CN108956553A - 环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法 - Google Patents

环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法，其采用超纯水或二次蒸馏水作为溶剂配制多组不同浓度的环磷腺苷标准溶液，并用B‑R缓冲溶液调节溶液的pH值为2，将溶液加热至50摄氏度，冷却至室温，并置于荧光分光光度计上，进行荧光光谱分析，绘出发射强度对环磷腺苷浓度的工作曲线；移取待测样品环磷腺苷注射液，稀释10000倍，并用B‑R缓冲溶液调节溶液的pH值为2，以285nm为激发波长，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，在290nm～550nm扫描范围内进行荧光光谱分析，根据待测样品的荧光发射强度，利用工作曲线求出待测样品中环磷腺苷注的浓度。本发明的检测方法具有准确性好、成本低、操作方便、环保的优点。

Description

环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法。
背景技术
环磷腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9H-嘌呤-4`,5`-环磷酸氢酯，别名环化腺苷酸(见图1)。环磷腺苷是在人体内广泛存在具有生理活性的一种重要物质，作为参与调节细胞功能的第二信使物质，在临床上应用广泛。
环磷腺苷作为蛋白激酶致活剂，属于核苷酸的衍生物，是由三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)通过腺苷酸环化酶(adenylate cyclases，AC)催化下反应生成，对于多种体内功能活动均起到调节作用[1-2]。近期研究证明了信号分子cAMP对于调节机体整体活动的协调性和精确性等方面起的主要作用[3-4]。因此，对cAMP含量的准确检测方法的研究具有重大意义。
早前运用较广泛的是Gilman的蛋白结合检测法[5]和免疫检测法[6]，但是操作耗时且成本较高。其他生物荧光方法能较好地追踪活体细胞中cAMP的变化[7]，但是操作过程显得相对复杂，难以推广。盛国荣等虽然采用了计算分光光度法建立复方环磷腺苷中环乳膏的质量控制标准[8]，测定了其中环磷腺苷和维A酸的含量，但需要进行复杂的计算分离过程，线性范围较窄。高效液相色谱作为灵敏的药物分析检测手段被收录在《中国药典》(2015版)中[9]，运用该方法对环磷腺苷的药理和含量检测的研究也常见报道[10-13]。但是，涉及到色谱条件的优化步骤较为繁琐，需要严格的对照样品才能准确定性，而且昂贵的仪器使其无法广泛普及。
鉴于此，本发明人对上述问题进行深入的研究，遂有本案产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确性好、成本低、操作方便、环保的检测方法，用于检测环磷腺苷注射剂中环磷腺苷的含量。
为了达到上述目的，本发明采用这样的技术方案：
环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法，采用超纯水或二次蒸馏水作为溶剂配制多组不同浓度的环磷腺苷标准溶液，并用B-R缓冲溶液调节溶液的pH值为2，将溶液加热至50摄氏度，冷却至室温，并置于荧光分光光度计上，以285nm为激发波长，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，在290nm～550nm扫描范围内进行荧光光谱分析，绘出发射强度对环磷腺苷浓度的工作曲线；移取待测样品环磷腺苷注射液，稀释200倍，并用B-R缓冲溶液调节溶液的pH值为2，以285nm为激发波长，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，在290nm～550nm扫描范围内进行荧光光谱分析，根据待测样品的荧光发射强度，利用工作曲线求出待测样品中环磷腺苷注的浓度，再求出环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量。
