CN112391447A

CN112391447A - 一种基于熵驱动的纳米机器同时检测二价铜离子和镁离子的方法

Info

Publication number: CN112391447A
Application number: CN202011299327.5A
Authority: CN
Inventors: 云雯; 熊政委; 吴虹; 哈霞; 卓琳; 王瑞琪
Original assignee: Chongqing Technology and Business University
Current assignee: Chongqing Technology and Business University
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2040-11-19
Also published as: CN112391447B

Abstract

本发明提供了一种基于熵驱动的纳米机器，是一种用于同时检测二价铜离子和镁离子的超灵敏的双重DNA镊子。双重DNA酶可同时响应两种金属离子并产生两个DNA片段。释放的DNA片段可以触发三维DNA纳米机器的熵驱动扩增。最后，双DNA镊子可以通过熵驱动扩增产生的序列打开，并恢复两种荧光信号。二价铜离子的检出限为10 pM，镁离子的检出限为2 nM。该方法还显示出良好的选择性和特异性。它已成功用于同时检测人血清中的二价铜离子和镁离子。

Description

一种基于熵驱动的纳米机器同时检测二价铜离子和镁离子的方法

技术领域

本发明涉及金属离子的检测领域，特别是基于DNA纳米机器的二价铜离子和镁离子检测方法领域。

背景技术

金属离子不仅可以维持生物分子的结构，而且可以广泛参与各种生命过程，并在许多生物系统中发挥重要作用，例如物质运输，信息传递，能量转换和生物催化。许多研究表明，破坏金属离子稳态是许多疾病的标志，包括阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，枕角综合征和威尔逊氏病。对金属离子的稳态，运输和调控的研究对于理解其在这些疾病的病因，进展，诊断和治疗中的功能和作用具有重要意义。在过去的十年中，建立了一些用于测定金属离子的分析技术，例如原子吸收光谱法，电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。尽管这些技术准确可靠，但它们的测量需要复杂的预处理和昂贵的设备。因此，开发一种同时获取多种金属离子的分布和浓度信息的方法对于理解其在疾病原因中的功能和开发新疗法特别重要。

典型的DNA酶由两条链组成：底物链和酶链，具有两个双链体部分和一个催化核心。金属离子可以特异性和牢固地结合在催化核心上，然后导致底物链断裂。DNA酶由于其出色的可编程性而备受关注。因此，各种传感机制已与DNA 酶结合用于金属离子检测，包括荧光，比色法，电化学和表面增强拉曼散射。由于这些独特的优势，已通过SELEX(通过指数富集的配体系统进化)程序分离了一系列离子特异性DNA酶，例如二价铜离子，镁离子，Pb²⁺，Zn²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Mn²⁺和UO2²⁺特异性DNA酶。尽管在该领域已经取得了进步，但是灵敏度仍然无法与基于仪器的方法相提并论。为了大大提高灵敏度，一些基于核酸酶和无酶的扩增方法已用于检测信号扩增。这些方法大多数是由碱基对形成的自由能驱动的，这可能会导致较高的背景和假阳性结果。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于熵驱动的纳米机器同时检测二价铜离子和镁离子的方法。

本发明包括如下步骤：

一种基于熵驱动的纳米机器同时检测二价铜离子和镁离子的方法，包括如下4 个步骤：

1)双重DNA酶的制备，使DNA序列E1，E2形成双重DNA酶结构，其中， E1序列(5’至3’)为 TCAGATTCCGAGCATTCTCTCTrAGGACAAAAGGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAA GAAAGAAC，E2序列(5’至3’)为 GCGAAAGCTTCTTTCTAATACGGCTTACCTTTTGTCAGCGATCCGGAACGGCACCCATGTGAGAGAA；

2)三维DNA纳米机器的制备，将序列Q1，P1，R1，Q2，P2和R2杂交，然后，加入20nM金纳米颗粒，孵育12小时以形成三维DNA纳米机器，其中， Q1序列(5’至3’)为CGTATTAGAAAGAAGCTTTCGCAGGGGTGAAACCCATCCCG-SH， P1序列(5’至3’)为CCACATACATCATATTCCCTGCGAAAGCTTCTTTCT，R1序列(5’至3’)为TAGCGGGATGGGTTTCAC，Q2序列(5’至3’)为 AGAGAGAATGCTCGGAATCTGATGATGTGACAGCTATCGCG-SH，P2序列(5’至3’) 为TGACTGACATGATGTAATCATCAGATTCCGAGCATT，R2序列(5’至3’)为 CTGCGCGATAGCTGTCAC；

