CN113295656A

CN113295656A - 一种细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法

Info

Publication number: CN113295656A
Application number: CN202010109600.7A
Authority: CN
Inventors: 王卫; 侯晓珊; 王世颖; 万均; 宋志灵; 罗细亮
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2020-02-22
Filing date: 2020-02-22
Publication date: 2021-08-24

Abstract

高毒性重金属引发的环境和水体污染一直是人类面临的严重问题。As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺均是具有严重毒性的、分布广泛的环境污染物，即使在低浓度下也会对环境和人类健康构成严重威胁。本发明提出了一种利用纳米胶囊‑核酸生物分子复合物进行细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像方法，本发明提出并构建的纳米胶囊‑核酸生物分子复合物具有结构简单、生物相容性好、设计巧妙、制备简单、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、特异性高、响应时间短等诸多优点，能够方便、快捷地实现细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的高灵敏、高选择性的同时荧光成像。

Description

一种细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法

技术领域

本发明涉及As³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺的同时检测与成像，具体涉及一种采用纳米胶囊-核酸生物分子复合物进行细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像，属于环境监测及纳米生物技术领域。

背景技术

高毒性重金属引发的环境和水体污染一直是人们关心的主要问题，高毒性重金属可以通过空气、水体和土壤进入食物链严重危害生态系统。

砷是一种自然界中广泛存在的、具有类金属特性的元素。砷及其化合物已被世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构和美国环保署(EPA)等诸多国际权威机构公认为致癌物。砷污染主要来自于农药、化肥、冶金、采矿、制药等行业的三废排放。砷在水环境中的主要存在形式是H₃AsO₃中的As(Ш)和H₃AsO₄中的As(V)，其中，As(Ш)毒性最高，是As(V)毒性的100倍，慢性摄入或长期接触砷会使其大量沉积在人体皮肤、肺、膀胱、肝和肾中，引发肺癌、皮肤癌等多种癌变，同时还会导致心血管疾病和人体循环系统的损害。由于砷污染的进一步扩大，人类正面临严峻的砷中毒威胁，砷污染导致的以皮肤和内脏疾病为主的健康危害已在全世界范围内受到广泛关注。为此，美国环境保护署最近重新调整了饮用水中的砷含量从50μg/L到10μg/L。该变化促使更多的研究人员开发出能够高灵敏检测砷的技术以满足这一新的标准。

严重危害人类健康和环境的重金属还包括铅，铅污染主要来源于人类生活及化工生产等相关领域，涉及油漆、涂料、蓄电池、冶炼、电镀、餐具、燃煤、自来水管、化妆品、染发剂等产品。铅是一种潜在的神经毒素，也是普遍存在于自然界的重金属污染中毒性较大的一种。对环境和人体健康产生严重的影响，一旦进入人体将很难排除，直接损害人的脑细胞。即使暴露于非常低水平的铅离子浓度(血液中<100μg/L)下也会引起多种疾病，包括记忆力减退、易怒、贫血、肾损伤和智力低下等，造成各种神经毒性作用，引发神经系统、心血管系统损伤和发育障碍，特别是对于生长发育期的儿童来说，危害尤为巨大。铅可经呼吸吸入、食物和饮水摄入、经皮肤吸收。铅的毒性作用没有阈值性，即体内有铅便有毒，因此，“零血铅”已成为临床控制儿童铅中毒的目标。

除了砷和铅以外，金属汞也是一种具有严重毒性且分布广泛的重要环境污染物，即使在低浓度下也会对环境和人类构成严重威胁，造成严重的、永久的损害。Hg²⁺废水污染物是构成水体污染的重要组成部分，排入水中的无极汞污染物不能被生物降解，而是参与食物链循环，可被微生物转化为毒性更强的甲基汞，在生物体内大量富集后经过食物链(尤其是鱼类)进入人体，严重威胁着人类的健康，可造成中枢神经系统、内分泌系统及脑部的损害，此外，它可能还会破坏人体免疫系统，甚至导致死亡。为此，美国环境保护署提出了饮用水中汞的最大容许值为10nM。

因此，建立灵敏、准确、高效的可同时检测As³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺的分析方法对于环境监测、食品安全和生物医药等领域至关重要。

