CN117051092A - 一种用于检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域,尤其是涉及一种用于检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒及其检测方法和应用。一种用于检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒,包括:用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液1和用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液2。该试剂盒操作简单、体系稳定、特异性强、灵敏度高、准确度高、通量高、成本低且适用广泛。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,尤其是涉及一种用于检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
他克莫司(Tac,又名FK506)是继环孢素(CsA)后的又一钙神经蛋白抑制剂(CNI),因其具有更高的移植物存活率、更低的排斥反应发生率及更少的副作用等优点,被广泛应用于肾移植、肝移植、心脏移植等各种器官移植术后的抗排斥治疗,近年来,也被越来越多地用于治疗肾小球肾炎和其他风湿性免疫疾病如狼疮肾炎、类风湿性关节炎等。但是其首过效应显著,口服生物利用度介于4%-89%,个体化差异显著,造成此差异的原因,除了传统上的病理、生理、性别、年龄、身高、体重、依从性等方面外,遗传因素是影响他克莫司反应差异的重要因素。
细胞色素P450酶系3A(cytochrome P450 3A,CYP3A)是肝内重要的代谢酶,占细胞色素P450超家族酶系的30%以上,参与了体内50%以上的药物代谢。在CYP3A中,又以CYP3A5在体内分布最广且相关研究较多,其在肝脏、小肠、肾脏中表达丰富,参与了CYP3A酶系50%以上的代谢活动,但是由于人群中广泛存在的CYP3A5的单核苷酸多态性,使其参与的药物代谢具有明显的个体差异。CYP3A5编码基因存在多个单核苷酸多态性位点(SNPs),其中最常见的突变是CYP3A5*3(c.6986A>G,rs776746)位点的突变,该位点的突变使得mRNA剪切位点发生改变,导致CYP3A5蛋白表达受阻,酶活性发生变化。多项研究数据表明他克莫司药物代谢差异与CYP3A5基因多态性相关。携带CYP3A5基因GG基因型的个体对他克莫司的代谢较慢,使用正常剂量即可达到药物所需血药浓度;携带CYP3A5基因AA基因型或AG基因型的个体对他克莫司的代谢正常或稍慢,均需较高剂量才可以达到药物所需血药浓度。因此,对患者进行CYP3A5基因分型具有重要的临床意义。
目前已经公开的用于检测CYP3A5基因多态性检测的试剂盒检测技术包括了焦磷酸测序、凝胶电泳技术、基因芯片技术等等,如中国专利CN105176991A公开了焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒,其检测结果尽管具有很高的精度,但是其依赖于大型精密仪器设备、固定实验室以及专业操作人员,成本较高步骤繁琐且耗时较长。中国专利CN103122389B公开了一种用于CYP3A5SNP rs776746分型快速检测的试剂盒和检测方法,使用该试剂盒来配制25μL的CYP3A5SNP(rs776746)分型检测反应体系,然后对配制好的反应体系进行PCR扩增反应,最后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,由此可知,该试剂盒的检测方法需要工作人员现场配制PCR反应体系,步骤繁琐且容易出错,给工作人员带来了较多的不便之处。中国专利CN101619352B公开了一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒,其公开了以待检测的来自于人体组织的基因组为模板,用针对特定突变位点设计的引物组和没有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重等位基因特异性PCR扩增,然后将得到的PCR产物与基因芯片上的寡核苷酸探针(等位基因特异性探针)进行杂交,根据杂交结果确定各基因位点的突变类型,该方法操作过程繁琐,难以实现批量化与自动化,结果判读方便,假阳性概率高。
因此有必要开发一种操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强和成本低的检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒,为医院及其它检测机构提供新的检测方案。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供了一种检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒及其检测方法和应用。该试剂盒操作简单、体系稳定、特异性强、灵敏度高、准确度高、通量高、成本低且适用广泛。
