CN108169189A

CN108169189A - 一种响应二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的比率荧光探针

Info

Publication number: CN108169189A
Application number: CN201711275538.3A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 马燕燕; 赵玉萍
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN108169189B

Abstract

本发明提供了一种快速检测二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的比率型荧光探针，化学名称为2‑（6‑（2‑苯并噻唑基）‑9‑乙基‑咔唑‑3‑基）‑7‑（二乙氨基）苯并吡喃盐。该探针可用于荧光检测溶液中二氧化硫/亚硫酸（氢）盐，其激发波长为370 nm，检测波长为425 nm和635 nm。该检测二氧化硫的比率型荧光探针，识别速度快，抗多种离子、氨基酸、活性氧的干扰，特异性好。

Description

一种响应二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的比率荧光探针

技术领域

本发明涉及一种快速检测二氧化硫的荧光探针，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

二氧化硫是大气中主要污染物之一，是衡量大气是否遭到污染的重要标志。二氧化硫一般通过呼吸道进入人体，由于其易溶于水，很多被阻塞在上呼吸道，进而形成其衍生物如亚硫酸、硫酸盐等，更加刺激了呼吸道，从而引发一系列的呼吸道疾病，但进入血液的二氧化硫仍可通过血液循环抵达肺部产生刺激作用。进入血液的二氧化硫能破坏酶的活力，从而明显地影响碳水化合物及蛋白质的代谢，而且对肝脏有一定的损害。动物试验证明，二氧化硫慢性中毒后，机体的免疫受到明显抑制。研究发现，暴露于高剂量的硫酸氢盐中，不仅是导致呼吸疾病，也与肺癌，心血管疾病的原凶，同时与许多神经系统疾病，如中风、偏头痛、阿尔兹海默症也有不可分的关系。亚硫酸氢盐和亚硫酸盐可作为食品添加剂，但是过量摄入将导致不良反应如低血压、腹泻、荨麻疹等。综上所述，实现二氧化硫及其衍生物的检测对环境保护和食品安全具有重要的意义。

近些年来，荧光传感技术已经越来越广泛地应用于阴离子、重金属、生物小分子以及一些有害气体的检测。与传统的分析检测方法相比，如分光光度法、色谱分析法和电化学分析法等，荧光光谱技术具有其独特的优点，如灵敏度高，选择性好，响应速度快，操作简便，最重要的一点是，荧光光谱技术可用于生物体内细胞成像及目标物的实时检测。目前已经开发的荧光探针主要包括有机分子，生物分子以及纳米材料等。由于环境及食品的成分复杂，且其中二氧化硫及其衍生物的含量低，因而急需开发一种灵敏度高、选择性好且成本低的方法，用于快速测定二氧化硫含量。目前，针对检测二氧化硫的分子荧光探针已有文献报道，但这些常见的荧光探针多有背景干扰、响应时间较长、散射干扰等缺陷，这样很容易受环境及浓度的影响，导致测量数据误差大。

发明内容

针对现有检测二氧化硫的分子荧光探针响应时间较长、易受环境及浓度的影响等问题，本发明提供一种快速检测二氧化硫的比率型荧光探针；本发明还提供了上述荧光探针的制备方法和在检测溶液中二氧化硫/亚硫酸（氢）盐中的用途。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种快速检测二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的比率型荧光探针，化学名称为2-（6-（2-苯并噻唑基）-9-乙基-咔唑-3-基）-7-（二乙氨基）苯并吡喃盐，简称为TCaP，其结构式为如式（I）所示：

式(I)。

所述荧光探针的阴离子基团优选为高氯酸离子。

一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）咔唑、氢化纳和溴乙烷在DMF中反应，分离得化合物9-乙基-9H-咔唑（1）：