目前，用于同时检测As³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺的检测方法非常少，远远少于单个离子的检测方法。对于单一金属离子的检测，传统技术主要包括电感耦合等离子体质谱法(ICP-AES)、原子吸收/发射光谱法和极谱法等方法。但是，这些方法常常需要复杂的专业操作、耗时的分析和贵重的仪器设备等，限制了它们在资源有限的环境中的使用。由于荧光传感技术具有灵敏、简单、快捷等优点而得到日益广泛的研究。不可否认，文献报道的方法存在检测灵敏度不高、选择性不强等问题。为了克服这些缺点，迫切需要开发出既简单、灵敏、又经济、高效的测定方法来满足环境、生物、医药等领域对于As³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺的同时检测的需求。

据文献报道，当金属离子进入错配的DNA碱基对时，金属离子和DNA碱基对之间会产生一种吸引力，将它们结合在一起。例如，Hg²⁺能够选择性地识别胸腺嘧啶碱基并形成强而稳定的胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶配位复合物。与汞离子类似，铅离子也能够特异性地和核苷酸发生作用，由于富含鸟嘌呤碱基的核酸分子对铅离子具有很强的亲和力，通过特异性的配位作用与铅离子结合而形成结构稳定的Pb²⁺-G-四链体，可以实现对铅离子高选择性、高灵敏的检测。对于As³⁺而言，可以与其核酸适配体特异性结合，但有关适配体的报道比较少见。

正是由于As³⁺对核酸适配体、Hg²⁺和Pb²⁺分别对富含胸腺嘧啶、鸟嘌呤碱基的功能核酸分子的亲和力高、特异性强的识别作用而形成结构稳定的金属离子-核酸分子配位复合物，该作用对于这3种金属离子的高灵敏、高特异性检测具有重要意义。本发明根据As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的这一反应特性，将其分别与核酸适配体、富含胸腺嘧啶、鸟嘌呤的核酸生物分子相结合，巧妙地应用到具有中空、多孔结构的纳米材料领域，同时，为了进一步提高As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的检测灵敏度，在生物识别技术的基础上，又结合了生物酶的剪切作用，使靶标As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺得到循环利用，最终使检测信号得到显著放大，为As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的同时、高灵敏检测提供了新型、特异、高效的检测技术。

迄今为止，采用中空多孔纳米材料、利用多种功能核酸生物分子构建纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于细胞内As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的同时荧光成像技术还未见文献报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，针对基于多种功能核酸生物分子识别技术的纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于同时检测As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的技术未见报道，因此，本发明的第一目的：提出并构建一种新型的可同时检测As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的纳米胶囊-核酸生物分子复合物，具体是利用中空、多孔的纳米金作为纳米胶囊，分别筛选、设计并合成易于修饰、方便合成的、可被As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺识别的核酸生物分子，并将其分别组装到纳米胶囊表面，一方面作为堵孔材料用于封堵纳米胶囊的孔口，防止孔内物质的外泄；另一方面分别作为As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的识别分子可与As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺发生特异性的识别反应，其中，Hg²⁺和Pb²⁺可分别形成T-Hg²⁺-T碱基对复合物、Pb²⁺-G-四链体复合物，在形成金属离子-核酸分子配位复合物的同时发生构象转化而脱离纳米胶囊表面，从而使封堵的孔口被打开，纳米胶囊内的染料分子得以释放，分离上清液，在一定波长的激发光照射下产生荧光信号，根据荧光发射信号的强弱实现对As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的同时检测。在本发明中，为了进一步提高同时检测As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的灵敏度，在分子识别的基础上，本发明又利用外切酶的剪切作用实现了荧光信号的循环放大。该循环放大技术利用了核酸外切酶可对具有双链结构的金属离子-核酸生物分子配位复合物进行剪切的作用，将As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺释放，释放出来的As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺能够再次与纳米胶囊表面的生物识别分子发生识别反应，然后再次被剪切……，循环往复，结果使As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺得到多次循环利用，更多的孔口被打开，释放出更多的孔内物质。正是由于剪切酶的作用，As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺被循环利用，使检测灵敏度得到显著提高。该技术可实现对于含量低至痕量的As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺样品的高灵敏、高选择性的同时检测。即便样品中同时含有极微量的As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺，也能够获得令人满意的检测结果。本发明的第二目的：提供一种细胞内As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的同时荧光成像方法。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的可同时检测As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的纳米胶囊-核酸生物分子复合物是以中空、多孔结构的纳米金作为纳米胶囊，利用其中空、多孔的结构特性，在其内部分别装载客体分子如荧光染料；为了实现对As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的同时检测，分别筛选、设计并合成了3种核酸生物识别分子，通过对碱基种类及其数量的选择，确保其对且仅对目标金属离子As³⁺、Hg²⁺或Pb²⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应。在此基础上，又对采用的3种荧光信号分子进行了相关的实验和筛选，为了克服同时采用的3种荧光分子之间的相互干扰和使用条件的限制，综合考虑溶解性好、荧光强、Stokes位移大、光学性质稳定、信噪比高、无光漂白、受环境影响小、生物相容性好等性能，最终选择采用的荧光染料优选罗丹明B、异硫氰酸荧光素FITC和荧光素Cy5。结果表明，这3种荧光信号分子的选择和使用成为本发明的关键条件之一。为了实现生物分子对As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的特异性识别，同时也为了防止荧光信号分子的泄漏，本发明筛选并合成了可分别被As³⁺和Pb²⁺识别的生物分子，设计并合成了可被Hg²⁺识别的生物分子，并将它们分别组装到纳米胶囊表面用于封堵孔口，起到防止孔内荧光分子外泄的作用；其中，特异性识别As³⁺的碱基序列为：5’-GGTAATACGACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATTTTA CAG AAC AAC CAA CGT CGC TCC GGG TAC TCC TTC TTCATC GAGATAGTAAGT GCAATC C-3’(P1)；富含鸟嘌呤碱基的特异性识别Pb²⁺的碱基序列为：5’-GGT GGT GGT GGT TGT GGTGGT GGT GG-3’(P2)；可识别Hg²⁺的富含胸腺嘧啶的生物分子是经过特别设计并合成的、具有特定碱基长度的核酸生物分子，其碱基序列为：5’-TTT GTT TGT TGG CCC CCC TTC TTTCTTA-3’(P3)；由于这3种序列对且仅对相应的金属离子有响应，因此，该检测体系能够完全避免相互干扰，确保同时检测的准确性和特异性。

