩增探针P3序列时，由于序列过长导致杂交效率有所降低，从而造成一些阳性细胞不能有效被检出，且检测到的荧光信号点数明显下降，不能实现准确检测。因此，当预扩增探针P3序列长度设计为24～28bp时，才能与本发明检测体系中的其他探针有效配合，试剂盒才能实现准确检测。其中，当使用序列长度为24bp的预扩增探针P3序列时，试剂盒检测效果最佳；而选用序列长度为22bp或30bp的预扩增探针P3序列会降低试剂盒检测性能，影响检测结果的准确性。
针对预扩增探针P4序列长度的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。
鉴于以上实验结果，本发明预扩增探针的P3序列和P4序列的长度为24～28bp，优选为24～26bp，本发明实施例1所述试剂盒预扩增探针的P3序列和P4序列的长度更优选为24bp。
实施例5预扩增探针碱基序列GC含量对试剂盒检测效果的影响
为了考察预扩增探针碱基序列GC含量对试剂盒检测效果的影响，以预扩增探针的P3序列为例，设计实验组1-6，实验组1选用的P3序列为本发明实施例1预扩增探针的P3序列1～2个碱基G或C替换为碱基A或T后的序列，GC含量为20％～25％；实验组2选用本发明实施例1预扩增探针的P3序列，GC含量为25％～30％；实验组3-6选用的P3序列为本发明实施例1预扩增探针的P3序列适当数量的碱基A或T替换为碱基G或C后的序列，GC含量分别为30％～35％、35％～40％、40％～45％和45％～50％。各实验组除了预扩增探针的P3序列GC含量不同以及能与预扩增探针P3序列互补配对的P2序列相应改变之外，P3序列长度不变，均为24bp，其它组分均相同，对比其检测效果。试剂盒具体设计参见表16。
表16预扩增探针P3序列GC含量的选择
Figure BDA0002573656890000141
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表17试剂盒选用不同GC含量的预扩增探针P3序列的检测结果比较
Figure BDA0002573656890000151
通过六组实验对比可知，使用GC含量分别为25％～30％、30％～35％、35％～40％和40％～45％的预扩增探针P3序列时(实验组2～5)，试剂盒检测效果最好，能将样本中细胞完全检出。当选用GC含量为20％～25％的预扩增探针P3序列时(实验组1)，由于GC含量过低，导致杂交难度增加、杂交效率下降，从而导致检测效果不稳定，一些阳性细胞不能有效被检出，且检测到的荧光信号明显减少。当选用GC含量为45％～50％的预扩增探针P3序列时(实验组6)，虽然检测到的荧光信号点数很多，但由于GC含量过高造成一些非特异性杂交，从而导致一些CD45阴性细胞被检测为CD45阳性，不能实现准确检测。因此，当预扩增探针P3序列GC含量为25％～45％时，才能与本发明检测体系中的其他探针有效配合，使试剂盒检测效果最好；而选用GC含量为20％～25％或45％～50％的预扩增探针P3序列会降低试剂盒检测性能，影响检测结果的准确性。
针对预扩增探针P4序列GC含量的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。
鉴于以上实验结果，本发明预扩增探针的P3序列和P4序列的GC含量为25％～45％，本发明实施例1所述试剂盒优选预扩增探针的P3序列和P4序列的GC含量选择25％～30％。
实施例6快速杂交缓冲液的运用
为了考察所述快速杂交缓冲液的运用对试剂盒检测效果的影响，设计四组实验组，依次记为实验组1-4，其中实验组1选用本发明试剂盒中的快速杂交缓冲液，实验组2-4分别选用不同的常规杂交缓冲液，四组实验组除了杂交缓冲液的不同之外，其它组分均相同。杂交时，四组实验组的杂交时间均设置为1小时、2小时、3小时。具体设计如表18所示。
表18杂交缓冲液的选择
Figure BDA0002573656890000161
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约7200个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为36份，依次编号1～36和37～72。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～72进行检测，杂交时间分别为1小时、2小时、3小时，每个实验组每个杂交时间每种细胞株各检3份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。
具体结果如下：
表19试剂盒选用不同杂交缓冲液在不同杂交时间内的检测结果比较
Figure BDA0002573656890000162
Figure BDA0002573656890000171
从上述检测结果可知，当使用本发明所述快速杂交缓冲液(实验组1)时，试剂盒检测效果最好，杂交1小时、2小时或3小时，均能将样本中阳性细胞完全检出。当使用常规杂交缓冲液(实验组2-4)进行检测时，试剂盒检测效果不稳定，杂交1小时、2小时或3小时，均存在一些阳性细胞不能被有效检出；与常规杂交缓冲液(实验组2-4)相比，无论是杂交1小时、2小时还是3小时，使用本发明的快速杂交缓冲液检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定；说明本发明的快速杂交缓冲液更适合本发明的检测体系，杂交效果最好、信号最强，在保证检测结果准确性的同时能有效促进本发明捕获探针杂交效率，缩短杂交时间。因此，在将本发明所述快速杂交缓冲液用于捕获探针杂交时，为保障试剂盒检测准确性的同时节约时间成本，杂交时间优选为2小时。
