JPH01104200A - 核酸の検出方法及びそのためのプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２つの特異的及び可溶性のオリゴヌクレオチ
ド・プローブ（ｐｒｏｂｅ）を用いる核酸を検出するた
めの溶液内ハイブリダイゼーション法に関する。

更に本発明はマイコプラズマ・ニューモニアエ（Ｍｙｃ
ｏｐｌａｓｍａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に特異的で
あるＲＮＡ配列及びそれに相補性のプローブに関する。

このプローブは特に限られた反応しかしない或いは交叉
反応しない試料中のマイコプラズマ・ニューモニアエを
、特に他のマイコプラズマ種から検出する方法に使用し
うる。

ここに本明細書を通して種々の刊行物及び特許が参照さ
れる。これらの刊行物及び特許の開示の全体が、ここに
記述する且つ特許請求する本発明の日付は以前の同業者
には公知の技術状態を更に完全に記述するために本明細
書に参考文献として引用される。

核酸のハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ）法は２つの形式（ｆｏｒｍａｔ）、即ち溶液内
ハイブリダイゼーション及び固定化ハイブリダイゼーシ
ョンの１つを含みうる。溶液内ハイブリダイゼーション
では、プローブと試料核酸がハイブリダイゼーション中
溶液内で自由である。固定化ハイブリダイゼーションで
は試料又はプローブのいずれかがハイブリダイゼーショ
ン前に固定化されていて、ハイブリダイゼーションは不
溶性相で起こる。溶液内ハイブリダイゼーションを行な
う１つの方法は、ハイブリダイゼーションされたＤＮＡ
を選択的に結合させるために水酸化燐灰石を用いること
を含む。溶液内ハイブリダイゼーションに対する他の方
法は国際特許願公開第ＷＯ３４１０２７２１号に記述さ
れている。固定化ハイブリダイゼーションの例は米国特
許第４．３５８，５３５号［フォルコラ（Ｆ　ａｌｋｏ
ｗ）ら］に記述されている。

本方法において標的の核酸配列は、溶液内で２つの特異
的及び可溶なオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリ
ダイゼーションせしめられる。ここにこれらのグローブ
の１つはホモポリヌクレオチドの尾（ｔａｉｌ）を有し
ている。ハイブリダイゼーションが完了した後に始めて
、ハイブリダイゼーションした複合体を含む試料は不溶
性の固体担体と接触せしめられ且つ捕捉される。ここに
記述する捕捉技術は固体担体上の相補的ホモポリヌクレ
オチドの尾及び捕捉オリゴヌクレオチドを利用するもの
である。

ｍＲＮＡを含むポリアデニル酸（ポリＡ）を捕捉するた
めにポリウリジル酸（ポリＵ）被覆紙を用いることは、
レシュナ−（Ｗ　ｒｅｓｃｈｎｅｒ）、Ｄ、Ｈ，ら、ヌ
クレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、■、１３４９〜１３
５９（１９８４）；こ記述されている。ポリシチジル酸
（ポリＣ）プローブを捕捉するためにポリデオキシグア
ニル酸（ポリｄＧ）セルロース担体を用いるハイブリダ
イゼーション法は、ベリー（Ｖ　ａｒｙ）、Ｃ，Ｐ。

Ｈ３ら、タリフ・ケム（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、）、３２
（９）、１６９６〜ｌ　７０１（１９８６）に記述され
ている。

べり−らによる方法は、信号核酸鎖（ｓｔｒａｎｄ）を
標的鋼で代替する競争的ハイブリダイゼーション分析を
含む。用いる信号核酸鎖は標的核酸に対して相補性でな
く、３元ハイブリダイゼーション複合体の生成がない。

斯くしてこの記述される方法は、サンドウィッチハイブ
リダイゼーション分析を含まない。更に記述される検出
法は標識を、不溶化された固体担体上よりも溶液中で検
出することを含む。

本方法は溶液内で起こるサンドウィッチハイブリダイゼ
ーション分析を含む。３元Ｑｅｒｎａｒｙ）又は３成分
０ｒｉｐａｒｔｉｔｅ）ハイブリダイゼーション複合体
が溶液内で生成し、標的ＤＮＡは固体担体上の凛識又は
レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）分子を検出することに
よって検知される。本方法はいずれかの種の核酸含有有
機体を検出するのに有用である。特に本方法はマイコプ
ラズマ・ニューモニアエラ検出するのに有用である。

マイコプラズマ属は約５ＸＩＯｊダルトンというゲノム
の大きさを有する最小の自由に生育する原始核有機体を
表わす多種類の有機体を包含する。

マイクプラズマはその小さい大きさのために、十分に発
育したコロニーが肉眼での同定には小さすぎ、同定が非
常に困難である。

人間の病気を引き起こすことが証明された唯一のマイク
プラズマ種は、通常［ウオーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）
肺炎」として言及される非定形の肺炎、即ち普通致命的
でないが診断の難しい病気の病固体であるＭ、ニューモ
ニアエである。病気の初期に適切な抗生物質治療剤を投
与するためには、Ｍ。

ニューモニアエをできるだけ早く診断することが望まし
い。

微生物の検出に対してＤＮＡグローブを用いることは十
分に確立されているが、長い塩基の配列を標的として用
いないならば、感度が悪くなる。

そのような方法は非常に大きい、即ち長さが５００以上
の塩基のＤＮＡプローブを使用することを必要とする。

これは大きいＤＮＡプローブが合成法によって効果的に
製造するのに適当でなく、また費用と時間のかかる組換
えＤＮＡ技術によって製造しなければならないから欠点
となる。他の欠点は大きいプローブが多くの異なる核酸
の配列に対する相補的核酸配列を有しがちであるから特
異性に欠けることである。最後に組換え技術で作られる
プローブは多くの異なる核酸を含む複雑な生物学的混合
物から単離及び精製しなければならない。そのような工
程は長たらしく、純粋でないかも知れないプローブを低
収率で与える。

マイコプラズマのいろいろな種を、マイコプラズマのリ
ポソームＲＮＡ配列に相補性のＤＮＡプローブを利用す
るハイブリダイゼーション分析によって検出する方法は
記述されている。例えばグベル（Ｇｂｅｌ）、Ｕ、Ｂ、
ら、サイエンス（Ｓ　Ｃ１ｅｎｃｅ）、２２６．１２１
１−１，２１３（１９８４）及びラジン（Ｒａｚｉｎ）
、Ｓ、ら、イスル・ジエイ・メト・サイ（Ｉ　ｓｒ、　
Ｊ　、Ｍｅｄ、Ｓ　ｃｉ、）、２０．７５８〜７６１（
１９８４）を参照。これらの方法は約１ｏｏｏ又はそれ
以上の塩基の単一のゲノム壽プローブを使用する。その
ような大きいゲノム・プローブは合成的に合成するのが
難しく、一般に大腸菌（Ｅ、ｃ。

１ｉ）宿主細胞中で分校することによって製造しなけれ
ばならない。更にこれらの方法はいずれか１つのマイコ
プラズマ種に特異的でなく、従って種間交叉反応の問題
により複雑となる。

