CN101182573A - 华法林中国人群个体用药剂量的确定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，先对患者提取基因组DNA并进行基因型检测，然后将个体患者的年龄、体重及VKORC1(－1639G＞A)和CYP2C9的基因型方便的推导出每个患者个体的用药剂量，从而能够帮助临床医生更好的合理应用华法林，提前获得INR合适水平，减少出血不良事件发生的机会，提高用药的安全性，提高治疗的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法。
背景技术
缺血性脑卒中是心房颤动(房颤)患者死亡最主要的原因，抗凝治疗是房颤治疗策略中重要的一环，华法林是目前明确唯一可以降低房颤患者卒中和栓塞风险、降低死亡率的药物。然而华法林的抗凝治疗，尤其在治疗的初始阶段，容易出现抗凝不当，从而导致出血不良事件的发生，这往往是由于忽视了个体变异对药物的影响，没有正确的估计药物剂量来预防出血等不良事件的发生。由于出血等风险以及经常监测INR所需的代价，因此有人估计大约有一半的心房颤动的患者没有用华法林抗凝治疗。
发明内容
本发明目的是提供一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，利用个体患者的年龄、体重以及VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型导出个体用药剂量，从而能够帮助临床医生更好的合理应用华法林，减少出血不良事件发生的机会，提高用药的安全性，提高治疗的效果。
本发明的技术方案是：一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，包括以下步骤：
(1)采集病人组织并进行基因组DNA提取；
(2)对提取的基因组DNA进行PCR扩增；
(3)以限制性核酸内切酶MspI进行VKORC1(-1639G＞A)扩增产物消化；
(4)以限制性核酸内切酶NsiI进行CYP2C9扩增产物消化；
(5)用琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(3)和步骤(4)所得的酶切产物进行观察和分析，分别得到VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型。
(6)将所得病人的VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型以及病人的年龄和体重带入下面的回归方程得出华法林的用药剂量：
D＝6.22-0.011×(年龄)+0.017×(体重)-0.775×(CYP2C9)-3.397×(VKORC1-x1)-4.803×(VKORC1-x2)；
其中D为华法林的用药剂量，年龄输入岁数，体重输入公斤数，CYP2C9基因型如果为*1/*3型输入1，如果为*1/*1型输入0，VKORC1基因型如果为AA型，在VKORC1-x1中输入0，在VKORC1-x2中输入1，如果为GA型，在VKORC1-x1中输入1，在VKORC1-x2中输入0，如果为GG型，VKORC1-x1和VKORC1-x2均输入0。
本发明更为详细的技术方案是：一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，包括以下步骤：
(1)首先对病人进行血样采集，再取外周抗凝血2ml，采用Wizard基因组DNA纯化试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作抽提DNA；
(2)对提取的基因组DNA进行PCR扩增；PCR反应体系体积为25μl，基因组DNA 0.2μg，10XPCR缓冲液 2.5μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，25mmol/LMgcl2 1.5μl，引物P1 10pmol，引物P2 10pmol，Taq聚合酶(5U/L)0.15μl；PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，59℃20s，72℃30s，共35个循环，72℃延伸7min。VKORC1基因正向引物为5′-CCAGCAGGAGAGGGAAATA-3′，反向引物为5′-TTTGG-ACTACAGGTGCCT-3′；CYP2C9基因正向引物为5′-TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3′，反向引物为5′-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3′。
(3)以限制性核酸内切酶MspI进行VKORC1(-1639G＞A)扩增产物消化：取5μl聚合酶链式反应(PCR)产物，缓冲液(buffer)2μl，去离子水(dH2O)8μl，Msp I 10U，37℃水浴过夜。
(4)以限制性核酸内切酶NsiI进行CYP2C9扩增产物消化：取5μl PCR产物，buffer 2μl，dH2O 8μl，NsiI 10U，37℃水浴过夜；
(5)用琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(3)和步骤(4)所得的酶切产物进行观察和分析，分别得到VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型：取16μl酶切产物加入2％琼脂糖凝胶负极端的加样孔，以溴酚蓝为指示剂，溴化乙锭(EB)为染色剂，在80V电压下电泳1小时，在紫外线灯下观察带型。
(6)将所得病人的VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型以及病人的年龄和体重带入下面的回归方程得出华法林的用药剂量：
D＝6.22-0.011×(年龄)+0.017×(体重)-0.775×(CYP2C9)-3.397×(VKORC1-x1)-4.803×(VKORC1-x2)；
其中D为华法林的用药剂量，年龄输入岁数，体重输入公斤数，CYP2C9基因型如果为*1/*3型输入1，如果为*1/*1型输入0，VKORC1基因型如果为AA型，在VKORC1-x1中输入0，在VKORC1-x2中输入1，如果为GA型，在VKORC1-x1中输入1，在VKORC1-x2中输入0，如果为GG型，VKORC1-x1和VKORC1-x2均输入0。