3)双DNA镊子纳米机器的制备，通过加热具有1：1摩尔比的序列A1，A2， T1，T2，L1和L2的混合物来合成双DNA镊子纳米机器，其中，A1，A2，T1，T2， L1和L2的序列(5’至3’)依次为： FAM-GCGGGAGTCCTATCTATGATGGCCCCTTTGTAGACTCAGGAT-GCTGTC-BHQ3， Cy5-GCGCGAATGACACATCACTAGGCCCCGTTGGAGCGACATTAG-GGTTTC-DABCYL， CTAATGTCGCTCCAACAACCATCATAGATAGGAC， ATCCTGAGTCTACAAATACCTAGTGATGTGTCAT，GTGAAACCCATCCCGCTA，GTGACAGCTATCGCGCAG；

4)同时检测二价铜离子和镁离子，将待测溶液与步骤1)，2)所得溶液混合，孵育，离心取上清液，加入步骤3)所得溶液，再孵育后，分别从505nm至600 nm和650nm至750nm测量混合溶液的荧光光谱，利用标准曲线法计算待测溶液中二价铜离子和镁离子的浓度。

优选的，步骤1)具体为：将DNA序列E1，E2溶解在20mM Tris-HCl溶液(pH 7.5) 中，将该溶液加热至90℃，保持5分钟，然后缓慢冷却以形成设计的双重DNA 酶结构。

优选的，步骤2)具体为：将序列Q1，P1，R1，Q2，P2和R2杂交，以在含有 0.1M NaCl的20mMTris-HCl溶液(pH 7.5)中形成DNA复合物20分钟，然后，将20nM金纳米颗粒添加到上述溶液中，孵育12小时以形成三维DNA纳米机器，之后，使用0.05％Tween 20减少非特异性吸附，通过以12,000rpm离心10分钟除去游离序列，洗涤沉淀物并将其分散在20mMTris-HCl溶液(pH 7.5)中。

优选的，步骤3)具体为：通过加热具有1：1摩尔比的序列A1，A2，T1，T2， L1和L2的混合物来合成双DNA镊子纳米机器，将该溶液加热至90℃5分钟，然后冷却以形成特定结构。

优选的，步骤4)具体为：待测溶液与100nM形成的双重DNA酶和50nM的具有0.5μM燃料链的三维DNA纳米机器混合，然后将混合物溶液在含有0.1M NaCl 的20mMTris-HCl溶液(pH 7.5)中孵育1.5小时，随后，将上述溶液以12,000rpm 离心10分钟，然后将0.5μM双DNA镊子纳米机器添加到上清液中孵育30分钟后，分别从505nm至600nm和650nm至750nm测量混合溶液的荧光光谱，利用标准曲线法计算待测溶液中二价铜离子和镁离子的浓度。

本发明提供了用于同时检测二价铜离子和镁离子的超灵敏的双DNA镊子。双重DNA酶可以同时识别两种金属离子。熵驱动的三维DNA纳米机器极大地放大了信号。双DNA镊子提供两种恢复的荧光信号，用于同时定量测定两种金属离子。重要的是，该方法显示了DNA酶的高度特异性，熵驱动的三维DNA纳米机器的超灵敏性以及双DNA镊子的多种金属离子检测能力。熵驱动的催化反应是一种无酶扩增方法，其基于在反应过程中伴随一系列链置换反应的熵增加。在整个过程中，反应物和产物之间的碱基对数不变，从而提供了较低的背景和较高的可靠性。为了获得最佳性能，优化了一些关键实验条件。随后，评估分析性能。二价铜离子的检出限分别为10pM和镁离子的检出限为2nM。另外，恢复荧光信号的模型可以避免误报，并提供可靠的结果。此外，双重DNA酶对二价铜离子和镁离子表现出良好的选择性，相对于其他金属离子具有至少10倍的浓度耐受性。

