JPH01104200A - 核酸の検出方法及びそのためのプローブ - Google Patents
核酸の検出方法及びそのためのプローブInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、2つの特異的及び可溶性のオリゴヌクレオチ
ド・プローブ(probe)を用いる核酸を検出するた
めの溶液内ハイブリダイゼーション法に関する。
ド・プローブ(probe)を用いる核酸を検出するた
めの溶液内ハイブリダイゼーション法に関する。
更に本発明はマイコプラズマ・ニューモニアエ(Myc
oplasma pneumoniae)に特異的で
あるRNA配列及びそれに相補性のプローブに関する。
oplasma pneumoniae)に特異的で
あるRNA配列及びそれに相補性のプローブに関する。
このプローブは特に限られた反応しかしない或いは交叉
反応しない試料中のマイコプラズマ・ニューモニアエを
、特に他のマイコプラズマ種から検出する方法に使用し
うる。
反応しない試料中のマイコプラズマ・ニューモニアエを
、特に他のマイコプラズマ種から検出する方法に使用し
うる。
ここに本明細書を通して種々の刊行物及び特許が参照さ
れる。これらの刊行物及び特許の開示の全体が、ここに
記述する且つ特許請求する本発明の日付は以前の同業者
には公知の技術状態を更に完全に記述するために本明細
書に参考文献として引用される。
れる。これらの刊行物及び特許の開示の全体が、ここに
記述する且つ特許請求する本発明の日付は以前の同業者
には公知の技術状態を更に完全に記述するために本明細
書に参考文献として引用される。
核酸のハイブリダイゼーション(hybridizat
ion)法は2つの形式(format)、即ち溶液内
ハイブリダイゼーション及び固定化ハイブリダイゼーシ
ョンの1つを含みうる。溶液内ハイブリダイゼーション
では、プローブと試料核酸がハイブリダイゼーション中
溶液内で自由である。固定化ハイブリダイゼーションで
は試料又はプローブのいずれかがハイブリダイゼーショ
ン前に固定化されていて、ハイブリダイゼーションは不
溶性相で起こる。溶液内ハイブリダイゼーションを行な
う1つの方法は、ハイブリダイゼーションされたDNA
を選択的に結合させるために水酸化燐灰石を用いること
を含む。溶液内ハイブリダイゼーションに対する他の方
法は国際特許願公開第WO34102721号に記述さ
れている。固定化ハイブリダイゼーションの例は米国特
許第4.358,535号[フォルコラ(F alko
w)ら]に記述されている。
ion)法は2つの形式(format)、即ち溶液内
ハイブリダイゼーション及び固定化ハイブリダイゼーシ
ョンの1つを含みうる。溶液内ハイブリダイゼーション
では、プローブと試料核酸がハイブリダイゼーション中
溶液内で自由である。固定化ハイブリダイゼーションで
は試料又はプローブのいずれかがハイブリダイゼーショ
ン前に固定化されていて、ハイブリダイゼーションは不
溶性相で起こる。溶液内ハイブリダイゼーションを行な
う1つの方法は、ハイブリダイゼーションされたDNA
を選択的に結合させるために水酸化燐灰石を用いること
を含む。溶液内ハイブリダイゼーションに対する他の方
法は国際特許願公開第WO34102721号に記述さ
れている。固定化ハイブリダイゼーションの例は米国特
許第4.358,535号[フォルコラ(F alko
w)ら]に記述されている。
本方法において標的の核酸配列は、溶液内で2つの特異
的及び可溶なオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリ
ダイゼーションせしめられる。ここにこれらのグローブ
の1つはホモポリヌクレオチドの尾(tail)を有し
ている。ハイブリダイゼーションが完了した後に始めて
、ハイブリダイゼーションした複合体を含む試料は不溶
性の固体担体と接触せしめられ且つ捕捉される。ここに
記述する捕捉技術は固体担体上の相補的ホモポリヌクレ
オチドの尾及び捕捉オリゴヌクレオチドを利用するもの
である。
的及び可溶なオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリ
ダイゼーションせしめられる。ここにこれらのグローブ
の1つはホモポリヌクレオチドの尾(tail)を有し
ている。ハイブリダイゼーションが完了した後に始めて
、ハイブリダイゼーションした複合体を含む試料は不溶
性の固体担体と接触せしめられ且つ捕捉される。ここに
記述する捕捉技術は固体担体上の相補的ホモポリヌクレ
オチドの尾及び捕捉オリゴヌクレオチドを利用するもの
である。
mRNAを含むポリアデニル酸(ポリA)を捕捉するた
めにポリウリジル酸(ポリU)被覆紙を用いることは、
レシュナ−(W reschner)、D、H,ら、ヌ
クレイツク・アシツズ・リサーチ(Nucleic A
c1ds Research)、■、1349〜13
59(1984);こ記述されている。ポリシチジル酸
(ポリC)プローブを捕捉するためにポリデオキシグア
ニル酸(ポリdG)セルロース担体を用いるハイブリダ
イゼーション法は、ベリー(V ary)、C,P。
めにポリウリジル酸(ポリU)被覆紙を用いることは、
レシュナ−(W reschner)、D、H,ら、ヌ
クレイツク・アシツズ・リサーチ(Nucleic A
c1ds Research)、■、1349〜13
59(1984);こ記述されている。ポリシチジル酸
(ポリC)プローブを捕捉するためにポリデオキシグア
ニル酸(ポリdG)セルロース担体を用いるハイブリダ
イゼーション法は、ベリー(V ary)、C,P。
H3ら、タリフ・ケム(CIin、Chem、)、32
(9)、1696〜l 701(1986)に記述され
ている。
(9)、1696〜l 701(1986)に記述され
ている。
べり−らによる方法は、信号核酸鎖(strand)を
標的鋼で代替する競争的ハイブリダイゼーション分析を
含む。用いる信号核酸鎖は標的核酸に対して相補性でな
く、3元ハイブリダイゼーション複合体の生成がない。
標的鋼で代替する競争的ハイブリダイゼーション分析を
含む。用いる信号核酸鎖は標的核酸に対して相補性でな
く、3元ハイブリダイゼーション複合体の生成がない。
斯くしてこの記述される方法は、サンドウィッチハイブ
リダイゼーション分析を含まない。更に記述される検出
法は標識を、不溶化された固体担体上よりも溶液中で検
出することを含む。
リダイゼーション分析を含まない。更に記述される検出
法は標識を、不溶化された固体担体上よりも溶液中で検
出することを含む。
本方法は溶液内で起こるサンドウィッチハイブリダイゼ
ーション分析を含む。3元Qernary)又は3成分
0ripartite)ハイブリダイゼーション複合体
が溶液内で生成し、標的DNAは固体担体上の凛識又は
レポーター(reporter)分子を検出することに
よって検知される。本方法はいずれかの種の核酸含有有
機体を検出するのに有用である。特に本方法はマイコプ
ラズマ・ニューモニアエラ検出するのに有用である。
ーション分析を含む。3元Qernary)又は3成分
0ripartite)ハイブリダイゼーション複合体
が溶液内で生成し、標的DNAは固体担体上の凛識又は
レポーター(reporter)分子を検出することに
よって検知される。本方法はいずれかの種の核酸含有有
機体を検出するのに有用である。特に本方法はマイコプ
ラズマ・ニューモニアエラ検出するのに有用である。
マイコプラズマ属は約5XIOjダルトンというゲノム
の大きさを有する最小の自由に生育する原始核有機体を
表わす多種類の有機体を包含する。
の大きさを有する最小の自由に生育する原始核有機体を
表わす多種類の有機体を包含する。
マイクプラズマはその小さい大きさのために、十分に発
育したコロニーが肉眼での同定には小さすぎ、同定が非
常に困難である。
育したコロニーが肉眼での同定には小さすぎ、同定が非
常に困難である。
人間の病気を引き起こすことが証明された唯一のマイク
プラズマ種は、通常[ウオーキング(walking)
肺炎」として言及される非定形の肺炎、即ち普通致命的
でないが診断の難しい病気の病固体であるM、ニューモ
ニアエである。病気の初期に適切な抗生物質治療剤を投
与するためには、M。
プラズマ種は、通常[ウオーキング(walking)
肺炎」として言及される非定形の肺炎、即ち普通致命的
でないが診断の難しい病気の病固体であるM、ニューモ
ニアエである。病気の初期に適切な抗生物質治療剤を投
与するためには、M。
ニューモニアエをできるだけ早く診断することが望まし
い。
い。
微生物の検出に対してDNAグローブを用いることは十
分に確立されているが、長い塩基の配列を標的として用
いないならば、感度が悪くなる。
分に確立されているが、長い塩基の配列を標的として用
いないならば、感度が悪くなる。
そのような方法は非常に大きい、即ち長さが500以上
の塩基のDNAプローブを使用することを必要とする。
の塩基のDNAプローブを使用することを必要とする。
これは大きいDNAプローブが合成法によって効果的に
製造するのに適当でなく、また費用と時間のかかる組換
えDNA技術によって製造しなければならないから欠点
となる。他の欠点は大きいプローブが多くの異なる核酸
の配列に対する相補的核酸配列を有しがちであるから特
異性に欠けることである。最後に組換え技術で作られる
プローブは多くの異なる核酸を含む複雑な生物学的混合
物から単離及び精製しなければならない。そのような工
程は長たらしく、純粋でないかも知れないプローブを低
収率で与える。
製造するのに適当でなく、また費用と時間のかかる組換
えDNA技術によって製造しなければならないから欠点
となる。他の欠点は大きいプローブが多くの異なる核酸
の配列に対する相補的核酸配列を有しがちであるから特
異性に欠けることである。最後に組換え技術で作られる
プローブは多くの異なる核酸を含む複雑な生物学的混合
物から単離及び精製しなければならない。そのような工
程は長たらしく、純粋でないかも知れないプローブを低
収率で与える。
マイコプラズマのいろいろな種を、マイコプラズマのリ
ポソームRNA配列に相補性のDNAプローブを利用す
るハイブリダイゼーション分析によって検出する方法は
記述されている。例えばグベル(Gbel)、U、B、
ら、サイエンス(S C1ence)、226.121
1−1,213(1984)及びラジン(Razin)
、S、ら、イスル・ジエイ・メト・サイ(I sr、
J 、Med、S ci、)、20.758〜761(
1984)を参照。これらの方法は約1ooo又はそれ
以上の塩基の単一のゲノム壽プローブを使用する。その
ような大きいゲノム・プローブは合成的に合成するのが
難しく、一般に大腸菌(E、c。
ポソームRNA配列に相補性のDNAプローブを利用す
るハイブリダイゼーション分析によって検出する方法は
記述されている。例えばグベル(Gbel)、U、B、
ら、サイエンス(S C1ence)、226.121
1−1,213(1984)及びラジン(Razin)
、S、ら、イスル・ジエイ・メト・サイ(I sr、
J 、Med、S ci、)、20.758〜761(
1984)を参照。これらの方法は約1ooo又はそれ
以上の塩基の単一のゲノム壽プローブを使用する。その
ような大きいゲノム・プローブは合成的に合成するのが
難しく、一般に大腸菌(E、c。
1i)宿主細胞中で分校することによって製造しなけれ
ばならない。更にこれらの方法はいずれか1つのマイコ
プラズマ種に特異的でなく、従って種間交叉反応の問題
により複雑となる。
ばならない。更にこれらの方法はいずれか1つのマイコ
プラズマ種に特異的でなく、従って種間交叉反応の問題
により複雑となる。
