CN110257055A - 高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针及合成方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针及合成方法与应用，属于化学分析检测技术领域。本发明中高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针具有如下结构：通过在有机溶剂中，加入碱，将化合物2与2‑二氰甲基‑3‑氰基‑4,5,5‑三甲基‑2,5‑二氢杂醇反应，分离纯化后得到，并且可应用该分子探针对水溶液或生物体系中谷胱甘肽进行定性或定量测定。本发明探针分子原料易得，合成方法简便易得，光学性能稳定，具有高选择性和高灵敏度，对谷胱甘肽识别能力强，响应速度较快，响应范围为1–150μmol·L‑1，检测限低为97nmol·L‑1，因此，该类型探针可用于水溶液及生物体系中谷胱甘肽的检测。

Description

高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针及合成方法与应用
技术领域
本发明涉及高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针及合成方法与应用，属于化学分析检测技术领域。
背景技术
生物硫醇，包括半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)，是在生理系统中具有基本作用的必需小分子。研究表明，生物硫醇在维系氧化还原的稳态和细胞生长中发挥着重要作用。作为细胞中最丰富的非蛋白质硫醇，谷胱甘肽在控制氧化应激中起着关键作用，帮助机体维持正常的免疫功能，具有抗氧化和解毒的作用。谷胱甘肽含量的变化预示着许多疾病的发展，如生长迟缓、组织损伤，药物滥用的迹象，心血管疾病、阿尔茨海默氏病和癌症的发生。因此，迫切需要开发一种高效检测谷胱甘肽的量化方法是十分必要的。
由于具有非侵入性、成本低廉及操作简便快速等优点，荧光探针的的光学检测技术已成为检测和成像活细胞中生物分子的重要手段。在生物体内，谷胱甘肽，半胱氨酸和同型半胱氨酸彼此之间有着紧密的相关性，由于分子结构相似大多数文献所报道的探针不能区分这三种生物硫醇。所以开发用于鉴别特异性检测这三种生物硫醇的荧光探针是具有挑战性的。目前报道的谷胱甘肽荧光探针主要是基于以下策略：1)N-Se键断裂，2)芳基取代反应，3)磺酸酯、磺酰胺，4)二硫键裂化，5)迈克尔加成。大多数已开发的谷胱甘肽荧光探针采用的都是荧光开关机制，与其相比，比率型荧光探针更加适合用于定量检测，因为它们可以通过测量两个发射带的荧光强度比来显著消除环境影响和仪器因素。因此，开发一种在体内快速分辨谷胱甘肽与同型半胱氨酸和半胱氨酸的高敏感比率型荧光探针具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术中存在的探针所采用的荧光开关机制不适合用于定量检测的问题，进而提供高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针及合成方法与应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针，结构式如下：
高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的合成方法，通过如下方法实现：
在有机溶剂中，加入碱，将化合物2与2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢杂醇反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1。
所述反应有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺其中之一。
所述反应碱选自醋酸钠、碳酸钠、碳酸钾、三乙胺、醋酸铵其中之一。
所述反应时间为3-24h。
所述反应温度为25-100℃。
本发明还包括高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的应用，通过利用该荧光探针对水溶液或生物体系中谷胱甘肽进行定性或定量测定。
