CN106978474A - 一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒及其应用，所述2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒，对HNF1B、RASGRP1和DKAL1与2型糖尿病相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在2型糖尿病方面的遗传因素，评估2型糖尿病发病的相对风险，对于2型糖尿病早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义。同时还能辅助2型糖尿病的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等。

Description

一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种检验技术领域，具体是一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒及其应用。
背景技术
随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的完成，大量疾病相关基因的发现，促进了传统生物医学模式向可预测性、可预防性、个体化和参与性的基因组医学模式转变，为未来发展预防、诊断、治疗长期困扰人类的诸如癌症、心脑血管疾病、糖尿病、神经和精神疾病等重大复杂性疾病开辟了新途径，也为基因科学的产业化提供了良好的机遇。
全基因组关联分析(Genome Wide Association Studies，GWAS)是应用人类基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)为标记进行病例一对照关联分析，即在一定人群中收集病例组和对照组DNA，进行SNPs芯片扫描，采用关联分析比较受检SNPs标记的某一等位基因频率在病例组和对照组间有无显著性差异，筛选与疾病关联的基因序列变异，做出该SNPs是否与疾病关联的判断，预测疾病的患病率及风险。该方法研究前不需构建任何假设，不再局限于候选基因或候选染色体区域作为关联分析对象，而是针对基因组中所有SNPs，随机进行基因分型，分析SNPs与疾病的关联度，可在全基因组水平上，开展多中心、大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，全面及时疾病发生、发展和治疗的相关遗传基因。
目前发现遗传因素，或其与环境因素之间的相互作用参与了几乎所有的人类疾病的发生过程。一些复杂的疾病往往不是由单一基因突变引起的，其发生发展与多基因多位点变异有关，且这些位点的变异可能与环境因素相关，这些位点可提高或降低个体患某种疾病的相对风险，被称为该种疾病的易感位点。根据大量的GWAS结果，已经发现并证明的一系列复杂疾病的易感位点已被普遍应用于基因检测领域。
糖尿病是一组以慢性高血糖为主要特征并造成器官严重损害的代谢性疾病，已成为严重危害人类健康的三大慢性病之一。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。
糖尿病是一种由遗传因素及环境因素共同参与相互作用的多基因病，1型或2型糖尿病均存在明显的遗传异质性。糖尿病存在家族发病倾向，1/4～1/2患者有糖尿病家族史。临床上至少有60种以上的遗传综合征可伴有糖尿病。1型糖尿病有多个DNA位点参与发病，其中以HLA抗原基因中DQ位点多态性关系最为密切。在2型糖尿病已发现多种明确的基因突变，如胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖激酶基因、线粒体基因等。
2型糖尿病(Type 2Diabetes mellitus，T2DM)是由于胰岛素抵抗和β细胞分泌缺陷导致高血糖的一种复杂多基因疾病，糖尿病患者中90％以上为2型糖尿病，其发病机制至今尚未完全阐明。遗传因素在T2DM的发生发展中起着重要作用，同时其发病还受到环境因素的影响，因而具有较强的异质性。
在发现单个基因突变导致糖尿病的同时，这些基因的高频多态也成为2型糖尿病等多基因糖尿病的重要候选位点。即引起单基因糖尿病的致病基因的常见型变异可能影响以2型糖尿病为代表的多基因糖尿病的遗传易感性。通过大样本关联分析，HNF1B基因与白种人2型糖尿病易感性相关，而HNF1B基因也是引起MODY5的致病基因。
HNF1B又名肝细胞核因子-1B(hepatocyte nuclear factor 1homeoboxB)，又称转录因子2(transcription factor 2，TCF2)，位于17号染色体长臂21区，由9个外显子组成，全长约23.8kb。HNF1B编码包含同源结构域的转录蛋白，高表达于人体的许多组织，在胚胎及胰岛β细胞形成及发育过程中发挥重要作用，特别是参与β细胞的转录蛋白网，参与血糖的稳态。最早在芬兰、瑞典、加拿大人群中发现，HNFlB区域多个SNP位点与2型糖尿病相关。这些关联信号被重组热点分隔，分别位于内含子2及内含子6-8。此外，Gudmundsson等人的研究发现，rs7501939以及rs4430796(均位于内含子l-2区域)与白种人和非洲人的2型糖尿病相关(Gudmundsson J,Sulem P,Steinthorsdottir V et a1.Two variants onchromosome 17confer prostate cancer risk,and the one in TCF2protects againsttype 2diabetes.Nat GeneL,2007,39(8)：977-983)。Wang等从中国人群中选取15个SNP位点的检测和分析，发现HNF1B基因内含子2上的rs4430796位点与中国人2型糖尿病易感性最相关(Wang C,Hu C,Zhang R,Bao Y,Ma X,Lu J,Qin W，Shao X，Lu J，Xu J，Lu H，Xiang K，Jia W.Common variants of hepatocyte nuclear factor l beta are associated withtype 2diabetes in a Chinese population.Diabetes.2009Apr；58(4)：l 023-7)。
