CN109796443A

CN109796443A - 一种检测二氧化硫的可逆性比率型荧光探针

Info

Publication number: CN109796443A
Application number: CN201910210378.7A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 高雯杰; 马燕燕
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2019-05-24

Abstract

本发明提供了一种检测二氧化硫的可逆性比率型荧光探针，其化学结构式为：。该探针由4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐、氨基丙烷、1‑（4‑哌嗪‑1‑基‑苯基）乙酮和N,N二乙基水杨醛为原料合成，合成原料易得，合成工艺简单。该探针在二氧化硫存在下，所发射的荧光由640 nm（近红外）变成了540 nm，探针能够快速的识别二氧化硫，同时又能快速的被甲醛恢复，具有良好的可逆性能。既能应用于细胞成像，同时也可用于小鼠活体成像，在生物体分析检测中具有很大的优越性。

Description

一种检测二氧化硫的可逆性比率型荧光探针

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测二氧化硫的荧光探针及其应用。

背景技术

在日常生活中，SO₂衍生物被广泛用作酶抑制剂、抗菌剂、医药产品、食品和饮料必不可少的防腐剂，它们大量用于范围广泛的行业。研究发现，暴露于高剂量的硫酸氢盐中，不仅是导致呼吸疾病，也与肺癌，心血管疾病的发生率提高有一定关联，同时与许多神经系统疾病，如中风、偏头痛、阿尔兹海默症也有不可分的关系。此外，二氧化硫还是雾霾的主要成分之一，在环境中被进一步氧化转变为硫酸，造成酸雨。气态二氧化硫作为主要大气污染物，危及着人类健康，酸雨将损害水生和陆地生态系统。它还可以由生物系统中的含硫氨基酸内源性产生，过量产生二氧化硫容易导致严重不良反应和急性症状，如潮红，低血压，腹泻，荨麻疹和腹痛。因此，发展一种有效快速检测二氧化硫及其衍生物的技术具有重要意义。

目前，针对检测二氧化硫的分子荧光探针已有文献报道，但这些常见的荧光探针多有背景干扰、响应时间较长、散射干扰等缺陷，这样有可能影响在复杂生理环境中对二氧化硫检测的应用。

发明内容

针对目前二氧化硫检测探针背景干扰、散射干扰大，响应时间较长等问题，本发明提供一种检测二氧化硫的可逆性比率型荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内硫酸氢根的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测二氧化硫的可逆性比率型荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

一种上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）在N₂保护下，4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨基丙烷于无水乙醇中加热反应，分离、提纯得固体，即为化合物1：

；

（2）在N₂保护下，化合物1与1-（4-哌嗪-1-基-苯基）乙酮于乙二醇甲醚中加热反应，反应结束，分离、提纯得到化合物2：

；

（3）在N₂保护下，化合物2与N,N二乙基水杨醛于浓硫酸中加热反应，反应结束后，分离、提纯得探针NaP：

。

步骤（1）中，所述物料4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨基丙烷的物质的量比为18:19。

步骤（1）中，所述反应温度为85 ℃，反应时间为3 h。

步骤（1）中，所述分离、提纯过程为：将反应液冷却至室温时，出现沉淀后抽滤，然后经硅胶色谱柱分离提纯，洗脱液为石油醚：二氯甲烷（V/V）=1:2，得到灰色固体，即化合物1。

步骤（2）中，所述化合物1与1-（4-哌嗪-1-基-苯基）乙酮的物质的量比为5:6。

步骤（2）中，所述反应温度为130 ℃，反应时间为5 h。

步骤（2）中，所述分离、提纯过程为：将反应液旋蒸后经柱色谱提纯，洗脱液为石油醚：二氯甲烷（V/V）=1:1），得到化合物2。

步骤（3）中，所述化合物2与N,N二乙基水杨醛的物质的量比为1:1。

步骤（3）中，所述反应温度为90 ℃，反应时间为6 h。

步骤（3）中，所述分离、提纯过程为：将反应液滴加至冰水中，用70％高氯酸洗涤抽滤后，经硅胶柱，洗脱液为二氯甲烷：甲醇（V/V）=30:1，提纯后得到探针NaP。

一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中硫酸氢根的应用。

本发明的机理如下：

。

根据亚硫酸氢盐或亚硫酸盐的亲核性，设计合成了以FRET荧光信号传感为原理的可逆性二氧化硫比率型荧光探针，亚硫酸氢或亚硫酸盐通过亲核加成进攻不饱和C=C键，导致近红外光消失，只释放萘酰亚胺荧光。而在甲醛存在下荧光又恢复原来的状态。

本发明具有以下优点：

本发明所述的快速识别二氧化硫的荧光探针的水溶液，在二氧化硫存在下，所发射的荧光由640 nm（近红外）变成了540 nm，该现象说明探针对二氧化硫有响应，这一现象为生物及环境检测二氧化硫的的应用奠定了可靠的理论基础。通过动力学实验证明，该探针识别速度极快。此外，该探针成功应用于细胞成像，同时也可用于小鼠活体成像，在生物体分析检测中显示出很大的优越性。