利用该荧光探针采用比色法或荧光比率检测时，将所述分子探针溶解于含水与二甲基亚砜的磷酸缓冲体系中，水与二甲基亚砜的体积比为9:1，对水溶液中谷胱甘肽进行定量检测。
利用该荧光探针与细胞培养，定性检测细胞中的谷胱甘肽。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种新的易于制备、性能稳定的具有较大共轭体系的比率型谷胱甘肽荧光探针，并提供该探针的合成方法，还在此基础开发出对谷胱甘肽进行高选择性和高灵敏度的检测方法，本发明利用谷胱甘肽具有较强的亲核反应特性，能与缺电子分子或双键发生反应，采用不饱和碳碳双键为谷胱甘肽的响应基团；另一方面，将具有较强供电子能力的咪唑[1,5-α]并吡啶醛和具有强吸电子能力的2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢杂醇以共价键的方式桥连，可以将其发射光谱红移至红光区域，显示出较好的长波长荧光发射性能，本发明设计大π共轭推拉体系骨架作为发光团，合成用于比率型检测谷胱甘肽的荧光分子探针。
本发明的荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，反应前最大吸收波长为～597nm，裸眼观察溶液为蓝色，最大发射波长为～603nm，溶液呈红色荧光；随着谷胱甘肽的加入，探针分子的最大吸收峰蓝移至～338nm，裸眼观察溶液为无色，最大发射波长蓝移至～475nm，溶液呈青色荧光。
本发明的荧光探针分子原料易得，合成方法简便易得，光学性能稳定(室温下，存放数月，光谱性质不发生改变)，高选择性和高灵敏度，对谷胱甘肽识别能力强，响应速度较快，响应范围为1–150μmol·L-1，检测限低(97nmol·L-1)，因此，该类型探针可用于水溶液及生物体系中谷胱甘肽的检测。
附图说明
图1为本发明高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的核磁共振氢谱图。
图2为本发明荧光探针与谷胱甘肽反应前后的紫外光谱图；其中，1为反应前，2为反应后。
图3为本发明荧光探针与谷胱甘肽反应前后的荧光光谱图；其中，1为反应前，2为反应后。
图4为本发明10μmol·L-1荧光探针在加入不同浓度谷胱甘肽后荧光光谱图；其中，从a至o，谷胱甘肽浓度分别为0μmol·L-1、1μmol·L-1、3μmol·L-1、5μmol·L-1、7μmol·L-1、9μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1、30μmol·L-1、40μmol·L-1、50μmol·L-1、80μmol·L-1、100μmol·L-1、120μmol·L-1、150μmol·L-1。
图5为本发明谷胱甘肽的浓度标准曲线图。
图6为本发明荧光探针对谷胱甘肽的选择性示意图；
其中，分析物A-T：A为谷胱甘肽,B为同型半胱氨酸,C为半胱氨酸,D为甘氨酸,E为苯丙氨酸,F为缬氨酸,G为丝氨酸,H为谷氨酸,I为赖氨酸,J为精氨酸,K为亮氨酸,L为组氨酸,M为丙氨酸,N为甲硫氨酸,O为酪氨酸,P为色氨酸,Q为苏氨酸,R为异亮氨酸,S为天冬酰胺,T为天冬氨酸。
图7为本发明荧光探针对谷胱甘肽识别能力的抗干扰性示意图；
其中，干扰物B-T：B为同型半胱氨酸,C为半胱氨酸,D为甘氨酸,E为苯丙氨酸,F为缬氨酸,G为丝氨酸,H为谷氨酸,I为赖氨酸,J为精氨酸,K为亮氨酸,L为组氨酸,M为丙氨酸,N为甲硫氨酸,O为酪氨酸,P为色氨酸,Q为苏氨酸,R为异亮氨酸,S为天冬酰胺,T为天冬氨酸。
图8为本发明荧光探针检测MCF-7细胞内谷胱甘肽的荧光成像图片；
其中，A1-A4分别是本发明分子荧光探针(10μmol·L-1)培养的MCF-7细胞的405nm激发荧光图片、543nm激发荧光图片、明场图片和叠加图片；
B1-B4分别是预先由巯基阻断剂(NEM,1mmol·L-1)处理后，再由本发明荧光探针(10μmol·L-1)培养的MCF-7细胞的405nm激发荧光图片、543nm激发荧光图片、明场图片和叠加图片；
C1-C4分别是预先由巯基阻断剂(NEM,1mmol·L-1)处理后，再由本发明荧光探针(10μmol·L-1)和谷胱甘肽(150μmol·L-1)培养的MCF-7细胞的405nm激发荧光图片、543nm激发荧光图片、明场图片和叠加图片；