为此,本发明第一方面提供了一种用于检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒,包括:用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液1和用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液2。
在本发明的一些实施方式中,所述PCR扩增混合液1包括检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的野生型引物探针组、Taq酶、Tris工作液、MgCl2、dNTPs和Buffer。优选地,所述野生型引物探针组包括野生型引物、公用引物和探针
在本发明的一些实施方式中,所述PCR扩增混合液2包括检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的突变型引物探针组、Taq酶、Tris工作液、MgCl2、dNTPs和Buffer。优选地,所述突变型引物探针组包括突变型引物、公用引物和探针。
在本发明的一些实施方式中,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的野生型引物包括如SEQ ID NO.1所示序列的野生型引物。
根据本发明,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的野生型引物序列为:
反向野生型引物(SEQ ID NO.1):5'-GTGGTCCAAACAGGGAAGAGATC T-3'。
在本发明的一些实施方式中,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的突变型引物包括如SEQ ID NO.2所示序列的突变型引物。
根据本发明,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的突变型引物序列为:
反向突变型引物(SEQ ID NO.2):5'-TGTGGTCCAAACAGGGAAGAGAT TC-3'。
在本发明的一些实施方式中,所述公用引物包括如SEQ ID NO.3所示序列的公用引物。
根据本发明,所述公用引物序列为:
正向公用引物(SEQ ID NO.3):5'-GAGTGGCATAGGAGATACCCACGT A-3'。
在本发明的一些实施方式中,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的探针包括如SEQ ID NO.4所示序列的探针。
根据本发明,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的探针序列为:
探针(SEQ ID NO.4):5'-TTAGAAATGACAGTAGAGCATTCGTTAAGCT GGGT-3'。
在本发明的一些实施方式中,所述PCR扩增混合液1和所述PCR扩增混合液2中Taq酶的浓度为0.27-0.33U/μL。
在本发明的一些实施方式中,所述引物探针的使用规格为100μM,所述Taq酶的使用规格为3U/μL,所述MgCl2的使用规格为50mM,所述dNTPs的使用规格为10mM,所述Buffer使用规格为含甘油的5×Buffer和10×Buffer。
在本发明的一些实施方式中,所述PCR扩增混合液1和PCR扩增混合液2还包括检测内标的引物探针组。
在本发明的一些实施方式中,所述内标包括RPPH。
在本发明的一些实施方式中,所述检测内标的引物包括如SEQ ID NO.5-6所示序列的内标引物。
根据本发明,所述检测内标的引物序列为:
正向引物(SEQ ID NO.5):5'-TCATCAGTGGGGCCACGA-3',
反向引物(SEQ ID NO.6):5'-CTGTTAGGGCCGCCTCTGGC-3'。
在本发明的一些实施方式中,所述检测内标的探针包括如SEQ ID NO.7所示序列的内标探针。
根据本发明,所述检测内标的探针序列为:
探针(SEQ ID NO.7):5'-TGCGTCCTGTCACTCCACTCCCATGT-3'。
在本发明的一些实施方式中,所述探针包括taqman探针。
在本发明的一些实施方式中,所述探针的5'端连接荧光报告基团,所述探针的3'端连接荧光淬灭基团。
在本发明的一些实施方式中,所述荧光报告基团选自FAM、TEXAS RED、VIC、CY5中的一种荧光染料。
在本发明的一些实施方式中,所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2荧光染料。
根据本发明,所述检测CYP3A5 c.6986A>G基因位点的探针5'端采用Texas Red荧光染料标记,所述检测CYP3A5 c.6986A>G基因位点的探针3'端采用BHQ1或者BHQ2荧光染料标记。
根据本发明,所述检测内标RPPH的探针的5'端采用CY5荧光染料标记,所述检测内标RPPH的探针的3'端采用BHQ1或者BHQ2荧光染料标记。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
在本发明的一些实施方式中,所述阳性对照包括含所有目标基因靶序列多态性位点的DNA重组质粒。
