CN101464250A - cAMP或cGMP的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种cAMP或cGMP的检测方法，所述方法为体外检测法，其包括a)使包含cAMP的混合物与示踪物和去淬灭剂的复合物接触，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，和b)测量荧光变化。此外，本发明涉及所述方法用于确定混合物中cAMP或cGMP浓度的用途，用于确定受体活性的用途，其中受体的信号转导包含cAMP或cGMP，以及用于为这类受体筛选配体的用途。

Description

cAMP或cGMP的检测方法
背景技术
核苷酸在细胞的信号转导中起重要作用。例如，核苷酸cAMP涉及G蛋白偶联受体(GPCR)的信号转导。
GPCR构成了最大类的药物靶点。在药物发明中，为了检测潜在的新药针对GPCR的活性，需要监控受体在其所处细胞环境中的功能的测定法。对于药物发明过程中甚为初期的高流通量筛选，这些功能试验需要是简单而含有较少的步骤，是灵敏的以检测早期化合物的微小效应，而且它们必须包含有力的读数，以适用于自动化的方式。
GPCR的功能测定可以依托于对第二信使分子的检测，以反映受体的活化状态。这种第二信使分子是在腺苷酸环化酶活性的调节之下产生的环腺苷酸(cAMP)。W.Thomsen等人总结回顾了一下商业上可用的功能测定试剂盒，所述试剂盒是基于荧光或化学发光读数来测定细胞内cAMP的水平(Current Opinion in Biotechnology 2005，16，655-665)。
发明内容
这些试剂盒都耗时而且复杂。因此，本发明提供了一种检测cAMP的简易测定法，及其在间接检测受体活性和筛选配体中的用途。
这项发明是基于一个令人称奇的事实，通过核碱基修饰设计的带有cAMP衍生物的缀合物能够淬灭荧光团的荧光发射，而cAMP不淬灭此荧光团。
因此，本发明提供了一种体外检测混合物中cAMP方法，所述方法包含：a)将包含cAMP的混合物与示踪物和去淬灭剂的复合物相接触，其中所述示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，以及
b)测量荧光变化。
意外的是，这种试验也能够用于检测混合物中的cGMP。与cAMP不同，cGMP具有淬灭的能力，但是仅在其浓度大约在1mM及以上时才有作用。然而细胞内的cGMP浓度通常在低于1mM几个数量级的范围内。
因此，本发明提供了体外检测混合物中cAMP或cGMP的方法，所述方法包括：a)将包含cAMP或cGMP的混合物与示踪物和去淬灭剂的复合物相接触，其中所述示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，以及b)测量荧光变化。
优选将测量出来的荧光变化与对照比较。此对照可以是预定量的核苷酸的标准曲线。
术语“混合物”是指把两种或更多种物质混合在一起，并且在这种方式之下，每种物质都保持不变。所述混合物包括但并不限于细胞裂解物、细胞培养上清液、生物体液如血清、血浆、尿液、支气管灌洗液、唾液，以及像脑脊液之类的活组织检查。
术语“核苷酸”是指包含核碱基、糖以及一个(MP)、两个(DP)或者三个(TP)磷酸基团的分子。核碱基有五种，分别是腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。糖分子是核糖或者脱氧核糖(d)。
术语“环核苷酸”是指核苷酸，其中该磷酸基与糖的两个羟基键合，形成环状结构。这些包括环腺苷酸(cAMP)、环胞苷酸(cCMP)、环胸腺苷酸(cTMP)、环尿苷酸(cUMP)和环鸟苷酸(cGMP)。
