CN107727618B - 生物芯片和特异性切割位点dna序列检测汞离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物芯片和特异性切割位点DNA序列检测汞离子的方法，属于生物化学、环境检测和食品安全等领域中的核酸检测方法。本发明应用一种新的简单有效的机制：基于Hg²⁺诱导的硫代磷酸酯RNA修饰的切割结合生物芯片来检测Hg²⁺。设计了两种包含一个和两个硫代磷酸酯RNA修饰的切割位点的分子信标，利用所携带的羧基荧光素荧光标记(FAM)可以灵敏地选择性检测Hg²⁺。本发明属于生物化学、环境检测和食品安全等领域中的重金属检测方法，所使用的DNA含有的硫代磷酸酯RNA修饰的切割位点具有多个，即增加DNA的Hg²⁺特异性切割位点会提高检测Hg²⁺的灵敏度。

Description

生物芯片和特异性切割位点DNA序列检测汞离子的方法

技术领域：

本发明属于生物化学、环境检测和食品安全等领域中的重金属检测方法，基于氧化石墨烯纳米材料(Graphene Oxide)，物理性吸附含有PS(硫代磷酸酯)RNA修饰的FAM(羧基荧光素)标记的DNA，结合生物芯片通过荧光强度的变化来检测所加Hg²⁺的浓度。此外本发明所使用的DNA含有的PS RNA修饰切割位点具有多个，即增加DNA的Hg²⁺特异性切割位点会提高检测Hg²⁺的灵敏度。

背景技术：

汞是一种剧毒的重金属，由于其生物累积性，长期暴露于汞中即使是很低的浓度也会导致严重的器官损伤。为了实现快速检测，许多小分子，肽，脂质和核酸已经被应用于Hg ²⁺的生物传感检测中。在过去的十年中，通过生物传感器检测Hg²⁺已吸引了人们广泛的研究兴趣。尤其是现已开发了许多基于DNA的传感策略。众所周知的实例包括胸腺嘧啶(T)-Hg²⁺相互作用和Hg²⁺活化的DNA酶。然而，这些机制高度依赖于缓冲条件或需要与另一条DNA链杂交。在这里，本发明应用一种新的简单有效的机制：基于Hg²⁺诱导的硫代磷酸酯RNA修饰的切割结合生物芯片来检测Hg²⁺。设计了两种包含一个和两个PS RNA切割位点的分子信标，利用所携带的FAM荧光标记可以灵敏地选择性检测Hg²⁺。

GO(氧化石墨烯)具有良好的亲水活性，表面积大且表面具有较多的功能基团，如羟基、羧基和环氧基等功能基团，这些功能基团与水分子具有较强的结合能力，因此易溶于水，制备方便。此外GO具有极强的吸附物理特性，对荧光分子有较强的淬灭作用。

强亲硫性是Hg²⁺的一个重要特征，其可将Hg²⁺与其它常见金属离子区分开。本发明通过硫代磷酸酯(PS)修饰将硫原子引入DNA序列，其中DNA磷酸主链中的一个非桥接氧原子被硫原子取代。Hg²⁺与S结合导致磷酸键断裂，致使带有FAM的一端远离淬灭剂，荧光强度增强。

生物芯片技术起源于核酸分子杂交。所谓生物芯片一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段、多肽、蛋白质、糖分子、组织等)的微阵列杂交型芯片(micro-arrays)，阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的序列点阵。芯片底部分布矩阵，将橡胶按底部的矩阵吸附在芯片上，这样橡胶将玻片表面平均分成多格而每格的传感体系互不干扰，可实现多浓度及多样本的高通量检测,见图1。且橡胶可拆卸下来循环利用，减低成本。所以将芯片作为测量传感器的载体工具简单有效。

发明内容

生物芯片和特异性切割位点DNA序列检测汞离子的方法，按照以下方法进行：

(1)设计：按检测原理设计含有一个和两个PS修饰切割位点的DNA序列，送去生物公司合成。将获得的DNA序列溶于超纯水中，终浓度为50nM。

(2)制作芯片：用浓硫酸和双氧水以体积7:3的比例浸泡玻片2小时及以上以去掉玻片上的杂质并使玻片材料的羟基(-OH)暴露便于和传感器中GO(氧化石墨烯)中的羧基结合，使传感器在玻片上稳定存在。之后用清水洗涤多次，晾干或风干，在测量时可将橡胶放置在处理后的玻片上，可按一定力度按压，以防后期加入的待测物泄露。

(3)淬灭：加入2mg/ml的GO，使其在一个切割位点反应体系中的终浓度为12μg/ml，在两个切割位点反应体系中的终浓度为10μg/ml。加入GO后常温下反应20分钟，测量此时的荧光强度F₀。

