CN105274196A - 一种基于l型脱氧核酶生物体系中金属离子的检测试剂盒、检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于L型脱氧核酶生物体系中金属离子的检测试剂盒、检测方法和应用。本发明具有操作简单、反应快速、信号稳定、灵敏度高、无假阳性信号等优点，且通用性好，各种对非手性物质特异性响应的D-型DNA探针均可设计为L-型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于L型脱氧核酶生物体系中金属离子的检测试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
对生物体内重金属离子灵敏、准确检测是人们一直努力的目标。除了传统的原子吸收、质谱等方法，近年来，基于体外筛选技术，科学家门发展了一系列具有催化活性的DNA结构(DNAzyme，中译文为脱氧核酶)，由于这些DNAzyme的活性对特定的重金属离子具有强烈的依赖性，人们因此发展了DNAzyme传感器用于重金属离子如铅、铜、汞、铀酰等的检测，这些传感器灵敏度高，选择性好，设计简单，反应快速，因此受到了越来越广泛的关注。然而，复杂的生理环境，限制了DNAzyme在体内的广泛应用。例如，生物基质中存在着大量的核酸酶，这些核酸酶能够对外源DNAzyme产生非特异性攻击，使得DNAzyme无法稳定存在于生理环境而报告出假阳性信号；其次，大量的蛋白质能够与DNAzyme非特异性结合，引起探针结构变化，报告假阳性信号；第三，外源DNAzyme探针与体内核酸属于同一类型，为了避免DNAzyme与体内其它非特异性的核酸序列产生杂交，需要对核酸探针进行序列的筛选和优化，这对核酸探针的设计造成了一定的复杂性。
L-DNA是天然DNA，D型DNA的对映异构体。与D-DNA相比，L-DNA能够抵抗核酸酶的降解、不与细胞内各种蛋白质产生非特异性结合，同时，L-DNA不会与D型核酸杂交，从而减少了L-DNA核酸探针设计的复杂性等问题。基于L-DNA的诸多优良性质，我们考虑能否设计L-DNAzyme用于生物体系中金属离子检测。根据手性底物特异性相关(reciprocalchiralsubstratespecificity)原理，如果物质A与B有特异性识别能力，那么A的镜像A’则能够与B的镜像B’具有同样的识别能力。基于此，我们推断，如果物质A与B有特异性识别能力，而B物质是非手性物质，则物质A的镜像A’应该对非手性的物质B具有同样的识别能力。如果这个推断成立，那么当D-DNAzyme对金属离子具有特异性依赖而产生催化活性时，其镜像结构：L-DNAzyme同样能够依赖该金属离子而产生催化活性，这样，我们就能够将D-DNAzyme序列直接转变为L-DNAzyme序列，用于金属离子的检测与成像，而根据前面的报道，L-DNA不会受到各种生物基质的干扰，从而发展一种生物体系中稳定存在的金属离子传感器用于金属离子的准确、灵敏检测。
发明内容
本发明针对现有D-DNAzyme易被生物基质干扰，对金属离子的检测容易产生假阳性信号等问题，提出一种稳定、灵敏、特异性分析生物体系中金属离子的定量定性分析试剂盒、方法和应用。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基于L型脱氧核酶生物体系中金属离子的检测试剂盒中含有L-DNAzyme。所述DNAzyme的序列包括酶链序列和底物链序列；所述酶链序列如SEQIDNO.1所示，所述底物链序列如SEQIDNO.2所示。
所述检测生物体系中金属离子的方法是将特异性识别金属离子的D-DNAzyme序列直接转换为L-DNAzyme，然后用L-DNAzyme进行金属离子的检测。所述DNAzyme的序列包括酶链序列和底物链序列；所述酶链序列如SEQIDNO.1所示，所述底物链序列如SEQIDNO.2所示。所述用L-DNAzyme进行金属离子的检测是将L-DNAzyme加入缓冲液中，配成L-DNAzyme浓度为50nM的检测溶液，在荧光分光光度计进行定量检测时检测溶液的反应体积为200μL。所述缓冲液包括以下成分：50mMNaCl,50mMKCl,5mMMgCl2,50mMHEPES，pH7.2或pH6.65，具体来说，用于Pb(II)离子传感时包括以下成分：50mMNaCl,50mMKCl,5mMMgCl2,50mMHEPES，pH7.2；在血清中检测时，缓冲液盐离子组分相同，pH6.65，血清浓度为10％。在标准缓冲液中对Pb(II)的检测灵敏度为0.7nM，血清中为50nM。
下面对本发明作进一步说明：
本发明将特异性识别金属离子的D-DNAzyme序列直接转换为L-DNAzyme，根据手性底物特异性相关原理，该L-DNAzyme同样能够识别对应的金属离子，同时，结合L-DNAzyme不会被生物基质干扰，实现生物体系中金属离子的定量分析。该L-DNAzyme能够抵抗生物基质中各组分的干扰，避免假阳性信号的产生，是用于生物体系中金属离子检测与成像的传感器。信号分子可以为FAM和Dabcyl，不存在金属离子时，标记在DNAzyme上的FAM基团发出的荧光被Dabcyl淬灭，存在特定金属离子时底物链断裂，发出荧光信号。
