CN102435647A - 一种利用基于石墨烯电极的分子器件检测重金属的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测重金属的方法及其专用的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件。所述DNAzyme单分子连接器件的制备方法包括下述步骤：1)构建石墨烯晶体管器件阵列；2)在石墨烯分子器件中切割1-10nm大小的纳米间隙；3)将设计的DNAzyme序列连接到纳米间隙中，得到DNAzyme单分子连接器件。利用上述制备的DNAzyme单分子连接器件进行与重金属离子结合与识别的电学信号检测，同时排除各项干扰因素；并在器件上对重金属离子进行灵敏度等的测试；根据以上步骤的实验结果确定测量条件，在连接器件上实现对重金属离子的检测。本发明可利用功能化的石墨烯电极的分子器件通过电学信号实现对重金属进行高灵敏度地检测。该方法对环境中痕量的重金属检测有较大的意义。

Description

一种利用基于石墨烯电极的分子器件检测重金属的方法

技术领域

本发明涉及一种利用基于石墨烯电极的分子器件检测重金属的方法。

背景技术

重金属不仅可以长期存在，还可以通过食物链累积的方式贮存到生物体内，产生的毒害不易察觉，而且当前重金属污染日趋严重，在医药、食品、环境等方面已经引起人们高度的重视。目前对重金属检测方法的研究越来越多，主要包括免疫分析法、原子分光光度法、溶出伏安法、色谱法、试纸法、酶分析法、生物化学传感器法等，现有的一些方法缺乏更高的灵敏度，受环境因素影响变化较大，建立一种高灵敏地检测方法的体系是目前迫切需要的。(1：Malitesta C，Guascito M R.Biosensor Bioelectron，2005，20(8)：1643-16472.2：Johnson D K，Combs S M，Parsen J D，et al.Environ SciTechnol，2002，36：1042-1047.3：Darwishi A，Blake D A.Analytical Chemistry，2001，73：1889-1895.4：Dhar R K，Zheng Y，Rubenstone J，et al.Anal Chim Acta，2004，526：203-209.5：Dong Y，Dayou F，Rong W，et al.Spectmehim Acta，2008，71：276-279.)

石墨烯是一种新兴的二维平面材料，有很多优良的性质，如它有较高的强度、较高的电子迁移率以及热导率(Geim，A.K.；Novoselov，K.S.Nature.Mater.2007，6，183.)。石墨烯由于其良好的导电性和化学稳定性可以作为一种理想的电极材料，我们已经建立在石墨烯的纳米间隙之间通过牢固的酰胺键连接一个或者几个分子构建单分子器件的方法。该石墨烯分子器件不仅可以有效地连接DNA分子，而且可以承受外界条件刺激。(1：Guo，X.et al.Science，2006，311，356.2：Guo，X.et al.Nano Lett.，2007，7，1119.3：Guo，X.，Gorodetsky，A.A.，Hone，J.，Barton，J.K.，Nuckolls，C.Nat.Nanotechnol.2008，3，163.)DNA酶(DNAzyme)是一种具有催化功能的DNA分子，该DNA分子是利用体外分子进化技术获得的(Santoro S W，Joyce G F.Proc.Natl.Acad.Sci.，1997，94，9：4262-4266)，目前广泛用于重金属的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种单分子水平上高灵敏度地检测重金属的方法及其专用的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件。

本发明所提供的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件，包括：

a)石墨烯晶体管器件阵列，所述石墨烯晶体管器件阵列中每个石墨烯晶体管器件均包括栅极、源极、漏极和导电沟道，所述导电沟道为石墨烯；其中，在所述石墨烯上设有一个通道，所述通道上间隔设有长度为1-10nm的DNAzyme序列连接部位(纳米间隙)，所述DNAzyme序列连接部位与所述石墨烯晶体管器件中的源极和漏极垂直；

b)能被待测重金属离子特异性切割的且末端(3′端和5′端)经氨基修饰的DNAzyme序列，或能被待测重金属离子特异性切割的且末端(3′端和5′端)连接氨基修饰的有机分子的DNAzyme序列；其连接于所述DNAzyme序列连接部位。