(4)检测:按梯度加入不同浓度的Hg²⁺，常温下反应20分钟。之后通过生物芯片观察其荧光强度F，与淬灭后的荧光数值F₀进行比较，按照F/F₀-1公式查看荧光回复率，加入的Hg²⁺浓度与荧光回复率呈一定的正比关系。

(5)对比：将一个切割位点的荧光回复率与两个的进行对比，发现本发明中两个切割位点的回复效率远高于一个切割位点的，说明增加切割位点会提高检测的灵敏度。

(6)实际检测：由于废水中Hg²⁺的含量我们不甚清楚，所以先在废水中加入DNA传感器，之后再向废水中加入所知浓度的Hg²⁺，而该已知浓度的Hg²⁺所引起的荧光强度变化值F₁可直接从灵敏性图中得知。

若废水中原本不存在Hg²⁺，那么所产生的荧光强度变化值则是由后加的Hg²⁺所引起，荧光强度值则为已知浓度的Hg²⁺所引起的荧光强度变化值F₁；若废水中原存在一定量的Hg²⁺加入传感器后会产生荧光强度变化值F₀，后加已知浓度的Hg²⁺通过累加效应会产生一个新的荧光强度值F₂(F₂＝F₁+F₀)，由于后加的Hg²⁺浓度和其对应的荧光强度变化值F₁已知，可代入灵敏性图中的公式中，求得废水中原存在的Hg²⁺的浓度。

两个PS修饰切割位点的DNA序列为：

一个切割(PS)位点：5’GTCACGAGTCAC TAT/rA/*G-FAM 3’

两个切割(PS)位点：5’GTCACGAGTCAC TAT/rA/*G/rA/*G-FAM 3’

(序列中“/rA/*”表示对腺嘌呤脱氧核糖核苷酸进行修饰，将其中磷酸基团中的一个非桥接氧原子换成一硫原子，并使原来C₂的脱氧状态变成带羟基(-OH)，使该脱氧核糖核苷酸变成核糖核苷酸。)

本发明具有以下优点：

(1)本发明原理简单，操作方便，省时省力，利用Hg²⁺特异性切割的原理明确的反映出Hg²⁺的含量，为环境及食品安全等领域检测Hg²⁺带来了极大的便利。

(2)本发明中氧化石墨烯纳米材料易于获得，方法简单、成本低，性质稳定。

(3)本发明中所用的测量载体——生物芯片，可实现多浓度，多样本的检测，因操作过程中所加的样片量较少，覆盖在芯片的矩阵点处即可，所以能实现对样品的高通量检测。

(4)本发明涉及不同数量切割PS位点，说明增加PS切割位点会提高检测Hg²⁺的灵敏度，对以后优化Hg²⁺检测提供了一定的基础，也为Hg²⁺检测开辟了新的研究道路。

附图说明

图1：芯片示意图。

图2：一个切割位点的最佳GO浓度的选择图。图中显示使用12μg/ml的GO荧光淬灭率达80％。

图3：两个切割位点的最佳GO浓度的选择图。图中显示使用10μg/ml的GO荧光淬灭率达80％。

图4：一个切割位点的动力学图。图中显示在一个切割位点体系中加入不同浓度Hg²⁺后不同反应时间下的荧光强度的变化，其中所加的Hg²⁺从0逐渐累加到终浓度为2μM。

图5：两个切割位点的动力学图。图中显示在两个切割位点体系中加入不同浓度Hg²⁺后不同反应时间下的荧光强度的变化，其中所加的Hg²⁺从0逐渐累加到终浓度为2μM。

图6：一个切割位点的灵敏性图(A₁和B₁)。图中显示一个切割位点体系中加入不同浓度Hg²⁺的荧光强度和荧光回复率(F/F₀-1)的变化，其中所加的Hg²⁺从0逐渐累加到终浓度为2μM。

图7：两个切割位点的灵敏性图(A₂和B₂)。图中显示两个切割位点体系中加入不同浓度Hg²⁺的荧光强度和荧光回复率(F/F₀-1)的变化，其中所加的Hg²⁺从0逐渐累加到终浓度为2μM。

图8：一个切割位点的选择性图。图中显示一个切割位点在加入不同金属离子后的荧光强度的变化，其中每种金属离子的终浓度为100nM。

图9：两个切割位点的选择性图。图中显示两个切割位点在加入不同金属离子后的荧光强度的变化，其中每种金属离子的终浓度为100nM。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。

实施例：

(1)合成特异的DNA序列如下所示：

一个切割(PS)位点：5’GTCACGAGTCAC TAT/rA/*G-FAM 3’