D1-D4分别是预先由巯基阻断剂(NEM,1mmol·L-1)处理后，再由本发明荧光探针(10μmol·L-1)和半胱氨酸(150μmol·L-1)培养的MCF-7细胞的405nm激发荧光图片、543nm激发荧光图片、明场图片和叠加图片；
E1-E4分别是预先由巯基阻断剂(NEM,1mmol·L-1)处理后，再由本发明荧光探针(10μmol·L-1)和同型半胱氨酸(150μmol·L-1)培养的MCF-7细胞的405nm激发荧光图片、543nm激发荧光图片、明场图片和叠加图片。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
如图1至图8所示，本实施例所涉及的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针及合成方法与应用，包括：
高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针，结构式如下：
高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的合成方法，通过如下方法实现：
在有机溶剂中，加入碱，将化合物2与2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢杂醇反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1。
所述反应有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺其中之一。
所述反应碱选自醋酸钠、碳酸钠、碳酸钾、三乙胺、醋酸铵其中之一。
所述反应时间为3-24h。
所述反应温度为25-100℃。
本发明还包括高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的应用，通过利用该荧光探针对水溶液或生物体系中谷胱甘肽进行定性或定量测定。
利用该荧光探针采用比色法或荧光比率检测时，将所述分子探针溶解于含水与二甲基亚砜的磷酸缓冲体系中，水与二甲基亚砜的体积比为9:1，对水溶液中谷胱甘肽进行定量检测。当加入谷胱甘肽后，谷胱甘肽能亲核进攻不饱和双键，同时发生加成反应，从而阻断了探针分子内强烈的分子内电荷转移(ICT)效应，使探针溶液的吸收光谱发生蓝移，并伴随产生从红光转变为青色荧光的比率型发射特性。采用荧光比率法检测时，所述荧光分子探针对谷胱甘肽的检测浓度为1-150μmol·L-1，检测限为97nmol·L-1。
利用该荧光探针与细胞培养，定性检测细胞中的谷胱甘肽。
实施例1：荧光分子探针1的合成
将化合物2(0.188g,0.6mmol)，2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢杂醇(0.12g,0.63mmol)，加入醋酸铵(23mg,0.3mmol)，溶剂四氢呋喃(5mL)中25℃反应12h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇：5:1)得到产物红黑色固体0.109g(收率：36.7％)。
实施例2：荧光分子探针1的合成
将化合物2(0.188g,0.6mmol)，2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢杂醇(0.12g,0.63mmol)，加入三乙胺(73mg,0.72mmol)，溶剂乙醇(10mL)中80℃反应24h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇：7:1)得到产物红黑色固体0.043g(收率：8.7％)。
产物结构式如下:
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.50(s,1H),8.19(d,J＝2.1Hz,1H),8.06–7.98(m,3H),7.96(d,J＝7.3Hz,2H),7.87(d,J＝7.2Hz,1H),7.48(t,J＝7.7Hz,2H),7.29(t,J＝7.4Hz,1H),7.20(d,J＝8.7Hz,1H),7.15(d,J＝16.3Hz,1H),7.00(dd,J＝9.1,6.4Hz,1H),6.79(t,J＝6.7Hz,1H),1.79(s,6H).