；

（2）9-乙基-9H-咔唑（1）、POCl₃和DMF在N₂保护下于CHCl₃中反应。分离、提纯得3-甲酰基-9-乙基-9H-咔唑（2）：

；

（3）2-邻氨基苯硫酚和3-甲酰基-9-乙基-9H-咔唑（2）在偏亚硫酸钠存在下在DMF中反应，经分离、重结晶得化合物（3）：

；

（4）化合物3与乙酸酐在三氯化铝存在下于DMF中反应，分离、纯化得3-乙酰基-9-乙基-9H-咔唑噻唑（4）：

；

（5）3-乙酰基-9-乙基-9H-咔唑噻唑（4）和4-二乙氨基水杨醛在浓硫酸中反应，分离、纯化得2-（6-（2-苯并噻唑基）-9-乙基-咔唑-3-基）-7-（二乙氨基）苯并吡喃盐：

。

所述步骤（1）中，咔唑（1）、溴乙烷（2）和氢化纳（3）的摩尔比为5:25:3。

所述步骤（2）中，9-乙基-9H-咔唑（1）、POCl₃和DMF的摩尔比为1:1:3。

所述步骤（3）中，2-邻氨基苯硫酚和3-甲酰基-9-乙基-9H-咔唑（2）的摩尔比为2:1。

所述步骤（4）中，化合物3与乙酸酐的摩尔比为2:3。

所述步骤（5）中，3-乙酰基-9-乙基-9H-咔唑噻唑（4）与4-二乙氨基水杨醛的摩尔比为7:5。

步骤（1）中所述分离步骤为将反应体系倒入水中，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液干燥后，减压蒸除乙酸乙酯。

步骤（2）中所述分离、纯化步骤为将反应体系滴加到冰水中，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，减压除去乙酸乙酯后，柱层析纯化；层析淋洗剂为石油醚:二氯甲烷=1:10。

步骤（3）中所述分离、重结晶步骤为将冰水加入反应体系中，析出沉淀，抽滤，干燥后在甲醇中重结晶。

步骤（4）中所述分离步骤为将反应体系滴加到冰水中，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层后，减压除去乙酸乙酯，柱层析纯化；层析淋洗液为二氯甲烷:甲醇=50:1。

步骤（5）中所述分离步骤为向反应体系中加入高氯酸，然后滴加蒸馏水，减压过滤，所得固体水洗、干燥后，柱层析纯化；层析淋洗剂为二氯甲烷:甲醇=20:1。

上述荧光探针在检测溶液中二氧化硫/亚硫酸（氢）盐中的应用。

所述检测溶液中二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的应用中，激发波长为370nm，检测波长为425nm和635nm。

本荧光探针的检测机理如下：

本发明的荧光探针以噻唑-咔唑为荧光母体，苯并吡喃盐作为SO₂反应的活性中心，制备含有碳碳双键的近红外探针，根据迈克尔加成反应，二氧化硫容易进攻不饱和Ｃ＝Ｃ键，荧光发射发生紫移。在不存在亚硫酸（氢）盐时，该荧光探针的发射波长为红光（645 nm）；当存在亚硫酸（氢）盐时，与活性中心发生亲核加成，所发射的荧光为近紫外光（425 nm）。

本发明具有以下优点：

本发明的检测二氧化硫的比率型荧光探针识别速度极快，同时，消除了背景、环境、浓度的干扰，抗多种离子、氨基酸、活性氧的干扰，特异性好。对检测环境及生物体系中的二氧化硫具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为探针TCaP的¹H NMR谱和¹³C NMR谱；

图2为探针TCaP对不同浓度二氧化硫响应的吸收光谱；

图3为探针TCaP对不同浓度二氧化硫响应的荧光光谱；

图4为TCaP探针检测亚硫酸氢钠的动力学测定；

图5为TCaP探针对干扰物质与亚硫酸氢钠的荧光强度比；

图6为TCaP探针识别二氧化硫的稳定性。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 快速检测二氧化硫的比率型荧光探针的合成