附图说明

图1为本发明检测过程示意图。

图2为不同种类样品的荧光强度。样品1：不含二价铜离子和镁离子的空白样品；样本2：序列R1和R2被序列R’1和R’2取代；样品3：仅使用20nM二价铜离子样品；样品4：燃料链序列F1和F2的浓度变为1/2；样品5：熵驱动反应的1/2孵育时间；样品6：标准条件(本发明最佳实施方案)；样品7：将锁体序列(L1和L2)添加回样品6的打开的DNA镊子中。

图3为一些关键参数对该方法的荧光强度的影响图：(A)DNA纳米机器上DNA 复合物的表面浓度；(B)锁体序列和臂序列之间的碱基对数；(C)反应温度；(D) DNA酶裂解和熵驱动反应的时间

图4为不同浓度(A)二价铜离子(0.03、1、5、10、20、40、60和80nM) 和镁离子(0.01、0.5、5、15、30、50和100)的荧光发射光谱μM)；荧光强度与相应的二价铜离子(B)和镁离子(C)的校准曲线；(D)检测二价铜离子和镁离子的方法的选择性和抗干扰性。

具体实施例

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

准备材料和试剂

准备Tris-HCl缓冲液、氯金酸(HAuCl4.4H2O)和柠檬酸钠。准备如下DNA序列：

双重DNA酶的制备

将DNA序列E1，E2溶解在20mM Tris-HCl溶液(pH 7.5)中。将该溶液加热至90℃，保持5分钟，然后缓慢冷却以形成设计的双重DNA酶结构。

三维DNA纳米机器的制备

首先，将序列Q1，P1，R1，Q2，P2和R2杂交，以在含有0.1M NaCl的20 mMTris-HCl溶液(pH 7.5)中形成DNA复合物20分钟。然后，将20nM金纳米颗粒(AuNPs)添加到上述溶液中，孵育12小时以形成三维DNA纳米机器。之后，使用0.05％Tween 20减少非特异性吸附。通过以12,000rpm离心10分钟除去游离序列。洗涤沉淀物并将其分散在20mM Tris-HCl溶液(pH7.5)中。通过 BEER-Lambert定律评估三维DNA纳米机器的浓度，具体方法如下：

利用BEER-Lambert定律计算消光系数为AuNPs(2.7×108M-1·cm-1)的三维DNA纳米机器(CAuNPs)浓度。AuNPs(SAuNPs)的总表面积由下式确定： SAuNPs＝4πR2×CAuNPs×V×6.02×1023(R代表AuNPs的半径，V代表溶液的体积)。

在AuNPs上修饰了带有荧光团标记序列Q的DNA纳米机器。负载在AuNPs 上的荧光团标记序列Q的数量由如下方法确定：将20mM MCH添加到三维DNA 纳米机器的溶液中，以替换AuNPs上的DNA纳米机器。孵育过夜后，通过离心分离释放的荧光团标记序列Q。通过具有已知浓度的荧光团标记序列Q的标准线性校准曲线来计算荧光团标记序列Q(CFAM)的浓度。荧光团标记序列Q(TFAM) 的总摩尔为TFAM＝CFAM×VFAM。(VFAM代表释放的荧光团标记序列Q的体积)。DNA纳米机器(SC)的表面浓度定量计算为：SC＝TFAM/SAuNPs。

双DNA镊子纳米机器的制备

通过加热具有1：1摩尔比的序列A1，A2，T1，T2，L1和L2的混合物来合成双DNA镊子纳米机器。将该溶液加热至90℃5分钟，然后冷却以形成特定结构。

同时检测二价铜离子和镁离子

在典型的金属离子检测测定中，金属离子与100nM形成的双重DNA酶和50 nM的具有0.5μM燃料链的三维DNA纳米机器混合。然后将混合物溶液在含有 0.1M NaCl的20mMTris-HCl溶液(pH 7.5)中孵育1.5小时，以进行DNA酶切割反应和熵驱动的扩增反应。随后，将上述溶液以12,000rpm离心10分钟，然后将0.5μM双DNA镊子纳米机器添加到上清液中。孵育30分钟后，对于FAM和 Cy5，分别从505nm至600nm和650nm至750nm测量混合溶液的荧光光谱。