RASGRP1又名Ras蛋白特异鸟嘌呤核苷酸释放因子1(RAS guanyl-releasingprotein 1)，具有激活Erk/MAP激酶级联反应并调控T细胞和B细胞发育、稳态和分化的功能。2013年，Li等人在中国汉族人群中全球首次发现了GRK5-rs10886471与RASGRP1-rs7403531两个新的基因区域(Li H,Gan W,Lu L,et al.A genome-wide associationstudy identifies GRK5and RASGRP1as type 2diabetes loci in ChineseHans.Diabetes,2013,62(1):291-298.)。
CDKAL1(cyclin-dependent kinase 5regulatory subunit-associated protein1-like 1)又名细胞周期素依赖激酶5调节亚单位相关蛋白1类似物1，CDKAL1基因位于6号染色体短臂22.3位点，编码65000蛋白，共有697948bp。CDKAL1的mRNA在人体的表达部位在胰岛、骨骼、肌肉和脑组织。CDKAL1的蛋白产物与CDK5调节亚单位相关蛋白1(CDK5RAP1)相似，CDK5RAP1在神经元性组织表达，能够抑制CDK5的活力，而CDK5在高糖毒性作用下活力过强，可以使胰岛β细胞功能受损。以往研究认为，在T2DM中，CDKAL1表达减少而不能抑制CDK5活力时，将导致胰岛β细胞功能受损(Steinthorsdottir V,ThorleifssonG,ReynisdottirI.A variant in CDKAL1influences insulin response and risk of type2diabetes.Nat Genet,2007,39(6):770-775)。
2008年，德国的一项研究确认了全基因组关联分析发现的3个与T2DM密切相关的CDKAL1基因位点：rs7754840、rs10946398和rs9465871，同时增加了2个易感位点：rs7767391和rs9460546。此后的全基因组关联分析又发现了其他3个与T2DM相关的位点，分别是rs7756992、rs9348440和rs4712523。Liu等我国科学家，在针对中国人员的GWAS研究中证明，CDKAL1基因的rs7754840、rs10946398位点为中国汉族人群的糖尿病易感位点(LiuY,Yu L,Zhang D et al.Positive association between variations in CDKAL1andtype 2diabetesin Han Chinese individuals.Diabetologia,2008,51(11)：2134－2137)。
因此，对HNF1B、RASGRP1和DKAL1与2型糖尿病相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在2型糖尿病方面的遗传因素，评估2型糖尿病发病的相对风险，对于2型糖尿病早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义。同时还能辅助2型糖尿病的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒，所述试剂盒中包括DNA提取试剂盒、DNA扩增试剂盒和测序试剂盒；所述DNA提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的DP322型产品，所述DNA扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、PCR Buffer、dNTP Mixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)F：5'-ACGTCCCTTCCTCAGCATCTTG-3'，R：5'-CCCCCCATACTTGGTGACTAGC-3',2)F：5'-CAATTACAAGGGGTGGCTTTTCA-3'，R：5'-TCACCCAGGACACGTCTAAGTCC-3',3)F：5'-CAATTACAAGGGGTGGCTTTTCA-3',R：5'-CTCAATGCTGTTCATCAGGCACTA-3'；所述酶采用宝生物工程有限公司的TaKaRa TaqTM酶；所述测序试剂盒采用美国ABI公司的Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit。
作为本发明进一步的方案：所述扩增引物为基于基因HNF1B、RASGRP1和CDKAL1进行设计合成的。
一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒的应用，具体步骤为：
(1)首先，将采集回来的样本按照DNA提取试剂盒提取获得样本基因组DNA；
(2)然后，将获得样本基因组DNA使用DNA扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；
(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；
(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/EDTA纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。