（1）化合物9-乙基-9H-咔唑(1)的合成

；

在室温下，将咔唑（1.67 g，10 mmol）和氢化纳（240 mg，10 mmol），加入装有6 mL DMF的烧瓶中，搅拌1.5小时后，滴加溴乙烷（5.4 g，50 mmol），室温搅拌2小时，将反应体系倒入150 mL冰水中，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层后，减压除去乙酸乙酯，得到白色针状状的化合物9-乙基-9H-咔唑，产率87%。该产物无需提纯，直接进行下一步反应。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.16 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.0 Hz,2H), 7.46 (m, 2H), 7.20 (m, 2H), 4.44 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.31 (t, J = 7.2Hz, 3H)。

（2）化合物3-甲酰基-9-乙基-9H-咔唑（2）的合成

；

量取DMF（1.80 mL，25.3 mmol）于三口烧瓶中，N₂保护，缓缓向其中滴加POCl₃，冰浴搅拌直至液体变成浅红色，且粘稠的状态。然后加溶于CHCl₃中的化合物1（5 g，25 mmol）于反应瓶，室温搅拌0.5小时后，回流反应12h。反应结束后，将反应体系滴加到200 mL冰水中，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层后，减压除去乙酸乙酯，柱层析纯化，得到浅黄色固体3-甲酰基-9-乙基-9H-咔唑，产率83%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ = 10.07(s, 1H), 8.78 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.01 (dd, J ₁ =8.6 Hz, J ₂ = 1.4 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H),7.56 (m, 1H), 7.32 (m, 1H), 4.53 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.35 (t, J = 7.0 Hz,3H)。

（3）化合物3的合成

；

2-邻氨基苯硫酚（24 mmol, 2.52 mL）与化合物 2（12 mmol, 2.78 g）溶于50 mL DMF中，偏亚硫酸钠（Na₂S₂O₅, 2.40 g）加入上述混合溶液中。反应体系回流4小时后，降至室温。200 mL冰水加入体系中，析出沉淀，抽滤，烘干后粗产品甲醇重结晶，得到暗黄色化合物3（产率为91%）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.93 (s, 1H), 8.39 (d, J = 7.6 Hz,1H), 8.21 (dd, J ₁= 8.6, J ₂ = 1.8 Hz, 1H), 8.14 (m, 1H), 8.05 (d, J = 7.6 Hz,1H), 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.55 (m, 2H), 7.44(m, 1H), 7.28 (m, 1H), 4.52 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.36 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。

（4）化合物3-乙酰基-9-乙基-9H-咔唑噻唑（4）的合成

；

称量化合物3（2g，6 mmol）于反应瓶，加入8 mL DCM，搅拌下加入三氯化铝（1.6 g，10mmol），室温搅拌0.5小时后，0 ℃下滴加乙酸酐（918 mg，9 mmol），室温搅拌6小时，将反应体系滴加到200 mL 冰水中，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层后，减压除去乙酸乙酯，柱层析纯化，得到白色固体3-乙酰基-9-乙基-9H-咔唑噻唑，产率90%。¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆), δ = 9.16 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 9.12 (d, J = 1.6 Hz, 1H),8.28 (dd, J ₁ = 8.6 Hz, J ₂ = 1.8 Hz, 1H), 8.15 (m, 2H), 8.06 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.55 (m, 1H), 7.46(m, 1H), 4.56 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.74 (s, 3H), 1.38 (t, J = 7.0 Hz, 3H)。

