CN103376250A - 一种特异性快速检测环腺苷酸的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性快速检测cAMP的试剂盒及检测方法。主要包括：Cy3荧光标记以及磷酸化修饰的cAMP适配体，Cy5荧光标记的cAMP适配体互补链；所述cAMP适配体序列如下：5’-ppp-ggaagagauggcgacUAAAACGACUUGUCGC-cy3-3’；所述cAMP适配体互补链序列如下：5’-cy5-GCGACAAG-3’。本发明利用cAMP与其配体链的特异性结合原理，在能量共振转移的基础上，通过检测荧光染料Cy3与荧光染料Cy5的荧光强度变化，从而对cAMP进行快速检测。本发明方法操作简单，样品消耗少，灵敏度高，可对不同样品的cAMP含量进行快速检测。

Description

一种特异性快速检测环腺苷酸的试剂盒及检测方法

（一）技术领域

本发明涉及一种特异性快速检测环腺苷酸的试剂盒及检测方法。

（二）背景技术

环腺苷酸（cAMP）以微量存在于动植物细胞和微生物中，是一种具有细胞内信息传递作用的小分子，被称为细胞内信使（intracellularmessenger）或第二信使（second messengers）。cAMP参与调节细胞的生理活动与物质代谢等过程；具有调节神经递质合成，促进激素分泌的作用；并可促使非神经细胞膜上某些蛋白的磷酸化，使其构型发生改变，从而调节膜的通透性；对离体细胞有抑制细胞分裂、促进分化的作用；同时，cAMP参与神经节突触传递，在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。cAMP作为最重要的分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，可作为细胞活性的一个重要标志物。cAMP最早发现于肝脏匀浆中，随后人们陆续在很多组织如肾、肺、肠、冠状动脉、支气管、脑垂体、血小板、乳汁、睾丸、骨髓等组织或体液中发现有cAMP存在，哺乳动物除红细胞外，所有组织中均有分布。因此，通过监测细胞内cAMP含量的改变，可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质对细胞以及生物体的影响。

早期cAMP检测的方法有三种：竞争性蛋白质结合分析法、放射性免疫分析法和薄层色谱法。但由于放射性免疫分析法采用放射性核素标记，应用范围受到一定限制。各种酶标记法和化学发光法的竞争性ELISA检测试剂盒的根本原理都是基于抗体抗原的免疫反应，这些试剂盒中采用的抗体多是兔抗血清或者是经过特异亲和提纯之后的抗cAMP兔多抗，采用高效锚定cAMP多抗的酶标板，试剂盒内提供cAMP-HRP偶联物，直接与待测样本内cAMP竞争性的结合到酶标板的cAMP抗体上。通过测定HRP显色底物等试剂在OD₄₅₀nm处的吸收值，从而测定cAMP的含量，这种方法虽然提高了检测的灵敏度和安全性，但同时也存在特异性不高的缺陷。随时科技技术的不断进步，实时无标记动态细胞分析技术也逐步应用于cAMP含量检测中，此技术通过特殊工艺，将微电子细胞传感器芯片整合到细胞检测板的底部，通过实时动态的电极阻抗检测从而获得细胞内cAMP含量等信息，但此方法存在成本较高，污染较大，需利用高灵敏度的仪器进行定量分析等弊端。

（三）发明内容

本发明目的是为了弥补上述现有技术的不足，提供一种特异性快速检测cAMP的试剂盒及检测方法。

本发明利用cAMP与其配体链的特异性结合原理，在能量共振转移的基础上，通过检测荧光染料Cy3与荧光染料Cy5的荧光强度变化，从而对cAMP进行快速检测；可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质对cAMP合成的影响。本发明操作简单，具有测试样品量低、灵敏性高，检测速度快等优点，可同时实现cAMP的体外及体内检测。

本发明采用的技术方案是：

一种特异性快速检测环腺苷酸的试剂盒，主要包括：Cy3荧光标记以及磷酸化修饰的cAMP适配体，Cy5荧光标记的cAMP适配体互补链；

所述cAMP适配体序列如下：

5’-ppp-ggaagagauggcgacUAAAACGACUUGUCGC-cy3-3’；

所述cAMP适配体互补链序列如下：

5’-cy5-GCGACAAG-3’。

上述为试剂盒主要试剂，不包括检测过程中所用的溶剂（如cAMP检测缓冲液）等常规试剂。

优选的，所述试剂盒还包括cAMP检测缓冲液，组成如下：137mMNaCl，2.7mM KCl，2mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，20μM IBMX，20μM EHNA，20μM Amrinone，20μMMilrinone，20μM Sildenafil，pH=8.0，溶剂为水。

本发明还涉及一种利用所述试剂盒检测cAMP的方法，所述方法包括：

（1）分别配制浓度为0.2μM～1μM的cAMP适配体和cAMP适配体互补链溶液。

（2）将步骤（1）所得cAMP适配体溶液和互补链溶液按照摩尔比1:1的比例充分混合，得到适配体与互补链混合液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测520nm～720nm处的荧光检测信号，所得数据作为检测对照。

