CN102534001A

CN102534001A - 适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒

Info

Publication number: CN102534001A
Application number: CN2012100039977A
Authority: CN
Inventors: 尹彤; 许强
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2012-01-06
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-01-06
Also published as: CN102534001B

Abstract

本发明提供一种适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒，其主要包含CYP2C9、VKORC1和CYP4F2相关基因型的扩增引物，CYP2C9、VKORC1和CYP4F2相关基因型的测序引物，PCR反应试剂，测序试剂。还可以包含用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书或/和记录有中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的计算机可读存储介质。本发明的华法林药物基因组学检测试剂盒，制备简单、使用方便；采用该试剂盒，通过检测华法林药物基因组学指标，整合临床环境因素，利用本发明建立的适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型软件，能够准确的估计中国患者人群的华法林抗凝治疗剂量。

Description

适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒。

背景技术

华法林是临床最常用和应用最广泛的有效口服抗凝药物，但是由于治疗窗口窄，治疗剂量个体间差异显著，不同个体的有效治疗药物剂量间可存在十倍以上的差异，剂量过高有严重出血副作用发生的可能，而剂量不足又会导致抗凝不足血栓栓塞发生的危险，因此华法林抗凝治疗的个体化问题一直是临床工作中的重点和难点。

近年来，越来越多的证据表明，除了临床环境因素(如年龄，体重，饮食中维生素K的摄取，抗凝适应症，合并用药等)以外，基因组的遗传变异很大程度上影响了华法林的抗凝效果。对华法林的药物基因组学研究发现，其代谢相关基因(CYP2C9)和作用靶基因(VKORC1)在华法林的疗效和毒副作用方面起着关键性的作用，其中的基因变异型CYP2C9*3(p.I359L)及VKORC1*2(tagSNP：-1639G＞A)已经在多个种族中(包括中国人群)被证实与华法林剂量个体间的差异密切相关，依据这两个基因变异型，并结合临床和环境因素，能使约50％的华法林剂量个体间差异得到合理的解释。据此，2007年8月，美国食品与卫生管理局(FDA)在华法林使用说明中，增加了对于携带CYP2C9*3和VKORC1(-1639G＞A)变异型的患者需要较低的华法林起始治疗剂量的预警；并于2010年提出了对于携带CYP2C9和VKORC1变异型的患者所需起始治疗剂量的建议案。

由于VKORC1和CYP2C9的遗传多态性能在很大程度上解释华法林剂量的个体间差异，因此，通过结合药物基因组学信息和临床环境相关因素(如年龄、性别、体重、身高、合并治疗的药物和治疗的效果)建立的华法林剂量运算预测模型，能够用来更准确的估计华法林的剂量，降低治疗引导阶段华法林过量的风险，并缩短华法林达到稳定治疗的时间。随着华法林药物基因组学研究的不断深入，越来越多的整合了临床和药物基因组学相关因素的多元回归预测模型被建立，并用于评估和预测患者的华法林抗凝治疗剂量，同时在国际上还开展了大规模的回顾性和前瞻性的临床研究用于对上述模型临床应用的实用价值的检验。在众多问世的预测模型中，2009年发表的国际华法林药物基因组学协会(International WarfarinPharmacogenetics Consortium，IWPC)基于世界各中心不同种族(包括来自台湾的中国人群)的4,043例华法林抗凝治疗患者的临床和遗传因素而建立的药物基因组学预测模型最具有代表性。该研究发现，药物基因组学模型(整合了临床和基因型相关因素)的预测治疗剂量，比固定治疗剂量(5mg/day)或者基于临床模型(仅仅包含临床相关因素)预测获得的剂量更接近患者的实际华法林治疗剂量，上述优势主要体现在华法林所需剂量偏高(≥49mg/week)或偏低(≤21mg/week)的患者，这些患者占所有受试人群的46.2％。