作为本发明进一步的方案：步骤(4)中乙醇/EDTA纯化具体为从PCR仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl 0.125M EDTA，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置PCR板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置PCR板低速离心片刻，转速不超过800rpm；PCR仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μl Hi-Di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明制备出一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒，对HNF1B、RASGRP1和DKAL1与2型糖尿病相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在2型糖尿病方面的遗传因素，评估2型糖尿病发病的相对风险，对于2型糖尿病早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义。同时还能辅助2型糖尿病的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等；本专利产品采用基因检测领域的金标准——桑格测序法进行基因分型；桑格测序法是通过控制DNA的合成来产生终止于靶序列特定位点的寡核苷酸片段；首先，合成的寡核苷酸引物同单链的DNA模板退火，设立四种不同的测序反应，每一种反应中都含有DNA聚合酶和四种正常的dNTP；除此之外，还含有少量的有3'-H取代普通脱氧核糖3'-OH的2',3'-ddNTP；若ddNTP掺入到延伸中的DNA链，由于缺少3'-OH将会阻断后续dNTP形成磷酸二酯键，DNA的进一步延伸被终止；使用四种不同的ddNTP，产生的寡核苷酸将终止于每一个A,C,G或T在模板链上占据的位置，将四种反应产生的寡核苷酸加到测序仪中，由于寡核苷酸片段的大小不同，泳动的速率就不同，测序仪的图像控制器按照寡核苷酸经过的时间顺序，便可以检测出新合成链5'到3'的序列信息。
附图说明
图1为本发明的正常纯合型AA测序分型结果图；
图2为本发明的杂合型AG测序分型结果图；
图3为本发明的杂合型GC测序分型结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒，所述试剂盒中包括DNA提取试剂盒、DNA扩增试剂盒和测序试剂盒；所述DNA提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的DP322型产品，所述DNA扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、PCR Buffer、dNTP Mixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)F：5'-ACGTCCCTTCCTCAGCATCTTG-3'(SEQ ID NO.1)，R：5'-CCCCCCATACTTGGTGACTAGC-3'(SEQ ID NO.2),2)F：5'-CAATTACAAGGGGTGGCTTTTCA-3'(SEQID NO.3)，R：5'-TCACCCAGGACACGTCTAAGTCC-3'(SEQ ID NO.4),3)F：5'-CAATTACAAGGGGTGGCTTTTCA-3'(SEQID NO.5),R：5'-CTCAATGCTGTTCATCAGGCACTA-3'(SEQID NO.6)；所述酶采用宝生物工程有限公司的TaKaRa TaqTM酶；所述测序试剂盒采用美国ABI公司的BTerminator v3.1Cycle Sequencing Kit。
所述扩增引物为基于基因HNF1B、RASGRP1和CDKAL1进行设计合成的；其中，检测的目标SNP位点包括rs4430796、rs7403531和rs7754840，这3个位点分别位于基因HNF1B、RASGRP1和CDKAL1。
一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒的应用，具体步骤为：
(1)首先，将采集回来的样本按照DNA提取试剂盒提取获得样本基因组DNA；
(2)然后，将获得样本基因组DNA使用DNA扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；
(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；
(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/EDTA纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。
其中：
步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。
步骤(2)中使用DNA扩增试剂盒进行扩增，扩增的反应体系为：
TaKaRa Taq TM(5U/μl)1U
10×PCR Buffer(Mg2+)5μl
dNTP Mixture(2.5mM each)4μl
正向引物(10pmol/μl)0.5μl
反向引物(10pmol/μl)0.5μl
模板1μl
双蒸水up to 50μl，
扩增程序为：
Stage1:Pre degeneration
Repeat:1time
95℃3minutes
Stage 2:PCR reaction
Repeat:30cycles
95℃5second
55℃30second
72℃1minutes
Stage 3:Final extension
72℃5minutes。