其中，所述栅极为含有厚度为100-1000nm(如300nm)二氧化硅层的硅基底，其电阻率为5-20ohm·cm^-1；所述源极和漏极均由Cr电极层和设于所述Cr电极层上的Au电极层组成，所述Cr电极层厚度为1-100nm(如80nm)，所述Au电极层厚度为20-1000nm(如600nm)；所述源极和漏极之间的间距为4-7μm。

制备上述基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件的方法，包括下述步骤：

1)构建石墨烯晶体管器件阵列；

2)在所述石墨烯晶体管器件阵列的每个石墨烯晶体管器件的石墨烯上采用电子束曝光法(即旋涂正性电子束光刻胶，用电子束对所述电子束光刻胶进行曝光)，得到虚线形状的曝光图案(见图5)，然后进行氧等离子体刻蚀，使所述石墨烯晶体管器件的源极和漏极之间得到一个通道，并在所述通道上间隔得到长度为1-10nm的纳米间隙，所述纳米间隙与所述石墨烯晶体管器件中的源极和漏极垂直；

所述虚线形状的曝光图案中，线条宽度为2-10nm(如5nm)，每段实线的长度为150-500nm(如150nm)、实线间距为20-50nm(如40nm)；

3)将步骤2)得到的纳米间隙两侧的石墨烯的末端羧基进行活化，然后与下述DNAzyme序列1)或2)进行纳米间隙中的酰胺键共价连接，得到基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件：所述序列1为能被待测重金属离子特异性切割的且末端经氨基修饰的DNAzyme序列；所述序列2)为能被待测重金属离子特异性切割的且末端连接氨基修饰的有机分子的DNAzyme序列。

上述步骤1)中构建石墨烯晶体管器件的方法具体可包括下述三个步骤：

a)在石墨烯上旋涂光刻胶，记为光刻胶1，对光刻胶1进行曝光得到标记图案，在标记图案处依次蒸镀厚度为1-100nm(如80nm)Cr层、20-1000nm(如200nm)Au层，除去光刻胶1，在石墨烯曝光位置处留下了蒸镀的金属标记，所述金属标记用于下两步光刻的位置对准标记；其中，所述石墨烯附着于表面具有二氧化硅层的硅基底上；

b)在步骤a得到的有金属标记的石墨烯上旋涂光刻胶2，通过步骤a的标记定位，曝光，留下条带状的光刻胶将部分石墨烯保护起来，其它部分通过曝光显影将石墨烯曝露出来，用氧等离子体刻蚀掉其它部分曝露的石墨烯，保护在条带状光刻胶下面的石墨烯不被刻蚀得以保留，除去光刻胶2，得到条带状石墨烯，将所述条带状石墨烯在氢气和氩气气氛下于400-450度退火，清洁石墨烯条带的表面；

c)在步骤b得到的有石墨烯条带的硅片上旋涂光刻胶3，通过步骤a的标记定位在石墨烯条带上曝光源极和漏极电极图案，所述源极和漏极之间的间距为4-7μm，在所述电极图案上依次蒸镀厚度为1-100nm(如80nm)的Cr层、厚度为20-1000nm(如600nm)的Au层作为器件的源极和漏极，除去光刻胶3，得到所述石墨烯晶体管器件。

所述步骤a)中的石墨烯是按照下述方法进行制备的：在铜箔上使用化学气相沉积的方法生长大面积连续的单层石墨烯，再将所述石墨烯从铜箔转移到表面具有100-1000nm(如300nm)二氧化硅层的硅基底上；所述表面具有100-1000nm二氧化硅层的硅基底的电阻率为5-20ohm·cm^-1。

其中，从铜箔上转移石墨烯的方法可按照常规方法进行，具体如下：利用柔性的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)高分子膜做担载，在已生长石墨烯的铜箔上旋涂PMMA薄膜，180℃烘2分钟，然后将样品置于饱和硝酸铁溶液中，将铜箔腐蚀掉，石墨烯包埋在PMMA薄膜中被分离出来。PMMA薄膜携带着石墨烯薄膜可以附着在硅基底上，然后用丙酮除去PMMA薄膜即可。