根据本发明,阳性对照为含有CYP3A5基因c.6986A>G多态性位点的标准质粒。
在本发明的一些实施方式中,所述阴性对照包括生理盐水。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒包括:包装盒、能够嵌入盒体的装有用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液1的容器、能够嵌入盒体的装有用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液2的容器、能够嵌入盒体的装有阴性对照的容器和能够嵌入盒体的装有阳性对照的容器。
在本发明的一些实施方式中,所述包装盒中还包括设置有嵌入孔的内托。
根据本发明,所述PCR扩增混合液1和所述PCR扩增混合液2的体积均为160μl。
根据本发明,所述阳性对照和阴性对照的体积均为300μl。
本发明第二方面提供了一种采用如本发明第一方面所述的试剂盒的检测方法,所述检测方法包括以下步骤:
S1:提取待测样本的DNA;
S2:根据n=待测样本数+阳性对照+阴性对照,计算所需反应测试数,每个测试分装两个反应体系,所述反应体系一对应的反应管分装5μl的PCR扩增混合液1,所述反应体系二对应的反应管分装5μl的PCR扩增混合液2;
S3:分别取15μl待测样本的基因组DNA提取物、阴性对照和阳性对照混合液加入到所述步骤S2准备的反应体系一和反应体系二的反应管中,混匀、离心转移至PCR扩增区;
S4:荧光定量PCR扩增;
S5:待测样本基因型判定。
在本发明的一些实施方式中,所述检测方法设置两个反应体系,包括反应体系一和反应体系二。
根据本发明,所述反应体系一含有5μl的PCR扩增混合液1,用于检测待测样本是否含有野生型基因位点。
根据本发明,5μl的所述反应体系一包括0.08μl检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的野生型引物、0.08μl公用引物、0.04μl检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的探针、0.03μl检测内标的正向引物、0.03μl检测内标的反向引物、0.04μl检测内标的探针、0.5μl的Taq酶、0.3μl的Tris工作液、0.05μl的MgCl2、0.3μl的dNTPs、2μl含甘油的5×Buffer和1μl含甘油的10×Buffer,剩余由水补足5μl。
根据本发明,所述反应体系二含有5μl的PCR扩增混合液2,用于检测待测样本是否含有突变型基因位点。
根据本发明,5μl的所述反应体系二包括0.06μl检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的突变型引物、0.06μl公用引物、0.04μl检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的探针、0.03μl检测内标的正向引物、0.03μl检测内标的反向引物、0.04μl检测内标的探针、0.5μl的Taq酶、0.3μl的Tris工作液、0.05μl的MgCl2、0.3μl的dNTPs、2μl含甘油的5×Buffer和1μl含甘油的10×Buffer,剩余由水补足5μl。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S1中提取的DNA纯度要求A260/A280为1.8-2.2,浓度为0.5-200ng/μl。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S4中设置反应体系为20μl,按以下程序进行PCR扩增:
预变性反应:95℃反应3min;
扩增反应:95℃反应15s,63.5℃反应45s,45个循环。
检测荧光选择:CYP3A5基因c.6986A>G位点选择Texas Red通道、内标基因选择CY5通道。
本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒用于检测血液样本、口腔拭子、鼻拭子、毛囊、组织脱落细胞或其组合的样本的CYP3A5基因c.6986A>G位点的应用。
本发明的有益效果:
(1)本发明的用于检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒分别设置预混的PCR扩增混合液1和预混的PCR扩增混合液2,提供了一种简便且稳定的预分装方式,免除了PCR扩增体系配制步骤,操作更加便捷,减少了操作误差,方便用户使用、准确度高。
(2)本发明的试剂盒通过将PCR扩增混合液中的各种组分浓缩,获得了体系稳定的预混液,能够兼容较大体积量的待测样本,利于弱阳性样本的检出。
(3)本发明的试剂盒可准确检测低至0.1ng的基因组DNA,灵敏度较高;通过引入内标,对检测过程进行全程质量监控,有效避免假阳性或者假阴性。
(4)本发明的试剂盒能够兼容应用于血液样本、口腔拭子、鼻拭子、毛囊、组织脱落细胞等或其组合多种类型样本的检测,拓宽了试剂盒的使用范围。
