CN110590762A - 一种用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针及其制备方法及应用 - Google Patents

一种用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法及应用，其分子式为C29H29N6O4 +，简称为：CBP‑N，通过荧光光谱仪研究了探针CBP‑N在CH3CN‑PBS溶液中与金属离子、常见氨基酸、活性氧、活性硫等小分子物质的识别特性。结果表明：探针CBP‑N对亚硫酸氢根具有高效专一的选择性，具有较强的抗干扰能力，其最低检出限为18 nM。探针CBP‑N与亚硫酸氢根响应后，荧光发射光谱中，在549 nm处荧光强度明显增强，631 nm处荧光强度显著降低，可以实现对亚硫酸氢根的比率型检测，该特性可以克服环境中常见因素的干扰，具有较好的实际应用价值。

Description

一种用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针及其制备方法及 应用
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，特别是指一种用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针及其制备方法及应用。
背景技术
二氧化硫是常见的大气污染物，在中性水溶液中，容易水解成亚硫酸氢根与亚硫酸根。在日常生产生活中，二氧化硫及衍生物被广泛应用于酶抑制剂、抗菌剂、防腐剂等。在食品产业中，亚硫酸盐被广泛用作食品和饮料的防腐剂，以防止食物氧化和细菌生长，抑制酶和非酶褐变在生产和储存过程中的发生。然而高剂量的亚硫酸盐可能引起不良反应和急性症状，世界卫生组织规定食品中亚硫酸盐的阈值水平应受到严格控制。因此，发展一种快速有效检测亚硫酸氢根及衍生物的检测技术具有重要的意义。
近年来，有机小分子荧光探针应用于特定目标分析物的检测受到广泛关注。荧光探针与特定目标分析物发生发生变化后，荧光信号有明显的变化，从而达到对目标分析物的识别检测。利用荧光探针的荧光分析法具有高特异选择性、高灵敏性、响应时间快、检出限低等优点，目前被广泛应用于环境科学和生物医学领域。专利108129428中公开了一种检测亚硫酸氢根的比率荧光探针及其应用，该探针是由丹磺酰荧光团作为供体，(E)-2-(3-氰基-4-(4-(二甲氨基)苯乙烯)-5,5-二甲基呋喃-2(5H)-亚基)丙二腈荧光团作为受体，通过哌嗪联接构筑成基于荧光共振能量转移机理的检测亚硫酸氢根的比率荧光探针，该探针主要应用于在细胞内脂滴定位成像，且灵敏度低；专利CN201310213806.4中公开了一种用苯并吲哚啉和芳香醛缩合得到的产物作为探针分子的亚硫酸氢根离子荧光探针及制备方法的技术方案，但该探针仅显示在水溶液中亚硫酸氢根子存在的专一性指示剂；使用局限且灵敏度不高；因此，开发出高效灵敏的用于亚硫酸氢根检测的荧光探针是十分有意义的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针及其制备方法及应用，荧光探针CBP-N对亚硫酸氢根具有高效专一的选择性，具有较强的抗干扰能力，其最低检出限为18 nM。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针，所述荧光探针结构式如下所示：
。
所述的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的合成路线如下：
。
比率型荧光探针的制备方法步骤如下：
（1）将中间体CBP和三乙胺溶于乙腈中混合搅拌后，加入4-氯-7-硝基苯呋咱（NBD-Cl），室温搅拌反应6-18小时；
（2）将步骤（1）得到的反应液旋干除去乙腈，用二氯甲烷重新溶解后再用饱和氯化钠溶液洗涤、分离有机相，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，最后柱层析分离得深蓝色固体即用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针。
所述步骤（1）中，中间体CBP的制备路线和方法如下：
① CBP-1的合成：将哌嗪（6 g，69 mmol）溶于30 mL DMF中，加入碳酸钾(9.51 g，69mmol)，搅拌15分钟后，向混合液中加入对氟苯乙酮（3.2 g，2.298 mmol），80℃条件下回流过夜，反应完全后，减压去除溶剂，二氯甲烷溶解，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压去除溶剂得到CBP-1，产率：55%；
② CBP的合成：在25 ml的圆底烧瓶中称取4-二乙胺基水杨醛（193.1 mg, 1 mmol）与CBP-1（204.1 mg, 1 mmol），加入3 mL浓硫酸，90℃条件下加热搅拌6 h；待反应结束后冷却至室温，将反应液逐滴加入到30 mL冰水中，再滴加7-8 滴高氯酸，有固体析出，过滤出固体，洗涤，烘干后柱色谱分离提纯（二氯甲烷：甲醇=15:1，v/v），得绿色固体，产率 71%。
所述步骤（1）中中间体CBP、三乙胺和4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为1：（1-8）：（1-10），混合搅拌时间为5-25分钟。
所述步骤（2）中柱层析分离采用的洗脱液为CH2Cl2 和CH3OH按体积比（30-50）: 1。
所述的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的应用，作为特异、高灵敏检测食品及环境中亚硫酸氢根的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所述比率型荧光探针制备方法简单，产率高。分析测试结果表明该探针CBP-N对亚硫酸氢根具有高效专一的选择性，具有较强的抗干扰能力，其最低检出限为18 nM，探针CBP-N与亚硫酸氢根响应后，荧光发射光谱中，在549 nm处荧光强度明显增强，631 nm处荧光强度显著降低，可以实现对亚硫酸氢根的比率型检测，该特性可以克服环境中常见因素的干扰，具有较好的实际应用价值。