以上方法为本发明的最佳实施方案。

图1中显示了该方法的检测原理。双重DNA酶将二价铜离子和镁离子特异性 DNA酶结合在一起。在存在二价铜离子和镁离子的情况下，双重DNA酶可裂解底物链并释放两个DNA片段。这两个DNA片段可以与金纳米颗粒上DNA复合物上的相应立足域结合，从而启动熵驱动的扩增，导致序列P的释放并暴露出新的立足点。然后，燃料链可以在新的脚趾处结合，并通过链置换反应引起序列R1， R2和两个DNA片段的离开。释放的DNA片段可在另一个三维DNA纳米机器的立足域位置重新结合，以触发下一轮熵驱动的扩增，并最终产生大量序列R。双 DNA镊子的臂被序列L1和L2锁定。L2，导致荧光团和猝灭剂非常接近，并且信号显着猝灭。但是，序列R1和R2可以与锁体序列(序列L1和L2)退火以形成双螺旋，从而导致双DNA镊子的打开和荧光信号的“恢复”。最后，监测FAM 和Cy5的荧光光谱，并使用520nm和670nm的荧光强度定量分析二价铜离子和镁离子。

下面通过不同的实验组合研究了该方法的可行性(图2)。没有二价铜离子和镁离子的空白样品在两个荧光通道上均显示背景信号(样品1)。没有目标金属离子就无法发生DNA酶裂解反应。在序列R1和R2替换为序列R'1和R'2之后，序列R'1和R'2既不会打开双DNA镊子，也不会打开荧光信号(样品2)。当目标金属离子只有一种时，强荧光信号仅在相应的信号通道中显示(样品3)。当燃料链的浓度降低到0.25μM时，由熵驱动的扩增反应产生的序列R的数量也减少，从而产生相对较强的荧光信号(样品4)。在样品5中，熵驱动的扩增反应的孵育时间缩短到45分钟，导致镊子的部分打开和两个通道上相对较强的荧光信号。在标准条件(最佳实施方案)下的样品6显示出最高的荧光信号，表明 DNA酶裂解反应，熵驱动的扩增反应以及DNA镊子的结构变化均按预期进行。向样品6的打开的DNA镊子中添加锁体序列(L1和L2)30分钟后，FAM和Cy5 的荧光强度均显着下降，表明打开的DNA镊子已部分恢复为关闭状态(样品7)。荧光信号的这些变化间接证明了该方法的工作机制。

下面是优化检测条件的过程为了获得最佳性能，已经优化了一些关键实验参数，包括DNA纳米机器上DNA复合物的表面浓度，DNA酶裂解时间和熵驱动反应的时间，反应温度，锁体序列和臂序列之间的碱基对数以及缓冲液的pH等。

DNA纳米机器DNA复合物的表面浓度对熵驱动反应的放大效率和该方法的敏感性有很大影响。DNA纳米机器的表面浓度按照支持信息中所述的步骤确定。 DNA纳米机器的表面浓度可以从0调整到55pmol/cm2。当DNA纳米机器的表面浓度增加时，它可以提高熵驱动反应的扩增效率，产生更多的序列R以打开双 DNA镊子。因此，荧光信号随DNA纳米机器的表面浓度从0升高到34pmol/cm2 而增加。但是，当表面浓度超过34pmol/cm2时，荧光信号会明显降低(图3A)。这可能归因于带负电荷的DNA的高表面浓度引起的静电排斥作用和空间位阻影响，从而导致熵驱动的扩增反应的杂交效率低。

对于双DNA镊子的设计，锁体序列L和臂序列R之间的碱基对数目可能会影响双DNA镊子的结构稳定性以及锁体序列L和序列R之间的杂交效率。如图 3B所示，背景信号随着碱基对数目增加的双DNA镊子热力学稳定性的改善，碱基对数目的下降明显下降。但是，高碱基对数会降低双DNA镊子的杂交效率和“打开”率。因此，在该实验中选择了6个碱基对。

