CN107121420B - 一种基于钙黄绿素-罗丹明b-金离子体系检测s2-的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于钙黄绿素‑罗丹明B‑金离子体系检测S2‑的方法,向钙黄绿素‑罗丹明B‑金离子的水溶液中加入不同体积的S2‑溶液,在450nm激发波长下,测试体系的荧光强度,通过S2‑离子淬灭钙黄绿素‑罗丹明B‑金离子的水溶液的荧光来实现对S2‑的检测。该方法操作简单、检测限低,能够快速准确的实现对S2‑的检测,并且能够排除其他离子的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于钙黄绿素-罗丹明B-金离子体系检测S2-的方法。
背景技术
随着我国经济建设的不断发展,空气、水体等这些环境污染已经严重危害到人类赖以生存的家园。而其中含硫化合物的排放对水体污染最为严重,这已经严重威胁到人类的健康与生存发展。对人体而言,天然的单质硫虽然对人体是无毒无害的,但稀硫酸、硫酸盐、亚硫酸和亚硫酸盐等含硫化合物是有毒的,除此之外,硫化物也通常有剧毒,浓硫酸会腐蚀人体皮肤。研究发现含硫(S2-) 废水不仅会造成水生动物、水生植物的死亡,还会危害人类的健康,甚至会腐蚀存放在水体中的一些金属设备。
荧光共振能量转移(荧光共振)是现代分子荧光光谱研究的重要发展方向之一。作为一种光谱技术,荧光共振能量转移已广泛应用于各个研究领域,FRET 供体和受体生色团之间已广泛应用于研究生物大分子及其配体、发展目标分析物的测定新方法之间的相互作用机制。特别是应用在结构生物学和分析化学当中,荧光共振能量转移(荧光共振)用来提高荧光探针的选择性和灵敏度。
众所周知,硫离子(S2-)广泛分布在自然水和废水中,硫离子(S2-)的浓度是一项重要的环境指数和水生污染指数,到目前为止,有很多传统的方法用于检测硫离子(S2-)的浓度,传统的方法包括电化学、色谱法、光谱法、滴定法和重量分析法等,这些检测方法应用于硫离子(S2-)的检测报告中,虽然这些硫离子的方法有一定的选择性,但是这些方法对硫离子(S2-)检测是十分复杂和耗时的,此外,这些检测方法往往高成本,低敏感性。
因此,设计一款具有高敏感性和高选择性的探针对S2-离子浓度的检测来说是十分必要的。由于荧光传感器操作简便,污染性低、超高的灵敏度等特点而引起了科研工作者的极大关注。
发明内容
基于上述背景,本发明提供了一种基于钙黄绿素-罗丹明B-金离子体系检测 S2-的方法,该方法操作简单、检测限低,能够快速准确的实现对S2-的检测,并且能够排除其他离子的干扰。
本发明提供的技术方案为:
一种基于钙黄绿素-罗丹明B-金离子体系(Calcein@RhB/Au(III)体系)检测 S2-的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)配制钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液;
(2)向步骤(1)得到的钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液中加入不同体积的S2-溶液,稀释,搅拌反应25min;
(3)在450nm激发波长下,测试体系的荧光强度,通过S2-离子淬灭钙黄绿素 -罗丹明B-金离子的水溶液的荧光来实现对S2-的检测。
所述方法进一步包括:以体系的荧光猝灭效率为纵坐标,S2-浓度为横坐标,进行曲线拟合,得到线性方程,根据线性方程即可定量计算出任意荧光猝灭效率下的S2-浓度。
所述线性方程为F0/F=1.20484+0.06366[S2-],线性相关系数R2为0.996;其中F0、F分别为加入S2-前后体系在590nm波长处的荧光强度值;F0/F表示体系的荧光淬灭效率。
所述钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液的pH为5.9。
进一步地,所述步骤(1)具体包括以下步骤:
分别取100μL 10-5mol/L的钙黄绿素和1000μL 10-4mol/L的罗丹明B混合,加入200μL 10-4mol/L氯金酸溶液,然后加入100μL PBS缓冲溶液,调节pH 至5.9,搅拌反应25分钟,制得钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液。