本発明の目的は化学的に合成するのに適したプローブを
提供することにより組換えDNA技術への依存性を回避
することである。
提供することにより組換えDNA技術への依存性を回避
することである。
一般に有機体中に含まれるリポソームDNAに相補性の
DNAプローブを用いることにより微生物を検出する方
法は国際特許出願公開(WO)第84102721号に
教示されている。これらの方法は単一の大きいDNAグ
ローブを利用する。第84102721号は、有機体の
単一群のrRNAを検出するためにそのrRNA配列の
特別なフラグメントに相補性のプローブを使用し、これ
によってこの群に特徴な1つ又はそれ以上の有機体の存
在を検出する溶液内ハイブリダイゼーション法を記述し
ている。しかしながら、教示されている方法は種特異性
でない。
DNAプローブを用いることにより微生物を検出する方
法は国際特許出願公開(WO)第84102721号に
教示されている。これらの方法は単一の大きいDNAグ
ローブを利用する。第84102721号は、有機体の
単一群のrRNAを検出するためにそのrRNA配列の
特別なフラグメントに相補性のプローブを使用し、これ
によってこの群に特徴な1つ又はそれ以上の有機体の存
在を検出する溶液内ハイブリダイゼーション法を記述し
ている。しかしながら、教示されている方法は種特異性
でない。
DNAプローブを用いるマイコプラズマ・バイオリンズ
(hyorhins)の種特異的検出は、テーラ−(T
aylor)、M、A、ら、イスル・ジエイ・メト・サ
イ、−λ」−1778〜780(1984)に記述され
た。この方法はゲノムDNAフラグメントを、リポソー
ムRNAの保存された配列に相補性の単一のDNAプロ
ーブとして使用した。記述されている最小のプローブは
3000以上の塩基を含んだ。
(hyorhins)の種特異的検出は、テーラ−(T
aylor)、M、A、ら、イスル・ジエイ・メト・サ
イ、−λ」−1778〜780(1984)に記述され
た。この方法はゲノムDNAフラグメントを、リポソー
ムRNAの保存された配列に相補性の単一のDNAプロ
ーブとして使用した。記述されている最小のプローブは
3000以上の塩基を含んだ。
M、ニューモニアエ及びM、ゲニタリウム(gen i
talium)のrRNAに特異的なりNAプローブ
はラジン、S、ら、IOM第6第6除 86年8月26〜31日(B irmingham,
A labama)、81頁に報告されている。用いる
プローブはゲノム収集から選択されたるゴベル、U.ら
はM.ニューモニアエ及びM.ゲニタリウムの両方と反
応する長さが塩基20〜30の合成オリゴヌクレオチド
の使用を報告した(止揚、82頁)。
talium)のrRNAに特異的なりNAプローブ
はラジン、S、ら、IOM第6第6除 86年8月26〜31日(B irmingham,
A labama)、81頁に報告されている。用いる
プローブはゲノム収集から選択されたるゴベル、U.ら
はM.ニューモニアエ及びM.ゲニタリウムの両方と反
応する長さが塩基20〜30の合成オリゴヌクレオチド
の使用を報告した(止揚、82頁)。
本発明の目的はM.ニューモニアエに特異的なオリゴヌ
クレオチド・プローブを提供することである。ここに特
異的なM.ニューモニアエのリポソームRNA配列に相
補性の少くとも1つのプローブを利用するM.ニューモ
ニアエに特異的なハイブリダイゼーション法が提供され
る。このプローブは、それを合成法で製造するのに適当
ならしめる大きさのものである。
クレオチド・プローブを提供することである。ここに特
異的なM.ニューモニアエのリポソームRNA配列に相
補性の少くとも1つのプローブを利用するM.ニューモ
ニアエに特異的なハイブリダイゼーション法が提供され
る。このプローブは、それを合成法で製造するのに適当
ならしめる大きさのものである。
1段のサンドウィッチ式ハイブリダイゼーション分析に
よって微生物の核酸を同定する方法は[両方ともランキ
(Ranki)らによる] 米国特許第4。
よって微生物の核酸を同定する方法は[両方ともランキ
(Ranki)らによる] 米国特許第4。
563、419号及び第4.486.539号に記述さ
れている。この方法は一般に標的の一重鎖の微生物核酸
を、一方が固体担体に結合し且つ他が検出しうる標識を
もつ2つの異なる相補的核酸グローブとハイブリダイゼ
ーションさせることを含む。同様の方法はバータネン(
V 1rtanen)、M.ら、ランセット( L a
ncet)、上(8321)、381〜383(198
3)、及びランキ、M.ら、ジエン( G ene)、
−乳」−17 7 〜8 5(1 9 8 3)にも記
述されている。これらの方法は、組換えDNA技術を用
いて製造しなければならない大きいプローブを使用し且
つそれが種特異的でないという欠点を有する。
れている。この方法は一般に標的の一重鎖の微生物核酸
を、一方が固体担体に結合し且つ他が検出しうる標識を
もつ2つの異なる相補的核酸グローブとハイブリダイゼ
ーションさせることを含む。同様の方法はバータネン(
V 1rtanen)、M.ら、ランセット( L a
ncet)、上(8321)、381〜383(198
3)、及びランキ、M.ら、ジエン( G ene)、
−乳」−17 7 〜8 5(1 9 8 3)にも記
述されている。これらの方法は、組換えDNA技術を用
いて製造しなければならない大きいプローブを使用し且
つそれが種特異的でないという欠点を有する。
本発明は合成オリゴヌクレオチド・プローブを用いるM
.ニューモニアエに特異的な改良された1段サンドウィ
ッチ式ハイブリダイゼーション分析を提供する。
.ニューモニアエに特異的な改良された1段サンドウィ
ッチ式ハイブリダイゼーション分析を提供する。
本発明は標的の配列を含む疑いのある試料における標的
核酸配列の存在又は量を決定する方法を提供する。本方
法を行なうために、標的核酸配列の異なる部分に相補性
である可溶性のオリゴヌクレオチド・プローブを提供す
る。また共有結合したホモポリヌクレオチド尾を有する
可溶性の捕捉オリゴヌクレオチドを提供する。更に捕捉
オリゴヌクレオチドよりも標的の配列の実質的に異なる
部分に相補性である可溶な検出しうるオリゴヌクレオチ
ド・プローブを提供する。捕捉オリゴヌクレオチド、検
出しうるオリゴヌクレオチド及び一重鎖の標識核酸をハ
イブリダイゼーション条件下に水溶液中で混合し、可溶
性の3成分ハイブリダイゼーション複合体を生成せしめ
る。次いでこの3成分複合体を、共有結合したホモポリ
ヌクレオチド尾を有する不溶性の固体支持体と接触させ
る。
核酸配列の存在又は量を決定する方法を提供する。本方
法を行なうために、標的核酸配列の異なる部分に相補性
である可溶性のオリゴヌクレオチド・プローブを提供す
る。また共有結合したホモポリヌクレオチド尾を有する
可溶性の捕捉オリゴヌクレオチドを提供する。更に捕捉
オリゴヌクレオチドよりも標的の配列の実質的に異なる
部分に相補性である可溶な検出しうるオリゴヌクレオチ
ド・プローブを提供する。捕捉オリゴヌクレオチド、検
出しうるオリゴヌクレオチド及び一重鎖の標識核酸をハ
イブリダイゼーション条件下に水溶液中で混合し、可溶
性の3成分ハイブリダイゼーション複合体を生成せしめ
る。次いでこの3成分複合体を、共有結合したホモポリ
ヌクレオチド尾を有する不溶性の固体支持体と接触させ
る。
固定化されたホモポリヌクレオチド尾は捕捉オリゴヌク
レオチドの尾に相補性である。従って捕捉オリゴヌクレ
オチドの尾は固定化された尾とハイブリダイゼーション
し、3成分複合体が固定化される。次いで固体支持体上
の検出しうるオリゴヌクレオチドを検出し或いは測定す
る。
レオチドの尾に相補性である。従って捕捉オリゴヌクレ
オチドの尾は固定化された尾とハイブリダイゼーション
し、3成分複合体が固定化される。次いで固体支持体上
の検出しうるオリゴヌクレオチドを検出し或いは測定す
る。
本発明はM.ニューモニアエに特異的な16SrRNA
及びこのRNA配列に相補性の゛核酸プローブも提供す
る。
及びこのRNA配列に相補性の゛核酸プローブも提供す
る。
更に本発明はハイブリダイゼーション分析において、マ
イコプラズマ・ニューモニアエのリポソームRNAの試
料中における存在を同定するための改良された方法を提
供する。この方法はM.ニューモニ,アエの16SrR
NAに相補性の少くとも1つの合成核酸プローブを利用
する。ここに各配列は本発明のrRNA配列の少くとも
一部分に相補性である。
イコプラズマ・ニューモニアエのリポソームRNAの試
料中における存在を同定するための改良された方法を提
供する。この方法はM.ニューモニ,アエの16SrR
NAに相補性の少くとも1つの合成核酸プローブを利用
する。ここに各配列は本発明のrRNA配列の少くとも
一部分に相補性である。
M.ニューモニアエを特に検出する本方法は、M.ニュ
ーモニアエの15srRNAの塩基の特異的配列の発見
に依存している.M.ニューモニアエ及びM.ゲニタリ
ウムに特異的である115の塩基の配列が与えられる。
ーモニアエの15srRNAの塩基の特異的配列の発見
に依存している.M.ニューモニアエ及びM.ゲニタリ
ウムに特異的である115の塩基の配列が与えられる。
この配列をハイブリダイゼーション分析における1つ又
はそれ以上のオリゴヌクレオチドやグローブに対する標
的として用いる場合、過去の方法では見られなかった高
度の特異性と感度が達成される。過去の方法は種々のマ
イコプラズマ種間の区別法を教示していない。過去の方
法は大きな非特異的グローブと種間の多くの交叉反応と
に依存して多くの欠点を有した。本発明はいくつかがM
、ニューモニアエに特異的である短い合成プローブを使
用し、他のマイコプラズマ種との交叉反応を減じ又は排
除することによって過去の技術の欠点を回避する。
はそれ以上のオリゴヌクレオチドやグローブに対する標
的として用いる場合、過去の方法では見られなかった高
度の特異性と感度が達成される。過去の方法は種々のマ
イコプラズマ種間の区別法を教示していない。過去の方
法は大きな非特異的グローブと種間の多くの交叉反応と
に依存して多くの欠点を有した。本発明はいくつかがM
、ニューモニアエに特異的である短い合成プローブを使
用し、他のマイコプラズマ種との交叉反応を減じ又は排
除することによって過去の技術の欠点を回避する。
第1図は80の塩基の配列(これは本発明の115の塩
基の配列の一部である)及び相補的プローブ0DS55
及び0DS56の配列を示す。
基の配列の一部である)及び相補的プローブ0DS55
及び0DS56の配列を示す。
第2図はMPRDNAIと称せられるM、ニューモニア
エの16srRNAの5′端の300の塩基の配列を示
す。
エの16srRNAの5′端の300の塩基の配列を示
す。
本発明の溶液内ハイブリダイゼーション法は定性的又は
定量的でありうる。即ちそれは標的核酸の試料中におけ
る存在を単に検出するために使用でき、或いは標的核酸
の試料中における量を決定するために使用してもよい。
定量的でありうる。即ちそれは標的核酸の試料中におけ
る存在を単に検出するために使用でき、或いは標的核酸
の試料中における量を決定するために使用してもよい。
試験する試料はいずれかの生物学的物質例えば血液、血
漿、唾液、尿、粘液、脳せき髄液を含む生物学的体液;
いずれかの環境物質例えば水又は土壌;そして食品に由
来するいずれかの物質に由来していてよい。
漿、唾液、尿、粘液、脳せき髄液を含む生物学的体液;
いずれかの環境物質例えば水又は土壌;そして食品に由
来するいずれかの物質に由来していてよい。
標的核酸配列はいずれかの核酸、即ちDNA又はRNA
を含む有機体例えば病原体を含むバクテリヤ;ウィルス