本发明包括如下内容：(1)根据已经报告的对金属离子特异性响应的D-DNAzyme序列，设计合成出有荧光-淬灭基团标记的L-DNAzyme荧光探针(使用DNA/RNA自动合成仪合成L-DNAzyme序列)；(2)证明L-DNAzyme具有对金属离子依赖的催化能力，并构建缓冲液中L-DNAzyme对金属离子的检测体系(使用荧光分光光度计进行考察，反应体积为200μL，DNAzyme浓度为50nM)；(3)使用核酸酶、单链结合蛋白等具有代表性的生物基质干扰物，证明L-DNAzyme不会受到生物基质的干扰；(4)提取血清，构建中金属离子的检测体系(使用的血清浓度为10％，使用前进行无机酸消解)。(2)—(5)中金属离子参与的实验，反应时间均为30min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
首先，本发明是在手性底物特异性相关原理上的一个创新，证明了非手性物质在对A物质响应的同时，也会对A的镜像A’起到同样的响应效果；
其次，本发明不需要筛选、设计新的金属离子传感器，只需把已经筛选出的D-DNAzyme序列合成出L-DNAzyme序列即可，设计简单、快捷；
第三，借助于L-DNA能够抵抗生物基质干扰的优良性能，该方法能够用于生物体系中金属离子的检测，解决了D-DNAzyme在生物体系中易被降解、干扰的困难；
第四，本发明具有通用性，不仅对DNAzyme有特定响应能力的金属离子适应，其他能够对DNA有特定识别能力的非手性物质，同样适用于该方法。鉴于设计简单、方法通用、稳定性好、灵敏度高等优点，我们提出的基于L-DNAzyme用于金属离子的定量检测方法有可能发展成为普及的金属离子定量检测工具。
附图说明
图1A为本发明原理图。当特异性的金属离子能够催化D-DNAzyme的活性，切断底物链时，该金属离子同样能够催化相对应的L-DNAzyme发生同样的活性。而D-DNAzyme易被生物体系中各种生物学基质干扰时，L-DNAzyme能够抵抗这些干扰，从而能够发展生物体系中稳定的L-DNAzyme传感器用于金属离子的检测。图1B为L-DNA以及D-DNA的结构，两者呈镜像关系。
图2A为铅离子依赖的DNAzyme的序列及结构。图2B为其对铅离子的响应示意图。底物链上分别标记了荧光基团与淬灭基团，酶链上标记了淬灭基团。双链杂交，荧光被淬灭。铅离子出现后，酶链切割底物链，荧光基团远离，发出荧光信号，从而有效报告铅离子的存在。
图3B的插图为聚丙烯酰胺凝胶电泳分析L-DNAzyme对底物链的切割活性。插图通道1不加铅离子，通道2加入铅离子，可以看到铅离子的存在使得底物链被切断。图3A为GR-5L-DNAzyme用于铅离子的定量检测。能够实现0.72nM铅离子的检测。图3B为GR-5L-DNAzyme对于不同金属离子的响应，a-j分别指Ca2+,Cd2+,Co2+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,Mg2+,Ni+,Zn2+和Pb2+。
图4A为GR-5L-DNAzyme用于血清中铅离子的定量检测。能够实现50nM铅离子的检测。图4B为GR-5L-DNAzyme在血清中对不同金属离子的响应，a-i分别指Ca2+,Cd2+,Co2+,Cu2+,Hg2+,Mg2+,Ni+,Zn2+和Pb2+。
具体实施方式
DNAzyme序列：
酶链：5’-ACAGACATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGAG-3’(SEQIDNO.1)，3’端被Dabcyl标记；
底物链：5’-FAM-CTCACTTArAGGAAGAGATGATGTCTGT-3’(SEQIDNO.2)，5’端被FAM标记，3’端被Dabcyl标记。
实施例1铅离子依赖的L-DNAzyme传感器的设计、合成与纯化
以铅离子依赖的GR-5DNAzyme为例，我们直接将GR-5D-DNAzyme的序列变成L-DNAzyme的序列，L-DNA以及L-rA的合成单体均从ChemGene公司购得，将单体使用乙腈溶解为0.05g/ml的浓度，使用3端标记Dabcyl的CPG在DNA自动合成仪上同时合成出GR-5L-DNAzyme的酶链和底物链，合成结束后在底物链修饰FAM基团。合成结束后，将上述CPG转移至离心管中，加入0.5mL饱和氨水在65℃下氨解8h，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后脱去氨气，在10000rpm的转速下离心10min取上清液，然后往CPG中加入0.5mL超纯水，以洗脱吸附在CPG上的样品，再次在10000rpm的转速下离心10min取上清液，合并所得到的上清液即为粗产物。将得到的粗产物浓缩后溶于0.1M的醋酸三乙胺(TEAA)，使用反相高效液相色谱仪进行纯化。纯化条件如下：
PromosilC18反相柱(5μm,250×4.6mm)；
缓冲液A：0.1MTEAA；
缓冲液B：100％乙腈；
