CN108003866B - 一种二硫苏糖醇荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于氧杂蒽结构的检测细胞内二硫苏糖醇荧光探针。该探针廉价易得，使用简单，能与二硫苏糖醇特异性识别发生反应，进而生成荧光强度更大的氧杂蒽荧光染料，在检测二硫苏糖醇过程中不会受到硫醇及其他还原物的干扰，对二硫苏糖醇具有优异的选择性，能对活细胞中的二硫苏糖醇进行特异性检测。

Description

一种二硫苏糖醇荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种快速检测细胞内二硫苏糖醇的荧光探针，属于分析化学技术领域。
背景技术
DL-二硫苏糖醇（DTT）也称为Cleland's试剂，是巯基的保护试剂，已广泛应用于肽/蛋白质化学和细胞生物学。在上个世纪中期发现，这种小分子和水溶性试剂能够完全还原二硫化物，保护巯基免受氧化，并在还原状态下保存单巯基。作为一种有效的还原剂，主要用于临床和实验领域，也可用于某些疾病治疗，如胱氨酸病或由离子或金属毒性引起的医学病症。最近，DTT被用作细胞凋亡的显著抑制剂和解折叠蛋白的诱导剂以及细胞衰老的保护剂。
DTT本身可用二硫键形成六元环，在一些生物大分子中表现出强烈的分解二硫键的还原能力。它通常用作保护蛋白质/肽的还原剂，例如重组蛋白的表达，蛋白质的提取和纯化以及相对高水平的1-10mM的保存。然而，DTT的异常水平可能导致肽，蛋白质和DNA的氧化损伤，导致一些生物大分子的破坏和功能紊乱。在生物学，生物化学和生态学中普遍、使用DTT，在某种程度上表现出在生物环境中DTT检测的意义。
迄今为止，还有一些DTT的定量检测方法。例如，Cindric及其同事使用HPLC-MS来检测复合蛋白混合物中的DTT。另一方面，与其他检测技术相比，荧光检测具有高选择性，易于操作和敏感的等特点，并且已经成功开发了几种用于检测DTT的荧光探针。然而，大多数探针不能从生物硫代物中区分DTT。最近，张、谭和他的同事合成了一种用于检测DTT的比率型荧光探针，这个荧光探针可以与DTT发生反应，引发了基于哌嗪的氨基甲酸酯保护基的裂解，最终恢复了4-氨基萘二酰亚胺的绿色荧光；并且该探针能够对DTT产生响应而不是单个含巯基的生物硫醇。
由于硫醇-二硫化物交换对于广泛的生物系统是必需的，与此同时，DTT在巯基的保护以及维持许多生物大分子的生物学功能中起着至关重要的作用，DTT和单个含巯基生物素的同时鉴别检测可以使研究人员更好地了解生物系统中两者之间的相互作用，从而在实验室和医疗应用中安全地使用DTT。
荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，而且对细胞基本没有损伤，已经广泛用于各种生物小分子的检测。目前，用于检测细胞内DTT的荧光探针也得到了迅速发展。但是，目前报道的DTT荧光探针大都不具有迅速的响应和较高的灵敏度。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，且具有快速响应能力的DTT荧光探针具有重要的意义。
发明内容
针对现有DL-二硫苏糖醇（DTT）荧光探针大都不具有迅速的响应和较高的灵敏度的问题，本发明提供了一种新型检测细胞内DTT的新型荧光探针。本发明还提供了上述荧光探针的制备方法和在检测细胞中DTT中的用途。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测细胞内DTT的荧光探针，其结构式如式（I）所示：
式（）。
一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
（1）4-二乙氨基酮酸和1-6萘酚在浓硫酸中反应，分离、纯化得化合物3；
（2）将步骤1所得化合物3与2,4-二硝基氟苯加热反应，然后分离、纯化得化合物如式（）。
步骤1中所述物料4-二乙氨基酮酸和1,6-萘二酚的摩尔比为1:1。
步骤2所述物料化合物3、2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1-1.2。
步骤1中所述分离、纯化步骤为将反应液冷却至-5-0℃，加入高氯酸使其析出沉淀，抽滤、烘干，层析纯化，纯化所用淋洗液二氯甲烷:甲醇=10:1。
步骤2所述分离、纯化步骤为将反应液用二氯甲烷和纯净水分别萃取3-5次，收集有机层，用无水硫酸镁干燥后，旋干溶剂，然后柱层析纯化；层析淋洗液为二氯甲烷:甲醇=50:1。
上述荧光探针在检测溶液或细胞中DL-二硫苏糖醇的应用。
所述检测细胞中DL-二硫苏糖醇的应用中，单光子激发波长为580 nm，检测波长为638 nm；双光子激发波长为800 nm，检测波长为638 nm。
本荧光探针的检测机理如下：
本发明的荧光探针以罗丹明衍生物作为荧光团，以2,4-硝基苯作为DTT识别位点。在二硫苏糖醇存在的条件下，荧光探针分子结构中的2,4-二硝基苯可脱去，生成具有荧光发射能力很强的化合物Ⅱ，此时荧光探针发射强烈红色荧光（峰值约为638 nm）；一定浓度范围内，荧光强度与二硫苏糖醇呈正相关，通过检测不同的荧光强度来测定二硫苏糖醇的浓度。
本发明具有以下优点：
本发明的检测细胞内DTT的荧光探针具有高特异性、高灵敏度、高抗干扰性，且荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。可用于活细胞内DTT的快速实时测定，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为荧光探针的1H NMR图谱；