本发明中所用的回归方程的得出过程为：
首先选取多个患者，其选择标准为已明确为瓣膜置换术后、持续性心房颤动以及深静脉血栓、肺栓塞等稳定服用华法林大于3个月的患者，目标INR为1.5～3.0。(排除标准：明确的出血性疾病，如活动性溃疡、支气管扩张等；肝、肾功能不全；血液病，凝血系统障碍。)这里共选取了178例临床使用华法林的患者，包括瓣膜置换术后116例、持续性房颤51例、深静脉血栓4例、肺栓塞7例。其中男性74例，女性104例，男性中位年龄57岁(17～88)，女性的中位年龄53岁(15～82)。目标INR在1.5～2.0之间为110例，在2.0～2.5之间为49例，在2.5～3.0之间为19例。VKORC1-1639G＞A基因型检测有149个病人为突变纯合子AA型，28个病人为杂合子GA型，1个病人为纯合子GG型。CYP2C9基因型检测有162个病人为*1/*1型，16个病人为杂合子*1/*3型。
其次，从门诊及病房采集血样品进行INR、CYP2C9以及VKORC1基因型的检测，并观察年龄、性别、身高、体重以及体表面积对华法林用量及INR影响情况。
最后，进行统计学分析：将所有数据用SPSS统计软件处理，非参数Spearman等级相关用于分析华法林剂量与性别、年龄、体重、身高、体表面积以及INR的关系。不同基因型之间华法林剂量的比较用两样本t检验，多元线形回归用于分析华法林剂量与其它变量之间的关系，从而产生一个新的给药方案。结果用均数±标准差表示，检验水准α＝0.05。
结果表明，性别对华法林使用剂量没有显著性的影响，女性的平均使用剂量为2.01mg/d，男性的平均使用剂量为2.02mg/d，两者比较差异没有统计学意义(P＞0.05)。非参数Spearman相关分析显示，华法林剂量与年龄呈显著的负相关(r＝-0.35；P＜0.0 1)，与体重(r＝0.27；P＜0.01)、身高(r＝0.21；P＜0.01)、体表面积呈正相关(r＝0.27；P＜0.01)。INR值与任一变量均不相关。
VKORC1(-1639G＞A)GA+GG组，华法林平均剂量明显高于AA组(前者为(3.32±1.02)mg/d，而后者为(1.76±0.57)mg/d，p＜0.01)。CYP2C9*1/*1型患者华法林平均剂量高于杂合子*1/*3型患者(前者为(2.06±0.83)mg/d；后者为(1.55±1.32)mg/d，p＜0.05)。其中基因型为1*/1*和AA的患者137人，其平均剂量为1.81mg/d，基因型为1*/1*和GA型的患者25人，其平均剂量为3.37mg/d，基因型为1*/3*和AA型的患者12人，其平均剂量为1.15mg/d，基因型为1*/3*和GA型的患者3人，其平均剂量为1.84mg/d，基因型为1*/3*和GG型的患者1人，其使用剂量为6.25mg/d。
多元线形回归分析提示年龄、体重以及VKORC1基因型分别解释了约8.4％、6.3％、49.4％的个体间剂量差异，而身高以及体表面积对华法林使用剂量影响不显著(P＞0.05)，所以包括年龄、体重、CYP2C9以及VKORC1基因型的多变量模型能够最好的估计华法林剂量(r2＝0.628；P＜0.01)，由此推导得到回归方程。
本发明的优点是：利用个体患者的年龄、体重以及VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型方便的推导出每个患者个体的用药剂量，从而能够帮助临床医生更好的合理应用华法林，提前获得INR合适水平，减少出血不良事件发生的机会，提高用药的安全性，提高治疗的效果。
附图说明
图1为VKORC1基因-1639G＞A多态性酶切图；
图2为CYP2C9多态性酶切图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例：一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，包括以下步骤：
(1)首先对病人进行血样采集，再取外周抗凝血2ml，采用Wizard基因组DNA纯化试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作抽提DNA；
(2)对提取的基因组DNA进行PCR扩增；PCR反应体系体积为25μl，基因组DNA 0.2μg，10XPCR缓冲液2.5μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，25mmol/LMgcl2 1.5μl，引物P1 10pmol，引物P2 10pmol，Taq聚合酶(5U/L)0.15μl；PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，59℃20s，72℃30s，共35个循环，72℃延伸7min。VKORC1基因正向引物为5′-CCAGCAGGAGAGGGAAATA-3′，反向引物为5′-TTTGG-ACTACAGGTGCCT-3′；CYP2C9基因正向引物为5′-TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3′，反向引物为5′-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3′，引物设计参照有关文献，由大连宝生工程公司合成。
(3)以限制性核酸内切酶MspI进行VKORC1(-1639G＞A)扩增产物消化：取5μl聚合酶链式反应(PCR)产物，缓冲液(buffer)2μl，去离子水(dH2O)8μl，Msp I 10U，37℃水浴过夜。；
(4)以限制性核酸内切酶NsiI进行CYP2C9扩增产物消化：取5μl PCR产物，buffer 2μl，dH2O 8μl，NsiI 10U，37℃水浴过夜；
(5)用琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(3)和步骤(4)所得的酶切产物进行观察和分析，分别得到VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型：取16μl酶切产物加入2％琼脂糖凝胶负极端的加样孔，以溴酚蓝为指示剂，溴化乙锭(EB)为染色剂，在80V电压下电泳1小时，在紫外线灯下观察带型。