2、传统的用于亚硫酸氢根检测的荧光探针是简单的荧光增强或者淬灭型，其作用机理是基于探针的荧光增强或者淬灭，这类探针易受检测环境中如酸碱度、探针浓度、温度、溶液极性等的影响，还具有难以定量的缺点，而本发明所述比率型检测亚硫酸氢根的方法识别机理为荧光共振能量转移机理（FRET），该机理通过使用在两个不同波长出测定的荧光强度比值作为定量依据，可以进行探针分子内自校准，能够消除或者有效消除环境温度、溶液极性、酸碱度、检测器效率等外界因素对测量荧光强度的干扰，从而实现对痕量亚硫酸氢根含量的实时定性定量检测，在生物分析与环境检测中具有很大的优越性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的荧光探针CBP-N的核磁共振氢谱图。
图2为本发明的荧光探针CBP-N的核磁共振碳谱图。
图3为本发明的荧光探针CBP-N的高分辨质谱图。
图4为本发明的荧光探针CBP-N的荧光选择性（常见阴离子和活性小分子）图，激发波长450 nm。
图5为本发明的荧光探针CBP-N的荧光选择性（常见阴离子和活性小分子）柱状图，激发波长450 nm，发射波长549 nm和631 nm。
图6为本发明的荧光探针CBP-N的荧光选择性（常见氨基酸）柱状图，激发波长450nm，发射波长549 nm和631 nm。
图7为本发明的荧光探针CBP-N识别亚硫酸氢根的荧光滴定图，激发波长450 nm。
图8 为本发明的荧光探针CBP-N识别亚硫酸氢根的工作曲线图，发射波长549 nm和631 nm。
图9为本发明的荧光探针CBP-N识别亚硫酸氢根的酸碱度实验图，发射波长549 nm和631 nm。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中中间体CBP的制备路线和方法如下：
① CBP-1的合成：将哌嗪（6 g，69 mmol）溶于30 mL DMF中，加入碳酸钾(9.51 g，69mmol)，搅拌15分钟后，向混合液中加入对氟苯乙酮（3.2 g，2.298 mmol），80℃条件下回流过夜，反应完全后，减压去除溶剂，二氯甲烷溶解，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压去除溶剂得到CBP-1，产率：55%；
② CBP的合成：在25 ml的圆底烧瓶中称取4-二乙胺基水杨醛（193.1 mg, 1 mmol）与CBP-1（204.1 mg, 1 mmol），加入3 mL浓硫酸，90℃条件下加热搅拌6 h；待反应结束后冷却至室温，将反应液逐滴加入到30 mL冰水中，再滴加7-8 滴高氯酸，有固体析出，过滤出固体，洗涤，烘干后柱色谱分离提纯（二氯甲烷：甲醇=15:1，v/v），得绿色固体，产率 71%。
实施例1
本实施例的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法：
将中间体CBP（181 mg，0.5 mmol）和三乙胺（70 mg，0.5 mmol）溶于20 mL乙腈中搅拌10分钟，室温搅拌条件下加入4-氯-7-硝基苯呋咱（100 mg，0.5 mmol）后继续搅拌10小时。将步骤中的反应液旋干除去乙腈，用二氯甲烷（20 mL）重新溶解，20 mL的饱和氯化钠溶液洗涤3次、分离有机相，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，柱层析分离（DCM/MeOH=45/1）到得深蓝色固体131.3 mg即荧光探针CBP-N，产率50%。
荧光探针CBP-N的核磁共振测定：1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 1.24 (t, J = 6.0Hz, 6 H), 3.66 (d, J = 4.0 Hz, 4 H), 3.98 (s, 4 H), 4.38 (s, 4 H), 6.58 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.26 (s, 1 H), 7.33 (d, J = 8.0Hz, 1 H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.28 (d, J =8.0 Hz, 2 H), 8.52 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 8.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H); 13C NMR(DMSO, 100 MHz) δ 167.6, 158.6, 155.4, 154.2, 148.2, 145.9, 145.2, 145.1,138.1, 136.8, 132.2, 131.2, 121.5, 116.9, 116.8, 116.7, 113.4, 111.4, 111.3,108.6, 103.1, 96.4, 48.5, 45.6, 44.8, 12.9。高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd forC29H29N6O4 +：525.2245, found 525.2242 [M+H+]。
荧光探针CBP-N的核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示，高分辨质谱图如图3所示。
实施例2
本实施例的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法：
将中间体CBP（181 mg，0.5 mmol）和三乙胺（140 mg，1 mmol）溶于20 mL乙腈中搅拌15分钟，室温搅拌条件下加入4-氯-7-硝基苯呋咱（200 mg，1.5mmol）后继续搅拌18小时。将步骤中的反应液旋干除去乙腈，用二氯甲烷（20 mL）重新溶解，20 mL的饱和氯化钠溶液洗涤3次、分离有机相，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，柱层析分离（DCM/MeOH=40/1）到得深蓝色固体157.6 mg即荧光探针CBP-N，产率60%。