两个切割(PS)位点：5’GTCACGAGTCAC TAT/rA/*G/rA/*G-FAM 3’

(序列中“/rA/*”表示对腺嘌呤脱氧核糖核苷酸进行修饰，将其中磷酸基团中的一个非桥接氧原子换成一硫原子，并使原来C₂的脱氧状态变成带羟基(-OH)，使该脱氧核糖核苷酸变成核糖核苷酸。)

(2)向50nM DNA体系中加入梯度浓度的GO，选出最佳淬灭率的GO浓度使荧光淬灭率达80％左右,见图2和图3,这里最终的选择：一个切割位点需12μg/ml，两个切割位点需10μg/ml。

(3)向1ml含有50nM的1个PS位点的DNA中加入6μl的2mg/ml的GO(终浓度12μg/ml)，之后反应20min，吸取200μl于生物芯片上测量其荧光强度；向1ml含有50nM的2个PS位点的DNA中加入5μl的2mg/ml的GO(终浓度10μg/ml)，之后反应20min，吸取200μl于生物芯片上测量其荧光强度。

(4)向(3)体系中各自加入不同浓度的Hg²⁺(可按比例逐渐累加)，之后反应约20分钟多，吸取200μl于生物芯片上测量现有的荧光强度，见图4和图5查看两个传感器的动力学图，明确加入Hg²⁺后的反应时间和反应状态。与(3)的荧光强度进行比较计算回复率(F/F₀-1)，见图6和图7查看两个传感体系中Hg²⁺对荧光的回复作用。

(5)也可向(3)体系中加入不同浓度的各种金属离子包括Hg²⁺，突出Hg²⁺特异切割性质，步骤同(4)，结果见图8和图9。

(6)将一个切割位点的各种数据与两个的进行对比，说明增加PS切割位点可提高检测的灵敏度。

(7)本实验不需要预处理。取适量废水，经过滤去除其沉淀物，之后向1ml的已过滤的废水中加入50nM的一个切割位点的DNA传感器，再另向1ml的已过滤的废水中加入50nM的两个切割位点的DNA传感器，之后分别向这两个体系加入10nM,100nM,1000nM的Hg²⁺。结果显示一个切割位点传感器的回收率范围为93％～102％，两个切割位点的回收率范围为105％～109％。根据以上方法及灵敏性图中的公式得知检测结果：所用废水含有的Hg²⁺约0.0004mg/L(2.59nM)。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 生物芯片和特异性切割位点DNA序列检测汞离子的方法

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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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gtcacgagtc actat 15

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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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Claims (1)

1.生物芯片和特异性切割位点DNA序列检测汞离子的方法，其特征在于按照以下方法进行：

(1)设计：按检测原理设计含有一个和两个硫代磷酸酯(PS)RNA修饰切割位点的DNA序列，送去生物公司合成；将获得的DNA序列溶于超纯水中，终浓度为50nM；

其中一个切割PS位点为：5’GTCACGAGTCAC TAT/rA/*G-FAM 3’；

两个切割PS位点为：5’GTCACGAGTCAC TAT/rA/*G/rA/*G-FAM 3’；

(2)制作芯片：用浓硫酸和双氧水以体积7:3的比例浸泡玻片2小时以上以去掉玻片上的杂质并使玻片材料的羟基(-OH)暴露便于和传感器中氧化石墨烯(GO)中的羧基结合，使传感器在玻片上稳定存在；之后用清水洗涤多次，晾干或风干，在测量时将橡胶放置在处理后的玻片上，按一定力度按压，以防后期加入的待测物泄露；

(3)淬灭：加入2mg/ml的GO，使其在一个切割位点反应体系中的终浓度为12μg/ml，在两个切割位点反应体系中的终浓度为10μg/ml；加入GO后常温下反应20分钟，测量此时的荧光强度F₀；

(4)检测:按梯度加入不同浓度的Hg²⁺，常温下反应20分钟；之后通过生物芯片观察其荧光强度F，与淬灭后的荧光数值F₀进行比较，按照F/F₀-1公式查看荧光回复率，加入的Hg²⁺浓度与荧光回复率呈一定的正比关系；

(5)对比：将一个切割位点的荧光回复率与两个的进行对比，发现两个切割位点的回复效率高于一个切割位点的，说明增加切割位点会提高检测的灵敏度；

(6)实际检测：由于废水中Hg²⁺的含量未知，所以先在废水中加入DNA传感器，之后再向废水中加入所知浓度的Hg²⁺，而该已知浓度的Hg²⁺所引起的荧光强度变化值F₁可直接从灵敏性图中得知。