CN111020025A - 用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因检测的引物探针组合及试剂盒及应用 - Google Patents

用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因检测的引物探针组合及试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的特异性引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括针对rs628031、rs12943590、rs11212617基因SNP的特异性引物探针组合。本发明还提供了包含所述引物组合的试剂盒及其应用。本发明的有益效果在于：提供了一种快捷的用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的分型试剂盒及应用，应用本发明获得的检测结果精确可靠，且成本较低，具有较好的实用性。

Description

用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因检测的引物探针 组合及试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因检测的引物探针组合及试剂盒及应用。
背景技术
糖尿病是世界范围常见流行病，已成为全世界发病率和死亡率最高的5种疾病之一。糖尿病的发病率仍持续上升，在中国，这种上升趋势更为显著。在数量急剧增加的糖尿病患者中，2型糖尿病(T2DM)至少占患者总数的90％以上。T2DM的主要特征是高血糖。在正常的胰岛β细胞中，胰岛素的分泌依赖于葡萄糖浓度和细胞内钙离子信号的变化，而T2DM患者的胰岛β细胞则出现胰岛素分泌不足，胰岛素敏感性降低。
而由于胰岛素相对或绝对不足，最终引起T2DM患者体内葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱。糖尿病的发生可以累及全身多个系统，引起视网膜、肾脏、神经等器官发生并发症，严重影响糖尿病患者的生活质量，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病的发生是遗传与环境共同作用的结果，尽管T2DM发展和恶化的确切机制尚且未知，遗传因素在糖尿病的发病过程中占主导地位。
在糖尿病患者控制血糖水平的药物治疗中，口服降糖药的使用最为广泛，主要包括二甲双胍、磺脲类、格列奈类等，其中，二甲双胍运用最为广泛。二甲双胍是美国糖尿病协会和欧洲糖尿病学会共同推荐的2 型糖尿病首选药物，其作用机制主要通过抑制肝糖原生成而改善糖代谢，它具有改善胰岛素抵抗、保护β细胞、减轻体重、调节血脂、保护心血管、降低肿瘤患病风险，以及降低CRP水平的作用。
然而，临床实践中发现，二甲双胍应用于不同个体，存在明显的疗效和不良反应的差异，引起这种个体差异的机制尚未明确，可能与药物代谢酶、药物转运体、药物受体或作用靶点和下游信号通路等相关的基因多态性有关。
SLC22A1基因具有显著的遗传多态性，在多个种族中存在多个基因位点突变，rs628031基因多态性与二甲双胍治疗后空腹胰岛素变化水平有关，GA/AA基因型比GG基因型空腹胰岛素增加幅度多0.228(95％CI： 0.018，0.437)，差异有统计学意义。带有rs628031 GA/AA基因型的患者疗效优于GG基因型患者。2型糖尿病患者SLC22A1 rs628031位点多态性可能与二甲双胍单药治疗后不良反应的发生有关，GA/AA基因型在高剂量时增加不良反应发生的风险。
SLC47A2基因编码MATE2，MATE2K是MATE2的一种剪接变体，位于肾小管刷状缘膜，可能是将二甲双胍排泄到尿液中的主要转运体。目前已有研究发现MATE2K的某些SNPs影响其转运功能。2011年，Choi等对253 例单用二甲双胍的2型糖尿病患者进行回顾性研究，结果发现MAKE2K基因rs12943590G>A基因多态性与二甲双胍效应减弱有关，AA基因型患者在二甲双胍治疗后HbA1c水平下降幅度显著变小。
有文献报道C11orf65 rs11212617基因多态性与二甲双胍的降糖效果具有显著的相关性，携带C等位基因的个体二甲双胍疗效优于不带C 等位基因个体。
二甲双胍用药过量会引起胃肠道不良反应(如腹胀、腹泻、恶心等)、低血糖，严重时会导致乳酸性酸中毒。二甲双胍治疗效果存在明显的个体化差异，随之而来的毒副作用也严重危害病患的健康。通过检测二甲双胍代谢、转运或作用靶点基因，可以及早发现二甲双胍用药对不同个体的疗效和毒副反应差异，从而实现二甲双胍的“个体化”用药以降低用药剂量不当引起的风险。
目前市场上采用的基因多态性检测技术有PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否，但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR 产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。
多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。
发明内容
为了解决传统临床经验医疗方式诊断及二甲双胍药物用药时易出现临床用药不良反应且没有合适的试剂盒产品的技术问题，
本发明的目的之一在于提供一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的引物探针组合。
本发明的目的之二在于提供包含所述相关基因SNP的引物探针组合的试剂盒。
本发明的目的之三在于所述试剂盒的应用。
为实现本发明的目的之一，所采用的技术方案是：
一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的特异性引物探针组合，其中，所述引物探针组合包括针对rs628031、rs12943590、 rs11212617基因SNP的特异性引物探针组合，具体如下：
rs628031引物探针序列为：
rs628031-F：5'-CCTCATCACCATTGACCGC-3'；
rs628031-R：5'-AGTCACAACACTTTCCCCACACT-3'；
rs628031-P1：5'FAM-CATCTACCCCATGGCCATGTCAAAT-TAMRA 3'；