作为可分别识别As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的3种核酸生物分子是通过静电作用被分别组装到中空、多孔结构的纳米金表面，而纳米金表面则需要通过采用正电荷修饰剂进行预先修饰，优选采用地正电荷修饰剂是聚二烯丙基二甲基氯化铵。当靶标As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺存在时，被组装到纳米胶囊表面的核酸生物分子分别对As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺发生特异性的响应，3种离子分别与其相应的核酸生物分子特异性结合，使其构象发生改变，从纳米胶囊表面脱落，使封堵的孔口被打开，从而导致RhB、异硫氰酸荧光素FITC和Cy5从纳米胶囊内部被释放出来。对释放出的3种荧光染料分别给予相应波长的激发，均得到显著增强的3种染料的荧光信号。当加入不同浓度的As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺时，荧光信号与加入的离子浓度呈现良好的响应关系。因此，根据测得的荧光信号强度就可以实现对As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的同时检测。

一种制备本发明提出的细胞内As³⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的同时荧光成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物的方法，包括如下步骤：

(1)分别筛选、设计并合成3种核酸生物识别分子，确保其分别对且仅对目标金属离子As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应；

(2)在具有中空、多孔结构的纳米金溶液中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液清洗；

(3)加入荧光素Cy5溶液，10-12h后加入可识别As³⁺的核酸生物分子溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别As³⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-GGTAATACGACT CAC TATAGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT TTA CAG AAC AAC CAA CGT CGC TCC GGG TAC TCCTTC TTCATC GAGATAGTAAGT GCAATC C-3’；

(4)在(2)步产物中加入罗丹明B溶液，10-12h后加入可识别Pb²⁺的核酸生物分子溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别Pb²⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-GGT GGT GGT GGT TGTGGT GGT GGT GG-3’；

(5)在(2)步产物中加入异硫氰酸荧光素FITC溶液，10-12h后加入可识别Hg²⁺的核酸生物分子溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别Hg²⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-TTT GTT TGT TGG CCCCCC TTC TTT CTTA-3’；

(6)将(3)步、(4)步和(5)步所得产物分别用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液稀释后混合，离心分离，即可制得细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物。

一种本发明提出的细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像方法，包括以下步骤：

(1)取适量细胞悬浮液，用含有As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的溶液对细胞进行培养后离心，移除上清液；

(2)加入本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物溶液进行细胞孵育，10-50min后分别给予相应波长的激发进行细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的激光共聚焦扫描成像，所述的细胞是Hela细胞。