;菌例えばイースト菌及びプロトシアン(protos
oan)からのものであってよい。標的の核酸配列はD
NA又はRNAのいずれかであってよく、それはそれが
由来する特別な有機体の特徴となる。斯くして特別な核
酸配列の検出は試験試料中の有機体の検出に相当する。
を含む有機体例えば病原体を含むバクテリヤ;ウィルス
;菌例えばイースト菌及びプロトシアン(protos
oan)からのものであってよい。標的の核酸配列はD
NA又はRNAのいずれかであってよく、それはそれが
由来する特別な有機体の特徴となる。斯くして特別な核
酸配列の検出は試験試料中の有機体の検出に相当する。
本発明の捕捉及び検出オリゴヌクレオチド・グローブは
長さが11〜約100のヌクレオチドである。プローブ
は標的核酸中の相補的配列と効果的にハイブリダイゼー
ションするために少くとも11のヌクレオチドの長さで
あるべきである。プローブ中の少くとも11の連続した
ヌクレオチド残基がハイブリダイゼーションする限りに
おいて、全体のプローブの配列が標的配列とハイブリダ
イゼーションする必要は必ずしもない。斯くして2つの
グローブはある部分部分において重複すればよく、成功
したサンドウィッチ分析がもたらせられる。しかしなが
らプローブは、隣接するか或いは1つ又はそれ以上のヌ
クレオチドによって隔離されている隣る標的の配列に相
補的であり、斯くして実質的にすべてのプローブを標的
配列とハイブリダイゼーションせしめることが好適であ
る。
長さが11〜約100のヌクレオチドである。プローブ
は標的核酸中の相補的配列と効果的にハイブリダイゼー
ションするために少くとも11のヌクレオチドの長さで
あるべきである。プローブ中の少くとも11の連続した
ヌクレオチド残基がハイブリダイゼーションする限りに
おいて、全体のプローブの配列が標的配列とハイブリダ
イゼーションする必要は必ずしもない。斯くして2つの
グローブはある部分部分において重複すればよく、成功
したサンドウィッチ分析がもたらせられる。しかしなが
らプローブは、隣接するか或いは1つ又はそれ以上のヌ
クレオチドによって隔離されている隣る標的の配列に相
補的であり、斯くして実質的にすべてのプローブを標的
配列とハイブリダイゼーションせしめることが好適であ
る。
ここにハイブリダイゼーションとは相補的塩基が対を作
ることである。
ることである。
本方法を用いるホモポリヌクレオチドは単一のヌクレオ
チドのホモポリマーである。適当なホモポリヌクレオチ
ド°はポリウリジル酸(ポリU)、ポリアデニル酸(ポ
リA)、ポリチミジル酸(ポリT)、ポリグアニル酸(
ポリG)及びポリシチジル酸(ポリC)である。また対
応するデオキシリボヌクレオチドも、即ちポリアデニル
酸の代りにポリデオキシアデニル酸も使用しうる。捕捉
オリゴヌクレオチド及び固体支持体上の尾(tail)
は少くとも約50の、但し約5000までのヌクレオチ
ド長、好ましくは100〜1000の範囲のヌクレオチ
ド長を有する。捕捉オリゴヌクレオチド上のホモポリヌ
クレオチド尾は固体担体上のホモポリヌクレオチド尾に
相補的である。好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドの尾
はポリAであり、固体支持体上の尾はポリUである。こ
こに尾つけ(tailing)又は尾とはヌクレオチド
配列の、核酸配列の端への付加に関するものである。尾
はオリゴヌクレオチド・プローブ端の3′端に、酵素タ
ーミナル・トランスフェラーゼを用いて付加することが
できる。また尾は適当な化学的又は酵素的手段により、
例えば酵素DNAリガーゼを用いて5′端に付加させて
もよい。好ましくは尾は3′端に付加される。酵素ター
ミナル・トランスフェラーゼを用いる尾付は法は核酸ハ
イブリダイゼーション技術において良く知られている。
チドのホモポリマーである。適当なホモポリヌクレオチ
ド°はポリウリジル酸(ポリU)、ポリアデニル酸(ポ
リA)、ポリチミジル酸(ポリT)、ポリグアニル酸(
ポリG)及びポリシチジル酸(ポリC)である。また対
応するデオキシリボヌクレオチドも、即ちポリアデニル
酸の代りにポリデオキシアデニル酸も使用しうる。捕捉
オリゴヌクレオチド及び固体支持体上の尾(tail)
は少くとも約50の、但し約5000までのヌクレオチ
ド長、好ましくは100〜1000の範囲のヌクレオチ
ド長を有する。捕捉オリゴヌクレオチド上のホモポリヌ
クレオチド尾は固体担体上のホモポリヌクレオチド尾に
相補的である。好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドの尾
はポリAであり、固体支持体上の尾はポリUである。こ
こに尾つけ(tailing)又は尾とはヌクレオチド
配列の、核酸配列の端への付加に関するものである。尾
はオリゴヌクレオチド・プローブ端の3′端に、酵素タ
ーミナル・トランスフェラーゼを用いて付加することが
できる。また尾は適当な化学的又は酵素的手段により、
例えば酵素DNAリガーゼを用いて5′端に付加させて
もよい。好ましくは尾は3′端に付加される。酵素ター
ミナル・トランスフェラーゼを用いる尾付は法は核酸ハ
イブリダイゼーション技術において良く知られている。
ハイブリダイゼーションが起こりうる前に、標的の核酸
配列はその配列を含む有機体から除去しなければならず
、そしてその配列は一重鎮形としていなければならない
。標的核酸はそれを含む有機体から、有機体の、適当な
へ剤或いは蛋白質分解及び/又は加水分解酵素での溶解
によって除去しうる。溶解した細胞からの標的の核酸は
一重鎮形である必要があり、これは標準的な技術例えば
加熱、pHの変化、水性媒体の誘電定数の減少、或いは
尿、アミド又は同様の溶質への露呈によって、DNAを
変性することにより達成することができる。ここに変性
とは、二重鎖の核酸の相補的ストランドの分離である。
配列はその配列を含む有機体から除去しなければならず
、そしてその配列は一重鎮形としていなければならない
。標的核酸はそれを含む有機体から、有機体の、適当な
へ剤或いは蛋白質分解及び/又は加水分解酵素での溶解
によって除去しうる。溶解した細胞からの標的の核酸は
一重鎮形である必要があり、これは標準的な技術例えば
加熱、pHの変化、水性媒体の誘電定数の減少、或いは
尿、アミド又は同様の溶質への露呈によって、DNAを
変性することにより達成することができる。ここに変性
とは、二重鎖の核酸の相補的ストランドの分離である。
ハイブリダイゼーションに十分な量が提供されるかぎり
において、核酸分子は全部が又は一部が変性されていて
よい。核酸がすでに実質的に一重鎮形である、例えば一
重鎖のリポソーム、メツセンジャー及び転写RNAであ
る場合には、特別な変性工程は必要ない。用いる溶解/
変性溶液は捕捉の及び検出しうるオリゴヌクレオチドを
含有していてよい。次いで標的の核酸を含む試料を試料
採取箇所で添加し、続いて貯蔵するか、直ぐに分析する
のが簡便である。
において、核酸分子は全部が又は一部が変性されていて
よい。核酸がすでに実質的に一重鎮形である、例えば一
重鎖のリポソーム、メツセンジャー及び転写RNAであ
る場合には、特別な変性工程は必要ない。用いる溶解/
変性溶液は捕捉の及び検出しうるオリゴヌクレオチドを
含有していてよい。次いで標的の核酸を含む試料を試料
採取箇所で添加し、続いて貯蔵するか、直ぐに分析する
のが簡便である。
必要とされる唯一の更なる工程は不溶化された支持体と
の接触及び洗浄によるハイブリダイゼーションしてない
物質の除去であろう。
の接触及び洗浄によるハイブリダイゼーションしてない
物質の除去であろう。
ハイブリダイゼーションを起こさせるために、3成分ハ
イブリダイゼーション複合体を生成させるのに十分な時
間プローブ及び標的配列を特定の温度に保温しなければ
ならない。ハイブリダイゼーションに必要とされる時間
の長さは用いる条件例えばグローブの濃度、標的核酸配
列の濃度及び用いる条件に特徴的なハイブリダイゼーシ
ョン速度と共に変化する。核酸配列のハイブリダイゼー
ションを達成するのに必要とされる条件はマニアチス(
Maniatis)、T、ら、分子クローニング:研究
室的手法(Molecular Cloning :
A L aboratory Manual)、コー
ルド・スプリング・ハーバ−出版(Cold S pr
ing Harbor P ublication)(
1982)に示されている。
イブリダイゼーション複合体を生成させるのに十分な時
間プローブ及び標的配列を特定の温度に保温しなければ
ならない。ハイブリダイゼーションに必要とされる時間
の長さは用いる条件例えばグローブの濃度、標的核酸配
列の濃度及び用いる条件に特徴的なハイブリダイゼーシ
ョン速度と共に変化する。核酸配列のハイブリダイゼー
ションを達成するのに必要とされる条件はマニアチス(
Maniatis)、T、ら、分子クローニング:研究
室的手法(Molecular Cloning :
A L aboratory Manual)、コー
ルド・スプリング・ハーバ−出版(Cold S pr
ing Harbor P ublication)(
1982)に示されている。
本発明の方法で用いる検出しうるオリゴヌクレオチドは
分子に共有結合せしめたレポータ(repoter)分
子によって検出しうる。レボータ分子は検出しうるいず
れかの分子例えば放射性分子、蛍光分子又は化学発光分
子であってよい。レポータ分子は相補的オリゴペプチド
に直接結合させてよく、或いはオリゴヌクレオチドにポ
リヌクレオチド尾を介して直接結合させ、後者を順次検
出しうるオリゴヌクレオチドに共有結合させてもよい。
分子に共有結合せしめたレポータ(repoter)分
子によって検出しうる。レボータ分子は検出しうるいず
れかの分子例えば放射性分子、蛍光分子又は化学発光分
子であってよい。レポータ分子は相補的オリゴペプチド
に直接結合させてよく、或いはオリゴヌクレオチドにポ
リヌクレオチド尾を介して直接結合させ、後者を順次検
出しうるオリゴヌクレオチドに共有結合させてもよい。
検出しうるオリゴヌクレオチドは分子に共有結合した特
別なリガンドによって検出することもできる。
別なリガンドによって検出することもできる。
適当なリガンドはビオチン、検出しうる色の変化を示す
酵素、抗体特異的抗原又は抗原特異的抗体である。この
リガンドは検出しうるオリゴヌクレオチドに直接結合さ
せることができ、或いはオリゴヌクレオチドに、共有結
合させたポリヌクレオチド尾を介して共有結合してもよ
い。またリガンドは化学的なスペーサ・アーム(spa
cer arm)を通して結合させてもよい。ポリヌク
レオチド尾はホモポリマー或いはホモコポリマー、即ち
2種だけのヌクレオチド、例えばアデニンとウラシル又
はグアニンとチミンを交互又はランダム配列で有する核
酸鎖であってよい。
酵素、抗体特異的抗原又は抗原特異的抗体である。この
リガンドは検出しうるオリゴヌクレオチドに直接結合さ
せることができ、或いはオリゴヌクレオチドに、共有結
合させたポリヌクレオチド尾を介して共有結合してもよ
い。またリガンドは化学的なスペーサ・アーム(spa
cer arm)を通して結合させてもよい。ポリヌク
レオチド尾はホモポリマー或いはホモコポリマー、即ち
2種だけのヌクレオチド、例えばアデニンとウラシル又
はグアニンとチミンを交互又はランダム配列で有する核
酸鎖であってよい。
3成分複合体を捕捉するために用いる不溶性の固体支持
体はシリカ系、多糖類、又はプラスチック物質であるこ
とができる。この固体支持体を、支持体に共有結合する
ホモポリヌクレオチド尾で被覆する。この固体支持体は
ビーズ、ミクロ粒子、マクロ粒子、ミクロカ価つェノ呟
ゲル又は濾紙の形態をとっていてよい。好適な具体例で