上述步骤2)中进行氧等离子体刻蚀后，对于没有形成所述纳米间隙的部位可以利用电流烧断法继续处理，逐渐缓慢增大通过电流，石墨烯会在氧化切割的缺陷部位优先断裂，直至得到所述的纳米间隙。

上述步骤3)中对纳米间隙两侧的石墨烯的末端羧基进行活化的方法为：将步骤2)得到的具有纳米间隙的石墨烯分子器件在含有氨基耦合和活化试剂(Sulfo-NHS，EDCI)的10-100mM(优选50nm)MES缓冲溶液中浸泡8-12小时；所述MES缓冲溶液的pH值为3-10(优选pH 4.7)，所述MES缓冲溶液中Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)的浓度为5-15mM，EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的浓度为3-10mM。步骤3)中所述酰胺键共价连接在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)中进行，所述PBS缓冲液的浓度为10-100mM，pH值为6-8(优选pH 7.2)。

本发明的再一个目的是提供一种利用上述基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件检测重金属的方法。

本发明所提供的检测重金属的方法，包括下述步骤：

1)对本发明制备的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件进行对重金属离子的结合与识别的电学信号检测，同时进行对照实验设计排除干扰因素；其中，所述重金属离子对器件中的DNAzyme具有特异性切割作用；

2)对本发明制备的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件进行重金属离子检测的灵敏度测试；

3)根据步骤1)和2)的实验结果确定检测条件，利用所述基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件检测重金属离子，测量检测过程中的电流变化，基于电流的变化实现对重金属离子的检测。

上述各步骤的确定均使用探针台对于器件的电学信号进行监测，在常温常压下测量数据结果。得到的连接器件的电学信号表明，石墨烯最初的半导体或者金属的性质在连接DNAzyme后得以保留。

当利用本发明的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件检测Cu²⁺时，所用的DNAzyme是由下述序列a和序列b变性形成双链口袋型构象的DNA，Cu²⁺能够特定切割该DNA序列的特定位点。

a.H₂N-(CH₂)₃-5′-TTCTTTCTAATACGGCTTACC-3′-(CH₂)₃-NH₂(核苷酸序列如序列表中序列1所示)

b.5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAAC-3′(核苷酸序列如序列表中序列2所示)

其中，序列a自5′端起第14-21位与序列b自5′端起第1-8位碱基互补，且序列b自5′端起第15-22位与序列b自5′端起第25-32位碱基互补。

当利用本发明的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件检测pb²⁺时，所用的DNAzyme是由下述序列c和序列d形成双链口袋型构象的DNA，pb²⁺能够特定切割该DNA序列的特定位点。

c.H₂N-(CH₂)₃-5′-GTAGAGAAGGrATATCACTCA-3′-(CH₂)₃-NH₂(核苷酸序列如序列表中序列3所示)

d.5′-TGAGTGATAAAGCTGGCCGAGCCTCTTCTCTAC-3′(核苷酸序列如序列表中序列4所示)

其中，序列c中的“rA”代表A为核糖核酸；序列c自5′端起第1-9位与序列d自5′端起第33-25位碱基互补，且序列c自5′端起第12-20位与序列d自5′端起第9-1位碱基互补，且序列d自5′端起第15-27位与序列d自5′端起第23-21位碱基互补。

在上述检测方法中，步骤1)是关键步骤，具体的结合过程是：将新得到的DNAzyme单分子连接器件浸泡在含有对DNAzyme具有特定切割作用的重金属离子溶液中，DNAzyme-重金属发生切割作用之后，对器件的电学信号进行检测，能够观察到器件导电性发生变化，在相同实验条件下进行重复性实验，结果表明上述实验现象相一致。

步骤1)中观察到的器件导电性的变化来源于连接在分子器件上的DNAzyme序列在重金属作用下结构的改变。为排除潜在的假相，本发明在相同的处理条件下进行了对照实验。对照实验中，发明人对于不具有切割位点的DNAzyme进行切割，电流没有发生明显变化。