荧光分子探针1的核磁共振氢谱如图1所示，荧光分子探针1可由咪唑[1,5-α]并吡啶醛和2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢杂醇反应得到，此探针通过2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢杂醇与咪唑[1,5-α]并吡啶的衍生物发生Knoevenagel缩合反应，扩展共轭体系使发射波长移到红色区域，结构中的不饱和C＝C双键是谷胱甘肽的识别位点。
实施例3：荧光探针对谷胱甘肽的荧光检测
将上述制得的荧光探针溶解于水与二甲基亚砜的磷酸缓冲溶液(H2O/DMSO＝9/1,v/v,50mM,pH 7.4)，配制成30μmol·L-1的探针溶液，在3mL的吸收池中加入配制的30μmol·L-1荧光探针溶液(1mL)，然后分别加入不同浓度的谷胱甘肽，混合均匀进行测试，结果如图4所示。荧光探针与谷胱甘肽反应前后的紫外光谱，如图2所示，其中，1为反应前，2为反应后。荧光探针与谷胱甘肽反应前后的荧光光谱，如图3所示，其中，1为反应前，2为反应后。以溶液在475nm和603nm的荧光强度比值对谷胱甘肽的浓度作图，谷胱甘肽浓度在1–150μmol·L-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系，如图5所示，为谷胱甘肽的浓度标准曲线图，即10μmol·L-1荧光探针反应前后的荧光发射强度比值(I475/I603)和谷胱甘肽浓度的线性关系，其中横坐标为谷胱甘肽的浓度，纵坐标为荧光强度比值(I475/I603)，能实现该浓度范围内谷胱甘肽的定量检测，而且溶液荧光从红色变为青色，裸眼观察溶液的颜色由蓝色逐渐变为无色。相对于其他分析物，如同型半胱氨酸,半胱氨酸,甘氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸,丝氨酸,谷氨酸,赖氨酸,精氨酸,亮氨酸,组氨酸,丙氨酸,甲硫氨酸,酪氨酸,色氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸，荧光探针表现出对谷胱甘肽专一的识别能力，如图6所示，为本实施例荧光探针对谷胱甘肽的选择性示意图；即10μmol·L-1本发明荧光探针，加入150μmol·L-1不同分析物后，荧光强度比值(I475/I603)的变化。并且在上述分析物质共存时，荧光探针不会受到其他氨基酸的影响，对谷胱甘肽仍具有良好的灵敏度，如图7所示，为本实施例荧光探针对谷胱甘肽识别能力的抗干扰性示意图；即10μmol·L-1本发明荧光探针加入150μmol·L-1的谷胱甘肽时，再加入150μmol·L-1不同共存物荧光强度比值(I475/I603)的变化。
将细胞经含本发明的荧光探针培养液培养后，在青色通道呈现显著的荧光，表明本发明制得的荧光探针可以进入细胞与内源性的谷胱甘肽作用，将细胞经巯基阻断剂预处理后，在加入本发明的荧光探针溶液培养，最后分别经谷胱甘肽溶液，半胱氨酸溶液和同型半胱氨酸溶液培养，结果只有经谷胱甘肽溶液培养的细胞会呈现出青色荧光，表明本发明的荧光光探针可以专一识别谷胱甘肽区分于半胱氨酸和同型半胱氨酸，如图8所示。
由上述实施例可以看出，本发明能实现对谷胱甘肽的定性、定量检测，灵敏度高，检测限达97nmol·L-1，且抗干扰强，并能实现细胞内的谷胱甘肽的检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式，而且本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (9)

1.高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针，其特征在于，结构式如下：
2.根据权利要求1所述的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，通过如下方法实现：
在有机溶剂中，加入碱，将化合物2与2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢杂醇反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1。
3.根据权利要求2所述的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，所述反应有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺其中之一。
4.根据权利要求2所述的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，所述反应碱选自醋酸钠、碳酸钠、碳酸钾、三乙胺、醋酸铵其中之一。
5.根据权利要求2所述的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，所述反应时间为3-24h。
6.根据权利要求2所述的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，所述反应温度为25-100℃。
7.根据权利要求1所述的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的应用，其特征在于，利用该荧光探针对水溶液或生物体系中谷胱甘肽进行定性或定量测定。
8.根据权利要求7所述的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的应用，其特征在于，利用该荧光探针采用比色法或荧光比率检测时，将所述分子探针溶解于含水与二甲基亚砜的磷酸缓冲体系中，水与二甲基亚砜的体积比为9:1，对水溶液中谷胱甘肽进行定量检测。
9.根据权利要求7所述的高选择性检测谷胱甘肽比率型荧光探针的应用，其特征在于，利用该荧光探针与细胞培养，定性检测细胞中的谷胱甘肽。
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