本発明の目的は化学的に合成するのに適したプローブを
提供することにより組換えＤＮＡ技術への依存性を回避
することである。

一般に有機体中に含まれるリポソームＤＮＡに相補性の
ＤＮＡプローブを用いることにより微生物を検出する方
法は国際特許出願公開（ＷＯ）第８４１０２７２１号に
教示されている。これらの方法は単一の大きいＤＮＡグ
ローブを利用する。第８４１０２７２１号は、有機体の
単一群のｒＲＮＡを検出するためにそのｒＲＮＡ配列の
特別なフラグメントに相補性のプローブを使用し、これ
によってこの群に特徴な１つ又はそれ以上の有機体の存
在を検出する溶液内ハイブリダイゼーション法を記述し
ている。しかしながら、教示されている方法は種特異性
でない。

ＤＮＡプローブを用いるマイコプラズマ・バイオリンズ
（ｈｙｏｒｈｉｎｓ）の種特異的検出は、テーラ−（Ｔ
ａｙｌｏｒ）、Ｍ、Ａ、ら、イスル・ジエイ・メト・サ
イ、−λ」−１７７８〜７８０（１９８４）に記述され
た。この方法はゲノムＤＮＡフラグメントを、リポソー
ムＲＮＡの保存された配列に相補性の単一のＤＮＡプロ
ーブとして使用した。記述されている最小のプローブは
３０００以上の塩基を含んだ。

Ｍ、ニューモニアエ及びＭ、ゲニタリウム（ｇｅｎ　ｉ
　ｔａｌｉｕｍ）のｒＲＮＡに特異的なりＮＡプローブ
はラジン、Ｓ、ら、ＩＯＭ第６第６除 ８６年８月２６〜３１日（Ｂ　ｉｒｍｉｎｇｈａｍ，　
Ａ　ｌａｂａｍａ）、８１頁に報告されている。用いる
プローブはゲノム収集から選択されたるゴベル、Ｕ．ら
はＭ．ニューモニアエ及びＭ．ゲニタリウムの両方と反
応する長さが塩基２０〜３０の合成オリゴヌクレオチド
の使用を報告した（止揚、８２頁）。

本発明の目的はＭ．ニューモニアエに特異的なオリゴヌ
クレオチド・プローブを提供することである。ここに特
異的なＭ．ニューモニアエのリポソームＲＮＡ配列に相
補性の少くとも１つのプローブを利用するＭ．ニューモ
ニアエに特異的なハイブリダイゼーション法が提供され
る。このプローブは、それを合成法で製造するのに適当
ならしめる大きさのものである。

１段のサンドウィッチ式ハイブリダイゼーション分析に
よって微生物の核酸を同定する方法は［両方ともランキ
（Ｒａｎｋｉ）らによる］　米国特許第４。

５６３、４１９号及び第４．４８６．５３９号に記述さ
れている。この方法は一般に標的の一重鎖の微生物核酸
を、一方が固体担体に結合し且つ他が検出しうる標識を
もつ２つの異なる相補的核酸グローブとハイブリダイゼ
ーションさせることを含む。同様の方法はバータネン（
Ｖ　１ｒｔａｎｅｎ）、Ｍ．ら、ランセット（　Ｌ　ａ
ｎｃｅｔ）、上（８３２１）、３８１〜３８３（１９８
３）、及びランキ、Ｍ．ら、ジエン（　Ｇ　ｅｎｅ）、
−乳」−１７　７　〜８　５（１　９　８　３）にも記
述されている。これらの方法は、組換えＤＮＡ技術を用
いて製造しなければならない大きいプローブを使用し且
つそれが種特異的でないという欠点を有する。

本発明は合成オリゴヌクレオチド・プローブを用いるＭ
．ニューモニアエに特異的な改良された１段サンドウィ
ッチ式ハイブリダイゼーション分析を提供する。

本発明は標的の配列を含む疑いのある試料における標的
核酸配列の存在又は量を決定する方法を提供する。本方
法を行なうために、標的核酸配列の異なる部分に相補性
である可溶性のオリゴヌクレオチド・プローブを提供す
る。また共有結合したホモポリヌクレオチド尾を有する
可溶性の捕捉オリゴヌクレオチドを提供する。更に捕捉
オリゴヌクレオチドよりも標的の配列の実質的に異なる
部分に相補性である可溶な検出しうるオリゴヌクレオチ
ド・プローブを提供する。捕捉オリゴヌクレオチド、検
出しうるオリゴヌクレオチド及び一重鎖の標識核酸をハ
イブリダイゼーション条件下に水溶液中で混合し、可溶
性の３成分ハイブリダイゼーション複合体を生成せしめ
る。次いでこの３成分複合体を、共有結合したホモポリ
ヌクレオチド尾を有する不溶性の固体支持体と接触させ
る。

固定化されたホモポリヌクレオチド尾は捕捉オリゴヌク
レオチドの尾に相補性である。従って捕捉オリゴヌクレ
オチドの尾は固定化された尾とハイブリダイゼーション
し、３成分複合体が固定化される。次いで固体支持体上
の検出しうるオリゴヌクレオチドを検出し或いは測定す
る。

本発明はＭ．ニューモニアエに特異的な１６ＳｒＲＮＡ
及びこのＲＮＡ配列に相補性の゛核酸プローブも提供す
る。

更に本発明はハイブリダイゼーション分析において、マ
イコプラズマ・ニューモニアエのリポソームＲＮＡの試
料中における存在を同定するための改良された方法を提
供する。この方法はＭ．ニューモニ，アエの１６ＳｒＲ
ＮＡに相補性の少くとも１つの合成核酸プローブを利用
する。ここに各配列は本発明のｒＲＮＡ配列の少くとも
一部分に相補性である。

Ｍ．ニューモニアエを特に検出する本方法は、Ｍ．ニュ
ーモニアエの１５ｓｒＲＮＡの塩基の特異的配列の発見
に依存している．Ｍ．ニューモニアエ及びＭ．ゲニタリ
ウムに特異的である１１５の塩基の配列が与えられる。

この配列をハイブリダイゼーション分析における１つ又
はそれ以上のオリゴヌクレオチドやグローブに対する標
的として用いる場合、過去の方法では見られなかった高
度の特異性と感度が達成される。過去の方法は種々のマ
イコプラズマ種間の区別法を教示していない。過去の方
法は大きな非特異的グローブと種間の多くの交叉反応と
に依存して多くの欠点を有した。本発明はいくつかがＭ
、ニューモニアエに特異的である短い合成プローブを使
用し、他のマイコプラズマ種との交叉反応を減じ又は排
除することによって過去の技術の欠点を回避する。

第１図は８０の塩基の配列（これは本発明の１１５の塩
基の配列の一部である）及び相補的プローブ０ＤＳ５５
及び０ＤＳ５６の配列を示す。

第２図はＭＰＲＤＮＡＩと称せられるＭ、ニューモニア
エの１６ｓｒＲＮＡの５′端の３００の塩基の配列を示
す。

本発明の溶液内ハイブリダイゼーション法は定性的又は
定量的でありうる。即ちそれは標的核酸の試料中におけ
る存在を単に検出するために使用でき、或いは標的核酸
の試料中における量を決定するために使用してもよい。

試験する試料はいずれかの生物学的物質例えば血液、血
漿、唾液、尿、粘液、脳せき髄液を含む生物学的体液；
いずれかの環境物質例えば水又は土壌；そして食品に由
来するいずれかの物質に由来していてよい。