尽管如此，目前已发表的华法林药物基因组学剂量预测模型大部分是基于多种族人群或者是西方人群建立的，尽管种族差异所致的剂量差异能够通过预测模型中的基因变异型体现出来，例如：与华法林低剂量相关的基因变异型VKORC1(-1639A)在亚洲人群中的发生频率(约为87％)远高于西方人群(约为36％)，但是在模型中需要整合的临床环境因素在不同种族人群中则各不相同，另外利用已发表的基于多种族或者西方人群的药物基因组学模型计算所得的预测剂量往往高于中国人群的实际所需剂量。鉴于此，有必要整合与中国人群华法林剂量个体差异相关的主要临床环境因素和基因变异型，建立基于中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒，检测与华法林抗凝敏感性密切相关的基因变异型，并利用本发明建立的华法林药物基因组学剂量预测模型，计算患者的华法林抗凝治疗剂量。进而为中国人群的华法林个体化抗凝治疗提供药物基因组学参考指标。

本发明所述的适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒主要包含CYP2C9、VKORC1和CYP4F2相关基因型的扩增引物，CYP2C9、VKORC1和CYP4F2相关基因型的测序引物，PCR反应试剂，测序试剂。

本发明所述的试剂盒还包含用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书或/和记录有中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的计算机可读存储介质。

根据本发明所述的试剂盒，所述适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型为：

每日华法林稳定治疗剂量(毫克/日)＝2.757-0.013×age-0.515×targetINR-1.175×Ln (INR on day 4)+0.996×BSA-2.382×CYP2C9*3/*3-0.679×CYP2C9*1/*3+0.536×VKORC1-1639AG+2.080×VKORC1-1639GG+0.658×CYP4F2rs2108622TT

模型中的参数赋值说明为：

Age：年龄

Target INR：目标国际标准化比值，如果INR的目标范围是1.6-2.5，则为1；如果INR的目标范围是2-3，则为0

INR on day 4：开始服用华法林第4日的INR值

BSA：体表面积

CYP2C9*3/*3：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

CYP2C9*1/*3：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

VKORC1-1639AG：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

VKORC1-1639GG：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

CYP4F2rs2108622TT：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0。

优选地，所述CYP2C9相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1-2所示。所述VKORC1相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQID NO：3-4所示。所述CYP4F2相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQID NO：5-6所示。

优选地，所述CYP2C9相关基因型的测序引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示。所述VKORC1相关基因型测序引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示。所述CYP4F2相关基因型测序引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。

优选地，所述PCR反应试剂采用HotStarTaq Master Mix Kit，所述测序试剂采用

Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit。本领域的技术人员根据他所掌握的技术知识，还可以采用任何的其它合适的PCR反应试剂和测序试剂。

本发明的适合中国人群华法林药物基因组学检测试剂盒，制备简单、使用方便；采用该试剂盒通过检测华法林药物基因组学指标，整合临床环境因素，利用本发明建立的适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型，能够准确的估计中国患者人群的华法林抗凝治疗剂量。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是CYP2C9的相关基因分型图；

图2是VKORC1的相关基因分型图；

图3是CYP4F2的相关基因分型图。

具体实施方式

实施例1：中国人群中华法林治疗病例的收集及全血DNA的采集

1.华法林稳定治疗病例的收集和分组：收集经华法林稳定抗凝治疗至少三个月的中国人群患者，排除年龄小于18岁的患者，以及确诊为癌症，肝肾功能不全，或者充血性心力衰竭的患者。

2.收集与华法林治疗和剂量相关的临床资料，包括患者的基本临床信息(年龄，性别，身高，体重等)，与华法林剂量和副作用相关的病史，华法林治疗指征，目标凝血酶原国际标准化比率(PT-INR)值，以及与华法林发生交互作用的合并用药情况等。当INR达到稳定值至少3个月时，记录华法林稳定治疗时的每日平均剂量。具体请详见表1。

表1用于建立和验证华法林剂量预测模型的中国患者人群的临床特征

^*数值表示为平均值±标准差。

数值表示为n(％)。

包括心脏栓塞，心肌梗死，外周动脉疾病，除房颤外的心律失常。^§包括苯妥英，卡马西平，利福平，氟康唑。

包括胺碘酮，氯吡格雷，噻氯匹定，阿司匹林，洛伐他汀等。INR为国际标准化比值。

3.采集每例患者外周EDTA抗凝全血3毫升，按照DNA提取试剂盒说明，提取每例基因组DNA约50-150毫克。

实施例2：利用sanger测序法检测基因变异型

在待测基因变异型所在位点的核苷酸序列片段两端设计合成引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增该片段，然后应用Sanger测序法对该片段进行测序分析，通过与参考序列对比，寻找待测位点的基因变异型。