梯度：50minB的梯度从12％到27％；
流速：1mL/min
将通过反相-HPLC纯化后的产品真空干燥后溶于超纯水，并使用凝胶过滤柱进行脱盐处理，脱盐后真空浓缩。对酶链，使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，对DNA进行定量。对底物链，要除去rA上的TOM基团，需要进行如下步骤：干燥后的底物链加入100μLofDMSO和125μL三乙胺氢氟酸，65℃反应2.5小时，然后加入,25μL3M的醋酸钠和1.5mL正丁醇，-20℃沉淀30min。脱盐后使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，对DNA进行定量。
实施例2标准缓冲液中铅离子对GR-5L-DNAzyme的特异性催化能力及L-DNAzyme传感器对铅离子的定量检测
进行电泳的L-DNAzyme，其浓度为10μM，体积为10μL，反应缓冲液为50mMNaCl,50mMKCl,5mMMgCl2,50mMHEPES，pH7.2，两个eppendorf管分别包含以上物质，其中一个加入5μM铅离子，一个不加，室温下反应30min然后进行电泳。使用变形聚丙烯酰胺凝胶电泳对L-DNAzyme的活性考察。变性聚丙烯酰胺胶的浓度为15％，电泳时间为1h，电压120V。电泳结束后使用“Stains-All”染色，照相机拍照分析。
在荧光光谱仪上使用L-DNAzyme对铅离子进行滴定分析。荧光实验均在Fluoromax-2(HORIBAJobinYvonInc.,Edison,NJ)fluorometer荧光分光光度计上进行，恒温水浴维持所需温度。波长扫描模式，激发波长为490nm，扫描范围从500nm到650nm。一系列200μL反应缓冲液(50mMNaCl,50mMKCl,5mMMgCl2,50mMHEPES，pH7.2)中包含50nM底物链，60nM酶链，95℃加热5min，然后缓慢降温至室温。加入不同浓度的铅离子反应30min，最后在荧光仪上测定荧光强度。在选择性实验中，以Cd2+,Co2+,Fe3+,Mg2+,Mn2+,Ni+,Zn2+和Cu2+对照，分别考察10μM的铅离子及100μM的其他离子对GR-5L-DNAzyme的响应情况。
实施例3L-DNAzyme抗生物基质干扰考察
以DNaseI、单链结合蛋白为模式分子，以D-GR-5的底物链为对照，考察这些具有代表性的生物基质对L-GR-5底物链的干扰作用。
抗酶切能力考察，以D-substrate作为对照，两个eppendorf管分别包含D-substrate及L-subatrate，其浓度为10μM，体积为10μL，均加入10UDNaseI，室温下反应30min，然后按照实施例3中的方法进行电泳。
与单链结合蛋白结合能力考察。
4管200μL反应缓冲液中两管加入50nML-substrate，另外两管加入50nMD-substrate，D及L-substrate中，各取一管加入100nM单链结合蛋白。室温下反应30min，然后在荧光分光光度计上测定其偏振值。
实施例4GR-5L-DNAzyme在血清体系中对铅离子的定量检测
医院获得人血，离心机6000rpm，5min获得血清，首先进行无机酸消解。消解干燥后使用反应缓冲液稀释至10ml，调pH至6.65左右。得到的即为稀释为10％的血清缓冲液，采用实施例3中的方法对其进行定量。
Claims (7)
1.一种基于L型脱氧核酶生物体系中金属离子的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有L-DNAzyme。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNAzyme的序列包括酶链序列和底物链序列；所述酶链序列如SEQIDNO.1所示，所述底物链序列如SEQIDNO.2所示。
3.一种检测生物体系中金属离子的方法，其特征在于，所述方法是将特异性识别金属离子的D-DNAzyme序列直接转换为L-DNAzyme，然后用L-DNAzyme进行金属离子的检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNAzyme的序列包括酶链序列和底物链序列；所述酶链序列如SEQIDNO.1所示，所述底物链序列如SEQIDNO.2所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述用L-DNAzyme进行金属离子的检测是将L-DNAzyme加入缓冲液中，配成L-DNAzyme浓度为50nM的检测溶液。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括以下成分：50mMNaCl,50mMKCl,5mMMgCl2,50mMHEPES，pH7.2或pH6.65。
7.L-DNAzyme在制备检测生物体系中金属离子的检测试剂中的应用。
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