(5)本发明的试剂盒的检测技术方法相对于市面上其它检测方法极大的简化了操作强度,可实现1小时左右出结果,大大降低了成本;通过设置两反应体系,检测结果容易判读,为临床医生提供了更多的患者基因信息,为免疫抑制剂药物他克莫司的使用提供了更完善的个性化用药参考,使患者受益。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的试剂盒的结构示意图;附图标记:
1-盒体,2-内托,2-1-嵌入孔,3-装有PCR扩增混合液1的容器,4-装有PCR扩增混合液2的容器,5-装有阴性对照的容器,6-装有阳性对照的容器;
图2为本发明实施例2中不同野生型引物分别对携带CYP3A5基因AA基因型待测样本和携带CYP3A5基因GG基因型待测样本的检测结果图;
图3为本发明实施例2中不同突变型引物分别对携带CYP3A5基因AA基因型待测样本和携带CYP3A5基因GG基因型待测样本的检测结果图;
图4为本发明实施例5中试剂盒对待测样本一进行CYP3A5基因c.6986A>G和内标基因在反应体系一中的检测结果图;
图5为本发明实施例5中试剂盒对待测样本一进行CYP3A5基因c.6986A>G和内标基因在反应体系二中的检测结果图;
图6为本发明实施例5中试剂盒对待测样本二进行CYP3A5基因c.6986A>G和内标基因在反应体系一中的检测结果图;
图7为本发明实施例5中试剂盒对待测样本二进行CYP3A5基因c.6986A>G和内标基因在反应体系二中的检测结果图;
图8为本发明实施例5中试剂盒对待测样本三进行CYP3A5基因c.6986A>G和内标基因在反应体系一中的检测结果图;
图9为本发明实施例5中试剂盒对待测样本三进行CYP3A5基因c.6986A>G和内标基因在反应体系二中的检测结果图;
图10为本发明实施例7中试剂盒对已知浓度和基因型的待测样本在反应体系一中的检测结果图;
图11为本发明实施例7中试剂盒对已知浓度和基因型的待测样本在反应体系二中的检测结果图;
图12为本发明实施例8中存储12月后的试剂盒和现配试剂盒对同一样本分别在反应体系一和反应体系二中的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解,下面将结合实施例来详细说明本发明,这些实施例仅起说明性作用,并不局限于本发明的应用范围。
试剂均采用市售试剂。
样本均由西安天博医学检验所提供。
实施例1试剂盒
常规的同类产品检测试剂盒通常是将PCR反应所需的缓冲溶液、酶反应混合物、引物混合物分装在不同的容器中,在使用时,需要人工现场混合、分装配制所需的PCR反应体系,再添加待测样本溶液,这不可避免的增加了操作的繁琐程度,而且由于PCR反应的高灵敏度难免在配制过程中出现操作误差,使得每一批每一管的反应体系形成误差最终影响检测结果的准确性。为此,详见图1,本实施例提供一种用于检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒,包括:包装盒1、能够嵌入盒体的装有用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液1的容器3、能够嵌入盒体的装有用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液2的容器4、能够嵌入盒体的装有阴性对照的容器5和能够嵌入盒体的装有阳性对照的容器6;为了便于包装,包装盒1中还包括设置有嵌入孔2-1的内托2,上述各容器直接插装在内托2内即可。
其中,所述PCR扩增混合液1包括检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的野生型引物探针组、检测内标的引物探针组、Taq酶、Tris工作液、MgCl2、dNTPs和Buffer;所述PCR扩增混合液2包括检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的突变型引物探针组、检测内标的引物探针组、Taq酶、Tris工作液、MgCl2、dNTPs和Buffer。
本发明的检测试剂盒通过将PCR反应体系所需的引物探针、酶以及缓冲溶液等组分混合在一起,大大简化了PCR反应体系配制步骤,减少了体系配制过程的操作误差。
为了方便结果判读,由此相对应的设计了两个反应体系,即反应体系一和反应体系二,反应体系一含有PCR扩增混合液1,用于检测待测样本是否含有野生型基因位点;反应体系二含有PCR扩增混合液2,用于检测待测样本是否含有突变型基因位点,综合反应体系一和反应体系二的检测结果对待测样本的基因型进行判定。
实施例2引物探针设计
本发明的检测试剂盒针对CYP3A5基因c.6986A>G位点设计特异性扩增引物,用于PCR扩增和荧光检测。根据等位基因特异性PCR原理,每条特异性引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增。为此目的,根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的CYP3A5基因的参考序列(NC_000007.14)以及dbSNP数据库公开的c.6986A>G(SNP ID:rs776746)的信息,采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的引物与探针。为了监测反应体系的有效性,在检测体系内加入内标引物与探针,本发明内标选取人RPPH基因(其GeneBank参考序列编号为:NG_009291.1)。本发明在研发阶段设计多个引物,经PCR条件及体系优化,最终筛选出一组特异性最强、扩增效率最优的引物和探针。