1.设计合成引物，以扩增变异型CYP2C9*3，VKORC1(-1639G＞A)和CYP4F2(rs2108622)所在目标基因片段的位点和周围已知的DNA序列。

扩增引物：

CYP2C9*3(303bp)

上游引物：5′-CCCCTGAATTGCTACAACAAA-3′ (SEQ ID NO：1)

下游引物：5′-GGGACTTCGAAAACATGGAG-3′ (SEQ ID NO：2)

VKORC1(-1639G＞A)(290bp)

上游引物：5′-GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3′ (SEQ ID NO：3)

下游引物：5′-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3′ (SEQ ID NO：4)

CYP4F2(rs2108622)(238bp)

上游引物：5′-GTCATCCCCAAAGGTGCTCAC-3′ (SEQ ID NO：5)

下游引物：5′-TCAAAACCCTGCCCCCTCCT-3′ (SEQ ID NO：6)

2.通过PCR扩增上述目标片段，反应体系和条件为：

PCR反应体系：

HotStarTaq Master Mix Kit：QIAGEN，美国

PCR反应条件：

3.PCR产物的纯化：

使用MultiScreen PCR 96-Well Plate(Millipore)对PCR产物进行纯化。

4.应用ABI3730自动序列分析仪，对PCR扩增产物片段进行测序分析。分别应用自动和人工序列分析软件，对测得序列中出现的目标变异型进行筛选。

测序引物依次分别为：SEQ ID NO：7-9

CYP2C9*3：5′-CCCCAAACTGGAAACAAGAGA-3′

VKORC1(-1639G＞A)：5′-GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3′

CYP4F2(rs2108622)：5′-CTCACGGGGAGGAGTCT-3′

测序分析的反应体系为：

测序反应条件为：

5.应用SNPalyze V4.0软件(DYNACOM，Kanagawa，日本)，对上述候选基因变异型进行最小等位基因频率、杂和性、哈迪-温伯格平衡和连锁不平衡等遗传特性的分析。

实施例3：试剂盒的制备及使用方法

1.试剂盒的成分

本试剂盒的主要成分是实施例2所述的扩增引物和测序引物、PCR反应试剂：HotStarTaq Master Mix Kit、测序试剂：Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit，还可以包含用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书或/和记录有中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的计算机可读存储介质。

2.试剂盒的储存条件

试剂盒内干粉状引物可常温保存2个月，-20℃可长期保存。干粉状引物溶解后可在-20℃稳定保存6个月，短时间内经常使用时，可以在室温下保存120小时。HotStarTaq Master Mix Kit-20℃可保存一年，

Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit保存在-15to-25℃，可以分装，避免反复冻融(少于5至10次)，室温下融解。

3.试剂盒的使用方法

需要从患者的抗凝血液标本(约1ml)中提取基因组DNA，用于该试剂盒PCR扩增反应的DNA模板。

1)引物的溶解：在使用本试剂盒之前，需要先用无菌去离子双蒸水稀释引物，并分装后置-20℃保存。

2)根据不同基因变异型的检测位点，选择试剂盒中相应的Taq酶混合物和相应的PCR反应体系，常规进行PCR反应。

PCR反应体系和反应条件：

PCR反应体系：

HotStarTaq Master Mix Kit：QIAGEN，美国

PCR反应条件：

3)对PCR的扩增产物进行纯化，并应用自动序列分析仪，对PCR扩增产物片段进行基于Sanger法的测序分析。

测序反应体系和反应条件：(应用于ABI3730自动序列分析仪)

测序分析的反应体系：

测序反应条件：

4.检测结果的解释

结果判定方法：通过将测序结果峰图对应的核苷酸序列与NCBI的基因参考序列进行比对，查找待测位点对应的核苷酸序列是否发生了基因变异，进而判断待测位点基因变异型的存在与否。根据携带基因变异型的情况，结合临床环境因素和药物基因组学剂量预测模型，进而判断受试者对华法林抗凝治疗的敏感性和预测稳定治疗剂量。

5.试剂盒的性能

1)灵敏度：使用人类组织细胞样品提取的基因组DNA 100ng可以成功进行PCR扩增和测序检测。通过设置阳性和阴性对照，实现变异型灵敏度的检测。

2)重复性：该试剂盒的试剂、反应体系和反应条件可重复应用于目前在市场上广泛使用的各种PCR扩增仪(例如：美国应用生物系统公司、日本Takara公司、美国的Bio-Rad公司的PCR仪等)和测序仪(例如美国应用生物系统公司的各型DNA测序仪)。