步骤2)中通过改变重金属的浓度来研究连接器件的灵敏度。多个DNAzyme单分子连接器件用来检测不同浓度的重金属。在重金属溶液处理前后，通过电学测量的I-V曲线检测结合过程，在不同的检测浓度下可以得到不同器件之间一致的实验结果，再次证明本发明具有较好的可信性与重现性。使用该发明的单分子器件对重金属检测与之前的检测方法相比，具有更高的检测灵敏度，目前使用DNAzyme和Cu²⁺的模型体系对Cu²⁺的检测灵敏度达到0.05pmol/l，已报道的较高的检测灵敏度是10nmol/l(Zong C.，Ai K.，Zhang G.，Li H.，and Lu L.Anal.Chem.2011，83，3126-3132)，在灵敏度上提高了200000倍。

本发明方法可检测的重金属包括：Cu²⁺、pb²⁺、Hg²⁺等。采用该方法对重金属离子检测的灵敏度可达到pmol级。

本发明利用功能化的石墨烯电极的分子器件通过电学信号实现对重金属高灵敏度地检测。本发明对环境中痕量的重金属的检测有较大的意义。

本发明所提供的DNAzyme单分子器件检测方法具有以下优点：

1、本发明是将一定的DNAzyme序列连接在石墨烯的分子点电极之间得到功能化的分子器件，通过重金属对DNAzyme序列的切割作用使监测电流产生变化，从而实现对重金属的检测，不需要其他标记，是一种无标记检测方法。

2、本发明使用的功能化单分子器件具有很好的稳定性，在检测重金属的过程中能够快速响应，通过电学信号的特征显示重金属对特定的DNAzyme序列的切割作用。

3、本发明的检测方法利用的是功能化器件中的单分子位点进行相互作用的识别，具有单分子水平检测的特征，与现有的方法相比，具有较高的检测灵敏度。

附图说明

图1基于石墨烯电极的分子器件对Cu²⁺体系检测示意图。

图2实施例中基于石墨烯电极的分子器件的电学性质检测图。

图3制备石墨烯电极的分子器件的第一次光刻图。

图4光学显微镜表征的石墨烯器件结构图。

图5石墨烯分子器件上虚线间隔的曝光图案。

图6石墨烯分子器件切割得到的纳米间隙表征图。

图7为基于石墨烯电极的分子器件对pb²⁺体系检测示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：基于石墨烯电极的DNAzyme分子器件检测微量Cu²⁺

检测Cu²⁺的DNAzyme分子器件，包括：

a)石墨烯晶体管器件阵列，所述石墨烯晶体管器件阵列中每个石墨烯晶体管器件均包括栅极、源极、漏极和导电沟道，所述导电沟道为石墨烯；其中，在所述石墨烯上设有由氧等离子体刻蚀石墨烯得到的一个通道，所述通道上间隔设有长度为1-10nm的分子连接部位(纳米间隙)，所述分子连接部位与所述石墨烯晶体管器件中的源极和漏极垂直；其中，所述栅极为含有厚度为300nm二氧化硅层的硅基底，其电阻率为5-20ohm·cm^-1；所述源极和漏极均由Cr电极层和设于所述Cr电极层上的Au电极层组成，所述Cr电极层厚度为80nm，所述Au电极层厚度为600nm；所述源极和漏极之间的间距为4-7μm；

b)在Cu2+作用下能被特定切割的DNAzyme，其连接于所述分子连接部位；

该DNAzyme是由下述序列a和序列b变性形成双链口袋型构象的DNA，Cu²⁺能够特定切割该DNA序列的特定位点：

a.H₂N-(CH₂)₃-5′-TTCTTTCTAATACGGCTTACC-3′-(CH₂)₃-NH₂(核苷酸序列如序列表中序列1所示)

b.5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAAC-3′(核苷酸序列如序列表中序列2所示)