（3）取步骤（1）所得cAMP适配体溶液，加入梯度浓度的cAMP溶液，300rpm、25℃充分反应5min，按照cAMP适配体与cAMP适配体互补链摩尔比1:1的比例加入cAMP适配体互补链溶液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测波长在570nm和666nm的荧光发射强度，计算666nm/570nm荧光强度比值，以cAMP浓度的对数值为横坐标、666nm/570nm荧光强度比值为纵坐标，绘制标准曲线。

（4）将待测样品加入步骤（1）所得cAMP适配体溶液中（1μM）；300rpm、25℃充分反应5min，按照cAMP适配体与cAMP适配体互补链摩尔比为1:1的比例加入cAMP适配体互补链溶液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测波长在570nm和666nm的荧光发射强度，计算666nm/570nm荧光强度比值，对照标准曲线，获得待测样品中cAMP浓度数据。

优选的，配制所述cAMP适配体和cAMP适配体互补链溶液的溶剂为cAMP检测缓冲液，组成如下：137mM NaCl，2.7mM KCl，2mMKH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，10mM Tris-HCl，1mM EDTA（乙二胺四乙酸），pH=8.0，20μM IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤），20μM EHNA（红-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤），20μM Amrinone（氨吡酮），20μM Milrinone（米利酮），20μM Sildenafil（昔多芬）。

所述待测样品来自组织或细胞，或者临床标本如体液、血液等。通常所述组织或细胞需要进行前处理后再进行检测，具体方法如下：

（Ａ）所述待测样品来自细胞时：

①待测样品为悬浮细胞时，室温，800g，离心5min；用PBS缓冲液反复离心洗涤3次后，加入细胞裂解液（50mM Tris-HCl（pH7.4），150mMNaCl，0.2%NP-40，0.3%Triton x-100，0.1%SDS，0.1mM PMSF），冰上放置5min后，14000g，4℃离心20min，收集上清液，为细胞裂解液；

②待测样品为贴壁细胞时，则用PBS洗涤3次后，直接加入细胞裂解液，冰上放置5min后，收集裂解溶液，14000g，4℃离心20min，收集上清液，为细胞裂解液；

（Ｂ）所述待测样品来自组织时：根据样品组织的量加入细胞裂解液，利用匀浆器将样品组织在冰上匀浆，然后在冰上放置5min后14000g，4℃离心20min，收集上清液，为细胞裂解液；

（Ｃ）所述待测样品来自体液（包括血液，尿液）或培养基上清时：培养基上清或体液，经过cAMP检测缓冲液适当稀释后，为样品稀释液；

取上述（Ａ）、（Ｂ）或（Ｃ）中所得细胞裂解液或样品稀释液1～2μL，加入步骤（1）所得混合液，充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测波长在570nm和666nm的荧光发射强度，计算666nm/570nm荧光强度比值，对照标准曲线，获得待测样品中cAMP浓度数据。

本发明采用能量共振转移原理（具体参见图1），利用cAMP与cAMP适配体特异性识别作用，以带有荧光染料Cy3标记的cAMP适配体与Cy5荧光标记的cAMP适配体互补链，通过杂交反应形成双链，构建能量共振转移体系。以Cy3为能量供体，Cy5为能量受体进行能量共振转移，结合荧光分光光度计，检测荧光信号强度改变。在cAMP存在的情况下，cAMP适配体环状结构打开，线状cAMP适配体与其互补链结合，Cy3与Cy5距离靠近，形成能量共振转移，Cy3荧光下降，Cy5荧光增强；当无cAMP存在时，环状cAMP适配体无法与其互补链结合，能量共振转移体系降低或消失，Cy3荧光增强，Cy5荧光减弱，从而实现对cAMP的快速检测；当加入具有抑制或增强cAMP的药物时，细胞内cAMP含量发生变化，Cy5和Cy3的荧光强度随之发生变化，通过监测细胞内荧光变化情况，从而实现药物评价。

本发明的有益效果主要体现在：本发明方法操作简单，样品消耗少，灵敏度高，可对不同样品的cAMP含量进行快速检测。

（四）附图说明

图1为本发明原理示意图；

图2为适配体与互补链混合液的荧光检测结果；

图3为加入梯度浓度cAMP溶液的荧光检测结果；

图4为标准曲线；

图5为实施例1待测cAMP（100nM）的荧光检测结果；

图6为实施例2待测样品的荧光检测结果；

图7为实施例3待测样品的荧光检测结果。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

（1）以cAMP检测缓冲液为溶剂，分别配制浓度均为1μM的cAMP适配体和cAMP适配体互补链溶液。cAMP检测缓冲液组成如下：137mM NaCl，2.7mM KCl，2mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，10mMTris-HCl，1mM EDTA，20μM IBMX，20μM EHNA，20μM Amrinone，20μM Milrinone，20μM Sildenafil，pH=8.0，溶剂为蒸馏水。

（2）各取步骤（1）所得cAMP适配体溶液和互补链溶液100μL（摩尔比为1:1），充分混合，得到适配体与互补链混合液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测520nm～720nm处的荧光检测信号（图2），图2中570nm处为Cy3特征峰，666nm处为Cy5特征峰。

