CN110564844A - 基于SNP标记CYP4F2rs3093168预测华法林出血风险的试剂盒 - Google Patents

基于SNP标记CYP4F2rs3093168预测华法林出血风险的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于SNP标记CYP4F2rs3093168预测华法林出血风险的试剂盒。本发明首先公开了用于检测SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的系统在预测或辅助预测华法林出血风险的产品中的应用；该SNP标记是人基因组的一个SNP位点，位于人基因组的19号染色体的第15885435位核苷酸，其为C或T。本发明进一步公开了用于检测上述SNP标记的多态性或基因型的成套引物和试剂盒。本发明用于预测或辅助预测华法林出血风险的试剂盒制备简单、使用方便；采用该试剂盒能检测出与华法林出血风险密切相关的SNP标记，结合临床环境因素，能够精准的评估华法林抗凝安全性。

Description

基于SNP标记CYP4F2rs3093168预测华法林出血风险的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及基于SNP标记CYP4F2rs3093168预测华法林出血风险的试剂盒。
背景技术
出血是华法林最常见和最致命的并发症，一直是人们关注的焦点，严重影响患者预后，是导致患者治疗中断、永久性致残甚至死亡的主要原因之一。在华法林抗凝治疗过程中，严重出血事件的发生率高达3.36％。影响华法林出血并发症的主要临床和环境因素包括：年龄、性别、抗凝强度、凝血指标监测情况、合并疾病以及合并用药等。近年来对华法林的药物基因组学研究发现，华法林代谢和作用相关基因的变异能够解释约50％的华法林剂量个体间差异，并且还与抗凝治疗期间华法林的出血并发症密切相关。
因此，挖掘出与华法林出血密切相关且具有潜在生物功能性的单核苷酸多态性(SNP)及其检测系统用于华法林出血风险预警和精准用药具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题为如何建立检测与华法林出血事件相关单核苷酸多态性(SNP)的检测系统，为华法林抗凝治疗提供药物基因组学参考指标。
为解决上述问题，本发明首先提供了用于检测SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的系统在预测或辅助预测华法林出血风险的产品中的应用；
所述SNP标记CYP4F2rs3093168是人基因组的一个SNP位点，所述SNP标记CYP4F2rs3093168位于人19号染色体的第15885435位(来源于GRCh38.p12数据库)，其为C或T。
所述SNP标记CYP4F2rs3093168是人基因组的一个SNP位点，所述SNP标记CYP4F2rs3093168位于人基因组的19号染色体的第15885435位核苷酸，其为C或T。
上述SNP标记CYP4F2rs3093168位置是基于GRCh38.p12数据库确定的。
上述SNP标记CYP4F2rs3093168对应于序列表中序列1的第121位核苷酸，其为C或T(即序列1中y代表C或T)。
上述应用中，所述用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的系统包括用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的成套引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器。
本发明进一步提供了用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的成套引物。
本发明用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的成套引物包括用于扩增包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段的PCR引物。
上述成套引物中，所述成套引物还包括用于检测包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段序列的测序引物。
具体的，所述PCR引物由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成；
所述测序引物如序列表中序列4所示。
包含上述成套引物的用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的试剂或试剂盒也在本发明的保护范围之内。
本发明用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的试剂盒，还包括用于扩增包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段的其他PCR反应试剂和用于检测包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段序列的其他测序试剂。
上述试剂盒中，所述其他PCR反应试剂为HotStarTaq和/或GCI Buffer。
上述试剂盒中，所述其他测序试剂为Terminator v3.1CycleSequencing Kit。
本发明中所述测序为利用ABI3730自动序列分析仪基于Sanger法进行测序。
上述试剂盒中，还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型转换为所述待测对象的预测结果：所述SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型为CC的待测对象的华法林出血风险高于所述SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型为CT或TT的待测对象的华法林出血风险；