此处所用的术语“cAMP淬灭剂”是指cAMP的衍生物，该衍生物能够淬灭测定中所用的荧光团。所述荧光团与该淬灭剂是共价相连的。该cAMP淬灭剂是用电子供体取代核碱基而产生的cAMP衍生物。如图11B所示，核碱基置换的位置是2位或8位。优选cAMP衍生物是2-(6-氨基已基)氨基-cAMP(2-AHA-cAMP)、8-(6-氨基已基)氨基-cAMP(8-AHA-cAMP)、8-(8-氨基-3，6-二氧杂辛氨基(dioxaoctylamino))-cAMP(8-ADOA-cAMP)、8-羟基-cAMP(8-OH-cAMP)、8-(4-巯基丁基硫(Mercaptobutylthio))-cAMP(8-MBT-cAMP)。其中最优选的衍生物是2-AHA-cAMP。
术语“荧光团”是指当用特定波长激发时发出荧光并且可静态淬灭的分子。荧光团优选嗪衍生物，例如EP747447中所述的MR121，Evoblue30或JA314。此外优选可用的荧光团还有ATTO 590、ATTO 655、ATTO 680、Atto 700(Atto-Tec GmbH，Am Eichenhang 50，57076 Siegen，德国)。更优选的荧光团是MR121或者Atto 700。
此处所用的术语“去淬灭剂”是指通过结合到cAMP淬灭剂上而逆转cAMP淬灭剂的淬灭效应的分子。其本质是去淬灭剂能够结合cAMP淬灭剂以及将被检测的环核苷酸，即cAMP或cGMP。
去淬灭剂可以是结合蛋白质。去淬灭剂优选是cAMP特异的抗体。此抗体可以是单克隆或者多克隆抗体。如果去淬灭剂是蛋白质，pH值需要调到该蛋白质能够结合的范围。通常这个范围是pH6.8到7.8。
本领域技术人员都熟知生产核苷酸特异抗体的方法，例如Kohler和Milstein(Nature 1975，256：495-497)描述了生产单克隆抗体的方法。
检测复合物包含示踪物和去淬灭剂。示踪物由共价连接于cAMP淬灭剂的荧光团组成。如果激发该检测复合物会发出荧光。当检测复合物接触到核苷酸，去淬灭剂结合一定百分比的游离核苷酸并从检测复合物中分离。此时示踪物不再被去淬灭，并且当被激发时仅显示出较低的荧光或者没有荧光。这个荧光的减少量可表示系统中存在的核苷酸的量。
荧光的改变可以与对照(如标准曲线)比较。通过测量将检测的预定量核苷酸的荧光变化，可以建立标准曲线。
本发明还提供了前述在混合物中测定cAMP浓度的方法的用途。此外，前述方法可以用来测定受体活性，在该受体的信号转导中包含cAMP或cGMP。所述受体优选G蛋白偶联受体(GPCR)。
因此，本发明也提供了测定受体活性的方法，在该受体的信号转导中包含cAMP或cGMP，所述方法包括：
a)使表达所述受体的细胞与示踪物和去淬灭剂的复合物接触，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
b)裂解细胞，和
c)测量荧光变化。
或者，步骤b)可以放在步骤a)之前。
优选的实施方案是测定GPCR活性的方法，包括：
a)使表达GPCR的细胞接触示踪物和去淬灭剂的复合物，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
b)裂解细胞，和
c)测量荧光变化。
或者，步骤b)可以放在步骤a)之前。
测量出来的荧光变化优选与对照比较。对照可以是关于预定量的cAMP或者cGMP的标准曲线。
另外，本发明还提供了前述为受体筛选配体方法的用途，在该受体的信号转导中包含cAMP或cGMP。所述受体优选GPCR。
因此，本发明也提供了为受体筛选配体的方法，在该受体的信号转导中包含cAMP或cGMP，所述方法包括：
a)使候选化合物与表达所述受体的细胞相接触，
b)加入示踪物和去淬灭剂的复合物，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
c)裂解细胞
