CN103808704A - 基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法 - Google Patents
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Abstract
基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法,属于分析化学技术领域;其特征在于利用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗的残留量;检测步骤包括:金纳米粒子(AuNPs)的制备;通过测定荧光光谱图和紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应;运用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗并进行实际样品的检测,该方法可简单、快速、灵敏的检测盐酸克伦特罗,并且有很高的灵敏度,为以后的研究、生产、监管等提供了方便。
Description
技术领域
基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法,属于分析化学技术领域。
背景技术
盐酸克伦特罗又称“瘦肉精”,是一种中毒蓄积性平喘药,是肾上腺类神经兴奋剂。美国一家公司曾意外发现,盐酸克仑特罗可明显促进动物生长,并增加瘦肉率。这一新发现很快被一些国家用于养殖业,在饲料中添加盐酸克仑特罗后,可使猪等畜禽生长速率、饲料转化率、胴体瘦肉率提高。由于瘦肉的价格高于肥肉,养殖户便愿意使用瘦肉精来养殖生猪,以提高瘦肉率。
但是,如果含有“盐酸克伦特罗”的猪肉如果被人食用后,会有急性中毒症状,若不及时抢救有可能导致心率失常而猝死。
2011年3月,媒体曝光了双汇“瘦肉精”事件,河南省孟州市等地养猪场采用违禁动物药品“瘦肉精”饲养生猪,有毒猪肉流入济源双汇食品有限公司。事件经相关媒体曝光后,引发广泛关注。瘦肉精有着较强的毒性,长期使用有可能导致染色体畸变,诱发恶性肿瘤。
然而,早在2002年9月10日,农业部、卫生部、国家药品监督管理局发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》,盐酸克仑特罗等7种“瘦肉精”列为禁用药品。非法添加物严重影响了人类健康,这一事件的发生又一次敲响了重视食品安全的警钟。
目前,盐酸克伦特罗的检测手段主要包括液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、酶联免疫法(ELISA)等。尽管这些方法灵敏度高,这些方法需要昂贵的设备,测定时间较长,成本高,需要专业技术人员操作,不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测盐酸克伦特罗。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于荧光共振能量转移利用罗丹明B和金纳米粒子快速检测盐酸克伦特罗的方法,以快速、简单、灵敏的检测盐酸克伦特罗的残留量。
技术问题:基于荧光共振能量转移利用罗丹明B和金纳米粒子快速检测盐酸克伦特罗的方法基于以下原理:
金纳米粒子的最大吸收波长在522nm,其光谱较宽;在510nm激发下,罗丹明B的荧光发射波长在573nm,两者的光谱具有较好的重叠。罗丹明在510nm被激发后,可在573nm左右发射荧光。罗丹明B在pH小于6时带正电荷,而柠檬酸根修饰的金纳米粒子带负电荷,在金纳米粒子体系中加入罗丹明B时,罗丹明B和金纳米粒子之间的静电作用将两者间的距离拉近,罗丹明B发射的荧光被金纳米粒子吸收,能量从供体(罗丹明B)向受体(金纳米粒子)转移,实现了荧光猝灭。
当在体系中添加盐酸克伦特罗之后,研究发现盐酸克伦特罗对罗丹明B的荧光没有影响。但是,盐酸克伦特罗可以竞争性的与金纳米粒子结合,通过盐酸克伦特罗之间的氢键作用,使金纳米粒子发生团聚,干扰了罗丹明B和金纳米粒子之间的荧光共振能量转移,从而实现了罗丹明B的荧光恢复。
本发明的技术方案:
包括以下步骤:金纳米粒子(AuNPs)的制备;分别对AuNPs和AuNPs、盐酸克伦特罗体系进行透射电镜表征;通过测定荧光光谱图和紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应;运用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗并进行实际样品的检测。
(1)金纳米粒子(AuNPs)的制备
制备时,向洁净的装有回流装置的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸100mL,在磁力搅拌的情况下使其沸腾,紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠10mL,边加热边搅拌,待溶液由淡黄色变成酒红色,反应持续10分钟,停止加热,溶液冷却至室温后,4℃保藏,所制得的金纳米粒子粒径为13nm。
(2)分别对AuNPs和AuNPs、盐酸克伦特罗体系进行透射电镜表征
①样品制备
吸取13nm金纳米粒子200μL,娃哈哈纯净水800μL于2mL离心管中,作为对照,另一离心管中分别吸取13nm金纳米粒子200μL,娃哈哈纯净水700μL和1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,在25℃下同时培养10min;将两种样品分别滴于两个铜网上,室温晾干备用;
②参数
用TECNAI F20透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜。
(3)通过测定荧光光谱图和紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应