は、固体支持体は多糖類物質例えばセルロース物質から
、好ましくは濾紙の形で作られる。可溶性の3成分複合
体を、濾紙の固体支持体を通して濾過する方法は、3成
分複合体を不溶化し且つこの複合体をハイブリッドを形
成してない成分から分離するための簡便な手段を提供す
る。次いで不溶化した3成分複合体を濾紙上で簡便に洗
浄することができる。
体はシリカ系、多糖類、又はプラスチック物質であるこ
とができる。この固体支持体を、支持体に共有結合する
ホモポリヌクレオチド尾で被覆する。この固体支持体は
ビーズ、ミクロ粒子、マクロ粒子、ミクロカ価つェノ呟
ゲル又は濾紙の形態をとっていてよい。好適な具体例で
は、固体支持体は多糖類物質例えばセルロース物質から
、好ましくは濾紙の形で作られる。可溶性の3成分複合
体を、濾紙の固体支持体を通して濾過する方法は、3成
分複合体を不溶化し且つこの複合体をハイブリッドを形
成してない成分から分離するための簡便な手段を提供す
る。次いで不溶化した3成分複合体を濾紙上で簡便に洗
浄することができる。
本発明は次のM、ニューモニアエ16srRNAの11
5の塩基のヌクレオチド配列に相補性の核酸プローブを
提供する: 5’ ACCGCAUAAGAACUUUGGLIUC
GCAUGAAUCAAAGUUGAAAGGACCU
GCAAGGGUUCGUUAUUUGAUGAGGG
UGCGCCAUAUCAGCUAGUUGGUGGG
GUAACGGCCUACCAAGGCA 3’但し式
中のA、C,G及びUはそれぞれ塩基アデニン、シトシ
ン、グアニン及びウラシルを表わす。
5の塩基のヌクレオチド配列に相補性の核酸プローブを
提供する: 5’ ACCGCAUAAGAACUUUGGLIUC
GCAUGAAUCAAAGUUGAAAGGACCU
GCAAGGGUUCGUUAUUUGAUGAGGG
UGCGCCAUAUCAGCUAGUUGGUGGG
GUAACGGCCUACCAAGGCA 3’但し式
中のA、C,G及びUはそれぞれ塩基アデニン、シトシ
ン、グアニン及びウラシルを表わす。
更に115の塩基の配列を越えて第2図の300の塩基
配列の他の部分(即ち塩基1〜157及び273〜30
0)に拡大するグローブの配列は本発明の範囲内である
と考えられる。また本発明はDNA又はチミン塩基が各
ウラシル塩基で代替された115の塩基のRNA配列の
転写同等物も提供する。この転写同等物は工5s r
RNAを転写するDNAに相当する。115の塩基配列
のrRN’A配列又はその7ラグメントはそれ自体16
S rRNAを転写するDNA鎖、即ち二重鎖DNA
のコード類に相補性の核酸プローブとして使用しうる。
配列の他の部分(即ち塩基1〜157及び273〜30
0)に拡大するグローブの配列は本発明の範囲内である
と考えられる。また本発明はDNA又はチミン塩基が各
ウラシル塩基で代替された115の塩基のRNA配列の
転写同等物も提供する。この転写同等物は工5s r
RNAを転写するDNAに相当する。115の塩基配列
のrRN’A配列又はその7ラグメントはそれ自体16
S rRNAを転写するDNA鎖、即ち二重鎖DNA
のコード類に相補性の核酸プローブとして使用しうる。
115の塩基配列の少くとも一部分に相補性である核酸
配列はM、ニューモニアエを検出するためのオリゴヌク
レオチド・グローブとして有用である。2つのそのよう
なプローブは以下の如き0DS55 (33量体)及び
0DS56 (37量体)である: QDS55 : 3’ GTATTCTTGAAACCAAGCGTAC
TTAGTTTCAAC5’ 及び 0DS56 : 3’ CTGGACGTTCCCAAGCAATAAA
CTACTCCCACGCGGT 5’ 16’s rRNA配列と0DS55及び0DS56
との間の相補的関係は第1図に示しである。
配列はM、ニューモニアエを検出するためのオリゴヌク
レオチド・グローブとして有用である。2つのそのよう
なプローブは以下の如き0DS55 (33量体)及び
0DS56 (37量体)である: QDS55 : 3’ GTATTCTTGAAACCAAGCGTAC
TTAGTTTCAAC5’ 及び 0DS56 : 3’ CTGGACGTTCCCAAGCAATAAA
CTACTCCCACGCGGT 5’ 16’s rRNA配列と0DS55及び0DS56
との間の相補的関係は第1図に示しである。
更に、本発明のオリゴヌクレオチド・プローブは、それ
ぞれ115の塩基配列に相補性であって、次のように表
わされる0DS−59(26量体)、0DS−60(2
6量体)又は0DS−81(37量体)を有していても
よい: 0DS−59: 3’ CCAAGCGTACTTAGTTTCAACT
TTCC5’0DS−60: 3’ TGGACGTTCCCAAGCAATAAAC
TACT 5’及び0DS−81: 3’ ATAGTCGATCAACCACCCCATT
GCCGGATGGTTCCGT5’適当な厳しいハイ
ブリダイゼーション条件下において、0DS−55,0
DS−59及び0DS−81はM、ニューモニアエに特
異的であるが、M。
ぞれ115の塩基配列に相補性であって、次のように表
わされる0DS−59(26量体)、0DS−60(2
6量体)又は0DS−81(37量体)を有していても
よい: 0DS−59: 3’ CCAAGCGTACTTAGTTTCAACT
TTCC5’0DS−60: 3’ TGGACGTTCCCAAGCAATAAAC
TACT 5’及び0DS−81: 3’ ATAGTCGATCAACCACCCCATT
GCCGGATGGTTCCGT5’適当な厳しいハイ
ブリダイゼーション条件下において、0DS−55,0
DS−59及び0DS−81はM、ニューモニアエに特
異的であるが、M。
ゲニタリウムと交叉反応しないことが決定された。
プローブ○DS−56及び○DS−60はM、ゲニタリ
ウム並びにM、ニューモニアエと反応した。
ウム並びにM、ニューモニアエと反応した。
本発明のプローブは効果的なハイブリダイゼーションを
保証するために少くともlOの塩基を有する。プローブ
の相補的部分は約50の塩基長までであってよい。また
グローブは例えば「尾付け」によって共有結合した補足
的な非相補性塩基配列を有していてもよい。この「尾付
け」した領域は検出しうる標識又は固体支持体を結合さ
せるために使用しうる。プローブは1つ又はそれ以上の
結合した検出しうる標識を有していてもよい。更に、プ
ローブは固定化でき(例えば順次固体支持体によって捕
捉しうるビオチン又はいくつかの他のハプテンつなぐ)
或いは固体支持体に固定される。
保証するために少くともlOの塩基を有する。プローブ
の相補的部分は約50の塩基長までであってよい。また
グローブは例えば「尾付け」によって共有結合した補足
的な非相補性塩基配列を有していてもよい。この「尾付
け」した領域は検出しうる標識又は固体支持体を結合さ
せるために使用しうる。プローブは1つ又はそれ以上の
結合した検出しうる標識を有していてもよい。更に、プ
ローブは固定化でき(例えば順次固体支持体によって捕
捉しうるビオチン又はいくつかの他のハプテンつなぐ)
或いは固体支持体に固定される。
本発明のプローブは試料中のM、ニューモニアエ16s
リポツムRNAの存在を同定するための方法に使用しう
る。そのような方法の場合、リポソームRNAに相補的
な少くとも1つのプローブがハイブリダイゼーション分
析において使用しうる。このグローブは本発明の115
の塩基RNAの少くとも一部分に相補的であることが好
ましい。
リポツムRNAの存在を同定するための方法に使用しう
る。そのような方法の場合、リポソームRNAに相補的
な少くとも1つのプローブがハイブリダイゼーション分
析において使用しうる。このグローブは本発明の115
の塩基RNAの少くとも一部分に相補的であることが好
ましい。
本発明のプローブは、試料中のM、ニューモニアエ16
SリポソームRNAの存在を同定するためのサンドウィ
ッチ式ハイブリダイゼーション分析においても使用しう
る。サンドウィッチ法では、リポソームRNAの異なる
部分に相補的な本発明の2つのオリゴヌクレオチド・プ
ローブが1段ハイブリダイゼーション分析において利用
される。
SリポソームRNAの存在を同定するためのサンドウィ
ッチ式ハイブリダイゼーション分析においても使用しう
る。サンドウィッチ法では、リポソームRNAの異なる
部分に相補的な本発明の2つのオリゴヌクレオチド・プ
ローブが1段ハイブリダイゼーション分析において利用
される。
各グローブは115の塩基のRNA配列の少くとも一部
分に相補的である配列を有する。0DS5510DS8
1又は0DS5910DS81の組合せは、これらのプ
ローブの各がM、ニューモニアエと特異的に反応し且つ
その組合せが重複しないから二重グローブ分析において
有用でありうる。
分に相補的である配列を有する。0DS5510DS8
1又は0DS5910DS81の組合せは、これらのプ
ローブの各がM、ニューモニアエと特異的に反応し且つ
その組合せが重複しないから二重グローブ分析において
有用でありうる。
サンドウィッチ分析法において、グローブは重複又は非
重複のいずれであってもよい。ハイブリダイゼーション
を最大にするためには、プローブが非重複である、即ち
相補的な塩基配列の重複がないことが好適である。非重
複であるならば、プローブの配列は標的のrRNA配列
に沿って互いに隣っており、そしてプローブは第1図に
示すように隣接して或いは1つ又はそれ以上の塩基によ
って分離していてよい。プローブが重複ならば、即ちそ
れらが16S rRNA上の塩基の同一の配列の少く
とも一部分に相補性であるならば、このプローブは依然
サンドウィッチ分析法に使用できるが、ハイブリダイゼ
ーションは最大とならないであろう。
重複のいずれであってもよい。ハイブリダイゼーション
を最大にするためには、プローブが非重複である、即ち
相補的な塩基配列の重複がないことが好適である。非重
複であるならば、プローブの配列は標的のrRNA配列
に沿って互いに隣っており、そしてプローブは第1図に
示すように隣接して或いは1つ又はそれ以上の塩基によ
って分離していてよい。プローブが重複ならば、即ちそ
れらが16S rRNA上の塩基の同一の配列の少く
とも一部分に相補性であるならば、このプローブは依然
サンドウィッチ分析法に使用できるが、ハイブリダイゼ
ーションは最大とならないであろう。
サンドウィッチ分析法の利点は、それぞれプローブが試
料内に存在する他の有機体と交叉反応しうるから、両プ
ローブに依存して最大の特異性を提供しうろことである
。そのような交叉反応性は標的分子を検出するために、
両グローブが該分子と相互作用することに依存して有利
に回避される。
料内に存在する他の有機体と交叉反応しうるから、両プ
ローブに依存して最大の特異性を提供しうろことである
。そのような交叉反応性は標的分子を検出するために、
両グローブが該分子と相互作用することに依存して有利
に回避される。
即ちプローブの1つだけが交叉反応性によって標的と非
特異的に反応するならば、他のプローブが同一の標的と
交叉反応しないであろうから、信号は得られない。この
ようにして試験の特異性は保持されよう。
特異的に反応するならば、他のプローブが同一の標的と
交叉反応しないであろうから、信号は得られない。この
ようにして試験の特異性は保持されよう。
固定型のハイブリダイゼーション分析の場合、サンドウ
ィッチ分析の実際の機作は、固体支持体に固定化された
1つのグローブと検出しうる標識又は「レボータ」物質
で標識された(又はレボータが特異的に結合しうるリガ
ンドでつながった)他のプローブとを含んでなる。「固
定化」及び「レポータ」の両グローブの一緒になった結
合だけが正の信号を与える。