3)稳定性：在试剂盒内的干粉状引物没有溶解时，可以常温保存2个月，在-20℃可以稳定保存一年。在干粉状引物溶解后(100uM)应该分装成小份并在-20℃可以稳定保存6个月，短时间内经常使用时，可以在室温(15℃到30℃)保存120小时。PCR扩增相关混合试剂，PCR产物纯化试剂，测序相关试剂一般在-20℃可稳定保存12-18个月。

实施例4：与华法林剂量相关的基因变异型在中国患者人群中的基因分型及与华法林剂量的相关性分析

1.利用单变量分析方法，分别在两组患者中，对候选基因变异型CYP2C9*3和VKORC1*2(-1639G＞A)与每日华法林稳定治疗剂量的相关性进行分析。

2.利用共变量分析方法，分别在两组患者中，通过对和华法林剂量相关的临床因素(包括性别，年龄，体重，目标INR，治疗指征，药物交互作用等)进行校准后，对候选基因变异型CYP2C9*3和VKORC1*2(-1639G＞A)与每日华法林稳定治疗剂量的相关性进行分析。具体请详见表2。

表2基因变异型与中国患者人群的华法林剂量相关性

相关性分析的统计学方法：分别利用Prism4(GraphPad，San Diego，CA)，PLINK v 0.99p，112JMP V 5.1和SAS release 8.2(SAS InstituteInc.，113Cary，NC)统计分析软件，应用单变量(ANOVA或T-Test)和共变量分析的方法，检测基因变异型以及单体型与每日华法林稳定治疗剂量的相关性；统计学显著性意义的标准为P＜0.05。

通过相关性的分析，对实施例1提供的患者的基因变异型携带与否的验证发现，利用该试剂盒检测到的基因变异型携带者和非携带者的符合率为100％。

实施例5：整合临床和药物基因组学信息建立适合中国人群的华法林剂量预测模型

应用多元回归分析模型，采用逐级回归的方法，经单因素相关性分析后，候选变量可进入回归方程的标准为p＜0.1，最终入选回归方程的候选变量统计学显著性意义的标准为P＜0.05。利用矫正的R²(adjustedr-squared，R²adj)评估模型对华法林剂量差异的解释能力。

基于中国患者人群的华法林药物基因组学剂量预测回归模型为：

每日华法林稳定治疗剂量(毫克/日)＝2.757-0.013×age-0.515×targetINR-1.175×Ln(INR on day 4)+0.996×BSA-2.382×CYP2C9*3/*3-0.679×CYP2C9*1/*3+0.536×VKORC1-1639AG+2.080×VKORC1-1639GG+0.658×CYP4F2rs2108622TT

模型中参数的赋值说明：

Age：年龄

INR on day 4：开始服用华法林第4日的INR值

BSA：体表面积

CYP2C9*3/*3：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

CYP2C9*1/*3：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

VKORC1-1639AG：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

VKORC1-1639GG：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

CYP4F2rs2108622TT：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0。

上述预测模型可以制作成“用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书”，作为试剂盒的一部分，只要根据测得的数据，带入模型的公式就可以计算出剂量；或者将适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型刻录以本领域公知的方式编写成自动执行上述计算的计算机可执行的程序，并存储在计算机可读存储介质中，作为试剂盒的一部分，操作人员可以通过计算机读取存储介质，然后存到本地计算机，再将测得的数据输入该程序，就可以自动计算出剂量。

据发明人目前的调研发现，该模型是至今为此唯一的基于中国人群的，同时整合了治疗早期INR值，三个基因(CYP2C9，VKORC1和CYP4F2)变异型和临床环境因素的华法林药物基因组学剂量预测回归模型；该模型能够解释52.1％的中国人群中华法林剂量个体间的差异。