（5）化合物TCaP的合成

；

称量化合物4（500 mg，1.35 mmol）和4-二乙氨基水杨醛（386 mg，1 mmol）于3 mL浓硫酸中，90℃下加热搅拌2小时后，向反应体系中加入3 mL 70%的高氯酸，然后慢慢向反应体系中滴加蒸馏水，析出大量固体，减压过滤，水洗真空干燥后，粗产物经过柱色谱提纯（使用二氯甲烷和甲醇为淋洗剂），得到蓝紫色固体，即本发明所述探针TCaP，产率：75%。探针TCaP的氢谱和碳谱如图1中a）和b）所示。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 9.37 (s, 2H), 8.40(d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.28 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 8.15 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.06(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.76 (m, 6H), 7.42 (s, 1H), 7.25 (d, J = 9.6 Hz, 1H),4.49 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.79 (dd, J ₁= 13.7 Hz, J ₂= 6.8 Hz, 4H), 1.55 (t, J =7.0 Hz, 3H), 1.45 (t, J = 7.0 Hz, 6H). ¹³C (101 MHz, CDCl₃) 173.52, 167.57,156.55, 147.62, 145.14, 144.71, 140.37, 132.16, 130.43, 128.64, 128.31,128.16, 127.34, 124.39, 123.93, 122.92, 122.78, 122.03, 121.66, 118.67,118.03, 117.80, 116.84, 111.52, 111.13, 110.16, 108.23, 96.95, 46.59, 38.88,13.64, 12.28。

实施例2 化合物TCaP比率型荧光探针识别二氧化硫的吸收光谱测试

配制浓度为1 mM的实施例1中荧光探针TCaP的乙腈母液：量取适量的本发明所述检测二氧化硫的荧光探针TCaP于5 mL容量瓶中，并加适量CH₃CN，用HEPES缓冲液（10 mM，pH=7.4）定容待用，其中含体积分数为20%的CH₃CN。

量取上述探针母液于12支试管中，其中1支试管中加入等量水，剩余加入不同浓度的亚硫酸氢钠溶液，使探针终浓度为10 μM，亚硫酸氢钠溶液终浓度为1 µM、2 µM、4 µM、6 µM、8 µM、10 µM、12 µM、14 µM、16 µM、18 µM、20 µM。进行吸收光谱测试，如图2所示：随着亚硫酸氢钠浓度的增加，370 nm处的吸收峰逐渐增加，570 nm处的吸收峰逐渐降低，当亚硫酸氢钠浓度达到20 μM时，反应体系吸收峰值基本不再发生变化。

实施例3 化合物TCaP比率型荧光探针识别二氧化硫的荧光光谱测试

配制亚硫酸氢钠终浓度为0-20 μM，探针终浓度为10 μM的溶液，具体浓度与配制方法如实施例2，进行荧光检测（λ_ex= 370 nm）。得各试管中的荧光强度值，如图3所示：随着亚硫酸氢钠浓度的增加，425 nm处的荧光强度逐渐增加，635 nm处的荧光强度逐渐降低，当亚硫酸氢钠浓度达到20 μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态。

实施例4 化合物TCaP比率型荧光探针的选择性

配制浓度为100 mM的各种不同离子，氨基酸和活性氧/活性氮溶液作为备用。

将亚硫酸钠，亚硫酸氢钠和不同干扰物质的溶液与探针配制成溶液，干扰物质终浓度为20 μM，探针终浓度为10 μM，摇匀后进行荧光检测（λ_ex= 370 nm），建立荧光强度与各干扰物质的柱状图，如图4所示：其中1-23号加入的离子分别是：探针NC-SO₂，氯化钙，氯化钴，硫酸铜，半胱氨酸，硫酸亚铁，硫酸铁，谷胱甘肽，过氧化氢，碘化钾，亚硝酸钠，次氯酸钠，过氧化叔丁基，硫酸锌，硝酸钠，2,5-二甲基-2,5-二(叔丁基过氧基)己烷，氟化钠，氯化镁，叠氮化钠，硫氰酸钾，硫氢化钠，亚硫酸钠，亚硫酸氢钠。由图4可知，荧光探针TCaP对各干扰离子、氨基酸和活性氧/活性氮荧光响应值低，对亚硫酸氢钠的I₄₂₅/I₆₃₅比值高，特异性好、抗干扰性能好。其他离子或氨基酸对探针TCaP的荧光几乎没有影响，能够选择性的识别二氧化硫。