標的核酸配列はいずれかの核酸、即ちＤＮＡ又はＲＮＡ
を含む有機体例えば病原体を含むバクテリヤ；ウィルス
；菌例えばイースト菌及びプロトシアン（ｐｒｏｔｏｓ
ｏａｎ）からのものであってよい。標的の核酸配列はＤ
ＮＡ又はＲＮＡのいずれかであってよく、それはそれが
由来する特別な有機体の特徴となる。斯くして特別な核
酸配列の検出は試験試料中の有機体の検出に相当する。

本発明の捕捉及び検出オリゴヌクレオチド・グローブは
長さが１１〜約１００のヌクレオチドである。プローブ
は標的核酸中の相補的配列と効果的にハイブリダイゼー
ションするために少くとも１１のヌクレオチドの長さで
あるべきである。プローブ中の少くとも１１の連続した
ヌクレオチド残基がハイブリダイゼーションする限りに
おいて、全体のプローブの配列が標的配列とハイブリダ
イゼーションする必要は必ずしもない。斯くして２つの
グローブはある部分部分において重複すればよく、成功
したサンドウィッチ分析がもたらせられる。しかしなが
らプローブは、隣接するか或いは１つ又はそれ以上のヌ
クレオチドによって隔離されている隣る標的の配列に相
補的であり、斯くして実質的にすべてのプローブを標的
配列とハイブリダイゼーションせしめることが好適であ
る。

ここにハイブリダイゼーションとは相補的塩基が対を作
ることである。

本方法を用いるホモポリヌクレオチドは単一のヌクレオ
チドのホモポリマーである。適当なホモポリヌクレオチ
ド°はポリウリジル酸（ポリＵ）、ポリアデニル酸（ポ
リＡ）、ポリチミジル酸（ポリＴ）、ポリグアニル酸（
ポリＧ）及びポリシチジル酸（ポリＣ）である。また対
応するデオキシリボヌクレオチドも、即ちポリアデニル
酸の代りにポリデオキシアデニル酸も使用しうる。捕捉
オリゴヌクレオチド及び固体支持体上の尾（ｔａｉｌ）
は少くとも約５０の、但し約５０００までのヌクレオチ
ド長、好ましくは１００〜１０００の範囲のヌクレオチ
ド長を有する。捕捉オリゴヌクレオチド上のホモポリヌ
クレオチド尾は固体担体上のホモポリヌクレオチド尾に
相補的である。好ましくは捕捉オリゴヌクレオチドの尾
はポリＡであり、固体支持体上の尾はポリＵである。こ
こに尾つけ（ｔａｉｌｉｎｇ）又は尾とはヌクレオチド
配列の、核酸配列の端への付加に関するものである。尾
はオリゴヌクレオチド・プローブ端の３′端に、酵素タ
ーミナル・トランスフェラーゼを用いて付加することが
できる。また尾は適当な化学的又は酵素的手段により、
例えば酵素ＤＮＡリガーゼを用いて５′端に付加させて
もよい。好ましくは尾は３′端に付加される。酵素ター
ミナル・トランスフェラーゼを用いる尾付は法は核酸ハ
イブリダイゼーション技術において良く知られている。

ハイブリダイゼーションが起こりうる前に、標的の核酸
配列はその配列を含む有機体から除去しなければならず
、そしてその配列は一重鎮形としていなければならない
。標的核酸はそれを含む有機体から、有機体の、適当な
へ剤或いは蛋白質分解及び／又は加水分解酵素での溶解
によって除去しうる。溶解した細胞からの標的の核酸は
一重鎮形である必要があり、これは標準的な技術例えば
加熱、ｐＨの変化、水性媒体の誘電定数の減少、或いは
尿、アミド又は同様の溶質への露呈によって、ＤＮＡを
変性することにより達成することができる。ここに変性
とは、二重鎖の核酸の相補的ストランドの分離である。

ハイブリダイゼーションに十分な量が提供されるかぎり
において、核酸分子は全部が又は一部が変性されていて
よい。核酸がすでに実質的に一重鎮形である、例えば一
重鎖のリポソーム、メツセンジャー及び転写ＲＮＡであ
る場合には、特別な変性工程は必要ない。用いる溶解／
変性溶液は捕捉の及び検出しうるオリゴヌクレオチドを
含有していてよい。次いで標的の核酸を含む試料を試料
採取箇所で添加し、続いて貯蔵するか、直ぐに分析する
のが簡便である。

必要とされる唯一の更なる工程は不溶化された支持体と
の接触及び洗浄によるハイブリダイゼーションしてない
物質の除去であろう。

ハイブリダイゼーションを起こさせるために、３成分ハ
イブリダイゼーション複合体を生成させるのに十分な時
間プローブ及び標的配列を特定の温度に保温しなければ
ならない。ハイブリダイゼーションに必要とされる時間
の長さは用いる条件例えばグローブの濃度、標的核酸配
列の濃度及び用いる条件に特徴的なハイブリダイゼーシ
ョン速度と共に変化する。核酸配列のハイブリダイゼー
ションを達成するのに必要とされる条件はマニアチス（
Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ、ら、分子クローニング：研究
室的手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　
Ａ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コー
ルド・スプリング・ハーバ−出版（Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐ　ｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）（
１９８２）に示されている。

本発明の方法で用いる検出しうるオリゴヌクレオチドは
分子に共有結合せしめたレポータ（ｒｅｐｏｔｅｒ）分
子によって検出しうる。レボータ分子は検出しうるいず
れかの分子例えば放射性分子、蛍光分子又は化学発光分
子であってよい。レポータ分子は相補的オリゴペプチド
に直接結合させてよく、或いはオリゴヌクレオチドにポ
リヌクレオチド尾を介して直接結合させ、後者を順次検
出しうるオリゴヌクレオチドに共有結合させてもよい。

検出しうるオリゴヌクレオチドは分子に共有結合した特
別なリガンドによって検出することもできる。

適当なリガンドはビオチン、検出しうる色の変化を示す
酵素、抗体特異的抗原又は抗原特異的抗体である。この
リガンドは検出しうるオリゴヌクレオチドに直接結合さ
せることができ、或いはオリゴヌクレオチドに、共有結
合させたポリヌクレオチド尾を介して共有結合してもよ
い。またリガンドは化学的なスペーサ・アーム（ｓｐａ
ｃｅｒ　ａｒｍ）を通して結合させてもよい。ポリヌク
レオチド尾はホモポリマー或いはホモコポリマー、即ち
２種だけのヌクレオチド、例えばアデニンとウラシル又
はグアニンとチミンを交互又はランダム配列で有する核
酸鎖であってよい。

３成分複合体を捕捉するために用いる不溶性の固体支持
体はシリカ系、多糖類、又はプラスチック物質であるこ
とができる。この固体支持体を、支持体に共有結合する
ホモポリヌクレオチド尾で被覆する。この固体支持体は
ビーズ、ミクロ粒子、マクロ粒子、ミクロカ価つェノ呟
ゲル又は濾紙の形態をとっていてよい。好適な具体例で
は、固体支持体は多糖類物質例えばセルロース物質から
、好ましくは濾紙の形で作られる。可溶性の３成分複合
体を、濾紙の固体支持体を通して濾過する方法は、３成
分複合体を不溶化し且つこの複合体をハイブリッドを形
成してない成分から分離するための簡便な手段を提供す
る。次いで不溶化した３成分複合体を濾紙上で簡便に洗
浄することができる。