反应温度会影响DNA酶裂解的效率，DNA镊子的恢复率以及双DNA酶和双 DNA镊子的稳定性。随着温度的升高，荧光信号明显增加，表明反应温度与DNA 的切割和杂交呈正相关。然而，荧光信号在45℃左右缓慢下降，归因于双重DNA 核酸酶和双重DNA镊子的热稳定性较弱。为了证明这一假设，我们研究了在不同温度下双DNA镊子的背景。背景信号在45℃时急剧上升，表明双DNA镊子在 45℃时的热力学稳定性相对较弱，双DNA镊子的结构不稳定(图3C)。因此，反应温度选择为30℃。

DNA酶裂解反应和熵驱动反应一起进行。因此，DNA酶裂解反应和熵驱动反应的时间是最佳的参数之一。它显示了DNA酶裂解反应的孵育时间和熵驱动的反应与该方法的荧光强度和灵敏度呈正相关。荧光信号在开始时随时间急剧增加，表明熵驱动的扩增反应具有明显的信号增强能力。此外，荧光强度在90分钟左右变得稳定(图3D)。该结果意味着熵驱动的扩增反应在90分钟左右几乎完成。因此，DNA酶裂解反应和熵驱动反应的时间为90分钟。

据报道，缓冲液的pH值对切割效率有显着影响。我们的方法中有两种DNA酶。它应该一起考虑这两种DNA酶的优选条件。两种DNA酶的相似孵育条件可以提供该方法更好的性能。二价铜离子特异性DNA酶在pH值为7.5时显示出最高的响应，而镁离子特异性DNA核酸酶在pH值为8时显示出最强的信号。结果表明这两种DNA酶的孵育条件并不矛盾。因此，我们的实验选择了Tris-HCl(pH 7.5)。

AuNPs和双DNA镊子的浓度对这种方法的扩增效率和灵敏度有很大影响。这两个参数也已优化，AuNPs和双DNA镊子的最佳浓度分别为50nM和0.5μM。

下面研究同时检测二价铜离子和镁离子的分析性能：在优化条件下评估了这种双DNA镊子的分析性能。二价铜离子和镁离子的荧光强度均随二价铜离子和镁离子浓度的增加而增加(图4A)，并获得0.02至20nM(R2＝0.991)的良好线性范围(图3B)和0.01至30μM(R2)。镁离子(＝0.994)(图4C)。根据空白的3σ标准，计算得出的二价铜离子的LOD为10pM，镁离子的LOD为2nM。单独的金属离子的分析性能比没有扩增方法的方法要好得多，并且可以与其他具有扩增方法的报告相媲美。该结果表明，熵驱动的反应具有高的信号放大效率。而且，它可以通过简单的实验操作同时检测两种金属离子。

下面通过一些干扰离子如Zn2+，Ca2+，Fe3+，Cd2+，Co2+，Hg2+和Pb2+ 评估该方法的选择性和抗干扰性。如图4D所示，该方法仅对二价铜离子和镁离子表现出强信号，而对于其他浓度为10倍的金属离子则可忽略不计。此外，强荧光信号仅在混合样品的靶标相应荧光通道上显示，而靶标和干扰金属离子之间没有串扰，可同时检测二价铜离子和镁离子。

下面为同时检测人血清样品中的二价铜离子和镁离子的研究：

通过同时检测人血清样品中的二价铜离子和镁离子，研究了该方法的实际应用能力。首先，使用孔径为10kDa的旋转过滤器去除蛋白质，然后将血清样品的pH 值调整为7.5。稀释至线性范围后，按照最佳实施方案所述的程序进行检测。二价铜离子和镁离子的浓度分别为14.2μM，18.1μM，1.12mM和0.95mM。加标样品用于回收率测量，二价铜离子的回收率从92％到106％，镁离子的回收率从93％到107％。二价铜离子的RSD从5.26％到9.53％，镁离子的RSD从6.31％到9.35％(结果如下表所示)。这些结果满足了实际应用的要求，显示了该方法在临床分析中的广阔前景。

综上所述，开发了一种超灵敏的双DNA镊子，用于同时超灵敏地检测二价铜离子和镁离子。该方法具有以下优点：通过熵驱动的扩增反应可进行扩增，灵敏度高；金属离子特异性DNA酶的特异性高；背景检测模型可靠且低。它可以同时检测两种金属离子，而没有高精度和高精度。该方法在生物样品用于医学诊断中显示出巨大的潜力。