附图说明

图1：探针NaP的¹H NMR谱；

图2：探针NaP的¹³C NMR谱；

图3：探针NaP不同浓度的二氧化硫的滴定测试；

图4：探针NaP不同浓度的甲醛的滴定测试；

图5：探针NaP在不同pH的PBS缓冲液中的实验；

图6：NaP探针对不同离子的选择性；

图7：探针NaP的响应速度；

图8：NaP荧光探针的细胞成像测试；

图9：NaP荧光探针的小鼠活体成像测试。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）化合物1的合成

称取5.0 g的4-溴-1,8-萘二甲酸酐（18 mmol）和1.64 g的氨基丙烷（19 mmol）于合适的反应瓶中，加入10 mL无水乙醇，在氮气保护下85℃加热回流3 h，等体系温度冷却至室温时出现沉淀然后抽滤，经硅胶色谱柱分离提纯，洗脱液为石油醚：二氯甲烷（V/V）=1:2，得到灰色固体。

（2）化合物2的合成

称取1.5 g化合物1（5 mmol）于合适的反应瓶中，加入1.3 g的化合物1-（4-哌嗪-1-基-苯基）乙酮（6 mmol）再加入10 mL乙二醇甲醚在氮气保护下130℃下搅拌5 h，旋蒸后经柱色谱提纯，洗脱液为石油醚：二氯甲烷（V/V）=1:1），后得到化合物2。

（3）探针NaP的合成

称取1.04 g化合物2（25 mmol）和N,N二乙基水杨醛（4.8 g，25 mmol）于合适的反应瓶中，加入5 mL的浓硫酸作溶剂在氮气保护下90℃条件下搅拌6 h。加热后颜色为灰褐色且随时间颜色逐渐加深。反应完后，将其慢慢滴加入冰水中后加入70％HClO₄，然后抽滤，经硅胶柱，洗脱液为二氯甲烷：甲醇（V/V）=30:1，提纯后得到探针NaP。其¹H NMR谱图如图1，¹³C NMR谱图如图2。

实施例2 荧光探针对不同亚硫酸氢根的可逆响应

配制浓度为1 mM的实施例1所得检测二氧化硫的荧光探针NaP的二甲基亚砜 (DMSO)的测试母液溶液待用。测试试液为20%的乙腈和80%的PBS缓冲液组成的2 mL体系，使得测试液中，探针的终浓度为10 μM，测试使用的亚硫酸氢钠的浓度分别为5 µM、10 µM、15 µM、20µM、30 µM、40 µM、50 µM、55 µM。继而进行吸收光谱测试和荧光检测（λ_ex=420 nm，λ_em=540nm，637 nm）。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与亚硫酸氢钠浓度标准曲线，如图3所示。由图3可知，随着亚硫酸氢钠浓度的增加，540 nm处的荧光强度逐渐增加，637 nm处的荧光强度逐渐降低，当亚硫酸氢钠浓度达到50 μM时，反应体系荧光强度不在随浓度的改变而发生变化，反应体系达到饱和状态。

配制2 mL测试试液体系，使测试液中探针的终浓度为10 μM，亚硫酸氢钠的浓度为50 µM，其中含乙腈的体积分数为20 %。然后加入不同浓度的甲醛浓度分别为10 µM、20 µM、40 µM、50 µM、60 µM、70 µM、100 µM、150 µM、200 µM、300 µM。继而进行吸收光谱测试和荧光检测（λ_ex=420 nm，λ_em=540 nm，637 nm），得各体系中荧光强度，建立荧光强度与甲醛浓度标准曲线，如图4所示。由图4可知，随着甲醛浓度的增加，540 nm处的荧光强度逐渐减弱，637 nm处的荧光强度逐渐增强，当甲醛浓度达到200 μM时，随着甲醛浓度的升高，该体系的荧光强度不再随之而变，反应体系荧光强度达到饱和状态。

实施例3 荧光探针在不同pH溶液中的稳定性

配制浓度为1 mM的实施例1所得检测二氧化硫的荧光探针NaP的二甲基亚砜 (DMSO)的测试母液溶液待用。配制不同pH值的PBS缓冲液，然后在测试试液为2 mL体系中，使得测试液中，探针的终浓度为10 μM，其中含乙腈的体积分数为20%，然后加入不同PH的PBS缓冲液，测试其荧光强度继而进行吸收光谱测试和荧光检测（λ_ex=420 nm，λ_em=540 nm，637 nm）。以pH为横坐标，以I₅₄₀/I₆₃₇比值为纵坐标，做图5。由图5可知，溶液pH对I₅₄₀/I₆₃₇比值无影响。