本発明は次のＭ、ニューモニアエ１６ｓｒＲＮＡの１１
５の塩基のヌクレオチド配列に相補性の核酸プローブを
提供する： ５’　ＡＣＣＧＣＡＵＡＡＧＡＡＣＵＵＵＧＧＬＩＵＣ
ＧＣＡＵＧＡＡＵＣＡＡＡＧＵＵＧＡＡＡＧＧＡＣＣＵ
ＧＣＡＡＧＧＧＵＵＣＧＵＵＡＵＵＵＧＡＵＧＡＧＧＧ
ＵＧＣＧＣＣＡＵＡＵＣＡＧＣＵＡＧＵＵＧＧＵＧＧＧ
ＧＵＡＡＣＧＧＣＣＵＡＣＣＡＡＧＧＣＡ　３’但し式
中のＡ、Ｃ，Ｇ及びＵはそれぞれ塩基アデニン、シトシ
ン、グアニン及びウラシルを表わす。

更に１１５の塩基の配列を越えて第２図の３００の塩基
配列の他の部分（即ち塩基１〜１５７及び２７３〜３０
０）に拡大するグローブの配列は本発明の範囲内である
と考えられる。また本発明はＤＮＡ又はチミン塩基が各
ウラシル塩基で代替された１１５の塩基のＲＮＡ配列の
転写同等物も提供する。この転写同等物は工５ｓ　　ｒ
ＲＮＡを転写するＤＮＡに相当する。１１５の塩基配列
のｒＲＮ’Ａ配列又はその７ラグメントはそれ自体１６
Ｓ　　ｒＲＮＡを転写するＤＮＡ鎖、即ち二重鎖ＤＮＡ
のコード類に相補性の核酸プローブとして使用しうる。

１１５の塩基配列の少くとも一部分に相補性である核酸
配列はＭ、ニューモニアエを検出するためのオリゴヌク
レオチド・グローブとして有用である。２つのそのよう
なプローブは以下の如き０ＤＳ５５　（３３量体）及び
０ＤＳ５６　（３７量体）である： ＱＤＳ５５　： ３’　ＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＴＡＣ
ＴＴＡＧＴＴＴＣＡＡＣ５’ 及び ０ＤＳ５６　： ３’　ＣＴＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡ
ＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＴ　５’ １６’ｓ　　ｒＲＮＡ配列と０ＤＳ５５及び０ＤＳ５６
との間の相補的関係は第１図に示しである。

更に、本発明のオリゴヌクレオチド・プローブは、それ
ぞれ１１５の塩基配列に相補性であって、次のように表
わされる０ＤＳ−５９（２６量体）、０ＤＳ−６０（２
６量体）又は０ＤＳ−８１（３７量体）を有していても
よい： ０ＤＳ−５９： ３’　ＣＣＡＡＧＣＧＴＡＣＴＴＡＧＴＴＴＣＡＡＣＴ
ＴＴＣＣ５’０ＤＳ−６０： ３’　ＴＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣ
ＴＡＣＴ　５’及び０ＤＳ−８１： ３’　ＡＴＡＧＴＣＧＡＴＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴ
ＧＣＣＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＧＴ５’適当な厳しいハイ
ブリダイゼーション条件下において、０ＤＳ−５５，０
ＤＳ−５９及び０ＤＳ−８１はＭ、ニューモニアエに特
異的であるが、Ｍ。

ゲニタリウムと交叉反応しないことが決定された。

プローブ○ＤＳ−５６及び○ＤＳ−６０はＭ、ゲニタリ
ウム並びにＭ、ニューモニアエと反応した。

本発明のプローブは効果的なハイブリダイゼーションを
保証するために少くともｌＯの塩基を有する。プローブ
の相補的部分は約５０の塩基長までであってよい。また
グローブは例えば「尾付け」によって共有結合した補足
的な非相補性塩基配列を有していてもよい。この「尾付
け」した領域は検出しうる標識又は固体支持体を結合さ
せるために使用しうる。プローブは１つ又はそれ以上の
結合した検出しうる標識を有していてもよい。更に、プ
ローブは固定化でき（例えば順次固体支持体によって捕
捉しうるビオチン又はいくつかの他のハプテンつなぐ）
或いは固体支持体に固定される。

本発明のプローブは試料中のＭ、ニューモニアエ１６ｓ
リポツムＲＮＡの存在を同定するための方法に使用しう
る。そのような方法の場合、リポソームＲＮＡに相補的
な少くとも１つのプローブがハイブリダイゼーション分
析において使用しうる。このグローブは本発明の１１５
の塩基ＲＮＡの少くとも一部分に相補的であることが好
ましい。

本発明のプローブは、試料中のＭ、ニューモニアエ１６
ＳリポソームＲＮＡの存在を同定するためのサンドウィ
ッチ式ハイブリダイゼーション分析においても使用しう
る。サンドウィッチ法では、リポソームＲＮＡの異なる
部分に相補的な本発明の２つのオリゴヌクレオチド・プ
ローブが１段ハイブリダイゼーション分析において利用
される。

各グローブは１１５の塩基のＲＮＡ配列の少くとも一部
分に相補的である配列を有する。０ＤＳ５５１０ＤＳ８
１又は０ＤＳ５９１０ＤＳ８１の組合せは、これらのプ
ローブの各がＭ、ニューモニアエと特異的に反応し且つ
その組合せが重複しないから二重グローブ分析において
有用でありうる。

サンドウィッチ分析法において、グローブは重複又は非
重複のいずれであってもよい。ハイブリダイゼーション
を最大にするためには、プローブが非重複である、即ち
相補的な塩基配列の重複がないことが好適である。非重
複であるならば、プローブの配列は標的のｒＲＮＡ配列
に沿って互いに隣っており、そしてプローブは第１図に
示すように隣接して或いは１つ又はそれ以上の塩基によ
って分離していてよい。プローブが重複ならば、即ちそ
れらが１６Ｓ　　ｒＲＮＡ上の塩基の同一の配列の少く
とも一部分に相補性であるならば、このプローブは依然
サンドウィッチ分析法に使用できるが、ハイブリダイゼ
ーションは最大とならないであろう。

サンドウィッチ分析法の利点は、それぞれプローブが試
料内に存在する他の有機体と交叉反応しうるから、両プ
ローブに依存して最大の特異性を提供しうろことである
。そのような交叉反応性は標的分子を検出するために、
両グローブが該分子と相互作用することに依存して有利
に回避される。

即ちプローブの１つだけが交叉反応性によって標的と非
特異的に反応するならば、他のプローブが同一の標的と
交叉反応しないであろうから、信号は得られない。この
ようにして試験の特異性は保持されよう。

固定型のハイブリダイゼーション分析の場合、サンドウ
ィッチ分析の実際の機作は、固体支持体に固定化された
１つのグローブと検出しうる標識又は「レボータ」物質
で標識された（又はレボータが特異的に結合しうるリガ
ンドでつながった）他のプローブとを含んでなる。「固
定化」及び「レポータ」の両グローブの一緒になった結
合だけが正の信号を与える。

利用される検出しうる標識又はレポータ分子は検出しう
るいずれの分子であってもよい。そのような検出しうる
分子の例は放射性同位体例えば３２Ｐ１蛍光分子例えば
ＦＩＴＣ，染料における色の変化をもたらす酵素例えば
西洋ワサビのペルオキシダーゼ、光散乱粒子及び化学発
酵触媒である。

他の適当な標識は酵素、蛍光分子又は他の検出しうる分
子をつなげた特別な蛋白質に結合しうるリガンドである
。

本発明のグローブを固定化しうる固体支持体はいずれか
のシリカ系、多糖類又は重合体物質であってよい。適当
な固体支持体は多糖類物質例えばセルロース及びアガロ
ース、或いは重合体物質例えばラテックスから作ること
ができる。更に微孔性表面例えばニトロセルロース紙、
並びにガラス繊維フィルター及び調節された多孔性ガラ
スも使用しうる。１つの具体例において、ストレプトア
ビジン（５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で被覆されたアガ
ロース・ビーズはビオチニル化プローブを固定化するた
めに使用される。他の具体例において、アガロース・ビ
ーズは付着したビオチニル化オリゴ（ｏｌｉｇｏｓ）を
有することができ、また被覆されたビーズはストレプト
アビジン−西洋ワサビのペルオキシダーゼ複合体と反応
させることができる。

本発明のプローブはゲノムＤＮＡ又はＲＮＡに由来する
よりもむしろ合成的に製造される。本発明のオリゴヌク
レオチド・プローブを化学的に合成する方法は技術的に
良く知られている。１つのそのような方法は米国特許第
４．４５８．０６６号［カルサース（Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）ら］に記述されているホスホルアミダイト法である
。他の方法はＡ。

アマルナス（Ａ　ｍａｒｎａｔｈ）ら、サム・レブ（Ｃ
ｈｅｍ。

Ｒｅｖ、　）　７ヱ、１８３〜２１７　（１９７７）に
記述されている。本発明の好適なプローブは、本明細書
に記述する如き１１５の塩基の配列に相補性の比較的短
い、例えば２０〜５０のヌクレオチド・オリゴマーであ
り、従って自動化されたＤＮＡ合成装置によって効果的
に作ることができる。グローブは付加的なヌクレオチド
、例えば塩基５０００までの、ビオチンで標識したヌク
レオチドの尾を有していてよい。プローブの化学的合成
は、天然起源から遺伝子情報を分離且つ精製するという
困難な組換え法に依存するよりも特別なヌクレオチド配
列を有する精製されたグローブを多数且つ容易に製造す
ることを可能にする。

本発明のプローブを製造するためには、Ｍ、ニューモニ
アエ１（５Ｓ　　ｒＲＮＡの部分的な配列を得、この配
列を確認した。１５ｓ　　ｒＲＮＡの配列の決定法は、
レーン（Ｌａｎｅ）　、Ｄ、Ｌ　、ら、ブロク・ナトル
ーアカド・サイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、）　、８２，６９５５〜６９５９　（１９８
５年８月）に例示されるように技術的に良く知られてい
る。特に、１６Ｓ　　ｒＲＮＡの５′端における３００
の塩基の配列を得、１１５の塩基の配列を確めた。この
ＭＰＲＤＮＡＩと称せられる配列を第２図に示す。

１１５の塩基の配列を決定するために、ＭＰＲＤＮＡｌ
配列を、近親のバクテリヤ種の他の公知の１６５　　ｒ
ＲＮＡの配列と共に配列相同分析において使用した。マ
イコプラズマ種の間には殆んど検出しえない塩基の相同
が存在すること並びにＭ、ニューモニアエがＭ、ゲニタ
リウムを除いて他のマイコプラズマのいずれにも関係な
いように見えることは公知である［スギノ（Ｓ　ｕｇｉ
ｎｏ）、Ｗ、Ｍ、ら、ジエイ・ゲン・ミクロ（Ｊ　、　
Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ、）　、　　１　２　１．　３３
３〜３３８　　（１９８０）　　コ　。

事実Ｍ、ニューモニアエはＭ、ゲニタリウムと高度の相
同を共有している。しかしながらＭ、ニューモニアエは
いくつかの他のマイコプラズマよりもグラム陽性バクテ
リヤと密接に関連している。

それ故に、グラム陽性バクテリヤ、枯草菌（Ｂ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）の１６ｓ　　ｒＲＮＡの配列を分析に用い
、そして他のマイコプラズマ種、Ｍ、カプリコラム（ｃ
ａｐｒｉｃｏｌｕｍ）の報告されている１６５　　ｒＲ
ＮＡ配列を利用した。系統発生学的にＭ、ニューモニア
エから遠いダラム陰性バクテリヤ、大腸菌の１６５　　
ｒＲＮＡを参照配列として用いた。

Ｍ、カプリコラムの配列はイヮミ（Ｉ　ｗａｍｉ）、Ｍ
、ら、モル・ゲン・ゲネト（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、）、１９６．３１７〜３２２　（１９８４）に
よって決されているようにｌ　９９２ｂｐ　ｄｓ−ＤＮ
Ａ配列であった。枯草菌の配列は、スチュヮート（Ｓ　
ｔｅｗａｒｔ）　、Ｃ、Ｐ　、ら、ヌクル拳アシド昏レ
ス（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、）　、１土、６
２８９〜６３００　（１９８３）が法案じたように１１
７２ｂｐｄｓ−ＤＮＡ配列であった。大腸菌の配列はニ
ーレスマン（Ｅ　ｈｒｅｓｍａｎｎ）　、Ｃ、ら、フェ
ブス参しト　（ＦＥＢＳ　　　　Ｌｅｔｔ、）　　、　
８４ユ、　３３７〜３４１（１９７７）；カーボン（Ｃ
ａｒｂｏｎ）ら、フェブ〜・レト、１１．１５２〜１５
６　　（１９７８）；及びカーボンら、ニール・ジェイ
・パイオヶム（Ｅｕｒ、　　Ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍ、）　　１００．３９９〜４１０（１９７９）によっ
て法案されているように１５４１ｂｐｒＲＮＡ配列であ
った。

次の実施例は本発明を例示する。ここに本発明はこれら
の実施例によってで、はなく、特許請求の範囲だけによ
って限定されるものと考える。

実施例１ 単一プローブを用いるドツト・プロット（ｄｏｔ　ｂｌ
ａｔ）ハイブリダイゼーション分析 感染した患者ののどを拭いてＭ、ニューモニアエの臨床
的試料を採取した。３２Ｐで標識した０ＤＳ−５６を用
いる簡単なドツト・プロット・ハイブリダイゼーション
分析により２１５の試料を試験した。分析の結果は５つ
の試料がＭ、ニューモニアエであることを示した。これ
らの５つの陽性試料は、培養によりＭ、ニューモニアエ
であることが確められた。この分析の方法は次の通りで
ある： のどの拭きとりによって単離された細胞中に存在する１
６Ｓ　　ｒＲＮＡを、粘膜を含む各拭きとりからの液体
を拭き取り物から流出させた後にフェノールで抽出した
。各抜き取り物から流出された液体を、約０．１Ｍへペ
ス、ｐＨ７，４を飽和させたフェノール１００μαと混
合した。この混合物ヲマイクロヒュージュ（ｍｉｃｒｏ
ｆｕｇｅ）中で滴流回転し、上澄液を除去した。この工
程を上澄液についてもう１回繰返した。

この上澄液を５ＭＮａＣ＜２の１７１０容量と混合し、
渦流させ、マイクロヒユーシュで処理し、上澄液を除去
し、ペレットを残した。上澄液をエーテルで２回抽出し
た。エーテルを除去し、管内に水性相を残した。この残
った下相を遠心分離蒸発機で乾燥して残留するエーテル
を除去した。

５ＳＰＥと言われる水性緩衝液を続く工程で使用した。

この５ＳＰＥはＮａＣＱ　ｌ　７４ｇ、ＮａＨ。

ｐｏ、−Ｈ，ｏ　　２７．６ｇ、ＥＤＴＡ　　７．４ｇ
を添加し、ｐＨをＮａＯＨで７．４に調節してＩαの容
量で調製した。他のＦ／Ｓと言われる使用した水溶液は
容量比２０　：　３０の３７％ホルムアルデヒド：５Ｓ
ＰＥであった。

抽出工程後に残る残渣をＦ／Ｓ　　１００μα中に最懸
濁し、渦流させ、そして６０℃に１５分間加熱した。室
温において１０ｘｓＳＰＥ２００μＱを混合し、そして
９６のウェルめドツト・プロッター（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ
ｔｅｒ）　　［シュライヒヤー・アンド・シュエル（Ｓ
　ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓ　ｃｈｕｅｌｌ）　
］を用いることにより予じめ濡らした［ジエン・スクリ
ーン”　（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ）　４　　［＝ニー
０イングランド０ヌクレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｎｕｃｌｅａｒ）　］ナイロン膜（Ｈｚ○、次いで２０
ＸＳＳＰＥで濡らす）を通して濾過した。試料をフィル
ターに結合せしめ、次いで液体を真空で吸引した。各ウ
ェルをｌ０ＸｓｓＰＥ１００μａで洗浄し、真空炉中８
０℃で１時間乾燥した。

乾燥後、濾過を、２５％ホルムアミド、４×５ＳＰＥ、
０．２％ＳＤＳ、ＩＸデン／１ルツ（Ｄ　ｅｎｈａｒｄ
ｔ）溶液及びｌ　ＯＯｐｇ／ｍＱ　ｔＲＮＡからなる予
備ハイブリダイゼーション溶液と３７°Ｃ下に０゜５時
間接触させた。次いで濾液を、３２Ｐで標識した０ＤＳ
５６　（３ｐモル；５ｍＱ中５０１２）を含有する同一
の混合物と接触させた。プロットを洗浄してＸ線フィル
ムにさらした。５つの陽性のドツトが得られた。これは
０ＤＳ５６がＭ、ニューモニアエ１６５　　ｒＲＮＡを
臨床試料から同定しうろことを示す。

実施例２ サンドウィッチ法ハイブリダイゼーション分析用いたサ
ンドウィッチ分析法の一般的な方法を以下に簡単に記述
する。

Ｍ、ニューモニアエ１６５　　ｒＲＮＡの隣った領域に
相補性のオリゴヌクレオチドに尾づけをして捕捉及び検
出オリゴヌクレオチド系を生成した。

ＲＮＡを捕捉し且つ固定するために捕捉オリゴヌクレオ
チドを生成せしめる目的で、０ＤＳ−５６にアデニル酸
の約１００〜２００残基（ポリＡ）を尾づけした。また
検出オリゴヌクレオチドとして用いるために、０ＤＳ−
８１にｄＣＴＰ及びビオチンａｕｒｐ　（５：　１）の
混合物を尾付けした。

ｒＲＮＡの補足は、ハイブリダイゼーションさせたオリ
ゴ（ｏｌｉｇｏ）　／　ＲＮ　Ａ複合体を、ポリＵの尾
を付けた濾紙［［ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）　Ｊ−□
ＡＰメツセンジャー親和親和性紙；アマハスハムｍｅｒ
ｓｈａｍ）　］中を通過させることによって行なった。

このメツセンジャー親和性紙は可逆的な具合にポリＡ含
有分子を結合したー。斯くして０ＤＳ−５６上のポリＡ
の尾は濾紙上のポリＵの尾とハイブリダイゼーションし
、この結果複合体が固定化された。ストレプトアビジン
−西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）［シグマ（
Ｓｉｇｔｎａ）　　；　０゜５　ｍｇ／　ｍＱの１／１
０００希釈、番号Ｓ−５５１２１を濾紙中を通過させ、
固定化されたビオチン（ＯＤＳ−８１上）に結合させ、
そして数回ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄し
く且つクエン酸塩メツウイーンで最終洗浄し）だ後、３
．３’、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
染色により検出した。ＴＭＢはＨＲＰに対する発色物質
である。

プローブ０ＤＳ−８１は、酵素ターミナル・トランスフ
ェラーゼ及び約２０％のビオチニル化ｄＵＴＰ　［ベセ
スダ・リサーチ研究所（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｓ）　、ビオチン−１１−ＵＴＰＩと残
りのｄＣＴ　Ｐを含むヌクレオチド混合物を用いること
により、３′端においてビオチンの尾がつケラレタ。０
ＤＳ−８１の１４７’１２（２５０ｐモル）を水２５８
μαに添加した。次いで１ＱｘＴｄＴ緩衝液４０μ（２
を、ｄｃＴＰ４μｍ２（４０ミリモル）、ビオチニル化
ｄＵＴＰ３１μＱ（１２，４ミリモル）及びターミナル
・トランスフェラーゼ［ファーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａ
ｃｉａ）　、Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ純度］６０／７１２と一緒
に添加した。この混合物を３７℃に４時間保温し、Ｇ−
５０セフアデツクス・カラムで精製した。○ＤＳ−５６
もｄＡＴＰ（ファーマシア）を用いて同様に尾付けした
。

用いたＭ、ニューモニアエはＭ、ニューモニア工の研究
室での培養から得た。細胞から抽出したｒＲＮＡ又はｒ
ＲＮＡを含む溶解した細胞混合物のいずれかを用いてサ
ンドウィッチ分析を行なった。

Ｍ、ニューモニアエの培養物（遅い対数相のもの）を、
培養物を含むＴ２５フラスコを２つ取り、そして成長媒
体を除去した後、ヘペスで緩衝した１％ＳＤＳ及び２５
ｍＭ　　ＤＴＴの１ｍＱを添加することにより溶解した
。次いで得られた混合物を、５０ｍＭビペス（Ｐｉｐｅ
ｓ）　、ｐＨ６，５８、及び０゜１％ＳＤＳで希釈して
、約１０１１細胞当量／ｍＱを得た。

用いた実際の工程は次の通りであった：約０．５％ドデ
シル硫酸リチウム、ｌｏｍＭ　　ＥＤＴＡ、２５ｍＭジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭ　　ＮａＭＥＳ
緩衝液（ｐＨ７，０）、０．１ｍｇ／ｍＱ　　ｔＲＮＡ
Ｓ　１０％デキストラン・サルフェート（ファーマシア
：分子量約５００．０００）、１ピコモルの尾づけした
０ＤＳ８１，０．２ピコモルの尾づけした０ＤＳ５６、
及び容量約２００μａの試料ＲＮＡ　（約１０−”モル
）を含有する試料を、約５８℃に１０分間保温した。５
．０ＭＬｉＣαを１／１０容量添加し、混合し、次いで
穏やかな真空（約０．２インチＨｇ）下にフィルターを
通して吸引した。この工程は凡そ５〜１０分間かかっＩ
こ　。

フィルターを（［意の工程として）真空下に、２．４Ｍ
テトラエチルアンモニウムクロライド（ＴＥＡＣＱ）１
０．５％７ウイー：／２０（７）２Ｘ５０μＱで洗浄し
た。これは不適当に生成したハイブリ°ツドを除去する
には必要な工程であった。ＴＥＡＣＩ２はＵ：Ａ結合を
融解することなしに不適当な二重鎖を融解する。次いで
フィルターを０．１Ｍ　　ＮａＣＱ２５０ｐＱ及び０．
１％ＳＤＳでゆすいだ。次に０．５μｇ／ｍＱのストレ
プトアビジン−ＨＲＰ溶液１００μαをフィルター中に
通過させた。

このフィルターを０．１Ｍ　　ＮａＣＱ及び０．１％Ｓ
ＤＳの３Ｘ２５０μαで洗浄した。次いでＯ，１ＭＮａ
ＣＱ、ｐＨ４，７のクエン酸ナトリウム緩衝液の洗浄溶
液をフィルター中を通した。

真空を止め、ＴＭＢ／緩衝液／パーオキサイド染色混合
物３０μＱをフィルターの上に置き、室温で約１０分間
放置（培養）した。次いでＴＭＢ溶液を水銀５〜ｌＯイ
ンチ下にフィルターを通して吸引することにより反応を
停止させた。ＴＭＢによる濾紙の染色は試料中における
Ｍ、ニューモニアエの存在を示した。色の変化は試料中
に存在するｒＲＮＡの量に依存して非常に明るい緑色か
ら非常に暗い緑色までであった。ハイブリダイゼーショ
ン混合物は全く粘稠で、フィルターをゆっくり通過した
。すべて他の洗浄物又は結合物（ＨＲＰ）は１分もかか
らずに通過した。

現在の分析検出限界はｒＲＮＡ１００アットモル（１０
−目）の範囲であり、或いは言い換えると本分析は１０
”個のＭ、ニューモニアエｒＲＮＡを検出することがで
きる。全分析は長いハイブリダイゼーション工程が必要
ないので約３０分以下に起こる。

以上本発明をある好適な具体例及び実施例を参考にして
記述してきた。しかし、同業者にはその明白なる変化が
想起されるであろうから、本発明はそれらに限定される
ものと考えるべきでない。

本発明の特徴及び態様は以下の通りである：１、ａ）標
的の配列の少くとも一部分に相補性の可溶な捕捉オリゴ
ヌクレオチド及び標的の配列の実質的に異なる部分に相
補性の可溶な検出しうるオリゴヌクレオチドを準備し、
但し捕捉オリゴヌクレオチドがそれに共有結合したホモ
ポリヌクレオチドの尾を有し： ｂ）捕捉オリゴヌクレオチド、検出しうるオリゴヌクレ
オチド及び一重鎖の標的核酸を水溶液中において、可溶
な３成分ハイブリダイゼーション複合体を生成しうるハ
イブリダイゼーション条件下に混合し； Ｃ）該３成分複合体を、ホモポリヌクレオチドの尾が共
有結合した不溶な固体担体と接触させ、但しこの固定化
された尾は捕捉オリゴヌクレオチドの尾に相補性であり
、且つ２つの尾はハイブリダイゼーションして該３成分
複合体を固定化し：そして ｄ）該固体担体上の検出しうるオリゴヌクレオチドの存
在を検出又は測定する、 標的の核酸配列を含む疑いのある試料中の該標的の存在
又は量を決定する方法。

２、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドが少くとも１１の
ヌクレオチド長を有する上記ｌの方法。

３、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドが約ｌ。

Ｏまでのヌクレオチド長を有する上記２の方法。

４、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドが隣接している或
いは１つ又はそれ以上のヌクレオチドで隔離されている
隣った標的配列に対して相補性である上記ｌの方法。

５、検出しうるオリゴヌクレオチドがそれに共有結合し
た少くとも１つのレポータ分子を有する上記ｌの方法。

６、レポータ分子が放射性、蛍光又は化学発光物質であ
る上記５の方法。

７、検出しうるオリゴヌクレオチドがそれに共有結合し
た少くとも１つの検出しうるリガンドを有する上記ｌの
方法。

８、リガンドがビチオン、酵素、抗体特異性抗原又は抗
原特異性抗体である上記７の方法。

９、レポータ分子が検出しうるオリゴヌクレオチドに共
有結合したポリヌクレオチドの尾に共有結合している上
記５の方法。

ＩＯ，リガンドが検出しうるオリゴヌクレオチドに共有
結合したポリヌクレオチドの尾に共有結合している上記
７の方法。

１１、ホモポリヌクレオチドの尾がポリＡ１ポリＧ１ポ
リＣ１ポリＴ及びポリＵの尾からなる群から選択される
上記ｌの方法。

１２、標的の核酸がＤＮＡである上記ｌの方法。

１３、標的の核酸がＲＮＡである上記１の方法。

１４、ホモポリヌクレオチドの尾が少くとも５０のヌク
レオチド長を有する上記ｌの方法。

１５、ホモポリヌクレオチドの尾が５０００までヌクレ
オチド長を有する上記１４の方法。

１６、工程（ｂ）に先立って或いは同時に、標的の核酸
を含む細胞を溶解し且つ標的の核酸を一重鎮形で与える
ように試料を処理する上記ｌの方法。

１７、固体支持体がシリカ系、多糖類又はプラスチック
物質である上記ｌの方法。

１８、多糖類がセルロース物質である上記１７の方法。

１９、セルロース物質が濾紙の形である上記１８の方法
。

２０、ＲＮＡ配列 ５’　　ＡＣＣＧＣＡＵＡＡＧＡＡＣＵＵＵＧＧＵＵＣ
ＧＣＡＵＧＡＡＵＣＡＡＡＧＵＵＧＡＡＡＧＧＡＣＣＵ
ＧＣＡＡＧＧＧＵＵＣＧＵＵＡＵＵＵＧＡＵＧＡＧＧＧ
ＵＧＣＧＣＣＡＵＡＵＣＡＧＣＵＡＧＵＵＧＧＵＧＧＧ
ＧＵＡＡＣＧＧＣＣＵＡＣＣＡＡＧＧＣＡ　　３’の少
くとも一部分に相補性の配列を有する合成核酸グローブ
。

２１、少くとも２０の塩基を有する上記２０のプローブ
。

２２、グローブが１−１５０の゛付加的ヌクレオチドの
尾を有し、また付加的ヌクレオチドがＲＮＡ配列に相補
的な配列を形成しない上記２０のプローブ。

２３、プローブの配列が ３’　ＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＴＡＣ
ＴＴＡＧＴＴＴＣＡＡＣ５’ である上記２０のプローブ。

２４、プローブの配列が ３’　ＣＴＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣ
ＴＡＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＴ　５’ である上記２０のプローブ。

