CN103834721A - 一种细胞色素p450 cyp3a4 snp的检测试剂盒 - Google Patents
一种细胞色素p450 cyp3a4 snp的检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种细胞色素P450CYP3A4SNP的检测试剂盒，该试剂盒包括探针，引物，MIX反应液，其中所述探针，序列如下：TCCTTCTCCATGTATCA（序列3），CTCCTTCTCCATGTACCA（序列4）其中所述引物，序列如下：TGGTGAGGAGGCATTTTTGC（序列5），TGCAGGAGGAAATTGATGCA（序列6）。
Description
技术领域
本发明涉及基因表型的测定，特别涉及一种细胞色素P450 CYP3A4 SNP的检测试剂盒，检测方法及其应用。
背景技术
同一种药物对一些人非常有效，对另一些人效果却不明显，是因为他们基因组中存在的差异。这种差异很多表现为人类基因组上单个碱基上的变异，也就是单核苷酸的多态性（SNP）。单核苷酸的多态性，全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。因此，SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。
细胞色素P450(CYP450)是一组含有亚铁血红素的酶蛋白是肝脏中主要的药物代谢I相酶,而CYP4503A4(CYP3A4)是其中重要的药物代谢酶,人肝脏中它的含量约占CYP450总量的30%,临床上约50%的药物靠它代谢。CYP3A4 基因具有多态性且其多态性存在种族差异，CYP3A4（WT）是CYP3A4 亚家族最主要的基因型；CYP3A4*3（ M445T ）、CYP3A4*4 （ I118V）、CYP3A4*17（F189S）和 CYP3A4*18（L293P）是 WT 的基因非同义突变所得。通过体外研究基因突变导致酶氨基酸改变，从而引起酶学性质的变化，为临床个体化用药指导和预测有关的药物相互作用等奠定基础。
药物的有效性和毒性主要取决于药物在体内的药代动力学过程，包括药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄等步骤。这些步骤若发生改变将会影响到药物的安全性。目前，对药物代谢的研究较为清楚。很多药物代谢酶已经被鉴定出来，其中最重要的一类就是细胞色素P450(CYP)家族。
芬太尼为一种阿片受体激动剂，属强效麻醉性镇痛药，镇痛作用产生快，但持续时间较短，用于麻醉前、中、后的镇静与镇痛，也用于各种原因引起的疼痛。
2011年5月发表在Journal of Human Genetics上的文章中有报道，CYP3A4在汉族人群中分布普遍的11种单核苷酸多态性，见图1。其中，2011年11月份由Dr. Jack以及2009年董章力等发表的文章中均指出，CYP3A4作为镇痛药芬太尼的主要代谢酶，其基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是导致芬太尼镇痛效果个体差异的原因。
CYP3A4*1G (CYP3A4 SNP（rs2242480）)，人群中突变率为2.5%，P450基因的第十个内含子上第20230位碱基由鸟嘌呤G由腺嘌呤A取代.CC 纯合子相较于CT/TT 杂合子，芬太尼镇痛效果有所减弱。
罗哌卡因是单一对映结构体（S形)长效酰胺类局麻药，其作用机制与其它局麻药相同，通过抑制神经细胞钠离子通道，阻断神经兴奋与传导。对运动神经的阻滞作用与药物浓度有关，浓度为0.2%对感觉神经阻滞较好，但几乎无运动神经阻滞作用；0.75%则产生较好的运动神经阻滞作用。
无痛分娩，在医学上叫做"分娩镇痛"。是用各种方法使分娩时的疼痛减轻甚至使之消失。目前通常使用的分娩镇痛方法有两种：一种方法是药物性的，是应用麻醉药或镇痛药来达到镇痛效果，这种就是我们现在所说的无痛分娩。
罗哌卡因在用于无痛分娩时在发挥镇痛效果时不影响肌张力，在产程中不影响产妇行走活动，有利于降低胎心音异常发生，减少尿潴留发生等。罗哌卡因对中枢神经系统和心血管系统的影响较小，对子宫胎盘血流没有明显影响，不影响产生和新生儿呼吸，在无痛分娩过程中起着很重要的作用。
但是，罗哌卡因对中枢神经系统有抑制和兴奋双相作用。血药浓度过高时可出现中枢神经系统中毒症状。罗哌卡因对心血管系统具有毒性作用。血药浓度过高时可抑制心脏传导和心肌收缩力。
在无痛分娩中，采用罗哌卡因芬太尼联合用药可明显减少产妇下肢运动阻滞，给药后体征稳定，产妇镇痛后5分钟、30分钟和60分钟VAS评分、心率、呼吸频率、平均动脉压分别与镇痛前比均具有统计学差异。
CYP3A4 SNP（rs2242480） 影响芬太尼的镇痛效果。所以罗哌卡因、芬太尼联合用于分娩镇痛时应考虑CYP3A4 SNP（rs2242480）的基因型而决定其用药方案和用量，以便达到最佳效果。
舒芬太尼为芬太尼的衍生物，药用其枸橼酸盐，主要作用于μ阿片受体。舒芬太尼与芬太尼一致，作用于同一类受体亚型。
对亚洲人的基因组型的调查显示，北京汉族人中，CT基因组出现几率为14.7%，TT/TC基因型在日本人中出现的几率为51.2%。（附件1： rs2242480基因频率人群分布）等位基因T携带者CT/TT组镇痛后2、4小时舒芬太尼的中位数用量(四分位数间距)分别为80.0(45.0,112.5)μg和120.0(80,173.8)μg,CC纯合子基因型组分别为(91.3[80.0,125.0]μg和169.0[112.5,226.3]μg,CT/TT组显著低于CC纯合子基因型组(P0.05)。尽管在镇痛后24和48小时舒芬太尼的用量CT/TT组有低于CC组的趋势,但是两组之间的差异无统计学意义。得出结论：按照平均均数计算，CT/TT基因型组术后2小时以及4小时给药剂量为CC组的87.6% 和 71.0%。
舒芬太尼的镇痛效果在 CYP3A4 SNP（rs2242480）的CC 纯合子和CT杂合子TT纯合子上表现有所不同。CC所需要的舒芬太尼量稍高于CT/TT基因型。所以在罗哌卡因舒芬太尼联合用药用于分娩镇痛之前进行CYP3A4 SNP（rs2242480），根据结果定出罗哌卡因和舒芬太尼所需剂量，可以在无痛分娩过程中减少产妇的副作用，在提高麻醉效果的同时，更低的麻醉药用量可以更有效的减少产妇下肢阻滞，对中枢神经系统和心血管系统的影响，更好的保护新生儿和产妇的健康。
发明内容
本发明提供一种技术解决方案，即根据每位孕妇的细胞色素P450 CYP3A4 SNP（rs2242480）基因表型确定分娩镇痛中麻醉药的用药计划和用量。
本发明根据rs2242480的多态性位点特点（rs2242480位点多态性基因组序列见附件2），设计并合成了特异性探针和引物，检测人基因组中rs2242480位点多态性，将人群分为正常代谢组（CC型）和缓慢代谢组（CT型和TT型）。正常代谢组常规给药。缓慢代谢组在罗哌卡因的基础上，同时给低剂量舒芬太尼，观察疗效，及时调整用药剂量。
为检测人群的正常代谢组（CC型）和缓慢代谢组（CT型和TT型）本发明设计了一种检测方法，在此基础上设计了一种检测试剂盒，以便更加方便的使用试剂盒中的试剂对上述人群进行检测。
本发明的检测方法，包括以下步骤：
1、孕妇全血基因组DNA提取，提取方法如下：
在1.5毫升离心管中加入10微升蛋白酶K和100微升待检样品(EDTA抗凝全血)，并混匀，2000rpm离心10秒，加入200微升缓冲液B，颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间颠倒混匀2-3次，加入200微升无水乙醇，颠倒混匀，并加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉非也，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升缓冲液C，12000rpm理性30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入700微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，然后12000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5毫升离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，向吸附膜中间部位悬空滴加100微升洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集管中即为基因组DNA。
2、PCR扩增：方法如下：
从以下序列中自主设计探针和引物
aggctatgac cactagcatc aaataacata tgagaaagtg attgttacct ttcaaaaaaa aaagtcacat gtctgtaacc aagaaaataa aaagagataa aaagagcaaa ttcctgtgtc catatgtgga tacagctaag gggacatcac acaccactat ggtgcctgct gcaaacatgt aattcacaac caaaaccaat gtgaaatgag tgtgagcaac aaatgcttat tgttagatgc cactgaggtt tttggaggtt ttttacttag cattattgta gtaatagaaa gcagatgaac cagagccagc acgttttaca aagatcttac gcttctgcca gtagcaacca tttgctatgt ttctttcttt ttcttttcag agccttccta catagagtca gtgaaagaat cagtgattat gctttttata aaaattctcc tgggaagtgg tgaggaggca tttttgctaa ggtttcacct cctccctcct tctccatgta（序列1）
[C/T]
catccactca ccttattggg taaaactgca tcaatttcct cctgcagttt ctgctggaca
tcagggtgag tggccagttc atacataatg aaggagagaa cactgctcgt ggtttcatag ccagcaaaaa taaagataat tgattgggcc acgagctcca gatcggacag agctgaaagg agaggaaaga cattttaggt aaatcagatc aatgtagggc atcacagttt agatgaagag aaatctaagt gaagccctca aatccctaag ggaaaagaat agaaaagcaa ttcagaggta cactgggggt ggtttcattc tgatgtgtat cttacagaac cagaataagg caaatcattt taatccagtt ttccccaagg tcttcgagaa tgtgggccat ccac（序列2）
使用GeneCopoeia公司所提供的2*Probe AllinOne Q-PCR Mix按照合适的比例加入MIX，探针，引物以及上一步提取出来的基因组DNA，最后加入石蜡油，在荧光PCR仪上按照以下程序进行扩增：95℃10分钟---40次循环（95℃10秒-60℃30秒），
3、按照扩增曲线进行单链多态性分析待检样品的基因型，方法如下：
使用单链多态性分析仪器，如使用BIO-RAD iQ5仪，通过Taq-man荧光PCR检测候检位点待检样品的基因型，不同的基因型显示的结果是不相同的，如正常代谢组（CC型）显示的结果为：FAM标记探针扩增
缓慢代谢组（CT型和TT型）显示的结果为：FAM标记探针和VIC标记探针同时扩增，或者VIC标记探针扩增。
根据以上所得到的待检样品的基因型的结果，就可以按照相对应的给药方式有针对性的调节药物剂量，给予合适的临床用药，如针对正常代谢组（CC型）给药方式为：0.01%舒芬太尼和0.15%罗哌卡因混合液负荷剂量6ml
缓慢代谢组（CT型和TT型）给药方式为：按照常规用量的87.6%给予舒芬太尼，（0.0087%舒芬太尼和0.15%罗哌卡因混合液负荷剂量6ml）,之后补加药量为按照常规用量的71%给予舒芬太尼（0.007%舒芬太尼和0.15%罗哌卡因混合液）
以上检测方法中，全血基因组DNA提取，可以使用庄盟血液基因组DNA小量提取试剂盒（Blood Genomic DNA Kit），试剂盒中内容为：红细胞裂解液，缓冲液A,B,C，漂洗液W2，洗脱缓冲液TE，蛋白酶K,吸附柱，收集管，说明书等，该试剂盒可以从市场上购买得到。全血基因组DNA提取属于现有技术，因此可以根据现有技术的方法进行提取，不局限于上述提及的方法。
以上本发明的检测方法，在临床应用中得到了良好的评价，如进行的以下实验：
根据评价标准选取入组孕妇，按照研究方法线路图进行（图3），按照技术路线（图4），取孕妇外周血2毫升（EDTA抗凝），全血提取基因组DNA，分别采用双向测序方法和实时荧光Teqman探针技术确定每例样本的基因型，然后随机分成2组，一组按照常规给药方式，进行效果评价。另外一组（A组）：分型组的CC基因型组按照临床常规给药方案给药；（0.01%舒芬太尼和0.15%罗哌卡因混合液负荷剂量6ml）。分型组的CT和TT基因型组按照临床常规给药剂量给予罗哌卡因，按照常规用量的87.6%给予舒芬太尼，（0.0087%舒芬太尼和0.15%罗哌卡因混合液负荷剂量6ml）之后补加药量为按照常规用量的71%给予舒芬太尼（0.007%舒芬太尼和0.15%罗哌卡因混合液），根据临床效果评价，这一组还可以进一步进行（B组）研究实验：CC基因型按照常规给药方案给药。CT/TT基因型按照常规给药减低罗哌卡因的用量，按照首次给药（0.0087%舒芬太尼和0.13%罗哌卡因混合液负荷剂量6ml），根据产妇的情况，持续给药以及补加药物为（0.007%舒芬太尼和0.1%罗哌卡因混合液）记录孕妇术后镇痛2、4、24和48小时的舒芬太尼用量、静息状态下的视觉模拟疼痛评分VAS (visual analogue scales,VAS)、镇静评分、恶心、呕吐、瘙痒等不良反应。根据以上实验结论，可以得出初步给药方案。实验后重新评价，确定剔除或者继续研究。
评价标准
本发明根据以上检测方法，设计了一种检测试剂盒，该试剂盒包括探针，引物，MIX反应液（为常规的PCR反应液，可以从市场上购买得到，如广州复能基因有限公司）。
其中所述探针，序列如下：
Taq-man FAM probe TCCTTCTCCATGTATCA（序列3）
Taq-man VIC probe CTCCTTCTCCATGTACCA（序列4）
其中所述引物，序列如下：
rs2242480F TGGTGAGGAGGCATTTTTGC（序列5）
rs2242480R TGCAGGAGGAAATTGATGCA（序列6）
以上所述的探针，引物，可以根据现有技术进行合成，如使用合成仪器，或通过化学合成方法，将核苷酸依次序进行连接。探针合成可选用MGB标记方法，产品的纯度以99%以上为宜。
以上试剂按照比例盛装，其中探针，引物的用量为：根据仪器的敏感程度，选择检测1-3次的用量，各试剂可分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，低温保存，使用时根据说明书中描述的方法进行操作即可。有关试剂的用量以一人1-3次的用量为宜，以上试剂根据需要可以和全血基因组DNA提取用的试剂盒共同组合包装，这样便于测定时一同使用。
本发明的优点在于：
1.尝试建立通过单核苷酸多态性判断人体药物代谢率，并据此调整用药方案的治疗孕妇的平台，为单核苷酸多态性在临床治疗中的应用提供理论及实践依据
2.提供分娩镇痛药物应用的新理念以及新的治疗方案，提高用药安全性
3.在保证镇痛效果的基础上减低镇痛药物罗哌卡因以及舒芬太尼药物的用量，并且将对孕妇的不良影响降到最低
附图说明：
图1：rs2242480多态性人群分布
图2：rs2242480位点多态性基因组序列
图3：研究方法
图4：技术路线
具体实施方式：
实施例1
荧光扩增试剂盒及其应用
试剂盒中装有：荧光反应管，去离子三蒸水，MIX反应液
其中荧光反应管中装有以下探针
Taq-man FAM probe TCCTTCTCCATGTATCA
Taq-man VIC probe CTCCTTCTCCATGTACCA
引物
rs2242480F TGGTGAGGAGGCATTTTTGC
rs2242480RTGCAGGAGGAAATTGATGCA
和石蜡油
混合盛装，以上试剂盒最好在-20℃低温保存。
各试剂配制方法如下：
探针配制成：25μM，去离子三蒸水为溶剂。
引物配制成：20μM，去离子三蒸水为溶剂。
各试剂的比例如下：
每条探针0.1微升
每条引物0.8微升
去离子三蒸水，用1.5毫升小瓶盛装
MIX反应液用1.5毫升小瓶盛装。
石蜡油，适量，可以直接加入到荧光反应管中，也可单独盛装，反应时加入。
PCR扩增时在混合物上面铺一层石蜡油，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明，应用石蜡油可使扩增产量增加5倍，
试剂盒的使用方法如下：
一．DNA提取过程按照以下步骤完成：
1. 全血基因组DNA提取，使用庄盟血液基因组DNA小量提取试剂盒（Blood Genomic DNA Kit），试剂盒中内容为：红细胞裂解液，缓冲液A,B,C，漂洗液W2，洗脱缓冲液TE，蛋白酶K,吸附柱，收集管，说明书等。
2. 仪器：低温高速离心机，电热恒温干浴锅，可调式移液器，等
3. 在1.5毫升离心管中加入10微升蛋白酶K和100微升待检样品(EDTA抗凝全血)，并混匀，2000rpm离心10秒，加入200微升缓冲液B，颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间颠倒混匀2-3次，加入200微升无水乙醇，颠倒混匀，并加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉非也，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升缓冲液C，12000rpm理性30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入700微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，然后12000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5毫升离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，向吸附膜中间部位悬空滴加100微升洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集管中即为基因组DNA。
二．从低温冰箱中取出按照一个人份分装好的荧光反应管，其中已经按照比例配置合适的探针，引物，石蜡油等反应液，操作者只需依次加入3.7微升去离子三蒸水，10微升MIX反应液，4.5微升上一步提取出来的DNA就可以上机扩增，扩增程序为：95℃10分钟---40次循环（95℃10秒-60℃30秒）。
三．最后根据扩增曲线，得出待检样品的基因型，按照相对应的给药方式予以临床应用。
序列表
<110>北京大学
<120>一种细胞色素P450 CYP3A4 SNP的检测试剂盒
<160>6
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aggctatgac cactagcatc aaataacata tgagaaagtg attgttacct ttcaaaaaaa 60 aaagtcacat gtctgtaacc aagaaaataa aaagagataa aaagagcaaa ttcctgtgtc 120 catatgtgga tacagctaag gggacatcac acaccactat ggtgcctgct gcaaacatgt 180 aattcacaac caaaaccaat gtgaaatgag tgtgagcaac aaatgcttat tgttagatgc 240 cactgaggtt tttggaggtt ttttacttag cattattgta gtaatagaaa gcagatgaac 300 cagagccagc acgttttaca aagatcttac gcttctgcca gtagcaacca tttgctatgt 360 ttctttcttt ttcttttcag agccttccta catagagtca gtgaaagaat cagtgattat 420 gctttttata aaaattctcc tgggaagtgg tgaggaggca tttttgctaa ggtttcacct 480 cctccctcct tctccatgta 500 <210>2
<211>404
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>2
catccactca ccttattggg taaaactgca tcaatttcct cctgcagttt ctgctggaca