实施例4 荧光探针对不同离子和活性小分子、氨基酸的选择性

配制浓度为1 mM的实施例1所得检测二氧化硫的荧光探针NaP的二甲基亚砜 (DMSO)的测试母液溶液待用。配制浓度为100 mM的各种不同离子，氨基酸和活性氧/活性氮溶液作为备用。在5 mL的容量瓶里加入25 μL探针母液、225 μL DMSO和500当量的各离子溶液或1000当量的各氨基酸溶液，用磷酸缓冲液定容，测试离子的浓度为2.5 mM，氨基酸的浓度为5 mM，活性氧活性氮浓度为100 μM。摇匀后进行荧光检测（λ_ex= 420 nm, λ_em= 540 nm，637nm），建立荧光强度与各离子的柱状图，如图6所示，1-27号加入的离子分别是探针NaP，氯化铝，氯化钡，丙二醛，氯化钙，氯化铜，半胱氨酸，过氧化二叔丁基，硫酸亚铁，谷胱甘肽，过氧化氢，次氯酸钠，同型半胱氨酸，氯化钾，碘化钾，硝酸钾，氯化镁，溴化钠，硫氰酸钾，氟化钠，亚硝酸钠，磷酸钠，叔丁基过氧化氢，乙二胺，乙酸铵，氯化锌，亚硫酸钠。由图6可知，其他离子（或氨基酸）对探针NaP的荧光几乎没有影响。

实施例5 探针识别SO₂的动力学以及探针识别SO₂后在甲醛作用下恢复到探针原来状态的动力学测试

配制浓度为1 mM的本发明所述检测的荧光探针NaP的二甲基亚砜 (DMSO) 的测试母液溶液待用。配制浓度为10 mM的亚硫酸氢钠溶液和100 mM的甲醛溶液。在5 mL的容量瓶里加入20 μL探针母液、380 μL 乙腈、50 µM的亚硫酸氢钠，用PBS缓冲液（pH=7.0）定容，使探针的浓度为10 µM；亚硫酸氢根的浓度为50 µM，摇匀后进行荧光检测（λ_ex= 420 nm, λ_em= 540nm，637nm），建立荧光强度比值与时间的曲线图；等上述溶液平衡后，加入甲醛溶液，使其浓度为200µM，建立荧光强度比值与时间的曲线图。由图7可以发现，在亚硫酸盐存在下，探针的荧光强度比值在1min已达到平衡，而在甲醛存在下荧光强度比值在3 min达到平衡，与探针强度比值很接近，说明该探针能够快速的识别二氧化硫，同时又能快速的被甲醛恢复。所述探针具有良好的可逆性能。

实施例6 荧光探针在活细胞中的成像应用

将适当密度的HeLa细胞接种到两个灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5% CO₂）中培养，待细胞贴壁后，向培养皿中加入实施例1所得检测二氧化硫的荧光探针NaP，使其终浓度均为10 μM。继续培养0.5 h，弃掉培养基，用PBS缓冲液（pH=7.0）冲洗细胞三次，其中一个加入适量亚硫酸氢钠水溶液，终浓度为50 μM，孵育0.5 h后进行成像，随后加入200 μM甲醛，孵育0.5 h后弃掉培养基，用PBS缓冲液（pH=7.0）冲洗细胞三次，随后进行成像实验。如图8所示，只加入探针时，细胞具有很强的红色荧光，较弱的绿色荧光，加入亚硫酸氢钠后红色荧光减弱，绿色荧光增强。加入甲醛后，荧光恢复与探针相似，说明该探针能够用于细胞内二氧化硫的可逆性检测。

实施例7 荧光探针在生物体中的成像应用

将4周大小的Babl/c小鼠注射麻醉后，在其腹腔注射本发明的探针NaP 50 μM，然后在活体成像仪下成像，注射位置有很强的红色荧光。在其原位置注射二氧化硫后在活体成像仪下显示无荧光，注射甲醛后荧光变强，结果如图9所示；说明该探针能够用于小鼠中可逆性检测二氧化硫。

Claims

1.一种检测二氧化硫的可逆性比率型荧光探针，化学结构式为：

。

2.一种如权利要求1所述的可逆性比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

；

（3）在N₂保护下，化合物2与N,N二乙基水杨醛于浓硫酸中加热反应，反应结束后，分离、提纯得探针：

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，物料4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨基丙烷的物质的量比为18:19；步骤（2）中，化合物1与1-（4-哌嗪-1-基-苯基）乙酮的物质的量比为5:6；步骤（3）中，化合物2与N,N二乙基水杨醛的物质的量比为1:1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中反应温度为85 ℃，反应时间为3 h；步骤（2）中反应温度为130 ℃，反应时间为5 h；步骤（3）中反应温度为90 ℃，反应时间为6 h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离、提纯过程为：将反应液冷却至室温时，出现沉淀后抽滤，然后经硅胶色谱柱分离提纯，洗脱液为石油醚：二氯甲烷（V/V）=1:2，得到化合物1；

步骤（2）中，所述分离、提纯过程为：将反应液旋蒸后经柱色谱提纯，洗脱液为石油醚：二氯甲烷（V/V）=1:1，得到化合物2；

步骤（3）中，所述分离、提纯过程为：将反应液滴加至冰水中，用70%高氯酸洗涤抽滤后，经硅胶柱，洗脱液为二氯甲烷：甲醇（V/V）=30:1，提纯后得到探针。

6.一种如权利要求1所述的可逆性比率型荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中硫酸氢根的应用。