ィッチ分析の実際の機作は、固体支持体に固定化された
1つのグローブと検出しうる標識又は「レボータ」物質
で標識された(又はレボータが特異的に結合しうるリガ
ンドでつながった)他のプローブとを含んでなる。「固
定化」及び「レポータ」の両グローブの一緒になった結
合だけが正の信号を与える。
利用される検出しうる標識又はレポータ分子は検出しう
るいずれの分子であってもよい。そのような検出しうる
分子の例は放射性同位体例えば32P1蛍光分子例えば
FITC,染料における色の変化をもたらす酵素例えば
西洋ワサビのペルオキシダーゼ、光散乱粒子及び化学発
酵触媒である。
るいずれの分子であってもよい。そのような検出しうる
分子の例は放射性同位体例えば32P1蛍光分子例えば
FITC,染料における色の変化をもたらす酵素例えば
西洋ワサビのペルオキシダーゼ、光散乱粒子及び化学発
酵触媒である。
他の適当な標識は酵素、蛍光分子又は他の検出しうる分
子をつなげた特別な蛋白質に結合しうるリガンドである
。
子をつなげた特別な蛋白質に結合しうるリガンドである
。
本発明のグローブを固定化しうる固体支持体はいずれか
のシリカ系、多糖類又は重合体物質であってよい。適当
な固体支持体は多糖類物質例えばセルロース及びアガロ
ース、或いは重合体物質例えばラテックスから作ること
ができる。更に微孔性表面例えばニトロセルロース紙、
並びにガラス繊維フィルター及び調節された多孔性ガラ
スも使用しうる。1つの具体例において、ストレプトア
ビジン(5treptavidin)で被覆されたアガ
ロース・ビーズはビオチニル化プローブを固定化するた
めに使用される。他の具体例において、アガロース・ビ
ーズは付着したビオチニル化オリゴ(oligos)を
有することができ、また被覆されたビーズはストレプト
アビジン−西洋ワサビのペルオキシダーゼ複合体と反応
させることができる。
のシリカ系、多糖類又は重合体物質であってよい。適当
な固体支持体は多糖類物質例えばセルロース及びアガロ
ース、或いは重合体物質例えばラテックスから作ること
ができる。更に微孔性表面例えばニトロセルロース紙、
並びにガラス繊維フィルター及び調節された多孔性ガラ
スも使用しうる。1つの具体例において、ストレプトア
ビジン(5treptavidin)で被覆されたアガ
ロース・ビーズはビオチニル化プローブを固定化するた
めに使用される。他の具体例において、アガロース・ビ
ーズは付着したビオチニル化オリゴ(oligos)を
有することができ、また被覆されたビーズはストレプト
アビジン−西洋ワサビのペルオキシダーゼ複合体と反応
させることができる。
本発明のプローブはゲノムDNA又はRNAに由来する
よりもむしろ合成的に製造される。本発明のオリゴヌク
レオチド・プローブを化学的に合成する方法は技術的に
良く知られている。1つのそのような方法は米国特許第
4.458.066号[カルサース(Caruther
s)ら]に記述されているホスホルアミダイト法である
。他の方法はA。
よりもむしろ合成的に製造される。本発明のオリゴヌク
レオチド・プローブを化学的に合成する方法は技術的に
良く知られている。1つのそのような方法は米国特許第
4.458.066号[カルサース(Caruther
s)ら]に記述されているホスホルアミダイト法である
。他の方法はA。
アマルナス(A marnath)ら、サム・レブ(C
hem。
hem。
Rev、 ) 7ヱ、183〜217 (1977)に
記述されている。本発明の好適なプローブは、本明細書
に記述する如き115の塩基の配列に相補性の比較的短
い、例えば20〜50のヌクレオチド・オリゴマーであ
り、従って自動化されたDNA合成装置によって効果的
に作ることができる。グローブは付加的なヌクレオチド
、例えば塩基5000までの、ビオチンで標識したヌク
レオチドの尾を有していてよい。プローブの化学的合成
は、天然起源から遺伝子情報を分離且つ精製するという
困難な組換え法に依存するよりも特別なヌクレオチド配
列を有する精製されたグローブを多数且つ容易に製造す
ることを可能にする。
記述されている。本発明の好適なプローブは、本明細書
に記述する如き115の塩基の配列に相補性の比較的短
い、例えば20〜50のヌクレオチド・オリゴマーであ
り、従って自動化されたDNA合成装置によって効果的
に作ることができる。グローブは付加的なヌクレオチド
、例えば塩基5000までの、ビオチンで標識したヌク
レオチドの尾を有していてよい。プローブの化学的合成
は、天然起源から遺伝子情報を分離且つ精製するという
困難な組換え法に依存するよりも特別なヌクレオチド配
列を有する精製されたグローブを多数且つ容易に製造す
ることを可能にする。
本発明のプローブを製造するためには、M、ニューモニ
アエ1(5S rRNAの部分的な配列を得、この配
列を確認した。15s rRNAの配列の決定法は、
レーン(Lane) 、D、L 、ら、ブロク・ナトル
ーアカド・サイ(Proc、 Natl、 、Acad
、Sci、) 、82,6955〜6959 (198
5年8月)に例示されるように技術的に良く知られてい
る。特に、16S rRNAの5′端における300
の塩基の配列を得、115の塩基の配列を確めた。この
MPRDNAIと称せられる配列を第2図に示す。
アエ1(5S rRNAの部分的な配列を得、この配
列を確認した。15s rRNAの配列の決定法は、
レーン(Lane) 、D、L 、ら、ブロク・ナトル
ーアカド・サイ(Proc、 Natl、 、Acad
、Sci、) 、82,6955〜6959 (198
5年8月)に例示されるように技術的に良く知られてい
る。特に、16S rRNAの5′端における300
の塩基の配列を得、115の塩基の配列を確めた。この
MPRDNAIと称せられる配列を第2図に示す。
115の塩基の配列を決定するために、MPRDNAl
配列を、近親のバクテリヤ種の他の公知の165 r
RNAの配列と共に配列相同分析において使用した。マ
イコプラズマ種の間には殆んど検出しえない塩基の相同
が存在すること並びにM、ニューモニアエがM、ゲニタ
リウムを除いて他のマイコプラズマのいずれにも関係な
いように見えることは公知である[スギノ(S ugi
no)、W、M、ら、ジエイ・ゲン・ミクロ(J 、
Gen、 Micro、) 、 1 2 1. 33
3〜338 (1980) コ 。
配列を、近親のバクテリヤ種の他の公知の165 r
RNAの配列と共に配列相同分析において使用した。マ
イコプラズマ種の間には殆んど検出しえない塩基の相同
が存在すること並びにM、ニューモニアエがM、ゲニタ
リウムを除いて他のマイコプラズマのいずれにも関係な
いように見えることは公知である[スギノ(S ugi
no)、W、M、ら、ジエイ・ゲン・ミクロ(J 、
Gen、 Micro、) 、 1 2 1. 33
3〜338 (1980) コ 。
事実M、ニューモニアエはM、ゲニタリウムと高度の相
同を共有している。しかしながらM、ニューモニアエは
いくつかの他のマイコプラズマよりもグラム陽性バクテ
リヤと密接に関連している。
同を共有している。しかしながらM、ニューモニアエは
いくつかの他のマイコプラズマよりもグラム陽性バクテ
リヤと密接に関連している。
それ故に、グラム陽性バクテリヤ、枯草菌(B、5ub
tilis)の16s rRNAの配列を分析に用い
、そして他のマイコプラズマ種、M、カプリコラム(c
apricolum)の報告されている165 rR
NA配列を利用した。系統発生学的にM、ニューモニア
エから遠いダラム陰性バクテリヤ、大腸菌の165
rRNAを参照配列として用いた。
tilis)の16s rRNAの配列を分析に用い
、そして他のマイコプラズマ種、M、カプリコラム(c
apricolum)の報告されている165 rR
NA配列を利用した。系統発生学的にM、ニューモニア
エから遠いダラム陰性バクテリヤ、大腸菌の165
rRNAを参照配列として用いた。
M、カプリコラムの配列はイヮミ(I wami)、M
、ら、モル・ゲン・ゲネト(Mo1. Gen、 Ge
net、)、196.317〜322 (1984)に
よって決されているようにl 992bp ds−DN
A配列であった。枯草菌の配列は、スチュヮート(S
tewart) 、C、P 、ら、ヌクル拳アシド昏レ
ス(Nucl、 Ac1d Res、) 、1土、6
289〜6300 (1983)が法案じたように11
72bpds−DNA配列であった。大腸菌の配列はニ
ーレスマン(E hresmann) 、C、ら、フェ
ブス参しト (FEBS Lett、) 、
84ユ、 337〜341(1977);カーボン(C
arbon)ら、フェブ〜・レト、11.152〜15
6 (1978);及びカーボンら、ニール・ジェイ
・パイオヶム(Eur、 J 、 B ioche
m、) 100.399〜410(1979)によっ
て法案されているように1541bprRNA配列であ
った。
、ら、モル・ゲン・ゲネト(Mo1. Gen、 Ge
net、)、196.317〜322 (1984)に
よって決されているようにl 992bp ds−DN
A配列であった。枯草菌の配列は、スチュヮート(S
tewart) 、C、P 、ら、ヌクル拳アシド昏レ
ス(Nucl、 Ac1d Res、) 、1土、6
289〜6300 (1983)が法案じたように11
72bpds−DNA配列であった。大腸菌の配列はニ
ーレスマン(E hresmann) 、C、ら、フェ
ブス参しト (FEBS Lett、) 、
84ユ、 337〜341(1977);カーボン(C
arbon)ら、フェブ〜・レト、11.152〜15
6 (1978);及びカーボンら、ニール・ジェイ
・パイオヶム(Eur、 J 、 B ioche
m、) 100.399〜410(1979)によっ
て法案されているように1541bprRNA配列であ
った。
次の実施例は本発明を例示する。ここに本発明はこれら
の実施例によってで、はなく、特許請求の範囲だけによ
って限定されるものと考える。
の実施例によってで、はなく、特許請求の範囲だけによ
って限定されるものと考える。
実施例1
単一プローブを用いるドツト・プロット(dot bl
at)ハイブリダイゼーション分析 感染した患者ののどを拭いてM、ニューモニアエの臨床
的試料を採取した。32Pで標識した0DS−56を用
いる簡単なドツト・プロット・ハイブリダイゼーション
分析により215の試料を試験した。分析の結果は5つ
の試料がM、ニューモニアエであることを示した。これ
らの5つの陽性試料は、培養によりM、ニューモニアエ
であることが確められた。この分析の方法は次の通りで
ある: のどの拭きとりによって単離された細胞中に存在する1
6S rRNAを、粘膜を含む各拭きとりからの液体
を拭き取り物から流出させた後にフェノールで抽出した
。各抜き取り物から流出された液体を、約0.1Mへペ
ス、pH7,4を飽和させたフェノール100μαと混
合した。この混合物ヲマイクロヒュージュ(micro
fuge)中で滴流回転し、上澄液を除去した。この工
程を上澄液についてもう1回繰返した。
at)ハイブリダイゼーション分析 感染した患者ののどを拭いてM、ニューモニアエの臨床
的試料を採取した。32Pで標識した0DS−56を用
いる簡単なドツト・プロット・ハイブリダイゼーション
分析により215の試料を試験した。分析の結果は5つ
の試料がM、ニューモニアエであることを示した。これ
らの5つの陽性試料は、培養によりM、ニューモニアエ
であることが確められた。この分析の方法は次の通りで
ある: のどの拭きとりによって単離された細胞中に存在する1
6S rRNAを、粘膜を含む各拭きとりからの液体
を拭き取り物から流出させた後にフェノールで抽出した