具体的,同时设计多个反向野生型引物和多个反向突变型引物,如表1所示;在相同PCR条件下,分别采用设计的多个反向野生型引物分别对携带CYP3A5基因AA基因型待测样本和携带CYP3A5基因GG基因型待测样本进行检测,检测结果如图2所示;分别采用设计的多个反向突变型引物分别对携带CYP3A5基因AA基因型待测样本和携带CYP3A5基因GG基因型待测样本进行检测,检测结果如图3所示。
表1设计的不同引物序列表
由图2结果显示,引物WR1-3在对携带CYP3A5基因AA基因型待测样本检测中出现S型荧光扩增曲线,引物WR1-3在对携带CYP3A5基因GG基因型待测样本检测中并未出现S型荧光扩增曲线,同时结合扩增曲线的CT值(如表2所示)和荧光信号值,可以得出WR2为优选引物。
表2不同反向野生型引物检测结果CT值汇总表
由图3结果显示,引物MR1-3在对携带CYP3A5基因GG基因型待测样本检测中出现S型荧光扩增曲线,引物MR1-3在对携带CYP3A5基因AA基因型待测样本检测中并未出现S型荧光扩增曲线,同时结合扩增曲线的CT值(如表3所示)和荧光信号值,可以得出MR3为优选引物。
表3不同反向突变型引物检测结果CT值汇总表
综上,本发明最终筛选出最优的引物探针组如表4所示:
表4.特异性引物探针序列表
其中,荧光探针采用Taqman荧光探针,探针序列5'端标记荧光报告基团,3'端标记荧光淬灭基团;优选地,检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的探针5'端采用Texas Red荧光染料标记,3'端采用BHQ1或者BHQ2荧光染料标记;检测内标RPPH的探针5'端采用CY5荧光染料标记,3'端采用BHQ1或者BHQ2荧光染料标记。
实施例3试剂盒的准备
本发明的试剂盒包括PCR扩增混合液1、PCR扩增混合液2、阳性对照和阴性对照;其中,PCR扩增混合液1包括检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的野生型引物探针组、检测内标的引物探针组、Taq酶、Tris工作液、MgCl2、dNTPs和Buffer;PCR扩增混合液2包括检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的突变型引物探针组、检测内标的引物探针组、Taq酶、Tris工作液、MgCl2、dNTPs和Buffer;阳性对照为含有CYP3A5基因c.6986A>G多态性位点的标准质粒;阴性对照为生理盐水。具体的,引物探针的使用规格为100μM,Taq酶的使用规格为3U/μL,MgCl2的使用规格为50mM,dNTPs的使用规格为10mM,然后按照以下表5的配比配制试剂盒的每1测试体积为5μl的PCR扩增混合液1和PCR扩增混合液2。
表5PCR扩增混合液具体组成
然后再等比例扩大PCR扩增混合液1和PCR扩增混合液2至160μl规格,阳性对照和阴性对照均设置为300μl,可以满足用户对大批量待测样本的便捷检测。具体规格如表6所示:
表6试剂盒具体组成和规格
其中,本发明提供的PCR扩增混合液中Taq酶的浓度范围优选为0.27-0.33U/μL,Taq酶的浓度过高会引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
试剂盒的储存条件为:-20℃±5℃避光保存。
试剂盒适用仪器为:由西安天隆科技有限公司自主研发的全自动PCR分析系统Gentier 96E、Gentier 96R或全自动核酸纯化及扩增检测分析系统PANA HM5000等仪器。
本发明的检测试剂盒采用预混形式,与其他PCR技术检测试剂盒比较,无需配液,操作简便。同时,本发明的试剂盒通过将PCR扩增混合液中的各种组分浓缩,获得了体系稳定的预混液,能够兼容较大体积量的待测样本,利于弱阳性样本的检出,具体的仅需移取预混的PCR扩增混合液1和PCR扩增混液2各5μL再添加15μL提取的待测样本DNA溶液。
实施例4试剂盒的检测方法
步骤1:提取待测样本的DNA,采用市面上的核酸提取试剂盒对收集到的待测样本进行DNA提取,具体操作参见试剂盒说明书,提取的DNA纯度要求A260/A280在1.8-2.2之间,浓度在0.5ng/μl-200ng/μl之间。
步骤2:试剂配制,从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温,各组件充分溶解并振荡混匀,2000rpm离心10s;计算所需反应测试数n[n=待测样本数+阳性对照(1)+阴性对照(1)],每个测试按照表7分装2个反应体系,然后转移至样本处理区。
表7反应体系配制表
反应体系 | 检测反应液 | 总体积 |
体系一 | PCR扩增混合液1 | 5μl |
体系二 | PCR扩增混合液2 | 5μl |
步骤3:加样,将处理好的待测样本及阴性对照和阳性对照分别取15μl加入准备好的反应管中,盖紧管盖,涡旋3s混匀,然后6000rpm离心5s后将反应管转移至检测区。
步骤4:PCR扩增及荧光检测,将各反应管按一定顺序放入荧光定量PCR仪上,设置反应体系为20μl,按以下程序进行PCR扩增:
预变性反应:95℃反应3min;
扩增反应:95℃反应15s,63.5℃反应45s,45个循环。
检测荧光选择:CYP3A5基因c.6986A>G位点选择Texas Red通道、内标基因选择CY5通道。
步骤5:数据分析
1)试剂盒有效性判定
阳性对照:各通道27<Ct<33,扩增曲线有明显指数增长期。
阴性对照:各通道均无扩增,Ct>36.5或无Ct值。
如不符合上述条件,则该次实验视为无效,应检查仪器、试剂、扩增条件、实验操作等。
2)样本有效性判定
内标基因:所有样本检测中CY5通道Ct值≤36.5,扩增曲线有明显指数增长期。如不符合此条件,则该样本视为无效样本。
3)基因型判定方式:
在上述PCR反应体系与PCR扩增程序条件下,内标基因信号形成正常的扩增“S”型曲线的前提下,观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成扩增“S”型曲线,若形成扩增“S”型曲线,则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性,并根据野生型反应体系(反应体系一)Ct值与突变型反应体系(反应体系二)Ct值的差值(ΔCt)对待测样本的基因型进行判读,具体基因型检测结果判定方式如表8所示。
表8基因型判定方式
注:1.Ct(1)表示体系一的Ct值,Ct(2)表示体系二的Ct值;
2.无Ct值或Ct>36.5时不使用ΔCt计算方法判读基因型,直接判读。
3.Ct(1)>36.5或无Ct值且Ct(2)>36.5或无Ct值时,基因型检测无效,应检查仪器、试剂、扩增条件、实验操作、模板质量等。
4.阈值设置原则:荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点设置为阈值或由仪器自动设定阈值。
实施例5样本检测基因型判定
本实施例采用实施例3提供的试剂盒和实施例4提供的检测方法,对3个全血样本的CYP3A5基因c.6986A>G位点和内标进行检测,第一个全血样本在反应体系一的检测结果如图4所示,在反应体系二的检测结果如图5所示;第二个全血样本在反应体系一的检测结果如图6所示,在反应体系二的检测结果如图7所示;第三个全血样本在反应体系一的检测结果如图8所示,在反应体系二的检测结果如图9所示。
由图4和图5所示,反应体系一和反应体系二内的内标基因荧光信号均合格,可判定第一个全血样本的的基因型为突变型,确定该样本的代谢型为慢代谢型。
由图6和图7所示,可判定第二个全血样本的基因型为杂合型,确定该样本的代谢型为中间代谢型。
由图8和图9所示,可判定第三个全血样本的的基因型为野生型,确定该样本的代谢型为快代谢型。
实施例6检测准确度
本实施例采用全血样本、口腔拭子、毛囊类型的待测样本作为扩增样本,采用实施例3提供的试剂盒和实施例4提供的检测方法进行测试,其中测试人员的基因型均经过Sanger基因测序法确证,每个样本总数为30例,检测结果如表9所示:
表9采用本发明试剂盒与Sanger测序法检测结果
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由表9结果可知,上述所有检测样本的分型检测结果均经过DNA测序验证,本发明的检测试剂盒检测结果与DNA测序验证结果吻合率达到100%,由此可以证明本发明的检测试剂盒检测结果的可靠准确性。
实施例7检测灵敏度
本实施例采用实施例3提供的试剂盒和实施例4提供的检测方法进行检测基因组DNA含量为0.1ng的已知基因型的全血待测样本,在反应体系一的检测结果如图10所示,在反应体系二的检测结果如图11所示。
由图10和图11结果所示,在待测样本的基因组DNA含量低至0.1ng时,本发明的试剂盒可准确检测出该样本的基因型,即说明本发明的试剂盒具有优异的灵敏度。
实施例8预混体系检测结果验证
本发明的试剂盒设计的PCR扩增混合液1和扩增混合液2能够提供简便且稳定的扩增体系,为了验证本发明的试剂盒体系的稳定性和检测效果,本实施例采用实施例3提供的试剂盒存储了12月后与现配的实施例3提供的试剂盒对已知基因型(野生型)全血样本进行检测,检测结果如图12所示。
由图12结果可知,针对野生型待测样本,存储了12月后与现配的试剂盒在反应体系一中同时出现S型扩增曲线,并且扩增曲线的荧光信号值以及CT值相差在5%之内,由此证明本发明的检测试剂盒提供的PCR扩增混合液体系是十分稳定的,扩增效果也优异。
实施例9基因检测结果与他克莫司用药指导的相关性
他克莫司药代动力学特点是经口服在小肠吸收,生物利用度较差且个体变异度大,服药后2h内达到药物峰浓度。研究表明,参与他克莫司的代谢酶主要是CYP3A5酶,约40-50%的他克莫司血药浓度的个体差异性是由CYP3A5多态性引起的。不同表型的CYP3A5携带者,对他克莫司这的代谢具有明显的差异性;导致肾移植患者群体中的他克莫司药物暴露量与其剂量的关系并不稳定,因此维持他克莫司治疗浓度范围常需鉴定CYP3A5基因型及治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)。临床研究表明,CYP3A5*1表达者(*1/*1或*1/*3,快代谢者或中代谢者)需要比不表达者(*3/*3,慢代谢者)用量高出50%以上才能达到目标浓度。经过大量的文献阅读,本实施例筛选出基于个体的不同基因型与他克莫司用药建议的关系,如表10所示。