rs628031-P2：5'VIC-ATCTACCCCATGGCCGTGTCAAAT-TAMRA 3'；
rs12943590引物探针序列为：
rs12943590-F：5'-GTAGGCTTGGCAGCAGGGA-3'；
rs12943590-R：5'-TTTGTCCAGCGAGCCACC-3'；
rs12943590-P1：5'FAM-AGTTGCCATGGTAGCCCCTCCTC-TAMRA 3'；
rs12943590-P2：5'VIC-TTGCCATGGTAGCTCCTCCTCCTG-TAMRA 3'；
rs11212617引物探针序列为：
rs11212617-F：5'-AAACAATGGCAACAAACAGGAA-3'；
rs11212617-R：5'-GTGGGTTGCTTGTGGATAACAT-3'；
rs11212617-P1：5'FAM-CAGATCAGAGACTGTCAGAG-MGB 3'；
rs11212617-P2：5'VIC-CAGATCAGAGAATGTCAG-MGB 3'。
为了实现本发明的目的之二，所采用的技术方案是：
一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的荧光定量PCR 试剂盒，其中，所述试剂盒包括了所述引物探针组合，所述引物组合如 SEQ ID NO.1-12所示。
在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒还包括PCRrs628031、 rs12943590、rs11212617的反应液，所述PCR反应液还包括：
2×NuHi SNP Mix及超纯水，所述NuHi SNP Mix包Taq酶、dNTPs、 MgCl2、PCRbuffer、ROX参比荧光。
在本发明的一个优选实施例中，所述PCR反应液成分的终浓度为：1 ×NuHi SNPMix，0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
在本发明的一个优选实施例中，所述荧光定量PCR试剂盒中还包括阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ或阳性对照品Ⅲ；
所述阳性对照品Ⅰ分别为rs628031或rs12943590或rs11212617基因位点的AA型或GG型或CC型质粒；
所述阳性对照品Ⅱ分别为rs628031基因位点AA型与GG型、 rs12943590基因位点GG型与AA型、rs11212617基因位点CC型与AA型按1：1数量比杂合的质粒；
所述阳性对照品Ⅲ分别为rs628031或rs12943590或rs11212617基因位点的GG型或AA型或AA型质粒。
为了实现本发明的目的之三，所采用的技术方案是：一种所述试剂盒的应用，所述应用是利用所述荧光定量PCR试剂盒，针对人基因组DNA 进行荧光定量PCR反应，根据反应过程产生的荧光信号区分相应SNP位点的多态性，用来指导二甲双胍药物个体化用药。
本发明的有益效果在于：提供了一种快捷的用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的分型试剂盒及应用，应用本发明获得的检测结果精确可靠，且成本较低，具有较好的实用性。
附图说明
图1：本发明实施例中rs628031的AA基因型的扩增曲线图(FAM在上)；
图2：本发明实施例中rs628031的AG基因型的扩增曲线图(FAM在下)；
图3：本发明实施例中rs628031的GG基因型的扩增曲线图(FAM在下)；
图4：本发明实施例中rs628031基因分型结果的PCR荧光分析图；
图5：本发明实施例中rs12943590的GG基因型的扩增曲线图(FAM 在上)；
图6：本发明实施例中rs12943590的GA基因型的扩增曲线图(FAM 在上)；
图7：本发明实施例中rs12943590的AA基因型的扩增曲线图(FAM 在下)；
图8：本发明实施例中rs12943590基因分型结果的PCR荧光分析图；
图9：本发明实施例中rs11212617的CC基因型的扩增曲线图(FAM 在上)；
图10：本发明实施例中rs11212617的CA基因型的扩增曲线图(FAM 在上)；
图11：本发明实施例中rs11212617的AA基因型的扩增曲线图(FAM 在下)；
图12：本发明实施例中rs11212617基因分型结果的PCR荧光分析图；
图13：对比例中引物探针组合rs628031-2的AA基因型的扩增曲线图(FAM在上)；
图14：对比例中引物探针组合rs628031-2的AG基因型的扩增曲线图(FAM在下)；
图15：对比例中引物探针组合rs628031-2的GG基因型的扩增曲线图(FAM在上)；
图16：对比例中引物探针组合rs628031-2基因分型结果的PCR荧光分析图；
图17：对比例中引物探针组合rs12943590-2的GG基因型的扩增曲线图(FAM在上)；
图18：对比例中引物探针组合rs12943590-2的GA基因型的扩增曲线图(FAM在下)；
图19：对比例中引物探针组合rs12943590-2的AA基因型的扩增曲线图(FAM在下)；
图20：对比例中引物探针组合rs12943590-2基因分型结果的PCR荧光分析图；
图21：对比例中引物探针组合rs11212617-2的CC基因型的扩增曲线图(FAM在上)；
图22：对比例中引物探针组合rs11212617-2的CA基因型的扩增曲线图(FAM在上)；
图23：对比例中引物探针组合rs11212617-2的AA基因型的扩增曲线图(FAM在下)；
图24：对比例中引物探针组合rs11212617-2基因分型结果的PCR荧光分析图。
具体实施方式
本发明的原理主要是：采用了高分辨率熔解曲线法进行检测，高分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度控制的精密性，假阳性高。Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。
本发明是采用Taqman探针与荧光定量PCR技术相结合的检测试剂盒，适用于临床推广和产业化。