实施例6：适合中国人群的华法林剂量预测模型的验证和比较

在模型验证组的中国人群中，本发明对上述华法林药物基因组学剂量预测模型(PG模型)的准确性进行了验证。通过比较预测剂量和实际剂量之间的平均绝对误差(major absolute error，MAE)，本发明还将该方程与单纯依据临床环境因素建立的模型(临床模型)，以及IWPC建立的华法林药物基因组学模型(IWPC模型)进行了比较。结果发现，本发明建立的药物基因组学剂量预测模型的准确性(R²＝45.1％，MAE：0.65±0.51毫克/日)显著优于临床模型(R²＝25.6％，MAE：0.75±0.61毫克/日)和IWPC模型(R²＝27.7％，MAE：0.81±0.53毫克/日)。(见表3)

表3：在验证组中比较药物基因组学模型、临床模型和IWPC模型对华法林剂量预测的准确性

^＊数值表示为均值±标准差。第一列中的p值代表PG模型与临床模型之间MAEs的比较l；第二列p值代表PG模型与IWPC模型之间的比较；MAE：平均绝对误差。ΔMAE平均绝对误差的差别.PG模型代表本发明上述建立的华法林药物基因组学剂量预测模型；临床模型代表单纯基于临床环境因素建立的华法林剂量预测模型；IWPC模型代表国际华法林药物基因组学协会建立的药物基因组学剂量预测模型。

通过亚组分析发现，本发明建立的药物基因组学模型在需要较低剂量(＜2.25毫克/日)的患者中，携带CYP2C9*3，VKORC1-1639A＞G，或者CYP4F2rs2108622TT中至少一个变异型的患者中，以及低强度抗凝(目标INR：1.6-2.5)的患者中，具有最好的预测准确性。在各个亚组中，IWPC模型均未优于本发明建立的药物基因组学模型。(见表4)

表4在验证组亚组中比较药物基因组学模型、临床模型和IWPC模型对华法林剂量预测的准确性

＊数值表示为均值±标准差；无变异型亚组代表不携带CYP2C9*3，VKORC1-1639A/G，和CYP4F2rs2108622TT变异型的患者。变异型组代表携带CYP2C9*3，VKORC1-1639A＞G，和CYP4F2rs2108622TT中至少一个变异型的患者。第一列中的p值代表PG模型与临床模型之间MAEs的比较；第二列p值代表PG模型与IWPC模型之间的比较；第三列p值代表临床模型与IWPC模型之间的比较。MAE：平均绝对误差.ΔMAE平均绝对误差的差别.PG模型代表本发明上述建立的华法林药物基因组学剂量预测模型；临床模型代表单纯基于临床环境因素建立的华法林剂量预测模型；IWPC模型代表国际华法林药物基因组学协会建立的药物基因组学剂量预测模型。

实施例7：检测效果

在综合考虑临床环境相关因素(包括年龄，体重，饮食中维生素K的摄取，抗凝适应症，合并用药等)和密切监测治疗过程中INR值变化的基础上，对于携带CYP2C9变异型的患者，应该采取较常规治疗剂量更低的华法林剂量进行抗凝治疗，以防出血副作用的发生；对于携带VKORC1和CYP4F2变异型的患者应该采取较常规剂量更高的华法林剂量进行抗凝治疗，以防出现抗凝不足所致的血栓并发症的出现。对于同时携带上述与华法林低剂量密切相关的纯合子变异型的患者，应该注意此类患者发生华法林出血并发症的风险极高，华法林的治疗剂量应该维持在更低的水平。

通过结合药物基因组学信息和临床相关因素，建立的华法林剂量运算预测模型，能够用来更准确的估计华法林的剂量，降低治疗引导阶段华法林过量的风险，并缩短华法林达到稳定治疗的时间。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims

1.一种适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒，其特征在于，包含CYP2C9、VKORC1和CYP4F2相关基因型的扩增引物，CYP2C9、VKORC1和CYP4F2相关基因型的测序引物，PCR反应试剂，测序试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书或/和记录有中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的计算机可读存储介质。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型为：

模型中的参数赋值说明为：

Age：年龄

INR on day 4：开始服用华法林第4日的INR值

BSA：体表面积

CYP2C9*3/*3：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

CYP2C9*1/*3：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

VKORC1-1639AG：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

VKORC1-1639GG：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0；

CYP4F2rs2108622TT：如果是该变异型携带者，则为1；否则为0。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2C9相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述VKORC1相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP4F2相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP2C9相关基因型的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述VKORC1相关基因型的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP4F2相关基因型的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

10.根据权利要求1-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂采用HotStarTaq Master Mix Kit，所述测序试剂采用Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit。