CN106896071A - 一种测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法 - Google Patents

一种测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对肥料中抑制剂作用效果的测定方法，具体来说是一种测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法。本发明通过加入一定量的脲酶溶液来加快含有脲酶抑制剂的稳定性肥料中尿素的水解速度，以基础肥料作为对照，经过一段时间的震荡培养，用对二甲氨基苯甲醛比色法测定稳定性肥料和对照肥料中尿素的残留质量，从而计算出两者的尿素残留差异率，来判断脲酶抑制剂的作用效果。本发明加入脲酶溶液，快速分解肥料中的尿素，缩短了检测时间，降低了传统方法中因土壤差异对检测结果带来的干扰。简化了操作步骤；方法准确度高，易操作；结果稳定可靠，重现性好。

Description

一种测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法
技术领域
本发明涉及对肥料中抑制剂作用效果的测定方法，具体来说是一种测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法。
背景技术
稳定性肥料是经过一定工艺加入脲酶抑制剂和(或)硝化抑制剂，施入土壤后能通过脲酶抑制剂抑制尿素的水解，和(或)通过硝化抑制剂抑制铵态氮的硝化，使肥效期得到延长的一类含氮素肥料(包括含氮的二元或三元肥料和单质氮肥)。在肥料的长效作用中，脲酶抑制剂起到了关键性作用，脲酶抑制剂是通过抑制脲酶的活性，间接地抑制脲酶对尿素的水解作用，其减缓了尿素向铵态氮的转化。因此，检验稳定性肥料中的脲酶抑制剂的抑制效果无疑非常重要。
目前，已建立了一系列的缓释肥料行业(或企业)的检测标准和检测方法(如土培法)，但存在着诸多弊端：诸如检测过程的稳定性和重现性较差、土壤脲酶活性难能达到统一标准、操作的程序繁杂且时间冗长、检测的影响因素不确定、不统一等等。
鉴于上述弊端，为了快捷而准确地对稳定性肥料进行评价，需要提供一种快速准确的测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法，将待测样品经缓冲液溶解室温下震荡，取溶解待测样品的滤液采用对二甲氨基苯甲醛比色法测定溶解待测样品的滤液中的尿素浓度，进而计算出待测样中的尿素含量(x)，由此计算出尿素残留量测定中样品的称样量(m1)；
根据上述样品的称样量(m1)，再次分别称取待测样品和对照样品，并向两种样品中分别加入风干土和脲酶溶液，而后分别于室温下震荡培养，取各培养液培养后滤液采用对二甲氨基苯甲醛比色法测定滤液中的尿素浓度，进而计算出待测样品中尿素残留量A和对照样品中尿素残留量B，待用；
由上述待测样品和对照样品中尿素残留量A、B的计算得到尿素残留差异率，进而得出待测样品中脲酶抑制剂抑制效果。
所述的稳定性肥料必须是含有一种或多种脲酶抑制剂的稳定性肥料；所述的脲酶抑制剂为在一段时间内通过抑制脲酶的活性，从而减缓尿素水解的一类物质，常用的脲酶抑制剂有NBPT、PPD、TPT、PT、HQ、TU、P-苯琨等。
对照样品的配制方法为，称取与试料中等氮、五氧化二磷、氧化钾百分含量的分析纯试剂作为对照样品，其中酰铵态氮肥的含量按实际测得的肥料中酰胺态氮含量计算，以尿素形式配入，铵态氮肥可使用磷酸一铵加入，不足的磷肥可使用氯化铵配入，钾肥可使用氯化钾。
所述风干土的加入量为尿素质量的10-20倍；脲酶溶液中加入量以脲酶计为尿素质量的3％-4％。
尿素残留差异率的计算：尿素残留差异率
其中：A——试料的尿素残留量，单位为毫克(mg)；B——对照样品的尿素残留量，单位为毫克(mg)。
所述缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制得到的pH为6.5的溶液。
所述样品的称样量(m1)以公式，计算。
所述尿素质量的测定使用对二甲氨基苯甲醛比色法。所述对二甲氨基苯甲醛分光光度法测定，吸取一定量的滤液，加入适量对二甲氨基苯甲醛显色剂，用蒸馏水定容至25mL后放置20min,用1cm比色皿在420nm波长处测定样品吸光度值，根据标准曲线的线性回归方程计算出尿素浓度C g/L，根据公式m＝6250×C计算出尿素质量m mg。
所述尿素标准曲线是以尿素浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，根据以不同浓度尿素标准溶液在显色剂对二甲氨基苯甲醛作用下于420nm波长处测得的吸光度，绘制标准曲线并得出线性回归方程。
所述风干土为按五点法采回的耕层土壤(0-20cm，pH值5.5-8.5)，风干，研磨，过1mm筛。
本发明所具有优点：
本发明方法能够快速准确的测定稳定性肥料中脲酶抑制剂的作用效果。该方法将脲酶引入监测体系中，加快了肥料中尿素的水解速度，使得添加了脲酶抑制剂的稳定性肥料对于尿素转化的抑制作用效果在短时间内表现出来，并通过尿素残留差异率这个指标准确的体现出来。本发明方法降低了传统方法中土壤差异对检测结果的干扰，检测效率高、准确度高、操作快捷简便，结果准确可靠，重现性好。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明通过加入一定量的脲酶溶液来加快含有脲酶抑制剂的稳定性肥料中尿素的水解速度，以基础肥料作为对照，经过一段时间的震荡培养，用对二甲氨基苯甲醛比色法测定稳定性肥料和对照肥料中尿素的残留质量，从而计算出两者的尿素残留差异率，来判断脲酶抑制剂的作用效果。本发明人为加入脲酶溶液，快速分解肥料中的尿素，缩短了检测时间，降低了传统方法中因土壤差异对检测结果带来的干扰。简化了操作步骤；方法准确度高，易操作；结果稳定可靠，重现性好。
试剂和材料
1)脲酶：巨豆酶，活性为1U/mg，-20℃冰箱内保存；脲酶溶液ρ＝0.15g/L：称取0.1500g活性为1U/mg的脲酶干粉，溶解于缓冲液中，用缓冲液定容至1000mL，现用现配。
2)对二甲氨基苯甲醛显色剂：准确称量2.0000g对二甲氨基苯甲醛溶于由10mL浓盐酸和100mL无水乙醇组成的混合液中，于棕色瓶中存放。
3)缓冲液：称取22.25g磷酸氢二钠和17.00g磷酸二氢钾溶解于800mL水中，定容至2L。
4)尿素标准溶液ρ＝0.5g/L：称取0.5000g尿素(分析纯)溶解于500mL水中，定容至1L，置于冰箱中4℃冷藏保存。
5)风干土：将未施过肥料两个月以上的耕层土壤(0-20cm，pH值5.5-8.5)按五点法采回实验室，风干，研磨，过1mm筛，混匀备用。
实施例1
1)称取约含0.5g尿素的试样m0g，置于250mL锥形瓶内，准确加入100mL缓冲液，于25℃恒温培养振荡器内(180r/min)振荡0.5h后取出过滤，吸取2.0mL滤液，用蒸馏水稀释至50mL。吸取10.0mL稀释后的滤液至25mL容量瓶内，加入10mL对二甲氨基苯甲醛显色剂，用蒸馏水定容。放置20min，待气泡完全消失后，用1cm比色皿，以试剂空白做参比，在420nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线的线性回归方程计算出尿素浓度C g/L。
尿素质量m(mg)的计算：
m—尿素质量，单位为毫克(mg)；
C—根据标准曲线的线性回归方程计算出尿素浓度，单位为克每升(g/L)；
25—显色体积，单位为毫升(mL)；
—稀释倍数；
—分取倍数。
尿素含量(x％)的计算：
其中：
x—尿素含量，单位为％；
m—尿素质量，单位为毫克(mg)；
m0—试样称样量，单位为克(g)；
1000—换算系数，毫克换算成克；
100—百分含量换算。
计算结果保留到小数点后一位。
三次平行，取平行测定结果的算术平均值为测定结果。
尿素残留量的测定中试料和对照样品的称样量m1(g)的计算：
其中：
m1—尿素残留量的测定中试料和对照样品的称样量，单位为毫克(mg)；
x—尿素含量，单位为％；
2)尿素标准曲线制作：分别吸取0.5g/L的尿素标准溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0mL，分别移至25mL容量瓶中，加10mL对二甲氨基苯甲醛显色剂，用蒸馏水定容。此尿素系列标准溶液尿素浓度分别为0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20g/L。放置20min，待气泡完全消失后，用1cm比色皿，在420nm波长处比色，测定吸光度，以尿素浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线并得出线性回归方程。
3)对照样品的配制：称取与试料中等氮、五氧化二磷、氧化钾百分含量的分析纯试剂作为对照样品，其中酰铵态氮肥的含量按实际测得的肥料中酰胺态氮含量计算，以尿素形式配入，铵态氮肥可使用磷酸一铵加入，不足的磷肥可使用氯化铵配入，钾肥可使用氯化钾。
4)尿素残留量的测定：分别称取m1g(前面根据尿素含量计算出的称样量)试料和对照样品，置于250mL锥形瓶中，在两个瓶中再分别加入5.00g风干土和0.15g/L的脲酶液(其中脲酶液是将活性为1U/mg的脲酶用缓冲溶液配制而成的)100mL，在37℃恒温振荡器(180r/min)中振荡5h后取出过滤。
5)吸取2.0mL滤液，用蒸馏水稀释至50mL。吸取5.0mL稀释后的滤液至25mL容量瓶内，加10mL对二甲氨基苯甲醛显色剂，用蒸馏水定容。放置20min，待气泡完全消失后，用1cm比色皿，以试剂空白做参比，在420nm波长处测定吸光度值，根据尿素标准曲线的线性回归方程计算出尿素残留量。
6)三次平行，取平行测定结果的算术平均值为测定结果。平行测定结果之间相对偏差不大于5.0％。
7)尿素残留差异率(dU)的计算：
其中：
A—稳定性肥料的尿素残留量，单位为毫克(mg)；
B—对照肥料的尿素残留量，单位为毫克(mg)。
计算结果保留到小数点后一位。
实施例2
试样样品为市场上收集的两种不同配方的稳定性肥料产品，这两个产品均含有脲酶抑制剂。1号样品配方为N-P2O5-K2O＝23-13-8；2号样品配方为N-P2O5-K2O＝26-12-10。用上述检测方法对这两种样品进行尿素含量及尿素残留差异率的测定。对检测结果进行分析，验证该方法的可靠性。
对这两种样品的具体分析步骤如下：
1)将收集到的1、2号样品分别研磨粉碎，过0.25mm筛，装袋备用。
2)分别称取约含0.5g尿素的试样样品1和2m0g，分别置于250mL锥形瓶内，分别准确加入100mL缓冲液，于25℃恒温培养振荡器内(180r/min)振荡0.5h后分别取出过滤，吸取2.0mL滤液，用蒸馏水稀释至50mL。分别吸取10.0mL稀释后的滤液至25mL容量瓶内，加入10mL对二甲氨基苯甲醛显色剂，用蒸馏水定容。放置20min，待气泡完全消失后，用1cm比色皿，以试剂空白做参比，在420nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线的线性回归方程计算出尿素浓度C g/L。
尿素质量m(mg)的计算：
m—尿素质量，单位为毫克(mg)；
C—根据标准曲线的线性回归方程计算出尿素浓度，单位为克每升(g/L)；
25—显色体积，单位为毫升(mL)；
—稀释倍数；
—分取倍数。
尿素含量(x％)的计算：
其中：
x—尿素含量，单位为％；
m—尿素质量，单位为毫克(mg)；
m0—试样称样量，单位为克(g)；
1000—换算系数，毫克换算成克；
100—百分含量换算。
计算结果保留到小数点后一位。
三次平行，取平行测定结果的算术平均值为测定结果。
尿素残留量的测定中试料和对照样品的称样量m1(g)的计算：
其中：
m1—尿素残留量的测定中试料和对照样品的称样量，单位为毫克(mg)；
x—尿素含量，单位为％；
3)尿素标准曲线制作：分别吸取0.5g/L的尿素标准溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0mL，分别移至25mL容量瓶中，加10mL对二甲氨基苯甲醛显色剂，用蒸馏水定容。此尿素系列标准溶液尿素浓度分别为0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20g/L。放置20min，待气泡完全消失后，用1cm比色皿，在420nm波长处比色，测定吸光度，以尿素浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线并得出线性回归方程。
4)对照样品的配制：称取与试料中等氮、五氧化二磷、氧化钾百分含量的分析纯试剂作为对照样品，其中酰铵态氮肥的含量按实际测得的肥料中酰胺态氮含量计算，以尿素形式配入，铵态氮肥可使用磷酸一铵加入，不足的磷肥可使用氯化铵配入，钾肥可使用氯化钾。
5)尿素残留量的测定：分别称取m1g(前面根据尿素含量计算出的称样量)试料和对照样品，置于250mL锥形瓶中，在两个瓶中再分别加入5.00g风干土和0.15g/L的脲酶液(其中脲酶液是将活性为1U/mg的脲酶用缓冲溶液配制而成的)100mL，在37℃恒温振荡器(180r/min)中振荡5h后取出过滤。
6)吸取2.0mL滤液，稀释至50mL。吸取5.0mL稀释后的滤液至25mL容量瓶内，加10mL对二甲氨基苯甲醛显色剂，用蒸馏水定容。放置20min，待气泡完全消失后，用1cm比色皿，以试剂空白做参比，在420nm波长处测定吸光度值，根据尿素标准曲线的线性回归方程计算出尿素残留量。
7)三次平行，取平行测定结果的算术平均值为测定结果。平行测定结果之间相对偏差不大于5.0％。
8)尿素残留差异率(dU)的计算：
其中：
A—稳定性肥料的尿素残留量，单位为毫克(mg)；
B—对照肥料的尿素残留量，单位为毫克(mg)。
计算结果保留到小数点后一位。
9)试验结果如下表1：
表1
从上表中的数据可以看出，对不同配方样品的尿素含量和尿素残留差异率的测定结果都有较高的的精密度，相对标准偏差均小于5％。按照本发明的检测方法，其尿素残留差异率均可以达到常规行业理想的检测标准。由此可以确认本方法稳定，重现性好，结果准确可靠。采用本检测方法是耐得住生产样品检验的。

Claims (6)

1.一种测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法，其特征在于：将待测样品经缓冲液溶解室温下震荡，取溶解待测样品的滤液,采用对二甲氨基苯甲醛比色法测定溶解待测样品的滤液中的尿素浓度，进而计算出待测样中的尿素含量(x)，由此计算出尿素残留量测定中样品的称样量(m1)；
根据上述样品的称样量(m1)，再次分别称取待测样品和对照样品，并向两种样品中分别加入风干土和脲酶溶液，而后分别于室温下震荡培养，取各培养液培养后滤液,采用对二甲氨基苯甲醛比色法测定滤液中的尿素浓度，进而计算出待测样品中尿素残留量A和对照样品中尿素残留量B，待用；
由上述待测样品和对照样品中尿素残留量A、B的计算得到尿素残留差异率，进而得出待测样品中脲酶抑制剂抑制效果。
2.按权利要求1所述的测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法，其特征在于：所述风干土的加入量为尿素质量的10-20倍；脲酶溶液中加入量以脲酶计为尿素质量的3％-4％。
3.按权利要求1所述的测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法，其特征在于：尿素残留差异率的计算：尿素残留差异率
其中：A——试料的尿素残留量，单位为毫克(mg)；B——对照样品的尿素残留量，单位为毫克(mg)。
4.按权利要求1所述的测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制得到的pH为6.5的溶液。
5.按权利要求1所述的测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法，其特征在于：所述样品的称样量(m1)以公式，计算。
6.按权利要求1所述的测定稳定性肥料中脲酶抑制剂抑制效果的方法，其特征在于：所述尿素标准曲线是以尿素浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，根据以不同浓度尿素标准溶液在显色剂对二甲氨基苯甲醛作用下于420nm波长处测得的吸光度，绘制标准曲线并得出线性回归方程。
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