荧光探针CBP-N的核磁共振测定：1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 1.24 (t, J = 6.0Hz, 6 H), 3.66 (d, J = 4.0 Hz, 4 H), 3.98 (s, 4 H), 4.38 (s, 4 H), 6.58 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.26 (s, 1 H), 7.33 (d, J = 8.0Hz, 1 H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.28 (d, J =8.0 Hz, 2 H), 8.52 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 8.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H); 13C NMR(DMSO, 100 MHz) δ 167.6, 158.6, 155.4, 154.2, 148.2, 145.9, 145.2, 145.1,138.1, 136.8, 132.2, 131.2, 121.5, 116.9, 116.8, 116.7, 113.4, 111.4, 111.3,108.6, 103.1, 96.4, 48.5, 45.6, 44.8, 12.9。高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd forC29H29N6O4 +：525.2245, found 525.2242 [M+H+]。
荧光探针CBP-N的核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示，高分辨质谱图如图3所示。
实施例3
本实施例的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法：
将中间体CBP（181 mg，0.5 mmol）和三乙胺（280 mg，2 mmol）溶于20 mL乙腈中搅拌25分钟，室温搅拌条件下加入4-氯-7-硝基苯呋咱（400 mg，2 mmol）后继续搅拌12小时。将步骤中的反应液旋干除去乙腈，用二氯甲烷（30 mL）重新溶解，20 mL的饱和氯化钠溶液洗涤3次、分离有机相，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，柱层析分离（DCM/MeOH=38/1）到得深蓝色固体183.8 mg即荧光探针CBP-N，产率70%。
荧光探针CBP-N的核磁共振测定：1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 1.24 (t, J = 6.0Hz, 6 H), 3.66 (d, J = 4.0 Hz, 4 H), 3.98 (s, 4 H), 4.38 (s, 4 H), 6.58 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.26 (s, 1 H), 7.33 (d, J = 8.0Hz, 1 H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.28 (d, J =8.0 Hz, 2 H), 8.52 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 8.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H); 13C NMR(DMSO, 100 MHz) δ 167.6, 158.6, 155.4, 154.2, 148.2, 145.9, 145.2, 145.1,138.1, 136.8, 132.2, 131.2, 121.5, 116.9, 116.8, 116.7, 113.4, 111.4, 111.3,108.6, 103.1, 96.4, 48.5, 45.6, 44.8, 12.9。高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd forC29H29N6O4 +：525.2245, found 525.2242 [M+H+]。
荧光探针CBP-N的核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示，高分辨质谱图如图3所示。
实施例4
本实施例的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法：
将中间体CBP（181 mg，0.5 mmol）和三乙胺（560 mg，4 mmol）溶于20 mL乙腈中搅拌5分钟，室温搅拌条件下加入4-氯-7-硝基苯呋咱（1000 mg，5 mmol）后继续搅拌6小时。将步骤中的反应液旋干除去乙腈，用二氯甲烷（40 mL）重新溶解，20 mL的饱和氯化钠溶液洗涤3次、分离有机相，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，柱层析分离（DCM/MeOH=30/1）到得深蓝色固体223.2 mg即荧光探针CBP-N，产率85%。