实施例7异硫氰酸胍浓度对快速杂交缓冲液使用效果的影响
为了考察异硫氰酸胍浓度对快速杂交缓冲液使用效果及试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-7，快速杂交缓冲液中异硫氰酸胍浓度分别为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5和1.8mol/L，六组实验组除了快速杂交缓冲液中异硫氰酸胍浓度不同之外，其它组分均相同(即甲酰胺体积浓度为30％，硫酸葡聚糖质量浓度为28％，Cot1DNA浓度为0.1mg/mL，氯化钠浓度为8.75g/L，柠檬酸钠浓度为4.4g/L，无核酸酶水作为溶剂，pH为7.4)，对比其检测效果。
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约4200个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为21份，依次编号1～21和22～42。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～42进行检测，每个实验组每种细胞株各检3份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表20试剂盒选用不同异硫氰酸胍浓度的杂交缓冲液的检测结果比较
Figure BDA0002573656890000181
通过七组实验对比可知，使用异硫氰酸胍浓度为0.5～1.5mol/L的快速杂交缓冲液均可完成检测，但当异硫氰酸胍浓度为0.8～1.2mol/L时，快速杂交缓冲液的使用效果和试剂盒的检测效果才都很好；其中，当异硫氰酸胍浓度为1.0mol/L时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。当使用异硫氰酸胍浓度为0.2mol/L的杂交缓冲液时，由于异硫氰酸胍浓度过低造成荧光信号亮度降低，使杂交缓冲液的使用效果变差，从而导致检测到的荧光信号点数明显减少，甚至一些阳性细胞不能被有效检出，不能实现准确检测。当使用异硫氰酸胍浓度为1.8mol/L的杂交缓冲液时，由于异硫氰酸胍浓度过高引起荧光信号背景增高，使杂交缓冲液的使用效果下降，从而导致检测到的荧光信号点数也明显减少，甚至一些阳性细胞也不能被有效检出，也不能实现准确检测。因此，本发明快速杂交缓冲液中异硫氰酸胍浓度为0.5～1.5mol/L；优选地，异硫氰酸胍浓度为0.8～1.2mol/L；进一步地，异硫氰酸胍浓度优选为1.0mol/L。
实施例8硫酸葡聚糖浓度对快速杂交缓冲液使用效果的影响
为了考察硫酸葡聚糖浓度对快速杂交缓冲液使用效果及试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-8，快速杂交缓冲液中硫酸葡聚糖质量浓度分别为24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％和31％，六组实验组除了快速杂交缓冲液中硫酸葡聚糖浓度不同之外，其它组份均相同(即甲酰胺体积浓度为30％，异硫氰酸胍浓度为1mol/L，Cot1DNA浓度为0.1mg/mL，氯化钠浓度为8.75g/L，柠檬酸钠浓度为4.4g/L，无核酸酶水作为溶剂，pH为7.4。)，对比其检测效果。
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约4800个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本均分为24份，依次编号1～24和25～48。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～48进行检测，每个实验组每种细胞株各检3份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表21试剂盒选用不同硫酸葡聚糖浓度的杂交缓冲液的检测结果比较
Figure BDA0002573656890000191
Figure BDA0002573656890000201
通过八组实验对比可知，使用硫酸葡聚糖质量浓度为25％～30％的快速杂交缓冲液均可完成检测，尤其是当硫酸葡聚糖质量浓度为27％～29％时，快速杂交缓冲液的使用效果和试剂盒的检测效果才都很好；其中，当硫酸葡聚糖质量浓度为28％时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。当使用硫酸葡聚糖质量浓度为24％的杂交缓冲液时，由于硫酸葡聚糖质量浓度过低造成荧光信号强度下降，使杂交缓冲液的使用效果变差，从而导致检测到的荧光信号点数明显减少，甚至一些阳性细胞不能被有效检出，不能实现准确检测。当使用硫酸葡聚糖质量浓度为31％的杂交缓冲液时，硫酸葡聚糖质量浓度过高造成杂交缓冲液粘度过大并对检测操作造成难度，使杂交缓冲液的使用效果不稳定，从而导致检测到的荧光信号不稳定、荧光信号点数减少，甚至一些阳性细胞也不能被有效检出，也不能实现准确检测。因此，本发明快速杂交缓冲液中硫酸葡聚糖质量浓度为25％～30％；优选地，硫酸葡聚糖质量浓度为27％～29％；进一步地，硫酸葡聚糖质量浓度优选为28％。