在上述实施方式中，所述标准溶液中，环磷腺苷的浓度在1×10-6mol/L-1×10- 5mol/L，所述工作曲线的线性方程为：F＝44.87+1.897×107CcAMP，其中，CcAMP为环磷腺苷的浓度，单位为mol/L，发射强度为F，相关系数r＝0.9991，检出限QL＝1.708×10-9mol/L。
在上述实施方式中，待测样品环磷腺苷注射液，逐层稀释后配制成0.8μg/mL溶液。
与现有的其它检测方法相比，本发明具有如下优点：精密度高、准确性好；反应条件温和，采用试剂廉价易得，所用仪器成本较低；采用水性体系，操作过程简单，省时省力，绿色环保无污染；实验操作简便，投入成本低，易于推广。
附图说明
图1(a)为本发明中环磷腺苷的荧光光谱图；
图1(b)为本发明中环磷腺苷的紫外光谱图；
图2(a)为本发明中cAMP溶液受不同pH影响的荧光光谱；
图2(b)为本发明中cAMP溶液受不同pH影响的(b)发射峰位置和(c)荧光强度随pH的变化趋势图；
图3为本发明中不同类型pH＝2.0的缓冲溶液环境对cAMP荧光强度的影响的荧光光谱图(其中1代表B-R缓冲溶液，2代表柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液；3代表磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液；4、邻苯二甲酸-盐酸缓冲溶液)；
图4为本发明中加热温度cAMP对荧光强度的影响的荧光光谱图；
图5为本发明中pH＝2.0B-R缓冲溶液中1.0×10-4mol/L cAMP稳定性实验结果图；
图6(a)为本发明中cAMP溶液受不同激发光波长影响的(a)荧光光谱；
图6(b)为本发明中cAMP溶液受不同激发光波长影响的(b)发射峰位置和(c)荧光强度随激发波长的变化趋势图；
图7为本发明中环磷腺苷标准溶液的工作曲线图；
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面结合附图进行详细阐述。
1实验部分
1.1仪器与试剂
Cary eclipse荧光分光光度计(美国Varian公司)UV-2600紫外-可见分光光度计(日本Shimazu公司)；F-7000荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；FLS920荧光光谱仪(英国Edinburgh Instruments)；HPLC-6460Q液质联用仪，配电喷雾离子(ESI)源(美国Agilent公司)；ZetaPALS Zeta电位及粒径分析仪(美国布鲁克海文仪器公司)。
环磷腺苷注射剂(山东潍坊制药厂有限公司，批号745150501，
745150505，745150507)：规格为40mg：5mL，用二次水稀释成4mg/L溶液，置于5℃冰箱中储存。腺嘌呤(Adenine，ANE，Mr＝135.13)，腺嘌呤核苷(Adenosine，ANS，Mr＝267.24)，一磷酸腺苷(Adenosine Monophosphate，AMP，Mr＝499.19)，环磷腺苷(Cyclic Adenosinemonophosphate，cAMP，Mr＝329)，均为AR试剂，上海阿拉丁试剂；其余的试剂均为分析纯；试验所用的水为二次蒸馏水或者超纯水。
1.2实验方法
1.2.1对照品溶液的配制
准确称取cAMP的对照品，分别配制成1×10-2mol/L的溶液，保存于4℃冰箱。临用前根据需要将储备液稀释配制1×10-4mol/L作为操作液。
1.2.2荧光光谱和紫外光谱表征实验
移取5mL以上对照品操作液，加入等量的不同pH值的缓冲液稀释成5.0×10-5mol/L溶液，于荧光分光光度计中，设置狭缝5.0nm/10.0nm,(这里分别指激发和发射狭缝)最佳激发波长Ex＝285nm，在290～550nm扫描范围内进行荧光光谱分析。同时在紫外分光光度计上测绘吸收光谱。设置光谱狭缝为2.5nm，以纯溶剂为空白参比液在300～600nm扫描范围内进行吸收光谱分析。
1.2.3环磷腺苷溶液的荧光性质实验
通过以下方法考察环磷腺苷对照品溶液的各种荧光性能：
(1)抗盐性能：准确移取1mL1×10-4mol/L cAMP溶液至10mL比色管中，再分别加入不同浓度的氯化钠溶液，用超纯水定容，摇匀后测定其荧光光谱，考察体系荧光受不同盐浓度环境影响的情况。