在TaqMan探针法的PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一对探针，探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基因，3’端标记有荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基因所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号，随着PCR 的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’-5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。用两种不同荧光染料(如FAM，HEX、VIC)分别标记这一对探针，针对双等位SNP的不同基因型，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。
实施例1
取100例人群抗凝血作为PCR模板的样本，使用商用DNA提取试剂盒进行提取。具体提取步骤如下：
1.取全血400ul，加800ul细胞裂解液CL混匀，10000rpm/11500×g， 1min离心，弃上清，若裂解不彻底可重复一次。
2.沉淀中加入200ul缓冲液GS，混匀，再加入20ul蛋白酶K，混匀。
3.加入200ul缓冲液GB，混匀，56℃，10min，期间颠倒数次，直至溶液变澄清(若未澄清，可延长时间至澄清)。
4.加200ul无水乙醇混匀，短暂离心。
5.转移样本混合液到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液。
6.加入500ul缓冲液GD到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液。
7.加入600ul缓冲液PW到吸附柱CB3，13400×g/12000rpm，30s离心，弃滤液，重复一次。
8.吸附柱CB3放入干净离心管中，13400×g/12000rpm，2min离心，弃滤液，室温静置3分钟，晾干。
9.加100ulddH2O，室温孵育2-5min,13400×g/12000rpm，2min离心，收集洗脱产物，-20℃保存。
引物和探针的设计与合成：
1、针对人基因组中rs628031、rs12943590、rs11212617基因位点(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用Primer Premier 5.0 及Primer Express 3.0软件，分别设计特异性引物及探针。
准备特异性引物及探针序列，如下表1所示：
表1
Figure BDA0002313389110000091
注：引物名称以基因对应的rs编号命名；F代表上游引物，R代表下游引物，P1代表FAM探针，P2代表VIC探针。
准备PCR反应液的步骤如下：
第一组添加基因位点为rs628031的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，探针序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
第二组添加基因位点为rs12943590的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.5和SEQID NO.6，探针序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
第三组添加基因位点为rs11212617的引物探针，引物序列为SEQ ID NO.9和SEQID NO.10，探针序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；
每组PCR反应液还包括2×NuHi SNP Mix(Taq酶、dNTPs、MgCl2、 PCR buffer、ROX参比荧光)及超纯水；
所述PCR反应液成分的终浓度为：1×NuHi SNP Mix，0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
PCR反应体系，如下表2所示：
表2
Figure BDA0002313389110000101
PCR扩增程序，如下表3所示：
表3
Figure BDA0002313389110000111
采用ABI SteponePlus荧光定量PCR仪(Appl ied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)。
实验结果如下：
PCR反应结束后，应用Stepone software V2.3(Appl ied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)进行分析，将得到的100例结果进行分类，依据本发明的探针共分辨出3个SNP位点的共9种基因型。
rs628031的三种基因型的扩增曲线图如图1～3所示，PCR荧光分析图如图4所示；rs12943590的三种基因型的扩增曲线图如图5～7所示， PCR荧光分析图如图8所示；rs11212617的三种基因型的扩增曲线图如图9～11所示，PCR荧光分析图如图12所示。
本发明的试剂盒检测结果在指导二甲双胍药物用药中的应用如下：
根据荧光定量PCR中的结果判定得出rs628031、rs12943590、 rs11212617各位点的基因型。基因型与二甲双胍药物个体化用药关系对应下表4所示：
表4
Figure BDA0002313389110000112
Figure BDA0002313389110000121
对比例1
对比例与实施例的主要区别在于：改变引物探针组合序列信息检测人抗凝血组织样本的基因分型。
取100例人群抗凝血作为PCR模板的样本，使用商用DNA提取试剂盒进行提取。具体抽提步骤同实施例1中的人DNA抽提步骤。
引物和探针的设计与合成：
1、针对人基因组中rs628031、rs12943590、rs11212617基因位点(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用Primer Premier 5.0 及Primer Express 3.0软件，分别设计两组引物探针。
本发明的特异性引物探针序列和对比引物探针序列，如下表5所示：
表5
Figure BDA0002313389110000122
Figure BDA0002313389110000131
Figure BDA0002313389110000141
注：引物名称以基因对应的rs编号命名；F代表上游引物，R代表下游引物，P1代表FAM探针，P2代表VIC探针。