本发明的有益效果：本发明提出的可用于细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺同时成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物不但能够实现细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像，还能够实现对As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时检测，解决了目前检测及成像技术不足、难以高效、灵敏、经济、快捷地同时进行多种离子的荧光成像问题。尤为重要的是，本发明克服了传统技术缺陷，无需再对核酸生物分子进行任何荧光标记，完全避免了对核酸生物分子性能的影响；本发明通过简单高效地可控释放及特异性的生物识别技术，建立了多种危害严重的重金属污染物的同时检测及成像技术，灵敏度得到显著增强。

结果表明，与现有技术相比，采用该体系同时检测As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺，可同时实现对As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的高灵敏、高选择性的检测。而且，所采用的3种核酸生物识别分子分别对且仅对目标金属离子As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应。当样品中仅含其中一种金属离子As³⁺、Pb²⁺或Hg²⁺时，该体系也能灵敏地检测出所含金属离子对应的荧光信号。因此，本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物除了用于As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时检测及成像，也可用于仅含As³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺或其中2种离子样品的单独或同时检测及成像，所有这些体系均能获得高灵敏、高选择性的检测及成像结果。

本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物具有结构简单、易合成、性能优异、稳定、适用范围广、高效、灵敏等优点，并且不会受到其它常见干扰物质如Cd²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺等金属离子的影响，同时，As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺相互之间也不存在干扰；具有高的特异性和选择性。实验结果表明，相比于传统的技术方法，采用本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物对As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺进行了同时检测，显示出高灵敏度和优异的选择性，与文献值相比，本发明对As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时检测在确保高特异性的前提下，灵敏度得到显著提高，提高10倍以上，同时，还获得了对3种离子更宽的线性检测范围。可以预见，本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物及其制备方法和检测成像技术具有巨大的医学应用潜力和广阔的应用前景，将在重大疾病的早期诊断与治疗以及食品、生物医药、环境监测等领域发挥重要的作用。

附图说明

图1.Hela细胞中As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的荧光成像亮场照片。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实验仪器：THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；F-4600荧光分光光度计(日立，日本)；Leica TCS SP5 II激光共聚焦扫描仪(德国莱卡公司)。

实验试剂：罗丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；异硫氰酸荧光素FITC、荧光素Cy5(Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)；聚二烯基丙二甲基氯化铵、硫酸汞、硝酸铅(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；亚砷酸钠母液、5’-GGTAATACGACT CAC TAT AGGGAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT TTA CAG AAC AAC CAA CGT CGC TCC GGG TAC TCC TTCTTC ATC GAGATAGTAAGT GCAATC C-3’(P1)、5’-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3’(P2)、5’-TTT GTT TGT TGG CCC CCC TTC TTT CTTA-3’(P3)(上海生工生物工程股份有限公司)；Tris-HCl缓冲溶液pH＝7.4，浓度为0.05M(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

实施例1：

一种可用于细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物的制备方法，包括如下步骤：

(2)在400μL具有中空、多孔结构的纳米金载体溶液中加入200μL 11.664mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，37℃10h后离心分离，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液清洗；

(3)加入荧光分子Cy5溶液2μL(终浓度1.0×10^-5mol/L)，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液稀释至100μL，37℃10h后加入10μL可识别As³⁺的核酸生物分子溶液(终浓度1.0×10^-7mol/L)，37℃10h后离心分离，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别As³⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-GGTAATACGACT CAC TATAGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT TTA CAG AAC AAC CAA CGT CGC TCC GGG TAC TCCTTC TTCATC GAGATAGTAAGT GCAATC C-3’(P1)；

(4)在(2)步产物中加入罗丹明B溶液2μL(终浓度1.0×10^-5mol/L)，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液稀释至100μL，37℃10h后加入10μL可识别Pb²⁺的核酸生物分子溶液(终浓度1.0×10^-6mol/L)，37℃10h后离心分离，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别Pb²⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-GGT GGT GGT GGT TGTGGT GGT GGT GG-3’(P2)；

(5)在(2)步产物中加入异硫氰酸荧光素FITC溶液2μL(终浓度1.0×10^-4mol/L)，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液稀释至100μL，37℃10h后加入10μL可识别Hg²⁺的核酸生物分子溶液(终浓度1.0×10^-6mol/L)，37℃10h后离心分离，用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别Hg²⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-TTT GTT TGT TGG CCCCCC TTC TTT CTTA-3’(P3)；

(6)将(3)步、(4)步和(5)步所得产物分别用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液稀释后混合，离心分离，即可制得细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺同时荧光成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物；

所述的具有中空、多孔结构的纳米金材料按文献方法获得(W.Wang,C.Chen,X.Li,S.Y.Wang and X.L.Luo.Chem.Commun.,2015,51,9109–9112.)。