(2)pH值的影响：将cAMP操作液用盐酸和氢氧化钠溶液调节其不同pH值，配制成1×10-4mol/L溶液，混合均匀后测其荧光光谱，考察pH值对体系荧光强度的影响。
(3)抗光漂白性：准确移取1mL1×10-4mol/L cAMP置于285nm紫外光源下照射，每隔一定的时间测其荧光光谱，考察体系的荧光强度受光源辐射的变化情况。
(4)波长依赖性：选择间隔10nm激发波长从300nm变化至450nm考察环磷腺苷的荧光发射光谱受激发波长的影响情况。
1.2.4环磷腺苷注射剂样品的荧光光谱测定
准确移取环磷腺苷注射液稀释制成0.8μg/mL溶液，于荧光分光光度计上，设置狭缝5.0nm/10.0nm，最佳激发波长Ex＝285nm，在290～550nm扫描范围内进行荧光光谱分析，同时用二次水进行空白对照实验。
2结果与讨论
2.1环磷腺苷溶液的荧光光谱特性
按实验方法准确移取不同pH值溶液环境中的环磷腺苷标准溶液，于荧光光谱仪上测绘荧光光谱，结果如图1(a)所示。在中性和酸性溶液中，环磷腺苷的激发光谱在285nm有一激发峰，同时荧光发射光谱在395nm处有最大的荧光值，这里的激发光谱是第一电子激发态的最低振动能级回到基态时各个振动能级所形成的峰。环磷腺苷的双杂环结构中的磷酸基团和氨基在强酸性环境下易质子化，从其使原来荧光体的最低单线激发态S1为n-π*型转化为π-π*，因此荧光强度明显增强且较为稳定；而在碱性条件下无法形成质子化而产生荧光发射[14]。而对应的紫外光谱如图1(b)所示，不同pH条件下的cAMP的吸收峰位置均相同，说明发生紫外吸收的特征结构没有明显改变。
2.2cAMP荧光体系的条件优化
2.2.1溶剂类型和用量的影响
按照操作步骤，分别配制1×10-4mol/L cAMP的二次水、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和甲醇溶液，混匀静置15min后。分别在荧光分光光度计上测绘荧光光谱。实验结果表明，除在超纯水中，其他溶剂均会干扰环磷腺苷的荧光信号，使其出峰位置发生改变，强度下降。在超纯水环境下环磷腺苷的荧光达到最强，所以本实验选择超纯水作为最佳溶剂。
2.2.2缓冲溶液类型和pH值的影响
测定了不同pH值条件下cAMP水溶液的荧光光谱，结果如图2所示，酸性条件下环磷腺苷具有较强的荧光信号值，环磷腺苷体系的荧光强度随溶液酸性的增强而逐渐变大，在pH＝2.0时荧光强度最高，酸性进一步增强荧光强度反而下降，这可能是因为分子结构中的磷酸根在pH＝2.0左右最易质子化而导致的。随后考察pH＝2.0的邻苯二甲酸氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液和B-R缓冲溶液类型对荧光信号的影响。结果如图3所示，cAMP在B-R缓冲液的环境中荧光最强。所以本实验选择pH＝2.0的B-R缓冲溶液为最佳溶液条件。
2.2.3体系温度的影响
按照上述实验方法中的步骤，将配制好的cAMP溶液分别在不同水浴温度下加热2小时，冷却到室温，在荧光分光光度计上测定荧光光谱，实验结果如图4所示，体系在50℃温度下反应一定时间，有效增强其荧光强度最大，可能的原因是分子间热运动达到合适的程度有利于分子间氢键形成。所以本实验选加热温度为50℃作为最佳加热温度。
2.2.4稳定性实验
取环磷腺苷标准操作溶液，按实验方法中的步骤，进行最优化条件处理后，于荧光分光光度计上测定荧光强度[16]，结果如图5所示，将样品平行测定10次，取其荧光强度计算其标准偏差为6.11938，则RSD值为1.08％。说明该体系具有较好的重现性和稳定性。
2.2.5cAMP溶液的荧光光谱性能
按实验方法，采用不同激发波长对cAMP进行发射光谱扫描，结果如图6所示，在不同激发下cAMP的荧光发射光谱的最大发射峰位置没有明显改变，但是荧光强度先增后降，在最佳激发为285nm时达到最高。这种激发光谱不依赖性质和荧光染料分子发光的特性是一致的，这也进一步验证cAMP自发荧光的可行性。
2.3环磷腺苷含量检测的工作曲线与检出限
按照实验方法，准确移取一系列不同浓度的cAMP标准溶液，于荧光分光光度计上测定荧光强度。结果如图7所示。由图可知cAMP体系的荧光强度在1×10-6mol/L-1×10- 5mol/L，线性方程为：F＝44.87+1.897×107CcAMP