其中，所述CC基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为C的纯合型，TT基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为T的纯合型，CT基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为C和T的杂合型。
所述待测对象为华法林抗凝治疗的患者；具体的，所述待测对象为华法林抗凝治疗的中国患者。
本发明还提供了一种用于预测或辅助预测华法林出血风险的产品。
本发明用于预测或辅助预测华法林出血风险的产品为上述用于检测SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的系统、成套引物或试剂盒。
本发明研究发现与华法林出血风险密切相关的SNP标记CYP4F2rs3093168，其风险等位基因为C(即所述SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型为CC的待测对象的华法林出血风险高于所述SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型为CT或TT的待测对象的华法林出血风险)。
本发明用于预测或辅助预测华法林出血风险的试剂盒制备简单、使用方便；采用该试剂盒能检测出与华法林出血风险密切相关的SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型，结合临床环境因素，能够精准的评估华法林抗凝安全性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明发明人经过在等位基因、单倍型、遗传模型等多个层面，利用生物信息学分析和生物功能分析等手段，深入发掘了与华法林出血风险密切相关且具有潜在生物功能性的CYP4F2标签单核苷酸多态性(SNP)，最终得到与华法林出血风险密切相关的SNP标记CYP4F2rs3093168，所述SNP标记CYP4F2rs3093168是人基因组的一个SNP位点，所述SNP标记CYP4F2rs3093168位于人基因组的19号染色体的第15885435位核苷酸，该标记对应于序列表中序列1的第121位，该核苷酸为C或T(即序列1中y代表C或T)。
实施例1用于检测SNP标记CYP4F2 rs3093168的试剂盒及其使用方法
一、试剂盒的成分
本发明试剂盒包括PCR引物、测序引物、PCR反应试剂、测序试剂和使用说明书；
1、所述PCR引物为
引物F：5′-CCAGTCGAGTCCAGGGTTTT-3′(序列2)；
引物R：5′-CCCCTAGTCCTGCTTCTCTT-3′(序列3)；
2、PCR反应试剂为TaKaRaEx Taq(Takara Bio Inc，日本，货号为PR01CM(AM x12)；
3、测序引物为：5′-CCAGTCGAGTCCAGGGTTTT-3′(序列4)；
4、测序试剂：Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(ThermoFisher，美国，货号为4337457)。
5、使用说明书
该试剂盒以从待测对象的抗凝血液标本(约1ml)中提取的基因组DNA为模板。
具体使用步骤如下：
1)引物的溶解：在使用本试剂盒之前，需要先用无菌去离子双蒸水稀释扩增引物和测序引物，并分装后置-20℃保存。
2)PCR反应：
以从待测对象的抗凝血液标本(约1ml)中提取的基因组DNA为DNA模板，利用扩增引物进行PCR反应，获得PCR产物。
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
3)对PCR产物进行纯化，获得纯化的PCR产物；利用ABI3730自动序列分析仪对纯化的PCR产物进行基于Sanger法的测序分析。
其中，测序分析的反应体系为：
测序分析的反应条件为：
4)检测结果的解释
结果判定方法：通过将测序结果峰图对应的核苷酸序列与NCBI的基因参考序列进行比对，确定SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型。SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型为CC(简称CC基因型)、TT(简称TT基因型)或CT(简称CT基因型)。所述CC基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为C的纯合型，TT基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为T的纯合型，CT基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为C和T的杂合型。
根据SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型的情况，结合临床环境因素和其他华法林敏感性相关基因型(参见前期试剂盒：适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒，专利号：ZL 2012 1 0003997.7)，进而判断待测患者接受华法林抗凝治疗时可能发生的出血风险。
当待测患者的SNP标记CYP4F2rs3093168为CC基因型时的出血风险要大于SNP标记CYP4F2rs3093168为TT基因型和CT的基因型。
二、试剂盒的储存条件
试剂盒内PCR引物和测序引物以干粉状物质存在时常温(25℃)保存2个月，-20℃可长期保存。
试剂盒内PCR引物和测序引物用无菌去离子双蒸水溶解后在-20℃稳定保存6个月，短时间内使用时，可以在室温(25℃)下保存120小时。
TaKaRaEx可保存一年；
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit保存在-15～-25℃，可以分装，避免反复冻融(少于5至10次)，室温(25℃)下融解。