所述步骤(2)中,体系中S2-的最终浓度分别为0、0.1μmol/L、0.8μmol/L、 3μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、13μmol/L、16μmol/L、19μmol/L、22μmol/L、24μmol/L、 26μmol/L。
所述步骤(2)具体包括:向步骤(1)得到的钙黄绿素-罗丹明B-Au(III)的水溶液中,分别加入0μL、1μL、8μL、30μL、50μL、80μL、130μL、160μL、 190μL、220μL、240μL、260μL浓度为10-3mol/L的S2-溶液,用去离子水稀释至10mL,混合搅拌25min。
所述方法的检测限为0.2μmol/L。
所述方法可以排除其他离子的干扰,所述其他离子包括SO3 2-、HPO4 2-、Ac-、 NO2 -、F-、SO4 2-、NO3 -、Cl-、I–或CO3 2-。
钙黄绿素的荧光发射波长(520nm)与罗丹明B吸收波长(552nm)有很好的重叠,为钙黄绿素和罗丹明B之间的能量转移提供了非常好的光谱条件。在微量的Au(III)离子存在下,S2-能够有效地猝灭Calcein@RhB/Au(III)体系的荧光发射。
这主要是由于微量的S2-使Au(III)还原成纳米单质金(AuNPs),AuNPs既能够猝灭给体钙黄绿素的荧光,使受体罗丹明B得不到足够的能量激发,同时 AuNPs又能猝灭罗丹明B的荧光发射,导致罗丹明B受到双重猝灭作用。在一定实验条件下,加入的S2-浓度与猝灭程度具有良好的线性关系(R2=0.996),线性范围是0.1~26μmol L-1。因此,本发明建立了一种基于荧光共振能量转移猝灭法快速高效测定S2-的新方法。
附图说明
图1为钙黄绿素的荧光光谱与罗丹明B的紫外吸收光谱图;
图2为钙黄绿素、罗丹明B、钙黄绿素@罗丹明B的荧光光谱图;
图3为Au(III)对Calcein@RhB体系的影响;
图4为S2-对Calcein@RhB/Au(III)体系的影响;
图5为Au(III)、S2-、Au(III)+S2-的紫外吸收光谱图;
图6为Calcein@RhB/Au(III)体系加入不同浓度硫离子(0μmol L-1~26μmol L-1)后的的荧光图谱;
图7为体系的荧光强度随加入的S2-浓度的变化趋势图;
图8为Calcein@RhB/Au(III)体系加入不同浓度硫离子(0μmol L-1~26μmol L-1)后的线性关系图;
图9为Calcein@RhB/Au(III)体系检测硫离子的干扰图,其中0代表SO3 2-、 1代表HPO4 2-、2代表Ac-、3代表NO2 -、4代表F-、5代表SO4 2-、6代表NO3 -、 7代表Cl-、8代表I-、9代表CO3 2-、10代表未加其他离子,只加入了S2-;
图10为反应时间对体系荧光强度的影响;
图11为pH对体系荧光猝灭效率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明。
本发明所使用的仪器为日立F-4500型荧光分光光度计,所有试剂均为分析纯;本发明中所有的阴离子均是相对应的钠盐。
钙黄绿素–罗丹明B之间的能量转移
荧光染料钙黄绿素和罗丹明B间的共振能量转移产生的首要条件就是钙黄绿素的发射光谱和罗丹明B的吸收光谱必须要有一定程度的重叠。而在本发明中,钙黄绿素为供体,罗丹明B为受体,如图1所示,钙黄绿素荧光强度最大处所对应的荧光波长(520nm)与罗丹明B吸光度最大处所对应的吸收波长 (552nm)具有一定程度的重叠,这样为钙黄绿素和罗丹明B之间的能量转移提供了非常好的光谱条件。重叠的多少与FRET效率的高低密切相关,说明钙黄绿素与罗丹明B的FRET效率很高。如图2所示,Calcein@RhB的荧光光谱在519nm和590nm处有两个特征峰,而519nm处的峰比单独钙黄绿素(Calcein) 的荧光峰要低,而590nm处的峰比单独罗丹明B(RhB)的荧光峰要高,这表明钙黄绿素与罗丹明B之间发生了有效的能量转移。
Calcein@RhB/Au(III)体系加入硫离子后的荧光猝灭机理
Calcein@RhB体系具有很强的的荧光强度,当加入Au(III)后,体系的荧光强度猝灭程度不大,如图3所示;当继续向体系中加入硫离子(S2-),由于硫离子(S2-)具有还原性,能将Au(III)还原成单质金,单质金具有更大的猝灭能力,导致Calcein@RhB/Au(III)体系的荧光急剧下降,如图4所示。