取五个2.0mL的离心管,编号为a,b,c,d,e,分别依次加入,a管(0.4μM罗丹明B20μL,980μL娃哈哈纯净水),b管(0.4μM罗丹明B20μL,1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,880μL娃哈哈纯净水),c管(0.4μM罗丹明B20μL,1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,13nm的金纳米粒子200μL,680μL娃哈哈纯净水),d管(1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,13nm的金纳米粒子200μL,700μL娃哈哈纯净水),e管(0.4μM罗丹明B20μL,13nm的金纳米粒子200μL,780μL娃哈哈纯净水),然后将混合物在25℃下培养10min,测紫外吸收图。
另取四个2.0mL的离心管,编号为a,b,c,d,分别依次加入,a管(0.4μM罗丹明B20μL,980μL娃哈哈纯净水),b管(0.4μM罗丹明B20μL,1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,880μL娃哈哈纯净水),c管(0.4μM罗丹明B20μL,1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,13nm的金纳米粒子200μL,680μL娃哈哈纯净水),d管,(0.4μM罗丹明B20μL,13nm的金纳米粒子200μL,780μL娃哈哈纯净水),然后将混合物在25℃下培养10min,测荧光吸收光谱。
(4)检测盐酸克伦特罗所用体系的制备:
实验组中,向含有200μL13nm金纳米粒子(6.62nM,pH=6.5)的体系中,分别加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液,室温反应10min后,在体系中加入20μL0.4μM的罗丹明B;根据[(F0-F)/F0]与盐酸克伦特罗的浓度建立标准曲线。对照组中,不添加盐酸克伦特罗,其它试剂与实验组相同。
所用盐酸克伦特罗标准品的浓度依次为:0.2,0.4,0.6,0.8,1.1,1.4,1.5,1.8μg·mL-1。本发明中,盐酸克伦特罗的检出限为3.96×10-3μg/mL,线性范围为0.2μg/mL-1.8μg/mL。
(5)实际样品检测:取仔猪饲料进行实际样品检测。
称取1g饲料加入25mL离心管中,加入3mL丙酮和1mol/L氢氧化钠混合溶液(体积比为9:1),超声5min,混合样品在10000r,5℃离心10min,重复3次,收集上清液,旋转蒸发至干,溶解在1mL娃哈哈纯净水中,再加入1mL正己烷除去脂肪,5℃,10000r离心5min,剩余的水溶液用于分析。分析中,将提取的水溶液稀释20倍,等分为10份,如权利要求5所述的方法,加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液进行测定。
本发明的有益效果:
本发明制备了金纳米粒子,并建立了一个简单、快速、灵敏的基于荧光共振能量转移原理的方法,能够快速检测盐酸克伦特罗,为今后的监管提供了方便。
附图说明
图1透射电镜图:金纳米粒子;
图2透射电镜图:1.6μg/mL的盐酸克伦特罗与金纳米粒子的混合体系;
图3不同体系的荧光光谱图:a,RB;b;RB and clenbuterol;c,mixture of RB-AuNPs and clenbuterol;d,RBand AuNPs。RB,0.4μM;AuNPs,6.62nM;clenbuterol,1.6μg·mL-1;
图4不同体系的紫外吸收光谱图:a,RB;b,RB and clenbuterol;c,mixture of RB-AuNPs and clenbuterol;d,AuNPs and clenbuterol;e,RB and AuNPs;RB,0.4μM;AuNPs,6.62nM;clenbuterol,1μg·mL-1;
图5含有不同浓度的盐酸克伦特罗(0.2,0.4,0.6,0.8,1.1,1.4,1.5,1.8μg·mL-1)的RB-AuNPs体系的荧光光谱图以及以RB-AuNPs体系为参照的盐酸克伦特罗的标准曲线图。
具体实施方式
金纳米粒子AuNPs的制备
材料/试剂:氯金酸和柠檬酸三钠购自北京化工厂。
方法:制备时,向洁净的装有回流装置的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸100mL,在磁力搅拌的情况下使其沸腾,紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠10mL,边加热边搅拌,待溶液由淡黄色变成酒红色,反应持续10分钟,停止加热,溶液冷却至室温后,4℃保藏。
结果:经透射电镜表征,所制得的金纳米粒子粒径为13nm,且分散性良好,粒径均匀。
由于实验所用的体系受到金纳米粒子浓度的影响,所以需要研究金纳米粒子浓度对反应体系的影响。
材料/试剂:13nm的金纳米粒子;罗丹明B购自生工生物(上海)公司。
方法:取编号为a,b,c的三组洁净的2.0mL试管(每组10个),每组试管编号依次为1-10,a组中分别依次加入5.01nM的金纳米粒子200μL,再依次加入不同浓度的盐酸克伦特罗(0.2,0.4,0.6,0.8,1.1,1.4,1.5,1.8,2,2.3μg·mL-1)100μL,将混合物在25℃下培养10min,然后,再依次加入0.4μM RB20μL,并用娃哈哈纯净水将体系稀释到1mL,测荧光光谱图;b组中所用金纳米粒子的浓度为6.62nM,c组为7.82nM,其它操作同a组。
结果:结果表明,体系中选用金纳米粒子浓度6.62nM为最佳。
该方法用于盐酸克伦特罗检测
材料/试剂:13nm的金纳米粒子;罗丹明B购自生工生物(上海)公司;宰猪饲料购自于当地市场。
方法:
(1)金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗:向含有200μL13nm金纳米粒子(6.62nM,pH=6.5)的体系中,分别加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液,室温反应10min后,在体系中加入20μL0.4μM的罗丹明B,罗丹明B的荧光强度抑制程度将随着盐酸克伦特罗浓度的不同而不同。
(2)所用盐酸克伦特罗标准品的浓度依次为:0.2,0.4,0.6,0.8,1.1,1.4,1.5,1.8μg·mL-1,通过测定对照组和实验组的荧光光谱,计算(F0-F)/F0。其中,F0为对照组的荧光值,F为加入盐酸克伦特罗之后的荧光值。