图2为荧光探针在不同浓度DTT条件下的荧光光谱；
图3为荧光探针与DTT浓度的线性关系；
图4为荧光探针与不同物质反应后的荧光强度；
图5为荧光探针在活细胞中的成像应用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 荧光探针的制备
（1）4-二乙氨基酮酸和1,6-萘二酚以浓硫酸做溶剂，于90℃回流；然后将反应液冷却至-5-0℃，加入高氯酸使其析出沉淀，抽滤、烘干及过层析柱纯化，纯化所用淋洗液二氯甲烷:甲醇=10:1，得化合物3：
；
（2）将步骤1所得化合物3 (1 mmol)、2,4-二硝基氟苯（1 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL)加入到50 mL单口烧瓶中，50℃下加热5小时。冷却至室温，用二氯甲烷（15mL）和纯净水（15mL）萃取3~5次，收集有机层，用无水硫酸镁干燥旋干，将所得固体以二氯甲烷:甲醇=50:1为淋洗剂进行柱层析纯化，除溶剂后得到粉红色产物，即为本发明所述检测细胞内DTT的荧光探针。荧光探针的1H NMR图谱如图1所示。
实施例2 荧光探针在不同DTT浓度下的荧光光谱
预先准备18份5mL含10μM实施例1中荧光探针的磷酸缓冲生理盐水（PBS），含20%乙腈，DTT浓度依次为0，2，4，6，8，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70μM。然后进行荧光检测（λex = 580nm）；计算各体系中荧光强度；评估该探针对DTT的响应性能，如图2所示。由图2可知，一定浓度范围内，荧光强度与二硫苏糖醇呈正相关，通过检测不同的荧光强度来测定二硫苏糖醇的浓度。分析638nm处的荧光强度与DTT浓度的线性关系，如图3所示，回归方程为y=0.93177x+0.177957，其中y为荧光强度，x为DTT浓度。由图3可知，随着有二硫苏糖醇浓度的增加，荧光强度增强。
实施例3 荧光探针与不同物质反应后的荧光强度
预先准备10份5mL含10μM实施例1中荧光探针的缓冲溶液(含20%乙腈，pH =7.4)，然后分别向该体系中依次加入100 μL浓度为100 μM的CuSO4、MgSO4、CaCl2、CoCl2、NaNO2、Na2SO3、Na2SO4、ZnSO4、过氧叔丁基、过氧叔丁醇、HClO、H2O2、NO、Na2S、SnSO4、KI、HgCl2、VC、Hcys、Cys、GSH、二硫苏糖醇的PBS溶液。然后进行荧光检测（λex = 580 nm）；计算各体系中荧光强度，评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性，如图4所示。由图4可知，本二硫苏糖醇荧光探针可抗多种干扰性物质的影响，特异性强。
实施例4 荧光探针在活细胞中的成像应用
将Hela细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎牛血清)中，放置于条件为37℃、5%CO2和20% O2的培养箱中培养24-48h。用微量进样器吸取本发明所述荧光探针(10 μM)注入含有Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。加入100 μM硫化氢溶液，继续培养30 min。之后用PBS (0.1mM，pH = 7.4)冲洗培养细胞3次，分别在明场成像、单光子（λex =561nm）与双光子（λex = 800nm）荧光成像，红通道检测如图5所示。由图5可知，其中，A表示探针（10 μM）在细胞分别在明场、红色通道和叠加荧光通道图；B表示双光子荧光通道图。

Claims (7)

1.一种检测细胞内DTT的荧光探针，其结构式如式（I）所示：
式（）。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）4-二乙氨基酮酸和1,6- 萘 二酚 在浓硫酸中反应，分离、纯化得化合物3；
（2）将步骤（ 1 ） 所得化合物3与2,4-二硝基氟苯加热反应，然后分离、纯化得化合物如式（）。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，4-二乙氨基酮酸和1,6-萘二酚的摩尔比为1:1；化合物3、2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1-1.2。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（ 1 ） 中所述分离、纯化步骤为将反应液冷却至-5-0℃，加入高氯酸使其析出沉淀，抽滤、烘干，层析纯化，纯化所用淋洗液二氯甲烷:甲醇=10:1。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（ 2 ） 所述分离、纯化步骤为将反应液用二氯甲烷和纯净水分别萃取3-5次，收集有机层，用无水硫酸镁干燥后，旋干溶剂，然后柱层析纯化；层析淋洗液为二氯甲烷:甲醇=50:1。
6.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测溶液或细胞中DL-二硫苏糖醇的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，单光子激发波长为580 nm，检测波长为638nm；双光子激发波长为800 nm，检测波长为638 nm。
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