荧光探针CBP-N的核磁共振测定：1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 1.24 (t, J = 6.0Hz, 6 H), 3.66 (d, J = 4.0 Hz, 4 H), 3.98 (s, 4 H), 4.38 (s, 4 H), 6.58 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.26 (s, 1 H), 7.33 (d, J = 8.0Hz, 1 H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.28 (d, J =8.0 Hz, 2 H), 8.52 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 8.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H); 13C NMR(DMSO, 100 MHz) δ 167.6, 158.6, 155.4, 154.2, 148.2, 145.9, 145.2, 145.1,138.1, 136.8, 132.2, 131.2, 121.5, 116.9, 116.8, 116.7, 113.4, 111.4, 111.3,108.6, 103.1, 96.4, 48.5, 45.6, 44.8, 12.9。高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd forC29H29N6O4 +：525.2245, found 525.2242 [M+H+]。
荧光探针CBP-N的核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示，高分辨质谱图如图3所示。
实施效果例1：荧光选择性实验
配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针CBP-N乙腈溶液。用荧光光谱仪考察了探针CBP-N对亚硫酸氢根的选择性。如附图4所示，在450 nm处激发条件下，单独的探针探针CBP-N (10 µM)在PBS缓冲溶液中在549 nm和631 nm处具有较强的荧光发射强度，当加入亚硫酸氢根(10 eq.)后，在549 nm处的荧光发射强度明显增强，在631 nm处的荧光发射强度明显降低，但是加入其它物质 (常见阴离子、活性小分子和氨基酸，10 eq.) 时，溶液体系的荧光发射比率（F549/F631）强度与单独探针体系的荧光发射比率（F549/F631）强度相比没有明显变化（附图5和6）。以上实验结果表明，该探针对亚硫酸氢根具有较好的专一选择性，并能实现比率检测。
实施效果例2：最低检出限实验
良好的检出限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针CBP-N乙腈溶液。固定探针CBP-N浓度为10 µM，测定其对不同浓度的亚硫酸氢根的响应强度，随着亚硫酸氢根浓度的增加，体系荧光发射强度在549 nm处的荧光发射强度明显增强，在631 nm处的荧光发射强度明显降低（附图7），研究发现溶液荧光发射比率（F549/F631）在亚硫酸氢根浓度为0-1 µM间呈线性（R2 = 0.999）（附图8），根据IUPAC规则，经计算(3σ/k)得出该探针分子对亚硫酸氢根的检出限为0.018 μM。
实施效果例3：酸碱度（pH）对探针识别能力的影响
为了测试探针可以在不同的酸碱度（pH）条件下识别亚硫酸氢根，考察了其在不同酸碱度（pH）对其识别亚硫酸氢根的影响。分别配制pH为2， 3.8， 4.8， 5.8， 6.8， 7.4， 8.8，9.7、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针CBP-N乙腈溶液。在CH3CN/PBS(10 mM, 7/3, v/v)溶液体系中，改变缓冲体系的pH值（2-10），单独探针(10 μL)的荧光发射比率值（F549/F631）变化不大，但是在亚硫酸氢根（浓度为100 μL）存在的条件下，体系荧光发射比率值（F549/F631）在pH为5.8-9.8间具有较明显的增强（附图9），该结果表明探针可以应用于生理条件下识别亚硫酸氢根。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针，其特征在于，所述荧光探针结构式如下所示：
。
2.权利要求1所述的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将中间体CBP和三乙胺溶于乙腈中混合搅拌后，加入4-氯-7-硝基苯呋咱，室温搅拌反应6-18小时；
（2）将步骤（1）得到的反应液旋干除去乙腈，用二氯甲烷重新溶解后再用饱和氯化钠溶液洗涤、分离有机相，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，最后柱层析分离得深蓝色固体即用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针。
3.根据权利要求2所述的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，中间体CBP的制备方法为：
① CBP-1的合成：将69 mmol的哌嗪溶于30 mL DMF中，加入69 mmol的碳酸钾，搅拌15分钟后，向混合液中加入2.298 mmol的对氟苯乙酮，80℃条件下回流过夜，反应完全后，减压去除溶剂，二氯甲烷溶解，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压去除溶剂得到CBP-1；
② CBP的合成：在25 ml的圆底烧瓶中称取1 mmol的4-二乙胺基水杨醛与1mmol 的CBP-1，加入3mL浓硫酸，90℃条件下加热搅拌6 h；待反应结束后冷却至室温，将反应液逐滴加入到30 mL冰水中，再滴加7-8 滴高氯酸，有固体析出，过滤出固体，洗涤，烘干后柱色谱分离提纯，得绿色固体即中间体CBP。
4.根据权利要求2所述的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，中间体CBP、三乙胺和4-氯-7-硝基苯呋咱的摩尔比为1：（1-8）：（1-10），混合搅拌时间为5-25分钟。
5.根据权利要求2所述的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中柱层析分离采用的洗脱液为CH2Cl2 和CH3OH按体积比（30-50）: 1。
6.权利要求1所述的用于亚硫酸氢根检测的比率型荧光探针的应用，作为特异、高灵敏检测食品及环境中亚硫酸氢根的应用。
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