实施例9甲酰胺浓度对快速杂交缓冲液使用效果的影响
为了考察甲酰胺浓度对快速杂交缓冲液使用效果及试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-8，快速杂交缓冲液中甲酰胺体积浓度分别为22％、25％、28％、29％、30％、31％、32％和35％，各实验组除了快速杂交缓冲液中甲酰胺浓度不同之外，其它组份均相同(即硫酸葡聚糖质量浓度为28％，异硫氰酸胍浓度为1mol/L，Cot1 DNA浓度为0.1mg/mL，氯化钠浓度为8.75g/L，柠檬酸钠浓度为4.4g/L，无核酸酶水作为溶剂，pH为7.4)，对比其检测效果。
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约4800个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为24份，依次编号1～24和25～48。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～48进行检测，每个实验组每种细胞株各检3份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表22试剂盒选用不同甲酰胺浓度的杂交缓冲液的检测结果比较
Figure BDA0002573656890000202
Figure BDA0002573656890000211
通过八组实验对比可知，使用甲酰胺体积浓度为25％～35％的快速杂交缓冲液均可完成检测，尤其是当甲酰胺体积浓度为28％～35％时，快速杂交缓冲液的使用效果和试剂盒的检测效果都很好，检测到的荧光信号强度很稳定，并不会随着甲酰胺体积浓度的增加而增加。当使用甲酰胺体积浓度为22％的杂交缓冲液时，由于甲酰胺体积浓度过低造成杂交效率降低、荧光信号强度下降，使杂交缓冲液的使用效果变差，从而导致检测到的荧光信号点数明显减少，甚至一些阳性细胞不能被有效检出，不能实现准确检测。因此，本发明快速杂交缓冲液中甲酰胺体积浓度为25％～35％；为保障试剂盒检测结果的准确性同时节约试剂成本，优选地，甲酰胺体积浓度为28％～31％；更优选地，甲酰胺体积浓度为30％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种CD45基因表达检测试剂盒
<130> 2020-07-01
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (10)

1.一种CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对CD45基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针为茎环状，用于连接CD45基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与CD45基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述预扩增探针连接捕获探针与扩增探针，每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；
所述扩增探针连接预扩增探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和CD45基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有荧光基团。
2.根据权利要求1所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述P3序列的长度为24～26bp，GC含量为25％～30％；和/或，所述P4序列的长度为24～26bp，GC含量为25％～30％。
3.根据权利要求1或2所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，针对CD45基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQ ID NO.21，P2序列为SEQ ID NO.23；
和/或，针对CD45基因mRNA的预扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.25，P4序列为SEQ IDNO.27；
和/或，针对CD45基因mRNA的扩增探针中，P5序列为SEQ ID NO.29，P6序列为SEQ IDNO.31；
和/或，针对CD45基因mRNA的标记探针中，P7序列为SEQ ID NO.33。
4.根据权利要求1所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括预扩增探针、扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针为茎环状，用于连接内参基因mRNA和预扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与内参基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述预扩增探针连接捕获探针与扩增探针，每条预扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列，所述P4序列的长度为24～28bp，GC含量为25％～45％；