三、试剂盒的性能
1)灵敏度：使用人类组织细胞样品提取的基因组DNA 100ng可以成功进行PCR扩增和测序检测。通过设置阳性和阴性对照，实现变异型灵敏度的检测。
2)重复性：该试剂盒的试剂、反应体系和反应条件可重复应用于目前在市场上广泛使用的各种PCR扩增仪(例如：美国应用生物系统公司、日本Takara公司、美国的Bio-Rad公司的PCR仪等)和测序仪(例如美国应用生物系统公司的各型DNA测序仪)。
3)稳定性：在试剂盒内的干粉状引物没有溶解时，可以常温保存2个月，在-20℃可以稳定保存一年。在干粉状引物溶解后(100uM)应该分装成小份并在-20℃可以稳定保存6个月，短时间内经常使用时，可以在室温(15℃到30℃)保存120小时。PCR扩增相关混合试剂，PCR产物纯化试剂，测序相关试剂一般在-20℃可稳定保存12-18个月。
实施例2与华法林出血相关实际应用
一、华法林治疗病例的收集及全血DNA的采集
1.华法林稳定治疗病例的收集和分组：收集经华法林稳定抗凝治疗至少三个月的患者，排除年龄小于18岁的患者，以及确诊为癌症、肝肾功能不全或者充血性心力衰竭的患者。
2.收集与华法林治疗和剂量相关的临床资料，包括患者的基本临床信息(年龄，性别，身高，体重等)，与华法林剂量和出血副作用相关的病史，华法林治疗指征，目标凝血酶原国际标准化比率(PT-INR)值，以及与华法林发生交互作用的合并用药情况等。当INR达到稳定值至少3个月时，记录华法林稳定治疗时的每日平均剂量。并将所有患者随机分为两组，即筛查组和验证组。具体请详见表1。
表1经华法林稳定抗凝治疗至少三个月的中国患者人群临床基线特征
*p值为筛查组和验证组病例基线信息比较
3.采集每例患者EDTA抗凝外周全血3毫升，按照全血DNA提取试剂盒(PAXaeneTMBlood DNA Kit，QIAGEN，美国)说明，提取每例患者基因组DNA 50-150毫克。
二、利用sanger测序法检测基因变异型
1、获得PCR产物
以步骤一得到的每例患者的基因组DNA为模板，利用实施例1中所述的PCR引物(引物F和引物R)、PCR反应试剂、PCR反应体系和PCR反应条件进行PCR反应，获得包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段的PCR产物。
2、纯化PCR产物
使用MultiScreen PCR 96-Well Plate(Millipore)对PCR产物进行纯化，得到纯化的PCR产物。
3、测序分析
应用ABI3730自动序列分析仪，以实施例1中所述的测序引物、测序试剂、测序分析的反应体系和测序分析的反应条件对纯化的PCR产物进行测序分析，确定SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型，得到的PCR产物的序列如序列表中序列1所示。
4、应用SNPalyze V4.0软件(DYNACOM，Kanagawa，日本)，对SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型进行最小等位基因频率和哈迪-温伯格平衡的分析，对基因分型的可靠性进行检验。
检测结果显示：最小等位基因为T等位基因，频率为0.46，哈迪-温伯格平衡检验为0.9，符合哈迪-温伯格平衡。
5、SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型与每日华法林稳定治疗剂量的相关性分心
分别利用Prism4(GraphPad，San Diego，CA)，PLINK v 0.99p，112JMP V 5.1和SASrelease 8.2(SAS Institute Inc.，113Cary，NC)统计分析软件，应用单变量(ANOVA或T-Test)和共变量分析的方法，分析SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型与每日华法林稳定治疗剂量的相关性；统计学显著性意义的标准为P＜0.05。
利用单变量分析方法，分别在筛查组患者、验证组患者和全部患者中，对SNP标记CYP4F2rs3093168基因型与华法林出血风险的相关性进行分析。具体请详见表2。
从表中可以看出，无论是筛查组还是验证组，CYP4F2rs3093168的基因型为CC的患者的出血风险均显著高于CYP4F2rs3093168的基因型为CC和CT的患者。
其中，出血事件的判断采用Fihn标准(Fihn SD，et al.Ann Intern Med.1996；124：970-9.)，其中主要出血包括：致命性出血，危及生命的出血(需外科或介入手术干预、需输血≥3个单位、致不可逆后遗症发生)；次要出血包括：轻度鼻出血、镜下血尿、皮肤瘀青、轻度痔疮出血等对患者不造成严重后果的出血；所有出血是包括了主要出血和次要出血的全部情况的出血。
表2.CYP4F2rs3093168(C＞T)基因型与华法林出血事件相关性分析
注：“N”代表相应组中CYP4F2rs3093168基因型为CC的患者总人数；
“N′”代表相应组中CYP4F2rs3093168基因型为CT和TT的患者总人数；
“n”代表相应组中CYP4F2rs3093168基因型为CC的各终点事件对应的患者人数；
“n′”代表相应组中CYP4F2rs3093168基因型为CT和TT的各终点事件对应的患者人数；
“％”代表各终点事件对应的患者人数占相应组患者总人数的比例。
利用共变量分析方法，分别在筛查组患者、验证组患者和全部患者中，通过对和华法林严重出血风险相关的临床因素(包括校对因素包括年龄，性别，目标INR，高血压，卒中史，肝肾疾病，胺碘酮，既往出血史，已知与华法林剂量相关的基因型(CYP2C9*3，VKORC1-1639A＞G)(见专利号：ZL 2012 1 0003997.7))进行校准后，对SNP标记CYP4F2rs3093168基因型与华法林出血事件的相关性进行分析。