准备PCR反应液：
第一组为引物探针组合rs628031-1：添加引物序列为SEQ ID NO.1 和SEQ IDNO.2，探针序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
第二组为引物探针组合rs628031-2：添加引物序列为SEQ ID NO.13 和SEQ IDNO.14，探针序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；
第三组为引物探针组合rs12943590-1：添加引物序列为SEQ ID NO.5 和SEQ IDNO.6，探针序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
第四组为引物探针组合rs12943590-2：添加引物序列为SEQ ID NO.17 和SEQ IDNO.18，探针序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；
第五组为引物探针组合rs11212617-1：添加引物序列为SEQ ID NO.9 和SEQ IDNO.10，探针序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；
第六组为引物探针组合rs11212617-2：添加引物序列为SEQ ID NO.21 和SEQ IDNO.22，探针序列为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；
每组PCR反应液还包括2×NuHi SNP Mix(Taq酶、dNTPs、MgCl2、 PCR buffer、ROX参比荧光)及超纯水；
所述PCR反应液成分的终浓度为：1×NuHi SNP Mix，0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
PCR的反应体系如实施例1中表2所示。PCR的扩增程序如实施例1 中表3所示。采用ABI SteponePlus荧光定量PCR仪(Appl ied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)。
实验结果：
PCR反应结束后，应用Stepone software V2.3(Appl ied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)进行分析，分析结果如下：
引物探针组合rs628031-1的三种基因型的扩增曲线图如图1～3所示，PCR荧光分析图如图4所示，扩增曲线图及PCR荧光分析图均区分良好；
引物探针组合rs628031-2的三种基因型的扩增曲线图如图13～15所示，PCR荧光分析图如图16所示，扩增曲线图及PCR荧光分析图均区分效果不佳；
引物探针组合rs12943590-1的三种基因型的扩增曲线图如图5～7所示，PCR荧光分析图如图8所示，扩增曲线图及PCR荧光分析图均区分良好；
引物探针组合rs12943590-2的三种基因型的扩增曲线图如图17～19 所示，PCR荧光分析图如图20所示，扩增曲线图及PCR荧光分析图均区分效果不佳；
引物探针组合rs11212617-1的三种基因型的扩增曲线图如图9～11 所示，PCR荧光分析图如图12所示，扩增曲线图及PCR荧光分析图均区分良好；
引物探针组合rs11212617-2的三种基因型的扩增曲线图如图21～23 所示，PCR荧光分析图如图24所示，扩增曲线图及PCR荧光分析图均区分效果不佳。
因此，对比对比例和实施例的结果可以知道：应用本发明获得的检测结果精确可靠，且成本较低，具有较好的实用性。
序列表
<110> 上海派森诺生物科技股份有限公司
<120> 用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因检测的引物探针组合及试剂盒及应用
<130> 20191205
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
cctcatcacc attgaccgc 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
agtcacaaca ctttccccac act 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
catctacccc atggccatgt caaat 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
catctacccc atggccatgt caaat 25
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 5
gtaggcttgg cagcaggga 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6
tttgtccagc gagccacc 18
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 7
agttgccatg gtagcccctc ctc 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
ttgccatggt agctcctcct cctg 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
aaacaatggc aacaaacagg aa 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
gtgggttgct tgtggataac at 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 11
cagatcagag actgtcagag 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 12
cagatcagag aatgtcag 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 13
cctttactcc gctctggtcg a 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 14