表10CYP3A5基因位点结果输出与代谢型判定及他克莫司用药建议间关系
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述,但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改,以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种用于检测人CYP3A5基因c.6986A>G位点的试剂盒,其特征在于,包括:用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液1和用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR扩增混合液1包括检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的野生型引物探针组、Taq酶、Tris工作液、MgCl2、dNTPs和Buffer;优选地,所述野生型引物探针组包括野生型引物、公用引物和探针。
和/或,所述PCR扩增混合液2包括检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的突变型引物探针组、Taq酶、Tris工作液、MgCl2、dNTPs和Buffer;优选地,所述突变型引物探针组包括突变型引物、公用引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的野生型引物包括如SEQ ID NO.1所示序列的野生型引物;
和/或,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的突变型引物包括如SEQ ID NO.2所示序列的突变型引物;
和/或,所述公用引物包括如SEQ ID NO.3所示序列的公用引物;
和/或,所述检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的探针包括如SEQ ID NO.4所示序列的探针。
4.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR扩增混合液1和所述PCR扩增混合液2中Taq酶的浓度为0.27-0.33U/μL。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR扩增混合液1和PCR扩增混合液2还包括检测内标的引物探针组,所述内标包括RPPH;
优选地,所述检测内标的引物包括如SEQ ID NO.5-6所示序列的内标引物;
和/或,所述检测内标的探针包括如SEQ ID NO.7所示序列的内标探针。
6.根据权利要求2或5所述的试剂盒,其特征在于,所述探针包括taqman探针;
优选地,所述探针的5'端连接荧光报告基团,所述探针的3'端连接荧光淬灭基团;
更优选地,所述荧光报告基团选自FAM、TEXAS RED、VIC、CY5中的一种荧光染料;和/或,所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2荧光染料。
7.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照;
优选地,所述阳性对照包括含所有目标基因靶序列多态性位点的DNA重组质粒;和/或,所述阴性对照包括生理盐水。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:包装盒、能够嵌入盒体的装有用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液1的容器、能够嵌入盒体的装有用于检测CYP3A5基因c.6986A>G位点的PCR扩增混合液2的容器、能够嵌入盒体的装有阴性对照的容器和能够嵌入盒体的装有阳性对照的容器;
优选地,所述PCR扩增混合液1和所述PCR扩增混合液2的体积均为160μl;和/或,所述阳性对照和阴性对照的体积均为300μl。
9.一种采用如权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤:
S1:提取待测样本的DNA;
S2:根据n=待测样本数+阳性对照+阴性对照,计算所需反应测试数,每个测试分装两个反应体系,所述反应体系一对应的反应管分装5μl的PCR扩增混合液1,所述反应体系二对应的反应管分装5μl的PCR扩增混合液2;
S3:分别取15μl待测样本的基因组DNA提取物、阴性对照和阳性对照混合液加入到所述步骤S2准备的反应体系一和反应体系二的反应管中,混匀、离心转移至PCR扩增区;
S4:荧光定量PCR扩增;
S5:待测样本基因型判定。
10.一种如权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒用于检测血液样本、口腔拭子、鼻拭子、毛囊、组织脱落细胞或其组合的样本的CYP3A5基因c.6986A>G位点的应用。
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