。各抜き取り物から流出された液体を、約0.1Mへペ
ス、pH7,4を飽和させたフェノール100μαと混
合した。この混合物ヲマイクロヒュージュ(micro
fuge)中で滴流回転し、上澄液を除去した。この工
程を上澄液についてもう1回繰返した。
この上澄液を5MNaC<2の1710容量と混合し、
渦流させ、マイクロヒユーシュで処理し、上澄液を除去
し、ペレットを残した。上澄液をエーテルで2回抽出し
た。エーテルを除去し、管内に水性相を残した。この残
った下相を遠心分離蒸発機で乾燥して残留するエーテル
を除去した。
渦流させ、マイクロヒユーシュで処理し、上澄液を除去
し、ペレットを残した。上澄液をエーテルで2回抽出し
た。エーテルを除去し、管内に水性相を残した。この残
った下相を遠心分離蒸発機で乾燥して残留するエーテル
を除去した。
5SPEと言われる水性緩衝液を続く工程で使用した。
この5SPEはNaCQ l 74g、NaH。
po、−H,o 27.6g、EDTA 7.4g
を添加し、pHをNaOHで7.4に調節してIαの容
量で調製した。他のF/Sと言われる使用した水溶液は
容量比20 : 30の37%ホルムアルデヒド:5S
PEであった。
を添加し、pHをNaOHで7.4に調節してIαの容
量で調製した。他のF/Sと言われる使用した水溶液は
容量比20 : 30の37%ホルムアルデヒド:5S
PEであった。
抽出工程後に残る残渣をF/S 100μα中に最懸
濁し、渦流させ、そして60℃に15分間加熱した。室
温において10xsSPE200μQを混合し、そして
96のウェルめドツト・プロッター(dot blot
ter) [シュライヒヤー・アンド・シュエル(S
chleicher and S chuell)
]を用いることにより予じめ濡らした[ジエン・スクリ
ーン” (Gene 5creen) 4 [=ニー
0イングランド0ヌクレア(New England
Nuclear) ]ナイロン膜(Hz○、次いで20
XSSPEで濡らす)を通して濾過した。試料をフィル
ターに結合せしめ、次いで液体を真空で吸引した。各ウ
ェルをl0XssPE100μaで洗浄し、真空炉中8
0℃で1時間乾燥した。
濁し、渦流させ、そして60℃に15分間加熱した。室
温において10xsSPE200μQを混合し、そして
96のウェルめドツト・プロッター(dot blot
ter) [シュライヒヤー・アンド・シュエル(S
chleicher and S chuell)
]を用いることにより予じめ濡らした[ジエン・スクリ
ーン” (Gene 5creen) 4 [=ニー
0イングランド0ヌクレア(New England
Nuclear) ]ナイロン膜(Hz○、次いで20
XSSPEで濡らす)を通して濾過した。試料をフィル
ターに結合せしめ、次いで液体を真空で吸引した。各ウ
ェルをl0XssPE100μaで洗浄し、真空炉中8
0℃で1時間乾燥した。
乾燥後、濾過を、25%ホルムアミド、4×5SPE、
0.2%SDS、IXデン/1ルツ(D enhard
t)溶液及びl OOpg/mQ tRNAからなる予
備ハイブリダイゼーション溶液と37°C下に0゜5時
間接触させた。次いで濾液を、32Pで標識した0DS
56 (3pモル;5mQ中5012)を含有する同一
の混合物と接触させた。プロットを洗浄してX線フィル
ムにさらした。5つの陽性のドツトが得られた。これは
0DS56がM、ニューモニアエ165 rRNAを
臨床試料から同定しうろことを示す。
0.2%SDS、IXデン/1ルツ(D enhard
t)溶液及びl OOpg/mQ tRNAからなる予
備ハイブリダイゼーション溶液と37°C下に0゜5時
間接触させた。次いで濾液を、32Pで標識した0DS
56 (3pモル;5mQ中5012)を含有する同一
の混合物と接触させた。プロットを洗浄してX線フィル
ムにさらした。5つの陽性のドツトが得られた。これは
0DS56がM、ニューモニアエ165 rRNAを
臨床試料から同定しうろことを示す。
実施例2
サンドウィッチ法ハイブリダイゼーション分析用いたサ
ンドウィッチ分析法の一般的な方法を以下に簡単に記述
する。
ンドウィッチ分析法の一般的な方法を以下に簡単に記述
する。
M、ニューモニアエ165 rRNAの隣った領域に
相補性のオリゴヌクレオチドに尾づけをして捕捉及び検
出オリゴヌクレオチド系を生成した。
相補性のオリゴヌクレオチドに尾づけをして捕捉及び検
出オリゴヌクレオチド系を生成した。
RNAを捕捉し且つ固定するために捕捉オリゴヌクレオ
チドを生成せしめる目的で、0DS−56にアデニル酸
の約100〜200残基(ポリA)を尾づけした。また
検出オリゴヌクレオチドとして用いるために、0DS−
81にdCTP及びビオチンaurp (5: 1)の
混合物を尾付けした。
チドを生成せしめる目的で、0DS−56にアデニル酸
の約100〜200残基(ポリA)を尾づけした。また
検出オリゴヌクレオチドとして用いるために、0DS−
81にdCTP及びビオチンaurp (5: 1)の
混合物を尾付けした。
rRNAの補足は、ハイブリダイゼーションさせたオリ
ゴ(oligo) / RN A複合体を、ポリUの尾
を付けた濾紙[[ハイボンド(Hybond) J−□
APメツセンジャー親和親和性紙;アマハスハムmer
sham) ]中を通過させることによって行なった。
ゴ(oligo) / RN A複合体を、ポリUの尾
を付けた濾紙[[ハイボンド(Hybond) J−□
APメツセンジャー親和親和性紙;アマハスハムmer
sham) ]中を通過させることによって行なった。
このメツセンジャー親和性紙は可逆的な具合にポリA含
有分子を結合したー。斯くして0DS−56上のポリA
の尾は濾紙上のポリUの尾とハイブリダイゼーションし
、この結果複合体が固定化された。ストレプトアビジン
−西洋ワサビのペルオキシダーゼ(HRP)[シグマ(
Sigtna) ; 0゜5 mg/ mQの1/1
000希釈、番号S−55121を濾紙中を通過させ、
固定化されたビオチン(ODS−81上)に結合させ、
そして数回ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で洗浄し
く且つクエン酸塩メツウイーンで最終洗浄し)だ後、3
.3’、5.5’−テトラメチルベンジジン(TMB)
染色により検出した。TMBはHRPに対する発色物質
である。
有分子を結合したー。斯くして0DS−56上のポリA
の尾は濾紙上のポリUの尾とハイブリダイゼーションし
、この結果複合体が固定化された。ストレプトアビジン
−西洋ワサビのペルオキシダーゼ(HRP)[シグマ(
Sigtna) ; 0゜5 mg/ mQの1/1
000希釈、番号S−55121を濾紙中を通過させ、
固定化されたビオチン(ODS−81上)に結合させ、
そして数回ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で洗浄し
く且つクエン酸塩メツウイーンで最終洗浄し)だ後、3
.3’、5.5’−テトラメチルベンジジン(TMB)
染色により検出した。TMBはHRPに対する発色物質
である。
プローブ0DS−81は、酵素ターミナル・トランスフ
ェラーゼ及び約20%のビオチニル化dUTP [ベセ
スダ・リサーチ研究所(B ethesdaResea
rch Labs) 、ビオチン−11−UTPIと残
りのdCT Pを含むヌクレオチド混合物を用いること
により、3′端においてビオチンの尾がつケラレタ。0
DS−81の147’12(250pモル)を水258
μαに添加した。次いで1QxTdT緩衝液40μ(2
を、dcTP4μm2(40ミリモル)、ビオチニル化
dUTP31μQ(12,4ミリモル)及びターミナル
・トランスフェラーゼ[ファーマシア(P harma
cia) 、F P L C純度]60/712と一緒
に添加した。この混合物を37℃に4時間保温し、G−
50セフアデツクス・カラムで精製した。○DS−56
もdATP(ファーマシア)を用いて同様に尾付けした
。
ェラーゼ及び約20%のビオチニル化dUTP [ベセ
スダ・リサーチ研究所(B ethesdaResea
rch Labs) 、ビオチン−11−UTPIと残
りのdCT Pを含むヌクレオチド混合物を用いること
により、3′端においてビオチンの尾がつケラレタ。0
DS−81の147’12(250pモル)を水258
μαに添加した。次いで1QxTdT緩衝液40μ(2
を、dcTP4μm2(40ミリモル)、ビオチニル化
dUTP31μQ(12,4ミリモル)及びターミナル
・トランスフェラーゼ[ファーマシア(P harma
cia) 、F P L C純度]60/712と一緒
に添加した。この混合物を37℃に4時間保温し、G−
50セフアデツクス・カラムで精製した。○DS−56
もdATP(ファーマシア)を用いて同様に尾付けした
。
用いたM、ニューモニアエはM、ニューモニア工の研究
室での培養から得た。細胞から抽出したrRNA又はr
RNAを含む溶解した細胞混合物のいずれかを用いてサ
ンドウィッチ分析を行なった。
室での培養から得た。細胞から抽出したrRNA又はr
RNAを含む溶解した細胞混合物のいずれかを用いてサ
ンドウィッチ分析を行なった。
M、ニューモニアエの培養物(遅い対数相のもの)を、
培養物を含むT25フラスコを2つ取り、そして成長媒
体を除去した後、ヘペスで緩衝した1%SDS及び25
mM DTTの1mQを添加することにより溶解した
。次いで得られた混合物を、50mMビペス(Pipe
s) 、pH6,58、及び0゜1%SDSで希釈して
、約1011細胞当量/mQを得た。
培養物を含むT25フラスコを2つ取り、そして成長媒
体を除去した後、ヘペスで緩衝した1%SDS及び25
mM DTTの1mQを添加することにより溶解した
。次いで得られた混合物を、50mMビペス(Pipe
s) 、pH6,58、及び0゜1%SDSで希釈して
、約1011細胞当量/mQを得た。
用いた実際の工程は次の通りであった:約0.5%ドデ
シル硫酸リチウム、lomM EDTA、25mMジ
チオスレイトール(DTT)、50mM NaMES
緩衝液(pH7,0)、0.1mg/mQ tRNA
S 10%デキストラン・サルフェート(ファーマシア
:分子量約500.000)、1ピコモルの尾づけした
0DS81,0.2ピコモルの尾づけした0DS56、
及び容量約200μaの試料RNA (約10−”モル
)を含有する試料を、約58℃に10分間保温した。5
.0MLiCαを1/10容量添加し、混合し、次いで
穏やかな真空(約0.2インチHg)下にフィルターを
通して吸引した。この工程は凡そ5〜10分間かかっI
こ 。
シル硫酸リチウム、lomM EDTA、25mMジ
チオスレイトール(DTT)、50mM NaMES
緩衝液(pH7,0)、0.1mg/mQ tRNA
S 10%デキストラン・サルフェート(ファーマシア
:分子量約500.000)、1ピコモルの尾づけした
0DS81,0.2ピコモルの尾づけした0DS56、
及び容量約200μaの試料RNA (約10−”モル
)を含有する試料を、約58℃に10分間保温した。5
.0MLiCαを1/10容量添加し、混合し、次いで
穏やかな真空(約0.2インチHg)下にフィルターを
通して吸引した。この工程は凡そ5〜10分間かかっI
こ 。
フィルターを([意の工程として)真空下に、2.4M
テトラエチルアンモニウムクロライド(TEACQ)1
0.5%7ウイー:/20(7)2X50μQで洗浄し
た。これは不適当に生成したハイブリ°ツドを除去する
には必要な工程であった。TEACI2はU:A結合を
融解することなしに不適当な二重鎖を融解する。次いで
フィルターを0.1M NaCQ250pQ及び0.