其中，序列a自5′端起第14-21位与序列b自5′端起第1-8位碱基互补，且序列b自5′端起第15-22位与序列b自5′端起第25-32位碱基互补。

制备方法如下：

1)在铜箔(Alfa Aesar，99.8％)上使用化学气相沉积的方法，用甲烷做碳源，900℃生长大面积石墨烯，利用柔性的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)高分子膜做担载，在所述已生长石墨烯的铜箔上旋涂PMMA薄膜，180℃烘2分钟，然后将样品置于饱和硝酸铁溶液中，将铜箔腐蚀掉，石墨烯包埋在PMMA薄膜中被分离出来。PMMA薄膜携带着石墨烯薄膜附着在含有300nm二氧化硅层的硅基底(其电阻率为5-20ohm·cm^-1)，然后用丙酮除去PMMA薄膜。

2)通过三步光刻的方法在石墨烯上得到图形化的光刻胶掩膜：第一步，在大片的石墨烯上旋图光刻胶，特定位置曝光(见图3)，得到标记图案，在标记图案处依次蒸镀厚度为80nm的Cr层、200nm的Au层后，丙酮浸泡除去光刻胶，在石墨烯上曝光的位置上留下了蒸镀的金属标记，作为下两步光刻的位置对准标记；第二步，在有标记的大片石墨烯上旋涂光刻胶，通过第一步的标记定位，曝光，留下条带状的光刻胶将部分石墨烯保护起来，其它部分通过曝光显影将石墨烯曝露出来，用氧等离子体刻蚀掉其它部分曝露的石墨烯，保护在条带状光刻胶下面的石墨烯不被刻蚀得以保留，丙酮浸泡除去光刻胶后，得到20*40μm的石墨烯条带；第三步，在第二步得到有石墨烯条带的硅片上旋涂光刻胶，通过第一步中的标记定位在石墨烯条带上曝光出电极图案。热蒸镀先后蒸镀Cr(80nm)、Au(600nm)作为器件的源极和漏极，构建石墨烯晶体管器件，图4显示为光学显微镜表征的石墨烯器件结构图。

3)在石墨烯晶体管器件的石墨烯上旋涂PMMA电子束光刻胶，选择虚线间隔的曝光图案(见图5)，对步骤2)得到的石墨烯晶体管器件进行电子束曝光和氧等离子体刻蚀，在石墨烯上得到一系列锯齿形的纳米间隙。对于没有直接氧化切断的部位，可以辅助大电流烧断法，逐渐缓慢增大通过电流，石墨烯会在氧化切割的缺陷位点优先断裂，得到1-10纳米间隔的纳米间隙(见图6)。

4)将具有纳米间隙的石墨烯器件在含有氨基耦合和活化试剂(Sulfo-NHS，EDCI)的50mM MES缓冲溶液(pH值为4.7，Sulfo-NHS的浓度为5mM，EDCI的浓度为10mM)中浸泡12小时，进行末端羧基活化；然后将经活化的石墨烯与经末端氨基修饰的浓度为10μM的Cu²⁺对应的DNAzyme在PBS缓冲液(10mM，pH值为7.2)中进行纳米间隙中的单分子共价连接，得到连接DNAzyme的单分子器件。

使用的DNA序列如下：

a.H₂N-(CH₂)₃-5′-TTCTTTCTAATACGGCTTACC-3′-(CH₂)₃-NH₂             ，

b.GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAAC，由a和b变性形成双链口袋型构象的DNA，Cu²⁺能够特定切割该DNA序列的特定位点。

利用上述基于石墨烯电极的分子器件检测Cu²⁺：

基于石墨烯电极的分子器件对Cu²⁺体系检测的示意图，如图1所示。

对步骤4)中得到的DNAzyme单分子连接器件进行Cu²⁺结合与识别的电学信号检测，器件经过Cu²⁺处理，Cu²⁺切割双链DNA(DNAzyme)，以致电流减少至0(见图2)。所有的工作器件均显示出一致的变化趋势，而且观察到导电性的明显变化来源于共价连接在石墨烯分子器件中的DNA被切断，而不是Cu²⁺的导电性引起的变化。