实施例2:

一种细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像的方法，包括以下步骤：

(1)取适量细胞悬浮液，离心分离，移除上清液，加入300μL含有As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的、终浓度均为1.0×10^-11M的溶液培养细胞，37℃、20.0min后离心，移除上清液；

(2)用pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液稀释实施例1中制得的纳米胶囊-核酸生物分子复合物，将其加入到上步处理好的细胞中，置于37℃恒温水浴箱孵育细胞15.0min；

(3)将孵育好的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上，分别采用激发波长649nm、559nm、488nm进行细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的激光共聚焦扫描成像；

其中，所述的细胞是Hela细胞。

实验结果表明，本发明通过简单高效地可控释放及特异性的生物识别技术，提出了多种危害严重的重金属污染物的同时检测及成像技术，灵敏度得到显著增强。利用本发明提出的方法，在As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺离子浓度低至1.0×10^-11mol/L时，仍然获得了显示离子存在的清晰的细胞荧光成像照片。

本发明提出的可用于细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺同时成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物不但能够实现细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像，还能够实现对As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时检测，解决了目前检测及成像技术不足、难以高效、灵敏、快捷地同时进行多种离子的荧光成像问题。尤为重要的是，本发明克服了传统技术缺陷，无需再对核酸生物分子进行任何荧光标记，完全避免了对核酸生物分子性能的影响。采用该体系同时检测As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺，获得的线性检测范围分别为：5.0×10^-12～1.0×10^-10mol/L、1.0×10^-13～8.0×10^- ¹¹mol/L和5.0×10^-13～8.0×10^-11mol/L。由于本发明采用的3种核酸生物识别分子分别对且仅对目标金属离子As³⁺、Pb²⁺或Hg²⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应，具有高的特异性和选择性。因此，本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物不但能够同时对As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺检测及成像，还可用于仅含As³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺或其中2种离子的检测及成像，均能获得高灵敏、高选择性的检测及成像结果。

采用本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像，具有结构简单、生物相容性好、设计巧妙、制备简单、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺特异性强、响应时间短、便于实时监测等诸多优点，并且不会受到其它常见干扰物质如Cd²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺等金属离子的影响，能够方便、快捷地实现细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的高灵敏、高选择性的同时荧光成像。

可以预见，本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物及其制备方法和检测成像技术具有巨大的医学应用潜力和广范的应用前景，将在重大疾病的早期诊断与治疗以及食品卫生、生物医药、环境监测等领域发挥重要的作用。

序列表

<110> 青岛科技大学

<120> 一种细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttttacagaa caaccaacgt 60

cgctccgggt actccttctt catcgagata gtaagtgcaa tcc 103

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgtttgtt ggcccccctt ctttctta 28

Claims

1.一种细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像方法，其特征在于该方法采用了一种由3种核酸生物识别分子、3种荧光信号分子和具有中空、多孔结构的纳米金构建而成的纳米胶囊-核酸生物分子复合物。

2.一种如权利要求1所述的细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的3种核酸生物识别分子分别是5’-GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCTTAT TCA ATT TTA CAG AAC AAC CAA CGT CGC TCC GGG TAC TCC TTC TTC ATC GAG ATAGTA AGT GCA ATC C-3’、5’-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3’和5’-TTT GTT TGTTGG CCC CCC TTC TTT CTT A-3’。

3.一种如权利要求1所述的细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的3种荧光信号分子分别是荧光素Cy5、RhB和异硫氰酸荧光素FITC。

4.一种如权利要求1所述的细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的3种核酸生物识别分子是通过静电作用被分别组装到具有中空、多孔结构的纳米金表面。

5.一种如权利要求1所述的细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的同时荧光成像方法，其特征在于步骤如下：

(2)加入本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物溶液进行孵育，10-50min后分别给予相应波长的激发进行细胞内As³⁺、Pb²⁺和Hg²⁺的荧光成像；

其中，所述的纳米胶囊-核酸生物分子复合物的制备方法，步骤如下：

其中，所述的可识别As³⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-GGT AAT ACG ACT CAC TATAGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT TTA CAG AAC AAC CAA CGT CGC TCC GGG TAC TCCTTC TTC ATC GAG ATA GTA AGT GCAATC C-3’；

其中，所述的可识别Pb²⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-GGT GGT GGT GGT TGT GGTGGT GGT GG-3’；

其中，所述的可识别Hg²⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-TTT GTT TGT TGG CCC CCCTTC TTT CTT A-3’；