其中基因型的鉴定如图1和图2所示，经PCR扩增后VKORC1(-1639G＞A)基因目的片段大小为290bp，CYP2C9基因目的片段大小为131bp。根据酶切情况，VKORC1(-1639G＞A)基因型有3种，如图1所示(其中M：DNA mark；1：GA基因型；2、3：AA基因型；4：GG基因型)：纯合子A/A型有290一条带，杂合子G/A有290、168、122三条带，野生型G/G为168、122两条带；CYP2C9基因型有两种，如图2所示(其中M：DNA mark；1、2、4：CYP2C9*1/*1型；3、5：CYP2C9*1/*3型)，CYP2C9*1/*1有110和21两条带，CYP2C9*1/*3型有131、110和21三条带。
(6)将所得病人的VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型以及病人的年龄和体重带入下面的回归方程得出华法林的用药剂量：
D＝6.22-0.011×(年龄)+0.017×(体重)-0.775×(CYP2C9)-3.397×(VKORC1-x1)-4.803×(VKORC1-x2)；
其中D为华法林的用药剂量，年龄输入岁数，体重输入公斤数，CYP2C9基因型如果为*1/*3型输入1，如果为*1/*1型输入0，VKORC1基因型如果为AA型，在VKORC1-x1中输入0，在VKORC1-x2中输入1，如果为GA型，在VKORC1-x1中输入1，在VKORC1-x2中输入0，如果为GG型，VKORC1-x1和VKORC1-x2均输入0。
如一个70公斤80岁的人，CYP2C9*1/*3和VKORC1 AA基因型，将以上数据带入回归方程，则可以估算到其所需的华法林剂量为0.95mg。
采用本发明所提出的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，利用个体患者的年龄、体重以及VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型方便的推导出每个患者个体的用药剂量，从而能够帮助临床医生更好的合理应用华法林，提前获得INR合适水平，减少出血不良事件发生的机会，提高用药的安全性，提高治疗的效果。
Claims (7)
1.一种华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，包括以下步骤：
(1)采集病人组织并进行基因组DNA提取；
(2)对提取的基因组DNA进行PCR扩增；
(3)以限制性核酸内切酶MspI进行VKORC1(-1639G＞A)扩增产物消化；
(4)以限制性核酸内切酶NsiI进行CYP2C9扩增产物消化；
(5)用琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(3)和步骤(4)所得的酶切产物进行观察和分析，分别得到VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型；
(6)将所得病人的VKORC1(-1639G＞A)和CYP2C9的基因型以及病人的年龄和体重带入下面的回归方程估算出华法林的用药剂量：
D＝6.22-0.011×(年龄)+0.017×(体重)-0.775×(CYP2C9)-3.397×(VKORC1-x1)-4.803×(VKORC1-x2)；
其中D为华法林的用药剂量，年龄输入岁数，体重输入公斤数，CYP2C9基因型如果为*1/*3型则输入1，如果为*1/*1型则输入0；VKORC1基因型如果为AA型，在VKORC1-x1中输入0，在VKORC1-x2中输入1，如果为GA型，在VKORC1-x1中输入1，在VKORC1-x2中输入0，如果为GG型，VKORC1-x1和VKORC1-x2均输入0。
2.根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特征在于：所述步骤(1)中基因组DNA的提取为首先对病人进行血样采集，取外周抗凝血2ml，采用Wizard基因组DNA纯化试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作抽提DNA。
3.根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增采取PCR反应体系体积为25μl，基因组DNA 0.2μg，10XPCR缓冲液2.5μl，2.5mmol/L dNTP 2μl，25mmol/LMgcl2 1.5μl，引物P1 10pmol，引物P2 10pmol，Taq聚合酶(5U/L)0.15μl；PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，59℃20s，72℃30s，共35个循环，72℃延伸7min。
4.根据权利要求3所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特征在于：VKORC1基因正向引物为5′-CCAGCAGGAGAGGGAAATA-3′，反向引物为5′-TTTGGACTACAGGTGCCT-3′；CYP2C9基因正向引物为5′-TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3′，反向引物为5′-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3′。
5.根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特征在于：所述步骤(3)取5μl聚合酶链式反应(PCR)产物，缓冲液(buffer)2μl，去离子水(dH2O)8μl，Msp I 10U，37℃水浴过夜。
6.根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特征在于：所述步骤(4)取5μl PCR产物，缓冲液2μl，去离子水8μl，NsiI 10U，37℃水浴过夜。
7.根据权利要求1所述的华法林中国人群个体用药剂量的确定方法，其特征在于：所述步骤(5)取16μl酶切产物加入2％琼脂糖凝胶负极端的加样孔，以溴酚蓝为指示剂，溴化乙锭(EB)为染色剂，在80V电压下电泳1小时，在紫外线灯下观察带型。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20080521 |