步骤(2)中电泳检测和纯化，其中电泳检测具体步骤为：制备1％的琼脂糖凝胶：称一定量的琼脂糖粉加入对应体积的10×TAE加热熔解琼脂糖，待其完全熔解后加入10000×Gold ViewⅠ。待胶凝固后，取5μl的PCR产物加入Loading Buffer混合后，点到胶孔内，120V定压，跑15min左右。在TGreen Transilluminator内观察扩增产物的片段大小、单一性及扩增浓度；
其中纯化体系为：
PCR扩增后的反应液5μl
SAP/CIP(1U/μl)1μl
ExoⅠ(5U/μl)1μl
ddH2O 3μl，
其中纯化反应程序为：
37℃30minutes
75℃15minutes。
步骤(3)中的桑格测序反应，反应体系为：
BigDye混合液1μl
测序引物(3.2pmol/μl)1μl
模板(纯化产物)1μl
ddH2O 2μl，
反应程序为：
Stage1:1time
95℃2minutes
Stage 2:25cycles
95℃10second
50℃5second
60℃4minutes。
步骤(4)中乙醇/EDTA纯化具体为从PCR仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl 0.125M EDTA，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置PCR板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl 75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置PCR板低速离心片刻，转速不超过800rpm；PCR仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μlHi-Di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。
结果检测判定：
分型判定标准如下，见表1。
表1
其中rs4430796的正常纯合型AA、rs7403531的杂合型AG和rs7754840的杂合型GC，测序分型结果图，见图1-3.
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括DNA提取试剂盒、DNA扩增试剂盒和测序试剂盒；所述DNA提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的DP322型产品，所述DNA扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、PCR Buffer、dNTP Mixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)F：5'-ACGTCCCTTCCTCAGCATCTTG-3'，R：5'-CCCCCCATACTTGGTGACTAGC-3',2)F：5'-CAATTACAAGGGGTGGCTTTTCA-3'，R：5'-TCACCCAGGACACGTCTAAGTCC-3',3)F：5'-CAATTACAAGGGGTGGCTTTTCA-3',R：5'-CTCAATGCTGTTCATCAGGCACTA-3'；所述酶采用宝生物工程有限公司的TaKaRa TaqTM酶；所述测序试剂盒采用美国ABI公司的Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit。
2.根据权利要求1所述的2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒，其特征在于，所述扩增引物为基于基因HNF1B、RASGRP1和CDKAL1进行设计合成的。
3.一种如权利要求2所述的2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒的应用，其特征在于，具体步骤为：
(1)首先，将采集回来的样本按照DNA提取试剂盒提取获得样本基因组DNA；
(2)然后，将获得样本基因组DNA使用DNA扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；
(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；
(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/EDTA纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。
4.根据权利要求3所述的2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒的应用，其特征在于，步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。
5.根据权利要求3所述的2型糖尿病易感基因检测分型试剂盒的应用，其特征在于，步骤(4)中乙醇/EDTA纯化具体为从PCR仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl 0.125MEDTA，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置PCR板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl 75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置PCR板低速离心片刻，转速不超过800rpm；PCR仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μl Hi-Di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。
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