为了研究体系荧光猝灭的机理,本发明继续研究了相关的紫外对比图谱。由于S2-的还原性使得Au(III)还原成金纳米粒子,如图5所示,金纳米粒子具有更大的猝灭能力,Au(III)和S 2-的紫外特征峰的位置和强度没有太大的变化,在紫外吸收光谱中没有特别的吸收峰,然而,向Au(III)体系中加入少量硫离子之后,在520nm处出现了新的紫外特征吸收峰,即金纳米粒子表面等离子体共振吸收峰。
实施例1
一种基于钙黄绿素-罗丹明B-Au(III)体系检测S2-的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)分别取100μL 10-5mol/L的钙黄绿素和1000μL 10-4mol/L的罗丹明B 于10mL试管中,加入200μL 10-4mol/L氯金酸溶液,然后加入100μL PBS缓冲溶液,调节pH至5.9,搅拌反应25分钟,制得钙黄绿素-罗丹明B-Au(III)的水溶液;
(2)向上述钙黄绿素-罗丹明B-Au(III)的水溶液中,分别加入0μL、1μL、8μL、 30μL、50μL、80μL、130μL、160μL、190μL、220μL、240μL、260μL浓度为10-3mol/L 的S2-溶液,用去离子水稀释至10mL,得到S2-溶液的终浓度分别为0、0.1 μmol/L、0.8μmol/L、3μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、13μmol/L、16μmol/L、19μmol/L、 22μmol/L、24μmol/L、26μmol/L,混合搅拌25min,得到检测体系;
(3)设定荧光光谱仪的激发波长为450nm,发射狭缝宽度为5.0nm,测定各体系的荧光光谱,如图6所示,当往Calcein@RhB/Au(III)体系中加入一定浓度S2-(0.1μmol/L~26μmol/L)后,混合体系的荧光强度降低,而且混合体系的荧光强度随着加入该体系的S2-浓度增大而降低,如图7所示。
然后以体系的荧光猝灭效率F0/F为纵坐标,S2-浓度为横坐标,在直角坐标系中作图,进行曲线拟合,如图8所示,从图中可以看出,加入不同浓度的S2- (0.1μmol/L~26μmol/L),体系荧光强度降低的程度不同,体系的荧光猝灭效率 (F0/F)与S2-浓度在0.1μmol/L~26μmol/L范围内具有良好的线性关系,得到线性方程F0/F=1.20484+0.06366[S2-],线性相关系数R2为0.996,检测限为 0.2μmol/L。
上式中F0为加入S2-前体系在590nm波长处的荧光强度值,即体系中加入的S2-溶液的体积为0;F为加入S2-后体系在590nm波长处的荧光强度值。
实施例2
Calcein@RhB/Au(III)体系对S2-的选择性实验
向钙黄绿素-罗丹明B-Au(III)的水溶液分别加入一些其他常见的阴离子,如SO3 2-、HPO4 2-、Ac-、NO2 -、F-、SO4 2-、NO3 -、Cl-、I-、CO3 2-用于选择性试验,测其荧光强度,并以(F0-F)/F0为纵坐标,离子种类为横坐标作柱状图,之后再分别向包含这些离子的Calcein@RhB/Au(III)体系中加入S2-,测其荧光强度,并以(F0-F)/F0为纵坐标,离子种类为横坐标作柱状图,此试验中,其他阴离子的终浓度为120μmol/L,S2-的终浓度为6μmol/L,其他实验条件同实施例1。
结果如图9所示,从图中可以看出,当往Calcein@RhB/Au(III)荧光体系中加入相同浓度的其他阴离子时,其他阴离子对Calcein@RhB/Au(III)体系的荧光强度的猝灭基本无影响。但是,当继续向体系中加入S2-时,体系的荧光强度猝灭加大。结果证明Calcein@RhB/Au(III)体系作为荧光传感器在检测S2-具有非常好的选择性和专一性,因此,此方法可以用来定量检测溶液中S2-的含量。
实施例3
反应时间对体系荧光强度的影响
反应时间t是非常重要参数之一,反应时间t会影响目标分析物检测的灵敏度。在其他条件同实施例1的情况下,S2-的终浓度为1μmol L-1,改变步骤(1) 和(2)的反应时间,并测试不同反应时间下,体系的荧光强度的变化情况,结果如图10所示,从图中可以看出,反应至25min时,体系荧光强度趋于稳定,因此本发明中控制体系的反应时间为25分钟。