通过改变重金属Cu²⁺的浓度来研究连接器件的灵敏度。多个DNAzyme单分子连接器件用来检测不同浓度的Cu²⁺。在Cu²⁺处理前后，通过电学测量的I-V曲线检测结合过程，在不同的检测浓度下可以得到不同器件之间一致的实验结果，再次证明本发明具有较好的可信性与重现性。使用本发明的单分子器件对Cu²⁺检测灵敏度达到0.05pmol/l，已报道的较高的检测灵敏度是10nmol/l(Zong C.，Ai K.，Zhang G.，Li H.，andLu L.Anal.Chem.2011，83，3126-3132)，在灵敏度上提高了200000倍。

实施例2：基于石墨烯电极的DNAzyme分子器件检测微量pb²⁺

检测pb²⁺的DNAzyme分子器件，除在分子连接部位所连接的DNAzyme与检测Cu²⁺的DNAzyme分子器件不同外，其余均相同。

在检测pb²⁺的DNAzyme分子器件中所连接的DNAzyme是由下述序列c和序列d形成双链口袋型构象的DNA，pb²⁺能够特定切割该DNA序列的特定位点。

c.H₂N-(CH₂)₃-5′-GTAGAGAAGGrATATCACTCA-3′-(CH₂)₃-NH₂(核苷酸序列如序列表中序列3所示)

d.5′-TGAGTGATAAAGCTGGCCGAGCCTCTTCTCTAC-3′(核苷酸序列如序列表中序列4所示)

其中，序列c中的“r”代表A为核糖核酸；序列c自5′端起第1-9位与序列d自5′端起第33-25位碱基互补，且序列c自5′端起第12-20位与序列d自5′端起第9-1位碱基互补，且序列d自5′端起第15-27位与序列d自5′端起第23-21位碱基互补。

利用上述基于石墨烯电极的分子器件检测pb²⁺：

基于石墨烯电极的分子器件对pb²⁺体系检测的示意图，如图7所示。

使用该单分子器件对pb²⁺检测灵敏度达到0.1pmol/l。

综上所述，本发明是一种直接的、具有单分子灵敏度的，检测重金属的方法，利用功能化的石墨烯分子器件可以根据特定检测目的，对实际样品进行不同体系高灵敏度的检测具有广阔的实际应用价值。

Claims (9)

1.一种基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件，包括：

a)石墨烯晶体管器件阵列，所述石墨烯晶体管器件阵列中每个石墨烯晶体管器件均包括栅极、源极、漏极和导电沟道，所述导电沟道为石墨烯；其中，在所述石墨烯上设有一个通道，所述通道上间隔设有长度为1-10nm的DNAzyme序列连接部位，所述DNAzyme序列连接部位与所述石墨烯晶体管器件中的源极和漏极垂直；

b)能被待测重金属离子特异性切割的且末端经氨基修饰的DNAzyme序列，或能被待测重金属离子特异性切割的且末端连接氨基修饰的有机分子的DNAzyme序列；其连接于所述DNAzyme序列连接部位。

2.根据权利要求1所述的DNAzyme单分子连接器件，其特征在于：所述栅极为含有厚度为100-1000nm二氧化硅层的硅基底，其电阻率为5-20ohm·cm^-1；所述源极和漏极均由Cr电极层和设于所述Cr电极层上的Au电极层组成，所述Cr电极层厚度为1-100nm，所述Au电极层厚度为20-1000nm；所述源极和漏极之间的间距为4-7μm。

3.根据权利要求2所述的DNAzyme单分子连接器件，其特征在于：所述栅极为含有厚度为300nm二氧化硅层的硅基底；所述Cr电极层厚度为80nm，所述Au电极层厚度为600nm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的DNAzyme单分子连接器件，其特征在于：所述待测重金属离子为Cu²⁺；

所述DNAzyme序列是由序列表中所示序列1和所示序列2变性形成双链口袋型构象的DNA；其中，所述序列1自5′端起第14-21位与所述序列2自5′端起第1-8位碱基互补，且所述序列2自5′端起第15-22位与所述序列2自5′端起第25-32位碱基互补。