1%SDSでゆすいだ。次に0.5μg/mQのストレ
プトアビジン−HRP溶液100μαをフィルター中に
通過させた。
テトラエチルアンモニウムクロライド(TEACQ)1
0.5%7ウイー:/20(7)2X50μQで洗浄し
た。これは不適当に生成したハイブリ°ツドを除去する
には必要な工程であった。TEACI2はU:A結合を
融解することなしに不適当な二重鎖を融解する。次いで
フィルターを0.1M NaCQ250pQ及び0.
1%SDSでゆすいだ。次に0.5μg/mQのストレ
プトアビジン−HRP溶液100μαをフィルター中に
通過させた。
このフィルターを0.1M NaCQ及び0.1%S
DSの3X250μαで洗浄した。次いでO,1MNa
CQ、pH4,7のクエン酸ナトリウム緩衝液の洗浄溶
液をフィルター中を通した。
DSの3X250μαで洗浄した。次いでO,1MNa
CQ、pH4,7のクエン酸ナトリウム緩衝液の洗浄溶
液をフィルター中を通した。
真空を止め、TMB/緩衝液/パーオキサイド染色混合
物30μQをフィルターの上に置き、室温で約10分間
放置(培養)した。次いでTMB溶液を水銀5〜lOイ
ンチ下にフィルターを通して吸引することにより反応を
停止させた。TMBによる濾紙の染色は試料中における
M、ニューモニアエの存在を示した。色の変化は試料中
に存在するrRNAの量に依存して非常に明るい緑色か
ら非常に暗い緑色までであった。ハイブリダイゼーショ
ン混合物は全く粘稠で、フィルターをゆっくり通過した
。すべて他の洗浄物又は結合物(HRP)は1分もかか
らずに通過した。
物30μQをフィルターの上に置き、室温で約10分間
放置(培養)した。次いでTMB溶液を水銀5〜lOイ
ンチ下にフィルターを通して吸引することにより反応を
停止させた。TMBによる濾紙の染色は試料中における
M、ニューモニアエの存在を示した。色の変化は試料中
に存在するrRNAの量に依存して非常に明るい緑色か
ら非常に暗い緑色までであった。ハイブリダイゼーショ
ン混合物は全く粘稠で、フィルターをゆっくり通過した
。すべて他の洗浄物又は結合物(HRP)は1分もかか
らずに通過した。
現在の分析検出限界はrRNA100アットモル(10
−目)の範囲であり、或いは言い換えると本分析は10
”個のM、ニューモニアエrRNAを検出することがで
きる。全分析は長いハイブリダイゼーション工程が必要
ないので約30分以下に起こる。
−目)の範囲であり、或いは言い換えると本分析は10
”個のM、ニューモニアエrRNAを検出することがで
きる。全分析は長いハイブリダイゼーション工程が必要
ないので約30分以下に起こる。
以上本発明をある好適な具体例及び実施例を参考にして
記述してきた。しかし、同業者にはその明白なる変化が
想起されるであろうから、本発明はそれらに限定される
ものと考えるべきでない。
記述してきた。しかし、同業者にはその明白なる変化が
想起されるであろうから、本発明はそれらに限定される
ものと考えるべきでない。
本発明の特徴及び態様は以下の通りである:1、a)標
的の配列の少くとも一部分に相補性の可溶な捕捉オリゴ
ヌクレオチド及び標的の配列の実質的に異なる部分に相
補性の可溶な検出しうるオリゴヌクレオチドを準備し、
但し捕捉オリゴヌクレオチドがそれに共有結合したホモ
ポリヌクレオチドの尾を有し: b)捕捉オリゴヌクレオチド、検出しうるオリゴヌクレ
オチド及び一重鎖の標的核酸を水溶液中において、可溶
な3成分ハイブリダイゼーション複合体を生成しうるハ
イブリダイゼーション条件下に混合し; C)該3成分複合体を、ホモポリヌクレオチドの尾が共
有結合した不溶な固体担体と接触させ、但しこの固定化
された尾は捕捉オリゴヌクレオチドの尾に相補性であり
、且つ2つの尾はハイブリダイゼーションして該3成分
複合体を固定化し:そして d)該固体担体上の検出しうるオリゴヌクレオチドの存
在を検出又は測定する、 標的の核酸配列を含む疑いのある試料中の該標的の存在
又は量を決定する方法。
的の配列の少くとも一部分に相補性の可溶な捕捉オリゴ
ヌクレオチド及び標的の配列の実質的に異なる部分に相
補性の可溶な検出しうるオリゴヌクレオチドを準備し、
但し捕捉オリゴヌクレオチドがそれに共有結合したホモ
ポリヌクレオチドの尾を有し: b)捕捉オリゴヌクレオチド、検出しうるオリゴヌクレ
オチド及び一重鎖の標的核酸を水溶液中において、可溶
な3成分ハイブリダイゼーション複合体を生成しうるハ
イブリダイゼーション条件下に混合し; C)該3成分複合体を、ホモポリヌクレオチドの尾が共
有結合した不溶な固体担体と接触させ、但しこの固定化
された尾は捕捉オリゴヌクレオチドの尾に相補性であり
、且つ2つの尾はハイブリダイゼーションして該3成分
複合体を固定化し:そして d)該固体担体上の検出しうるオリゴヌクレオチドの存
在を検出又は測定する、 標的の核酸配列を含む疑いのある試料中の該標的の存在
又は量を決定する方法。
2、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドが少くとも11の
ヌクレオチド長を有する上記lの方法。
ヌクレオチド長を有する上記lの方法。
3、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドが約l。
Oまでのヌクレオチド長を有する上記2の方法。
4、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドが隣接している或
いは1つ又はそれ以上のヌクレオチドで隔離されている
隣った標的配列に対して相補性である上記lの方法。
いは1つ又はそれ以上のヌクレオチドで隔離されている
隣った標的配列に対して相補性である上記lの方法。
5、検出しうるオリゴヌクレオチドがそれに共有結合し
た少くとも1つのレポータ分子を有する上記lの方法。
た少くとも1つのレポータ分子を有する上記lの方法。
6、レポータ分子が放射性、蛍光又は化学発光物質であ
る上記5の方法。
る上記5の方法。
7、検出しうるオリゴヌクレオチドがそれに共有結合し
た少くとも1つの検出しうるリガンドを有する上記lの
方法。
た少くとも1つの検出しうるリガンドを有する上記lの
方法。
8、リガンドがビチオン、酵素、抗体特異性抗原又は抗
原特異性抗体である上記7の方法。
原特異性抗体である上記7の方法。
9、レポータ分子が検出しうるオリゴヌクレオチドに共
有結合したポリヌクレオチドの尾に共有結合している上
記5の方法。
有結合したポリヌクレオチドの尾に共有結合している上
記5の方法。
IO,リガンドが検出しうるオリゴヌクレオチドに共有
結合したポリヌクレオチドの尾に共有結合している上記
7の方法。
結合したポリヌクレオチドの尾に共有結合している上記
7の方法。
11、ホモポリヌクレオチドの尾がポリA1ポリG1ポ
リC1ポリT及びポリUの尾からなる群から選択される
上記lの方法。
リC1ポリT及びポリUの尾からなる群から選択される
上記lの方法。
12、標的の核酸がDNAである上記lの方法。
13、標的の核酸がRNAである上記1の方法。
14、ホモポリヌクレオチドの尾が少くとも50のヌク
レオチド長を有する上記lの方法。
レオチド長を有する上記lの方法。
15、ホモポリヌクレオチドの尾が5000までヌクレ
オチド長を有する上記14の方法。
オチド長を有する上記14の方法。
16、工程(b)に先立って或いは同時に、標的の核酸
を含む細胞を溶解し且つ標的の核酸を一重鎮形で与える
ように試料を処理する上記lの方法。
を含む細胞を溶解し且つ標的の核酸を一重鎮形で与える
ように試料を処理する上記lの方法。
17、固体支持体がシリカ系、多糖類又はプラスチック
物質である上記lの方法。
物質である上記lの方法。
18、多糖類がセルロース物質である上記17の方法。
19、セルロース物質が濾紙の形である上記18の方法
。
。
20、RNA配列
5’ ACCGCAUAAGAACUUUGGUUC
GCAUGAAUCAAAGUUGAAAGGACCU
GCAAGGGUUCGUUAUUUGAUGAGGG
UGCGCCAUAUCAGCUAGUUGGUGGG
GUAACGGCCUACCAAGGCA 3’の少
くとも一部分に相補性の配列を有する合成核酸グローブ
。
GCAUGAAUCAAAGUUGAAAGGACCU
GCAAGGGUUCGUUAUUUGAUGAGGG
UGCGCCAUAUCAGCUAGUUGGUGGG
GUAACGGCCUACCAAGGCA 3’の少
くとも一部分に相補性の配列を有する合成核酸グローブ
。
21、少くとも20の塩基を有する上記20のプローブ
。
。
22、グローブが1−150の゛付加的ヌクレオチドの
尾を有し、また付加的ヌクレオチドがRNA配列に相補
的な配列を形成しない上記20のプローブ。
尾を有し、また付加的ヌクレオチドがRNA配列に相補
的な配列を形成しない上記20のプローブ。
23、プローブの配列が
3’ GTATTCTTGAAACCAAGCGTAC
TTAGTTTCAAC5’ である上記20のプローブ。
TTAGTTTCAAC5’ である上記20のプローブ。
24、プローブの配列が
3’ CTGGACGTTCCCAGCAATAAAC
TACTCCCACGCGGT 5’ である上記20のプローブ。
TACTCCCACGCGGT 5’ である上記20のプローブ。
25、プローブの配列が
3’ CCAAGCGTACTTAGTTTCAAC
TTTCC5’である上記20のプローブ。
TTTCC5’である上記20のプローブ。
26、グローブの配列が
3’ TGGACGTTCCCAAGCAATAAAC
TACT 5’である上記20のグローブ。
TACT 5’である上記20のグローブ。
27、プローブの配列が
3’ ATAGTCGATCAACCACCCCATT
GCCGGATGGTTCCGT 5’ である上記20のプローブ。
GCCGGATGGTTCCGT 5’ である上記20のプローブ。
28、ハイブリダイゼーション分析において、マイコプ
ラズマ・ニューモニアエの163リポソームRNAに相
補性の少くとも1つの核酸プローブを用いて試料中の該
リポソームRNAの存在を固定する際に、上記20の少
くとも1つの合成核酸プローブを準備するマイコプラズ
マ・ニューモニアエ16SリポソームRNAの同定法。
ラズマ・ニューモニアエの163リポソームRNAに相
補性の少くとも1つの核酸プローブを用いて試料中の該
リポソームRNAの存在を固定する際に、上記20の少
くとも1つの合成核酸プローブを準備するマイコプラズ
マ・ニューモニアエ16SリポソームRNAの同定法。
29.1段のサンドウィッチ法ハイブリダイゼーション
分析において、マイコプラズマ・ニューモニアエの16
SリポソームRNAに相補性の2つの異なる核酸グロー
ブを用いて試料中の該リポ゛ソ−ムRNAの存在を同定
する際に、上記20の第1及びta2の合成核酸プロー
ブを準備するマイコプラズマ・ニューモニアエ165リ
ポソームRNAの同定法。
分析において、マイコプラズマ・ニューモニアエの16
SリポソームRNAに相補性の2つの異なる核酸グロー
ブを用いて試料中の該リポ゛ソ−ムRNAの存在を同定
する際に、上記20の第1及びta2の合成核酸プロー
ブを準備するマイコプラズマ・ニューモニアエ165リ
ポソームRNAの同定法。
30、第1及び第2のプローブが重複しない配列を有す
る上記29の方法。
る上記29の方法。
31、第1及びvg2のプローブが重複するが、重複し
ない配列も有する上記29の方法。
ない配列も有する上記29の方法。
32、第1及び第2のプローブが隣った配列であり、ま
たこの配列が隣接している或いは1つ又はそれ以上の塩
基で隔離されている上記29の方法。
たこの配列が隣接している或いは1つ又はそれ以上の塩
基で隔離されている上記29の方法。
336第1及び第2のプローブがそれぞれ少くともlO
の塩基を有する上記29の方法。
の塩基を有する上記29の方法。
34、プローブの1つが検出しうる標識を結合して有し
且つ他のプローブが不動性であり又は固体支持体に固定
化されている上記29の方法。
且つ他のプローブが不動性であり又は固体支持体に固定
化されている上記29の方法。
35、プローブの1つが配列
3’ GTATTCTTIII;AAACCAAGCG
TACTTAGTTTCAAC5’ を有する上記29の方法。
TACTTAGTTTCAAC5’ を有する上記29の方法。
36、プローブの1つが配列
3’ C丁GGACGTTCCCAAGCAATAA
ACTACTCCCACGCGGT 5’ を有する上記29の方法。
ACTACTCCCACGCGGT 5’ を有する上記29の方法。
37、プローブの1つが配列
3’ CCAAGCGTACTTAGTTTCAACT
TTCC5’を有する上記29の方法。
TTCC5’を有する上記29の方法。
38、プローブの1つが配列
3’ TGGACGTTCCCAAGCAATAAAC
TACT 5’を有する上記29の方法。
TACT 5’を有する上記29の方法。
39、プローブの1つが配列
3’ ATAGTCGATCAACCACCCCATT
GCCGGATC;GTTCCGT 5’ を有する上記29の方法。
GCCGGATC;GTTCCGT 5’ を有する上記29の方法。
40、ヌクレオチドの配列
5’ ACCGCAUAAGAACUUUGGUUCG