实施例5 化合物TCaP识别二氧化硫的动力学测试

按照实施例2中所述方法配制亚硫酸氢钠终浓度为20 μM，探针终浓度为10 μM的溶液，立即进行荧光检测（λ_ex= 370 nm），并每隔3s测定一次，记录425nm与635nm处荧光强度，测定1min，建立荧光强度比值随时间的变化曲线，如图5所示：加入亚硫酸氢钠后，比率值（I₄₂₅/I₆₃₅）在5 s达到平衡，说明该探针能够快速识别二氧化硫。

实施例6 化合物TCaP识别二氧化硫的稳定性测试

按照实施例2中所述方法配制亚硫酸氢钠终浓度为20 μM，探针终浓度为10 μM的溶液，立即进行荧光检测（λ_ex= 370 nm），并每隔5min测定一次，记录425nm与635nm处荧光强度，测定60min，建立荧光强度比值随时间的变化曲线，如图6所示：探针TCaP在1 h具有较好的稳定性，而且加入亚硫酸氢钠后，比率值（I₄₂₅/I₆₃₅）在1 h内没有变化，说明该探针及识别二氧化硫后具有良好的稳定性。

Claims

1.一种快速检测二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的比率型荧光探针，化学名称为2-（6-（2-苯并噻唑基）-9-乙基-咔唑-3-基）-7-（二乙氨基）苯并吡喃盐，其结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，阴离子基团为高氯酸离子。

3.一种如权利要求1所述的比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）咔唑、氢化纳和溴乙烷在DMF中反应，分离得化合物9-乙基-9H-咔唑：

；

（2）9-乙基-9H-咔唑、POCl₃和DMF在N₂保护下于CHCl₃中反应：

分离、提纯得3-甲酰基-9-乙基-9H-咔唑：

；

（3）2-邻氨基苯硫酚和3-甲酰基-9-乙基-9H-咔唑在偏亚硫酸钠存在下在DMF中反应，经分离、重结晶得化合物3：

；

（4）化合物3与乙酸酐在三氯化铝存在下于DMF中反应，分离、纯化得3-乙酰基-9-乙基-9H-咔唑噻唑：

；

。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，咔唑、溴乙烷和氢化纳的摩尔比为5:25:3；步骤（2）中，9-乙基-9H-咔唑、POCl₃和DMF的摩尔比为1:1:3；步骤（3）中，2-邻氨基苯硫酚和3-甲酰基-9-乙基-9H-咔唑的摩尔比为2:1；步骤（4）中，化合物3与乙酸酐的摩尔比为2:3；步骤（5）中，3-乙酰基-9-乙基-9H-咔唑噻唑与4-二乙氨基水杨醛的摩尔比为7:5。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中分离步骤为将反应体系倒入水中，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液干燥后，减压蒸除乙酸乙酯；

步骤（2）中分离、纯化步骤为将反应体系滴加到冰水中，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，减压除去乙酸乙酯后，柱层析纯化；层析淋洗剂为石油醚:二氯甲烷=1:10；

步骤（3）中分离、重结晶步骤为将冰水加入反应体系中，析出沉淀，抽滤，干燥后在甲醇中重结晶；

步骤（4）中分离步骤为将反应体系滴加到冰水中，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层后，减压除去乙酸乙酯，柱层析纯化；层析淋洗液为二氯甲烷:甲醇为淋洗剂=50:1；

步骤（5）中分离步骤为向反应体系中加入高氯酸，然后滴加蒸馏水，减压过滤，所得固体水洗、干燥后，柱层析纯化；层析淋洗剂为二氯甲烷:甲醇=20:1。

6.一种如权利要求1所述的比率型荧光探针在检测溶液中二氧化硫/亚硫酸（氢）盐中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，检测溶液中二氧化硫/亚硫酸（氢）盐的应用中，激发波长为370 nm，检测波长为425 nm和635 nm。