5.一种制备权利要求1-4中任一项所述DNAzyme单分子连接器件的方法，包括下述步骤：

1)构建石墨烯晶体管器件阵列；

2)在所述石墨烯晶体管器件阵列的每个石墨烯晶体管器件的石墨烯采用电子束曝光法得到虚线形状的曝光图案，然后进行氧等离子体刻蚀，使所述石墨烯晶体管器件的源极和漏极之间得到一个通道，并在所述通道上间隔得到长度为1-10nm的纳米间隙，所述纳米间隙与所述石墨烯晶体管器件中的源极和漏极垂直；

所述虚线形状的曝光图案中，线条宽度为2-10nm，优选5nm，每段实线的长度为150-500nm，优选150nm，实线间距为20-50nm，优选40nm；

3)将步骤2)得到的纳米间隙两侧的石墨烯的末端羧基进行活化，然后与下述DNAzyme序列1)或2)进行纳米间隙中的酰胺键共价连接，得到基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件：所述序列1为能被待测重金属离子特异性切割的且末端经氨基修饰的DNAzyme序列；所述序列2)为能被待测重金属离子特异性切割的且末端连接氨基修饰的有机分子的DNAzyme序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在步骤2)中进行氧等离子体刻蚀后，对所述氧等离子体刻蚀没有形成所述纳米间隙的部位，利用电流烧断法继续处理，得到所述纳米间隙。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤1)中构建石墨烯晶体管器件的方法包括三个步骤；

a)在石墨烯上旋涂光刻胶，记为光刻胶1，对光刻胶1进行曝光得到标记图案，在标记图案处依次蒸镀厚度为1-100nmCr层、20-1000nmAu层，除去光刻胶1，在石墨烯曝光位置处留下了蒸镀的金属标记，所述金属标记用于下两步光刻的位置对准标记；所述石墨烯附着于表面具有二氧化硅层的硅基底上；

b)在步骤a得到的有金属标记的石墨烯上旋涂光刻胶2，通过步骤a的标记定位，曝光，留下条带状的光刻胶将部分石墨烯保护起来，其它部分通过曝光显影将石墨烯曝露出来，用氧等离子体刻蚀掉其它部分曝露的石墨烯，保护在条带状光刻胶下面的石墨烯不被刻蚀得以保留，除去光刻胶2，得到条带状石墨烯，将所述条带状石墨烯在氢气和氩气气氛下于400-450度退火，清洁石墨烯条带的表面；

c)在步骤b得到有石墨烯条带的硅片上旋涂光刻胶3，通过步骤a的标记定位在石墨烯条带上曝光出源极和漏极电极图案，所述源极和漏极之间的间距为4-7μm，在所述电极图案上依次蒸镀厚度为1-100nm的Cr层、厚度为20-1000nm的Au层作为器件的源极和漏极，除去光刻胶3，得到所述石墨烯晶体管器件阵列。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中对纳米间隙两侧的石墨烯的末端羧基进行活化的方法为：将步骤2)得到的具有纳米间隙的石墨烯分子器件在含有N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的10-100mM MES缓冲溶液中浸泡8-12小时；

所述MES缓冲溶液的pH值为3-10，所述MES缓冲溶液中N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为5-15mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为3-10mM；

步骤3)中所述酰胺键共价连接在PBS缓冲液中进行，所述PBS缓冲液的浓度为10-100mM，pH值为6-8。

9.一种检测重金属的方法，包括下述步骤：

1)将权利要求1-3中任一所述的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件浸泡在重金属离子溶液中，进行DNAzyme与重金属离子的结合与识别的电学信号检测，同时进行对照实验设计排除干扰因素；其中，所述重金属离子对所述的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件中的DNAzyme具有特异性切割作用；

2)对权利要求1-3中任一所述的基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件进行重金属离子检测的灵敏度测试；

3)根据步骤1)和2)的实验结果确定检测条件，利用所述基于石墨烯电极的DNAzyme单分子连接器件检测重金属离子，测量检测过程中的电流变化，基于电流的变化实现对重金属离子的检测。

Images