tcagggtgag tggccagttc atacataatg aaggagagaa cactgctcgt ggtttcatag ccagcaaaaa taaagataat tgattgggcc acgagctcca gatcggacag agctgaaagg agaggaaaga cattttaggt aaatcagatc aatgtagggc atcacagttt agatgaagag aaatctaagt gaagccctca aatccctaag ggaaaagaat agaaaagcaa ttcagaggta cactgggggt ggtttcattc tgatgtgtat cttacagaac cagaataagg caaatcattt taatccagtt ttccccaagg tcttcgagaa tgtgggccat ccac 404
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>3
Tccttctcca tgtatca 17
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>4
Ctccttctcc atgtacca 18
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>5
Tggtgaggag gcatttttgc 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>6
Tgcaggagga aattgatgca 20
Claims (6)
1.一种细胞色素P450 CYP3A4 SNP的检测试剂盒，该试剂盒包括探针，引物，MIX反应液，
其中所述探针，序列如下：
TCCTTCTCCATGTATCA，CTCCTTCTCCATGTACCA，
其中所述引物，序列如下：
TGGTGAGGAGGCATTTTTGC，TGCAGGAGGAAATTGATGCA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，试剂盒中装有：荧光反应管，去离子三蒸水，MIX反应液；
其中荧光反应管中装有以下探针：TCCTTCTCCATGTATCA，CTCCTTCTCCATGTACCA；引物：TGGTGAGGAGGCATTTTTGC，TGCAGGAGGAAATTGATGCA。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，探针配制成：25μM，引物配制成：20μM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，各试剂的比例如下：
每条探针0.1微升，每条引物0.8微升，去离子三蒸水，用1.5毫升小瓶盛装，MIX用1.5毫升小瓶盛装。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中还包括石蜡油。
6.权利要求1所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1）孕妇全血基因组DNA提取，提取方法如下：
在1.5毫升离心管中加入10微升蛋白酶K和100微升待检样品(EDTA抗凝全血)，并混匀，2000rpm离心10秒，加入200微升缓冲液B，颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间颠倒混匀2-3次，加入200微升无水乙醇，颠倒混匀，并加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉非也，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升缓冲液C，12000rpm理性30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入700微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，然后12000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5毫升离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，向吸附膜中间部位悬空滴加100微升洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集管中即为基因组DNA，
2)PCR扩增：
使用GeneCopoeia公司所提供的2*Probe AllinOne Q-PCR Mix按照合适的比例加入MIX，探针，引物以及上一步提取出来的基因组DNA，最后加入石蜡油，在荧光PCR仪上按照以下程序进行扩增：95℃10分钟---40次循环（95℃10秒-60℃30秒），
3)按照扩增曲线进行单链多态性分析待检样品的基因型，方法如下：
使用单链多态性分析仪器，如使用BIO-RAD iQ5仪，通过Taq-man荧光PCR检测候检位点待检样品的基因型，不同的基因型显示的结果是不相同的，正常代谢组（CC型）显示的结果为：FAM标记探针扩增
缓慢代谢组（CT型和TT型）显示的结果为：FAM标记探针和VIC标记探针同时扩增，或者VIC标记探针扩增。
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