（3）取步骤（1）所得cAMP适配体溶液100μL，加入梯度浓度的cAMP溶液（以cAMP检测缓冲液为溶剂）（使终浓度分别为0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM），300rpm、25℃充分反应5min，按照cAMP适配体与cAMP适配体互补链为1:1的摩尔比加入cAMP适配体互补链溶液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测波长在570nm和666nm的荧光发射强度（图3），按照下述方法绘制标准曲线：

R为加入不同浓度的cAMP后，666nm处荧光强度与570nm处荧光强度的比值；R0为没有加入cAMP时，666nm处荧光强度与570nm处荧光强度的比值；ΔR=|R-R0|，以加入不同浓度cAMP后计算得到的ΔR为纵坐标，相应的cAMP浓度的对数值为横坐标来绘制得到标准曲线（图4）。

（4）以100nM cAMP为待测样品验证本发明准确性：将cAMP溶液加入上述步骤（1）所得cAMP适配体溶液中，使cAMP终浓度为100nM；300rpm、25℃充分反应5min后，按照cAMP适配体与cAMP适配体互补链为1:1的摩尔比加入cAMP适配体互补链溶液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测得到520nm～720nm处的荧光检测信号图（图5）；并计算666nm/570nm荧光强度的比值，将得到的比值并与上述（3）所得到的标准曲线参比，计算得到待测样品中cAMP的浓度，检测结果与实际相符。

实施例2：

在贴壁培养的小鼠巨噬细胞中，加入2mL PBS洗涤3次，加入0.5mL细胞裂解液，冰上放置5min后，收集裂解溶液，14000g，4℃离心20min，收集上清液，取1μL此上清液，加入实施例1步骤（1）所得cAMP适配体溶液中（1μM）；300rpm、25℃充分反应5min，按照cAMP适配体与cAMP适配体互补链为1:1的摩尔比加入cAMP适配体互补链溶液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测得到520nm～720nm处的荧光检测信号图（图6）；并计算666nm/570nm荧光强度的比值，将得到的比值与实施例1步骤（3）所得到的标准曲线参比，计算得到待测样品中cAMP的浓度，检测结果与ELISA检测结果一致。

实施例3：

取1mL尿液加入9mL cAMP检测缓冲液稀释后，取1μL此稀释液，加入实施例1步骤（1）所得cAMP适配体溶液中（1μM）；300rpm、25℃充分反应5min，按照cAMP适配体与cAMP适配体互补链为1:1的摩尔比加入cAMP适配体互补链溶液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测得到520nm～720nm处的荧光检测信号图（图7）；并计算666nm/570nm荧光强度的比值，将得到的比值并与上述实例1中步骤（3）所得到的标准曲线参比，计算得到待测样品中cAMP的浓度，检测结果与ELISA检测结果一致。

Claims (4)

1.一种特异性快速检测环腺苷酸的试剂盒，主要包括：Cy3荧光标记以及磷酸化修饰的cAMP适配体，Cy5荧光标记的cAMP适配体互补链；

所述cAMP适配体序列如下：

5’-ppp-ggaagagauggcgacUAAAACGACUUGUCGC-cy3-3’；

所述cAMP适配体互补链序列如下：

5’-cy5-GCGACAAG-3’。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括cAMP检测缓冲液，组成如下：137mM NaCl，2.7mM KCl，2mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，20μM IBMX，20μM EHNA，20μM Amrinone，20μM Milrinone，20μM Sildenafil，pH=8.0，溶剂为水。

3.利用权利要求1所述试剂盒检测cAMP的方法，所述方法包括：

（1）分别配制浓度为0.2μM～1μM的cAMP适配体和cAMP适配体互补链溶液；

（2）将步骤（1）所得cAMP适配体溶液和互补链溶液按照摩尔比1:1的比例充分混合，得到适配体与互补链混合液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测520nm～720nm处的荧光检测信号，所得数据作为检测对照；

（3）取步骤（1）所得cAMP适配体溶液，加入梯度浓度的cAMP溶液，300rpm、25℃充分反应5min，按照cAMP适配体与cAMP适配体互补链摩尔比1:1的比例加入cAMP适配体互补链溶液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测波长在570nm和666nm的荧光发射强度，计算666nm/570nm荧光强度比值，以cAMP浓度的对数值为横坐标、666nm/570nm荧光强度比值为纵坐标，绘制标准曲线；

（4）将待测样品加入步骤（1）所得cAMP适配体溶液中；300rpm、25℃充分反应5min，按照cAMP适配体与cAMP适配体互补链摩尔比为1:1的比例加入cAMP适配体互补链溶液，300rpm、25℃充分反应5min后，用552nm的激发光源激发，检测波长在570nm和666nm的荧光发射强度，计算666nm/570nm荧光强度比值，对照标准曲线，获得待测样品中cAMP浓度数据。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于配制所述cAMP适配体和cAMP适配体互补链溶液的溶剂为cAMP检测缓冲液，组成如下：137mMNaCl，2.7mM KCl，2mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，20μM IBMX，20μM EHNA，20μM Amrinone，20μMMilrinone，20μM Sildenafil，pH=8.0，溶剂为水。

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