２５、プローブの配列が ３’　　ＣＣＡＡＧＣＧＴＡＣＴＴＡＧＴＴＴＣＡＡＣ
ＴＴＴＣＣ５’である上記２０のプローブ。

２６、グローブの配列が ３’　ＴＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣ
ＴＡＣＴ　５’である上記２０のグローブ。

２７、プローブの配列が ３’　ＡＴＡＧＴＣＧＡＴＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴ
ＧＣＣＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＧＴ　５’ である上記２０のプローブ。

２８、ハイブリダイゼーション分析において、マイコプ
ラズマ・ニューモニアエの１６３リポソームＲＮＡに相
補性の少くとも１つの核酸プローブを用いて試料中の該
リポソームＲＮＡの存在を固定する際に、上記２０の少
くとも１つの合成核酸プローブを準備するマイコプラズ
マ・ニューモニアエ１６ＳリポソームＲＮＡの同定法。

２９．１段のサンドウィッチ法ハイブリダイゼーション
分析において、マイコプラズマ・ニューモニアエの１６
ＳリポソームＲＮＡに相補性の２つの異なる核酸グロー
ブを用いて試料中の該リポ゛ソ−ムＲＮＡの存在を同定
する際に、上記２０の第１及びｔａ２の合成核酸プロー
ブを準備するマイコプラズマ・ニューモニアエ１６５リ
ポソームＲＮＡの同定法。

３０、第１及び第２のプローブが重複しない配列を有す
る上記２９の方法。

３１、第１及びｖｇ２のプローブが重複するが、重複し
ない配列も有する上記２９の方法。

３２、第１及び第２のプローブが隣った配列であり、ま
たこの配列が隣接している或いは１つ又はそれ以上の塩
基で隔離されている上記２９の方法。

３３６第１及び第２のプローブがそれぞれ少くともｌＯ
の塩基を有する上記２９の方法。

３４、プローブの１つが検出しうる標識を結合して有し
且つ他のプローブが不動性であり又は固体支持体に固定
化されている上記２９の方法。

３５、プローブの１つが配列 ３’　ＧＴＡＴＴＣＴＴＩＩＩ；ＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧ
ＴＡＣＴＴＡＧＴＴＴＣＡＡＣ５’ を有する上記２９の方法。

３６、プローブの１つが配列 ３’　　Ｃ丁ＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＡ
ＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＧＣＧＧＴ　５’ を有する上記２９の方法。

３７、プローブの１つが配列 ３’　ＣＣＡＡＧＣＧＴＡＣＴＴＡＧＴＴＴＣＡＡＣＴ
ＴＴＣＣ５’を有する上記２９の方法。

３８、プローブの１つが配列 ３’　ＴＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣ
ＴＡＣＴ　５’を有する上記２９の方法。

３９、プローブの１つが配列 ３’　ＡＴＡＧＴＣＧＡＴＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴ
ＧＣＣＧＧＡＴＣ；ＧＴＴＣＣＧＴ　５’ を有する上記２９の方法。

４０、ヌクレオチドの配列 ５’　ＡＣＣＧＣＡＵＡＡＧＡＡＣＵＵＵＧＧＵＵＣＧ
ＣＡＵＧＡＡＵＣＡＡＡＧＵＵＧＡＡＡＧＧＡＣＣＵＧ
ＣＡＡＧＧＧＵＵＣＧＵＵＡＵＵＵＧＡＵＧＡＧＧＧＵ
ＧＣＧＣＣＡＵＡＵＣＡＧＣ［ｒＡＧＵＩＪＧＧＵＧＧ
ＧＧＵＡＡＣＧＧＣＣＵＡＣＣＡＡＧＧＣＡ　３’を有
するＭ、ニューモニアエの１６３ｒＲＮＡからのＲＮＡ
フラグメントの少くとも一部分に相補性の核酸プローブ
。

４１、上記４０の配列内に含まれる少くともｌＯの塩基
の配列を有する合成の核酸プローブ。

４２、上記４０の１６Ｓ　　ｒＲＮＡを転写するＤＮＡ
の少くとも一部に相補性である上記２２のプローブ。

４３、相補的配列が１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列に対する鎖を
暗号するＤＮＡの相補体とハイブリダイゼーションしう
る上記２０のグローブに相補性の配列を有する合成の核
酸プローブ。

【図面の簡単な説明】

第１図は８０の塩基の配列（これは本発明の１１５の塩
基の配列の一部である）及び相補的グローブ０ＤＳ５５
及び０ＤＳ５６の配列を示し、そして 第２図はＭＰＲＯＭＡＩと称せられるＭ、ニューモニア
エの１６Ｓ　　ｒＲＮＡの５′端の３００の塩基の配列
を示す。 ＜　い 特開平１＝１０４２００　（１４）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）標的の配列の少くとも一部分に相補性の可溶な
   捕捉オリゴヌクレオチド及び標的の配列の実質的に異な
   る部分に相補性の可溶な検出しうるオリゴヌクレオチド
   を準備し、但し捕捉オリゴヌクレオチドがそれに共有結
   合したホモポリヌクレオチドの尾を有し； ｂ）捕捉オリゴヌクレオチド、検出しうるオリゴヌクレ
   オチド及び一重鎖の標的核酸を水溶液中において、可溶
   な３成分ハイブリダイゼーション複合体を生成しうるハ
   イブリダイゼーション条件下に混合し； ｃ）該３成分複合体を、ホモポリヌクレオチドの尾が共
   有結合した不溶な固体担体と接触させ、但しこの固定化
   された尾は捕捉オリゴヌクレオチドの尾に相補性であり
   、且つ２つの尾はハイブリダイゼーションして該３成分
   複合体を固定化し；そして ｄ）該固体担体上の検出しうるオリゴヌクレオチドの存
   在を検出又は測定する、 ことを特徴とする標的の核酸配列を含む疑いのある試料
   中の該標的の存在又は量を決定する方法。 ２、ＲＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 の少くとも一部分に相補性の配列を有する合成核酸プロ
   ーブ。 ３、ハイブリダイゼーシヨン分析において、マイコプラ
   ズマ・ニユーモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕ
   ｍｏｎｉａｅ）の１６ＳリボソームＲＮＡに相補性の少
   くとも１つの核酸プローブを用いて試料中の該リボソー
   ムＲＮＡの存在を同定する際に、特許請求の範囲第２項
   記載の少くとも１つの合成核酸プローブを準備するマイ
   コプラズマ・ニユーモニアエ１６ＳリボソームＲＮＡの
   同定法。 ４、１段のサンドウイツチ式ハイブリダイゼーシヨン分
   析において、マイコプラズマ・ニユーモニアエの１６Ｓ
   リボソームＲＮＡに相補性の２つの異なる核酸プローブ
   を用いて試料中の該リボソームＲＮＡの存在を同定する
   際に、特許請求の範囲第２項記載の第１及び第２の合成
   核酸プローブを準備するマイコプラズマ・ニユーモニア
   エ１６ＳリボソームＲＮＡの同定法。 ５、ヌクレオチドの配列 【遺伝子配列があります】 を有するＭ．ニユーモニアエの１６ＳｒＲＮＡからのＲ
   ＮＡフラグメントの少くとも一部分に相補性の核酸プロ
   ーブ。