gggaaatgat gaaagcagac aact 24
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 15
taccccatgg ccatgtc 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 16
taccccatgg ccgtgtc 17
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 17
tgcacggcca gctttgtc 18
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 18
ggcagtaggc ttggcagca 19
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 19
ccatggtagc ccctc 15
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 20
ccatggtagc tcctc 15
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 21
caatggcaac aaacaggaaa caa 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 22
ttaaagtggg ttgcttgtgg a 21
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 23
catataccaa ttacaaaggg cagatcagac ac 32
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 24
catataccaa ttacaaaggg cagatcagag tc 32

Claims (6)

1.一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的特异性引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括针对rs628031、rs12943590、rs11212617基因SNP的特异性引物探针组合，具体如下：
rs628031引物探针序列为：
rs628031-F：5'-CCTCATCACCATTGACCGC-3'；
rs628031-R：5'-AGTCACAACACTTTCCCCACACT-3'；
rs628031-P1：5'FAM-CATCTACCCCATGGCCATGTCAAAT-TAMRA 3'；
rs628031-P2：5'VIC-ATCTACCCCATGGCCGTGTCAAAT-TAMRA 3'；
rs12943590引物探针序列为：
rs12943590-F：5'-GTAGGCTTGGCAGCAGGGA-3'；
rs12943590-R：5'-TTTGTCCAGCGAGCCACC-3'；
rs12943590-P1：5'FAM-AGTTGCCATGGTAGCCCCTCCTC-TAMRA 3'；
rs12943590-P2：5'VIC-TTGCCATGGTAGCTCCTCCTCCTG-TAMRA 3'；
rs11212617引物探针序列为：
rs11212617-F：5'-AAACAATGGCAACAAACAGGAA-3'；
rs11212617-R：5'-GTGGGTTGCTTGTGGATAACAT-3'；
rs11212617-P1：5'FAM-CAGATCAGAGACTGTCAGAG-MGB 3'；
rs11212617-P2：5'VIC-CAGATCAGAGAATGTCAG-MGB 3'。
2.如权利要求1所述的一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括了所述引物探针组合如SEQ ID NO.1-12所示。
3.如权利要求2所述的一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCRrs628031、rs12943590、rs11212617的反应液，所述PCR反应液还包括：
2×NuHi SNP Mix及超纯水，所述NuHi SNP Mix包Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR buffer、ROX参比荧光。
4.如权利要求2所述的一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液成分的终浓度为：1×NuHi SNP Mix，0.5μM的各特异性引物及0.2μM探针。
5.如权利要求2所述的一种用于指导二甲双胍药物个体化用药相关基因SNP的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒中还包括阳性对照品Ⅰ、阳性对照品Ⅱ或阳性对照品Ⅲ；
所述阳性对照品Ⅰ分别为rs628031或rs12943590或rs11212617基因位点的AA型或GG型或CC型质粒；
所述阳性对照品Ⅱ分别为rs628031基因位点AA型与GG型、rs12943590基因位点GG型与AA型、rs11212617基因位点CC型与AA型按1：1数量比杂合的质粒；
所述阳性对照品Ⅲ分别为rs628031或rs12943590或rs11212617基因位点的GG型或AA型或AA型质粒。
6.如权利要求2-5当中任意一项所述的一种所述试剂盒的应用，其特征在于，所述应用是利用所述荧光定量PCR试剂盒，针对人基因组DNA进行荧光定量PCR反应，根据反应过程产生的荧光信号区分相应SNP位点的多态性，用来指导二甲双胍药物个体化用药。
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ANTONIO BRUNETTI ET AL.: ""Pharmacogenetics of type 2 diabetes mellitus: An example of success in clinical and translational medicine"", 《WORLD J TRANSL MED》 *

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