(3)实际样品检测:取仔猪饲料进行实际样品检测。
称取1g饲料加入25mL离心管中,加入3mL丙酮和1mol/L氢氧化钠混合溶液(体积比为9:1),超声5min,混合样品在10000r,5℃离心10min,重复3次,收集上清液,旋转蒸发至干,溶解在1mL娃哈哈纯净水中,再加入1mL正己烷除去脂肪,5℃,10000r离心5min,剩余的水溶液用于分析。分析中,将提取的水溶液稀释20倍,等分为10份,如权利要求5所述的方法,加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液进行测定。
结果:根据[(F0-F)/F0]与盐酸克伦特罗的浓度建立标准曲线,盐酸克伦特罗的检出限为3.96×10-3μg/mL,线性范围为0.2μg/mL-1.8μg/mL,加标回收试验结果见下表。
Claims (6)
1.基于荧光共振能量转移检测盐酸克伦特罗的方法,其特征在于利用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗的残留量,包括以下步骤:金纳米粒子(AuNPs)的制备;通过测定荧光光谱图和紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应;运用金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗并进行实际样品的检测。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述金纳米粒子(AuNPs)的制备和透射电镜表征步骤如下:
制备时,向洁净的装有回流装置的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸100mL,在磁力搅拌的情况下使其沸腾,紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠10mL,边加热边搅拌,待溶液由淡黄色变成酒红色,反应持续10分钟,停止加热,溶液冷却至室温后,4℃保藏,所制得的金纳米粒子粒径为13nm;
①样品制备
吸取13nm金纳米粒子200μL,娃哈哈纯净水800μL于2mL离心管中,作为对照,另一离心管中分别吸取13nm金纳米粒子200μL,娃哈哈纯净水700μL和1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,在25℃下同时培养10min;将两种样品分别滴于两个铜网上,室温晾干备用;
②参数
用TECNAI F20透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述通过测定紫外吸收光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应的步骤如下:
取五个2.0mL的离心管,编号为a,b,c,d,e,分别依次加入,a管(0.4μM罗丹明B20μL,980μL娃哈哈纯净水),b管(0.4μM罗丹明B20μL,1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,880μL娃哈哈纯净水),c管(0.4μM罗丹明B20μL,1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,13nm的金纳米粒子200μL,680μL娃哈哈纯净水),d管(1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,13nm的金纳米粒子200μL,700μL娃哈哈纯净水),e管(0.4μM罗丹明B20μL,13nm的金纳米粒子200μL,780μL娃哈哈纯净水),然后将混合物在25℃下培养10min,测紫外吸收图。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述通过测定荧光光谱图观察罗丹明B、金纳米粒子和盐酸克伦特罗体系的反应的步骤如下:
取四个2.0mL的离心管,编号为a,b,c,d,分别依次加入,a管(0.4μM罗丹明B20μL,980μL娃哈哈纯净水),b管(0.4μM罗丹明B20μL,1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,880μL娃哈哈纯净水),c管(0.4μM罗丹明B20μL,1.6μg/mL的盐酸克伦特罗100μL,13nm的金纳米粒子200μL,680μL娃哈哈纯净水),d管(0.4μM罗丹明B20μL,13nm的金纳米粒子200μL,780μL娃哈哈纯净水),然后将混合物在25℃下培养10min,测荧光吸收光谱。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述金纳米粒子对罗丹明B的荧光猝灭作用方法检测盐酸克伦特罗的步骤如下:
向含有200μL13nm金纳米粒子(6.62nM,pH=6.5)的体系中,分别加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液,室温反应10min后,在体系中加入20μL0.4μM的罗丹明B,罗丹明B的荧光强度抑制程度将随着盐酸克伦特罗浓度的不同而不同。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述实际样品的检测是取仔猪饲料进行的:称取1g饲料加入25mL离心管中,加入3mL丙酮和1mol/L氢氧化钠混合溶液(体积比为9:1),超声5min,混合样品在10000r,5℃离心10min,重复3次,收集上清液,旋转蒸发至干,溶解在1mL娃哈哈纯净水中,再加入1mL正己烷除去脂肪,5℃,10000r离心5min,剩余的水溶液用于分析;分析中,将提取的水溶液稀释20倍,等分为10份,如权利要求5所述的方法,加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液进行测定;根据[(F0-F)/F0]与盐酸克伦特罗的浓度建立标准曲线,盐酸克伦特罗的检出限为3.96×10-3μg/mL,线性范围为0.2μg/mL-1.8μg/mL。
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