CAUGAAUCAAAGUUGAAAGGACCUG
CAAGGGUUCGUUAUUUGAUGAGGGU
GCGCCAUAUCAGC[rAGUIJGGUGG
GGUAACGGCCUACCAAGGCA 3’を有
するM、ニューモニアエの163rRNAからのRNA
フラグメントの少くとも一部分に相補性の核酸プローブ
。
CAUGAAUCAAAGUUGAAAGGACCUG
CAAGGGUUCGUUAUUUGAUGAGGGU
GCGCCAUAUCAGC[rAGUIJGGUGG
GGUAACGGCCUACCAAGGCA 3’を有
するM、ニューモニアエの163rRNAからのRNA
フラグメントの少くとも一部分に相補性の核酸プローブ
。
41、上記40の配列内に含まれる少くともlOの塩基
の配列を有する合成の核酸プローブ。
の配列を有する合成の核酸プローブ。
42、上記40の16S rRNAを転写するDNA
の少くとも一部に相補性である上記22のプローブ。
の少くとも一部に相補性である上記22のプローブ。
43、相補的配列が16S rRNA配列に対する鎖を
暗号するDNAの相補体とハイブリダイゼーションしう
る上記20のグローブに相補性の配列を有する合成の核
酸プローブ。
暗号するDNAの相補体とハイブリダイゼーションしう
る上記20のグローブに相補性の配列を有する合成の核
酸プローブ。
第1図は80の塩基の配列(これは本発明の115の塩
基の配列の一部である)及び相補的グローブ0DS55
及び0DS56の配列を示し、そして 第2図はMPROMAIと称せられるM、ニューモニア
エの16S rRNAの5′端の300の塩基の配列
を示す。 < い 特開平1=104200 (14)
基の配列の一部である)及び相補的グローブ0DS55
及び0DS56の配列を示し、そして 第2図はMPROMAIと称せられるM、ニューモニア
エの16S rRNAの5′端の300の塩基の配列
を示す。 < い 特開平1=104200 (14)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、a)標的の配列の少くとも一部分に相補性の可溶な
捕捉オリゴヌクレオチド及び標的の配列の実質的に異な
る部分に相補性の可溶な検出しうるオリゴヌクレオチド
を準備し、但し捕捉オリゴヌクレオチドがそれに共有結
合したホモポリヌクレオチドの尾を有し; b)捕捉オリゴヌクレオチド、検出しうるオリゴヌクレ
オチド及び一重鎖の標的核酸を水溶液中において、可溶
な3成分ハイブリダイゼーション複合体を生成しうるハ
イブリダイゼーション条件下に混合し; c)該3成分複合体を、ホモポリヌクレオチドの尾が共
有結合した不溶な固体担体と接触させ、但しこの固定化
された尾は捕捉オリゴヌクレオチドの尾に相補性であり
、且つ2つの尾はハイブリダイゼーションして該3成分
複合体を固定化し;そして d)該固体担体上の検出しうるオリゴヌクレオチドの存
在を検出又は測定する、 ことを特徴とする標的の核酸配列を含む疑いのある試料
中の該標的の存在又は量を決定する方法。 2、RNA配列 【遺伝子配列があります】 の少くとも一部分に相補性の配列を有する合成核酸プロ
ーブ。 3、ハイブリダイゼーシヨン分析において、マイコプラ
ズマ・ニユーモニアエ(Mycoplasmapneu
moniae)の16SリボソームRNAに相補性の少
くとも1つの核酸プローブを用いて試料中の該リボソー
ムRNAの存在を同定する際に、特許請求の範囲第2項
記載の少くとも1つの合成核酸プローブを準備するマイ
コプラズマ・ニユーモニアエ16SリボソームRNAの
同定法。 4、1段のサンドウイツチ式ハイブリダイゼーシヨン分
析において、マイコプラズマ・ニユーモニアエの16S
リボソームRNAに相補性の2つの異なる核酸プローブ
を用いて試料中の該リボソームRNAの存在を同定する
際に、特許請求の範囲第2項記載の第1及び第2の合成
核酸プローブを準備するマイコプラズマ・ニユーモニア
エ16SリボソームRNAの同定法。 5、ヌクレオチドの配列 【遺伝子配列があります】 を有するM.ニユーモニアエの16SrRNAからのR
NAフラグメントの少くとも一部分に相補性の核酸プロ
ーブ。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8873787A | 1987-08-24 | 1987-08-24 | |
US088737 | 1987-08-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01104200A true JPH01104200A (ja) | 1989-04-21 |
Family
ID=22213151
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63208462A Pending JPH01104200A (ja) | 1987-08-24 | 1988-08-24 | 核酸の検出方法及びそのためのプローブ |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0305145A3 (ja) |
JP (1) | JPH01104200A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000505305A (ja) * | 1996-02-28 | 2000-05-09 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasmapneumoniae)の増幅、検出および型別のためのプライマーおよびプローブ |
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---|---|---|---|---|
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US6270961B1 (en) * | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
WO1990010716A1 (en) * | 1989-03-10 | 1990-09-20 | Gene-Trak Systems | Immobilized oligonucleotide probes and uses therefor |
JP3046838B2 (ja) * | 1989-03-10 | 2000-05-29 | バイシス・インコーポレーテツド | 親和性捕捉法の妨害の防止 |
ATE140732T1 (de) * | 1989-05-31 | 1996-08-15 | Amoco Corp | Nukleinsäuresonden zum nachweis von chlamydia trachomatis und chlamydia psittaci |
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CA2032203C (en) * | 1989-12-29 | 2009-05-19 | Christine L. Brakel | Amplification capture assay |
WO1992015708A1 (en) * | 1991-02-27 | 1992-09-17 | Amoco Corporation | Methods for improving the sensitivity of hybridization assays |
US5552279A (en) * | 1991-03-22 | 1996-09-03 | Amoco Corporation | Nucleic acid probes for the detection of mycoplasma pneumoniae and mycoplasma genitalium |
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FR2687168B1 (fr) * | 1992-02-10 | 1994-03-25 | Bio Merieux | Fragment de l'adn genomique de streptococcus pneumoniae, sonde d'hybridation, amorce d'amplification, reactif et procede de detection de streptococcus pneumoniae. |
EP0576743B1 (en) * | 1992-06-04 | 1996-12-11 | Amoco Corporation | Nucleic acid probes for the detection of mycoplasma pneumoniae |
FR2694768B1 (fr) * | 1992-07-30 | 1994-12-23 | Pasteur Institut | Séquences d'oligonucléotides pour la détection spécifique de mollicutes par amplication de gènes conservés. |
US7713528B1 (en) | 1993-02-18 | 2010-05-11 | Enzo Therapeutics, Inc. | Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate |
US5656427A (en) * | 1994-08-29 | 1997-08-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid |
WO1996024378A2 (en) * | 1995-02-10 | 1996-08-15 | Worcester Foundation For Biomedical Research, Inc. | Delivery of exogenous compounds |
US5817463A (en) * | 1996-06-28 | 1998-10-06 | Abbott Laboratories | Nucleic acid primers and probes for detecting Mycoplasma pneumoniae |
US6893822B2 (en) | 2001-07-19 | 2005-05-17 | Nanogen Recognomics Gmbh | Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate |
US7855051B2 (en) | 2005-09-12 | 2010-12-21 | Research & Diagnostic Systems, Inc. | Mycoplasma detection method and composition |
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---|---|---|---|---|
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EP0139489A3 (en) * | 1983-09-26 | 1988-01-13 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Sandwich hybridization method for nucleic acid detection |
FI72146C (fi) * | 1985-01-02 | 1987-04-13 | Orion Yhtymae Oy | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
ATE110418T1 (de) * | 1986-06-25 | 1994-09-15 | Univ California | Nachweis von mykoplasma durch hybridisierung von dns. |
DE3752172T3 (de) * | 1986-11-24 | 2008-04-10 | Gen-Probe Inc., San Diego | Nukleinsäuresonden zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von nicht-viralen Organismen |
-
1988
- 1988-08-23 EP EP88307793A patent/EP0305145A3/en not_active Withdrawn
- 1988-08-24 JP JP63208462A patent/JPH01104200A/ja active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0305145A2 (en) | 1989-03-01 |
EP0305145A3 (en) | 1990-05-02 |
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