在综合考虑临床环境相关因素(包括年龄，体重，饮食中维生素K的摄取，抗凝适应症，合并用药等)和密切监测治疗过程中INR值变化的基础上，对于SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型为CC的患者，应该采取较常规治疗剂量更低的华法林剂量，或者结合临床环境因素，考虑更换为新型口服抗凝药(NOAC)进行抗凝治疗，以防严重出血副作用的发生。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 基于SNP标记CYP4F2rs3093168预测华法林出血风险的试剂盒
<130> GNCFY191784
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 297
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens )
<400> 1
ccagtcgagt ccagggtttt ataagggaga cctaggggta aaattcatcc attcttgtcc 60
ggaacacttg cactgttcat ccgtcccatc cttattcagc aaacactccc acactgcatt 120
ytcaccccca catctgtgca cagcatcttt ctgtgctctg gagacctggg aaggaaccaa 180
cccagggatc tgttttccag gtgctcccag cctggtggtg gagctgtccc tgggcaggac 240
actcccagcc cacatgggca gagatgggat ttacagtaag agaagcagga ctagggg 297
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagtcgagt ccagggtttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccctagtcc tgcttctctt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccagtcgagt ccagggtttt 20

Claims (10)

1.用于检测SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的系统在预测或辅助预测华法林出血风险的产品中的应用；
所述SNP标记CYP4F2rs3093168是人基因组的一个SNP位点，所述SNP标记CYP4F2rs3093168位于人基因组的19号染色体的第15885435位核苷酸，其为C或T。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述“用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的系统”为权利要求3或4所述的成套引物或权利要求5-9任一所述的试剂盒。
3.用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的成套引物，其特征在于：所述成套引物包括用于扩增包括权利要求1中所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段的PCR引物。
4.根据权利要求3所述的成套引物，其特征在于：所述成套引物还包括用于检测包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段序列的测序引物。
5.根据权利要求3或4所述的成套引物，其特征在于：所述用于扩增包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段的PCR引物由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成；所述用于检测包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段序列的测序引物如序列表中序列4所示。
6.用于检测所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求3-5任一所述的成套引物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段的其他PCR反应试剂和用于检测包括所述SNP标记CYP4F2rs3093168在内的基因组DNA片段序列的其他测序试剂。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型转换为所述待测对象的预测结果：所述SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型为CC的待测对象的华法林出血风险高于所述SNP标记CYP4F2rs3093168的基因型为CT或TT的待测对象的华法林出血风险；
其中，所述CC基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为C的纯合型，TT基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为T的纯合型，CT基因型是人基因组中所述SNP标记CYP4F2rs3093168为C和T的杂合型。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述待测对象为华法林抗凝治疗的患者。
10.用于预测或辅助预测华法林出血风险的产品，其特征在于：所述产品为权利要求1或2中所述的用于检测SNP标记CYP4F2rs3093168的多态性或基因型的系统，或，权利要求3-5所述的成套引物，或，权利要求6-9任一所述的试剂盒。
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