Claims

1.一种基于熵驱动的纳米机器同时检测二价铜离子和镁离子的方法，包括如下步骤：

1)双重DNA酶的制备，使DNA序列E1，E2形成双重DNA酶结构，其中，E1序列(5’至3’)为TCAGATTCCGAGCATTCTCTCTrAGGACAAAAGGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAAC，E2序列(5’至3’)为GCGAAAGCTTCTTTCTAATACGGCTTACCTTTTGTCAGCGATCCGGAACGGCACCCATGTGAGAGAA；

2)三维DNA纳米机器的制备，将序列Q1，P1，R1，Q2，P2和R2杂交，然后，加入20nM金纳米颗粒，孵育12小时以形成三维DNA纳米机器，其中，Q1序列(5’至3’)为CGTATTAGAAAGAAGCTTTCGCAGGGGTGAAACCCATCCCG-SH，P1序列(5’至3’)为CCACATACATCATATTCCCTGCGAAAGCTTCTTTCT，R1序列(5’至3’)为TAGCGGGATGGGTTTCAC，Q2序列(5’至3’)为AGAGAGAATGCTCGGAATCTGATGATGTGACAGCTATCGCG-SH，P2序列(5’至3’)为TGACTGACATGATGTAATCATCAGATTCCGAGCATT，R2序列(5’至3’)为CTGCGCGATAGCTGTCAC；

3)双DNA镊子纳米机器的制备，通过加热具有1：1摩尔比的序列A1，A2，T1，T2，L1和L2的混合物来合成双DNA镊子纳米机器，其中，A1，A2，T1，T2，L1和L2的序列(5’至3’)依次为：FAM-GCGGGAGTCCTATCTATGATGGCCCCTTTGTAGACTCAGGAT-GCTGTC-BHQ3，Cy5-GCGCGAATGACACATCACTAGGCCCCGTTGGAGCGACATTAG-GGTTTC-DABCYL，CTAATGTCGCTCCAACAACCATCATAGATAGGAC，ATCCTGAGTCTACAAATACCTAGTGATGTGTCAT，GTGAAACCCATCCCGCTA，GTGACAGCTATCGCGCAG；

4)同时检测二价铜离子和镁离子，将待测溶液与步骤1)，2)所得溶液混合，孵育，离心取上清液，加入步骤3)所得溶液，再孵育后，分别从505nm至600nm和650nm至750nm测量混合溶液的荧光光谱，利用标准曲线法计算待测溶液中二价铜离子和镁离子的浓度。

2.如权利要求1所述方法，其中步骤1)具体为：将DNA序列E1，E2溶解在20mM Tris-HCl溶液(pH 7.5)中，将该溶液加热至90℃，保持5分钟，然后缓慢冷却以形成设计的双重DNA酶结构。

3.如上述权利要求之一所述方法，其中步骤2)具体为：将序列Q1，P1，R1，Q2，P2和R2杂交，以在含有0.1M NaCl的20mMTris-HCl溶液(pH 7.5)中形成DNA复合物20分钟，然后，将20nM金纳米颗粒添加到上述溶液中，孵育12小时以形成三维DNA纳米机器，之后，使用0.05％Tween 20减少非特异性吸附，通过以12,000rpm离心10分钟除去游离序列，洗涤沉淀物并将其分散在20mM Tris-HCl溶液(pH 7.5)中。

4.如上述权利要求之一所述方法，其中步骤3)具体为：通过加热具有1：1摩尔比的序列A1，A2，T1，T2，L1和L2的混合物来合成双DNA镊子纳米机器，将该溶液加热至90℃ 5分钟，然后冷却以形成特定结构。

5.如上述权利要求之一所述方法，其中步骤4)具体为：待测溶液与100nM形成的双重DNA酶和50nM的具有0.5μM燃料链的三维DNA纳米机器混合，然后将混合物溶液在含有0.1MNaCl的20mMTris-HCl溶液(pH 7.5)中孵育1.5小时，随后，将上述溶液以12,000rpm离心10分钟，然后将0.5μM双DNA镊子纳米机器添加到上清液中孵育30分钟后，分别从505nm至600nm和650nm至750nm测量混合溶液的荧光光谱，利用标准曲线法计算待测溶液中二价铜离子和镁离子的浓度。