实施例4
PH对体系荧光强度的影响
pH值对于化学研究中来说也是非常重要的参数之一,也会影响目标分析物检测的灵敏度。为了很大程度上降低检测限,实现Calcein@RhB/Au(III)体系对硫离子(S 2-)浓度高灵敏的检测,本发明对反应的pH值进行了优化,试验中 S2-的终浓度为1μmol L-1,用PBS缓冲溶液进行pH调节,并保持其他实验条件同实施例1,结果如图11所示,从图11中可以看出,随着pH的增大,体系荧光猝灭效率F0/F先增大,后减小,在pH=5.9时荧光猝灭效率达到最大,因此本发明中控制体系的pH=5.9。
上述参照实施例对一种基于钙黄绿素-罗丹明B-Au(III)体系检测S2-的方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于钙黄绿素-罗丹明B-金离子体系检测S2-的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)配制钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液;
(2)向步骤(1)得到的钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液中加入不同体积的S2-溶液,稀释,搅拌反应25min;
(3)在450nm激发波长下,测试体系的荧光强度,通过S2-离子淬灭钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液的荧光来实现对S2-的检测;
所述步骤(1)具体包括以下步骤:
分别取100μL 10-5mol/L的钙黄绿素和1000μL 10-4mol/L的罗丹明B混合,加入200μL10-4mol/L氯金酸溶液,然后加入100μL PBS缓冲溶液,调节pH至5.9,搅拌反应25分钟,制得钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法进一步包括:以体系的荧光猝灭效率为纵坐标,S2-浓度为横坐标,进行曲线拟合,得到线性方程,根据线性方程即可定量计算出任意荧光猝灭效率下的S2-浓度。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述线性方程为F0/F=1.20484+0.06366[S2-],线性相关系数R2为0.996;其中F0、F分别为加入S2-前后体系在590nm波长处的荧光强度值;F0/F表示体系的荧光淬灭效率。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法,其特征在于,所述钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液的pH为5.9。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,体系中S2-的最终浓度分别为0、0.1μmol/L、0.8μmol/L、3μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、13μmol/L、16μmol/L、19μmol/L、22μmol/L、24μmol/L、26μmol/L。
6.根据权利要求1或5所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)具体包括:向步骤(1)得到的钙黄绿素-罗丹明B-金离子的水溶液中,分别加入0μL、1μL、8μL、30μL、50μL、80μL、130μL、160μL、190μL、220μL、240μL、260μL浓度为10-3mol/L的S2-溶液,用去离子水稀释至10mL,混合搅拌25min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法的检测限为0.2μmol/L。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法可以排除其他离子的干扰,所述其他离子包括SO3 2-、HPO4 2-、Ac-、NO2 -、F-、SO4 2-、NO3 -、Cl-、I–或CO3 2-。
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