所述扩增探针连接预扩增探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与预扩增探针的P4序列互补配对的P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和内参基因mRNA之间不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P6序列互补配对的P7序列，且末端修饰有与荧光基团，所述荧光基团与针对CD45基因mRNA的标记探针的末端修饰的荧光基团互不相同。
5.根据权利要求4所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因；所述针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.20中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQ ID NO.22，P2序列为SEQ ID NO.24；针对ACTB基因mRNA的预扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.26，P4序列为SEQ ID NO.28；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P5序列为SEQ ID NO.30，P6序列为SEQ ID NO.32；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P7序列为SEQ ID NO.34。
6.根据权利要求1～5任一项所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基；优选地，所述间隔臂序列为5～10个T。
7.根据权利要求1～5任一项所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。
8.根据权利要求1～7任一项所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括快速杂交缓冲液，所述快速杂交缓冲液为包含以下浓度组分的无核酸酶水溶液：甲酰胺25～35v/v％、硫酸葡聚糖25～30w/v％、异硫氰酸胍0.5～1.5mol/L、Cot1 DNA 0.1～1mg/mL、氯化钠8.5～9.0g/L、柠檬酸钠4.2～4.6g/L。
9.根据权利要求8所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述快速杂交缓冲液为包含以下浓度组分的无核酸酶水溶液：甲酰胺28～31v/v％、硫酸葡聚糖27～29w/v％、异硫氰酸胍0.8～1.2mol/L、Cot1 DNA 0.1～0.2mg/mL、氯化钠8.6～8.8g/L、柠檬酸钠4.3～4.5g/L。
10.根据权利要求8或9所述的CD45基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述快速杂交缓冲液的pH值为7.3～7.5。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031993A (zh) * 2014-05-27 2014-09-10 益善生物技术股份有限公司 循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法
CN106480188A (zh) * 2016-10-17 2017-03-08 高新 转移性前列腺癌早期预测的分子探针、试剂盒及该分子探针的应用
CN106636318A (zh) * 2015-10-30 2017-05-10 益善生物技术股份有限公司 核酸信号放大检测试剂盒
CN108707662A (zh) * 2017-04-05 2018-10-26 益善生物技术股份有限公司 一种ar-v7表达检测试剂盒
CN110904195A (zh) * 2019-12-24 2020-03-24 益善生物技术股份有限公司 一种cd55基因表达检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031993A (zh) * 2014-05-27 2014-09-10 益善生物技术股份有限公司 循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法
CN106636318A (zh) * 2015-10-30 2017-05-10 益善生物技术股份有限公司 核酸信号放大检测试剂盒
CN106480188A (zh) * 2016-10-17 2017-03-08 高新 转移性前列腺癌早期预测的分子探针、试剂盒及该分子探针的应用
CN108707662A (zh) * 2017-04-05 2018-10-26 益善生物技术股份有限公司 一种ar-v7表达检测试剂盒
CN110904195A (zh) * 2019-12-24 2020-03-24 益善生物技术股份有限公司 一种cd55基因表达检测试剂盒

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