(mol/L)，相关系数r＝0.999 1。检出限QL＝1.708×10-9mol/L(3S0/K)，K为工作曲线的斜率，(S0为RSD值，在计算检出限的公式中通常用S0表示)，10次空白试验的RSD值为1.08％。将该荧光法测定所得标示量结果与高效液相色谱法[11]相比较，效果满意。
2.4共存物质的影响
实际注射剂样品的制备过程中通常要加入大量辅料，为了将本方法应用于测定实际样品，当cAMP浓度为1.0×10-4mol/L时，按实验方法对多种共存物质进行干扰实验。当相对误差≤±5％时，以下共存物质允许倍数为200倍的有CO3 －、NO3 －、Cl－、K+、Na+；允许倍数为100倍的是：Mg2+、Ca2+、Zn2+、淀粉、糊精和葡萄糖。此结果说明，常见药剂中辅料成分及无机离子共存物质对于cAMP的检测几乎没有影响，说明本方法具有较好选择性。2.5环磷腺苷注射剂的含量测定
取稀释后注射剂样品，分别添加低、中、高3个水平的混合标准溶液，在优化的实验条件下目标化合物的回收率在98.3％～110.0％之间，RSD≤4.9％(见表1)，可满足实际分析的要求。
表1注射剂样品测定结果
Tab.1 The determination results of injection sample and the recovery(n＝6)
总结
本本申请首次报道环磷腺苷分子的自发荧光性质，环磷腺苷在pH＝2.0B-R缓冲溶液中50℃水浴加热2h小时后会呈现稳定的荧光性质，最佳激发/发射波长为285nm/395nm。结合紫外光谱和MS实验结果，推测自身发光的机理可能为cAMP分子上环状磷酸基团与嘌呤环构成基态转动构型，在酸性条件下质子化后，具有稳定的刚性分子结构而形成。
将该体系应用于测定注射剂中环磷腺苷的含量，由此建立一种直接荧光法测定cAMP的新方法。实验表明，本法操作简便，重现性好，精确度高等优点，测定结果较准确，可用于注射剂中环磷腺苷含量的测定。
本申请的研究过程中，参考资料如下：
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本发明涉及的B-R缓冲溶液，是指由磷酸、硼酸和醋酸混合而成，并由氢氧化钠调整至一定pH值的缓冲溶液，其为公知的缓冲溶液。
本发明的产品形式并非限于本案图示和实施例，任何人对其进行类似思路的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

Claims (3)

1.环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法，其特征在于：采用超纯水或二次蒸馏水作为溶剂配制多组不同浓度的环磷腺苷标准溶液，并用B-R缓冲溶液调节溶液的pH值为2，将溶液加热至50摄氏度，冷却至室温，并置于荧光分光光度计上，以285nm为激发波长，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，在290nm～550nm扫描范围内进行荧光光谱分析，绘出发射强度对环磷腺苷浓度的工作曲线；移取待测样品环磷腺苷注射液，稀释200倍，并用B-R缓冲溶液调节溶液的pH值为2，将溶液加热至50摄氏度，冷却至室温，以285nm为激发波长，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，在290nm～550nm扫描范围内进行荧光光谱分析，根据待测样品的荧光发射强度，利用工作曲线求出待测样品中环磷腺苷注的浓度。
2.如权利要求1所述的环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法，其特征在于：所述标准溶液中，环磷腺苷的浓度在1×10-6mol/L-1×10-5mol/L，所述工作曲线的线性方程为：F＝44.87+1.897×107CcAMP，其中，CcAMP为环磷腺苷的浓度，单位为mol/L，荧光强度为F，相关系数r＝0.9991，检出限QL＝1.708×10-9mol/L。
3.如权利要求2所述的环磷腺苷注射剂中环磷腺苷含量的直接荧光光谱检测方法，其特征在于：待测样品环磷腺苷注射液，逐层稀释后配制成0.8μg/mL溶液。
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