d)测量荧光变化。
或者，步骤c)可以放在步骤b)之前。
优选的实施方案是为GPCR筛选配体的方法，包括
a)使候选化合物与表达所述受体的细胞相接触，
b)往细胞中加入示踪物和去淬灭剂的复合物，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
c)裂解细胞
d)测量荧光变化。
或者，步骤c)可以放在步骤b)之前。
优选将测量出来的荧光变化与对照比较。对照可以是关于预定量的核苷酸的标准曲线。
表达受体(例如GPCR)的细胞可以是内源表达所述受体的细胞，或者所述受体的转基因细胞。
用本领域众所周知的方法可以产生这样的转基因细胞。优选的方法包括以下步骤：克隆编码目的受体的DNA，将所述DNA插入载体并将该载体导入细胞。所述载体优选包含序列段，其与细胞基因组中适于同源重组的序列段同源，这种情况适于同源重组，由此使编码受体的DNA靶向插入到细胞基因组中。
此处所用的术语“配体”是指与受体结合的分子。配体可以是激动剂、拮抗物、调节子、部分激动剂或者部分拮抗物。
术语“激动剂”是指结合受体并能触发细胞内应答的分子。术语“部分激动剂”是指部分激活受体的分子。术语“拮抗物”是指一种分子，该分子结合受体，但是未能激活受体，而事实上阻断了激动剂对受体的活化作用。
本发明也涉及试剂盒，该试剂盒包含去淬灭剂和如前所述的与cAMP淬灭剂共价连接的荧光团。试剂盒包含的去淬灭剂和修饰的荧光团，可以是分开的形式或者是复合物的形式。
在分别测量各自荧光团水平的情况下，该试剂盒可能包含其他任何被认为恰当的成分，如合适的缓冲液、滤器等。
可选的，该试剂盒可以另外包含使用手册，用于解释关于确定GPCR活性的所有测量法中的结果。这样的手册尤其可以包括解释测量的荧光变化的信息，优选标准曲线。
现已对本发明进行了一般性描述，参考具体的实施例连同下列附图将对其有更好的了解，此处包括的实施例仅意在说明，并且除非另有说明，并没非意在限制。
附图说明
图1显示MR121荧光团作为NHS酯用于标记实施例中的cAMP衍生物的分子结构。
图2显示MR121-2-ANA-cAMP的分子结构。
图3以测定细胞中cAMP浓度为例，图示说明其测定原理。裂解细胞并且在细胞裂解液中加入检测混合物。该检测混合物包含与cAMP淬灭剂(cAMP衍生物，如2-AHA-cAMP)连接的荧光团(如MR121)和cAMP抗体(如小鼠抗-cAMP的单克隆抗体)的复合物。由抗体去除了淬灭剂对荧光团的淬灭效应(等同于去淬灭剂)。当接触到cAMP时，该抗体与之结合，而不再与cAMP衍生物结合。在没有抗体的去淬灭效应的情况下，所述cAMP淬灭剂淬灭荧光团并且导致荧光信号的减弱。cAMP浓度越高，则荧光越弱。
图4图示说明MR121和色氨酸(a)、2-AHA-cAMP(b)、cAMP(c)的Stern-Volmer图。I0/I：荧光强度的变化(I0是没有淬灭剂情况下的荧光强度，I是有淬灭剂情况下的荧光强度)，t0/t：荧光寿命的变化(t0是没有淬灭剂情况下的荧光寿命，t是有淬灭剂情况下的荧光寿命)。
图5图示说明对于不同的cAMP衍生物(8-AHA-cAMP、2-AHA-cAMP、N-6-氨基己基-cAMP、8-羟基-cAMP、8-ADOA-cAMP、2’-AEC-cAMP、8-MBT-cAMP)荧光强度的减少量。8-AHA-cAMP的超出约5mM的大的线性偏差是由于溶解性的问题。I0/I：荧光强度变化。
图6图示说明示踪物MR121-2-AHA-cAMP的荧光的淬灭和去淬灭，此处用了两种不同的特异识别cAMP的抗体A和B。Ab：抗体。
图7图示说明在示踪物浓度固定的前提下(10nMMR121-2-AHA-cAMP)抗-cAMP抗体的滴定。实验数据的拟合得到28nM的Kd值。
图8图示说明两条cAMP标准曲线，其一在无细胞情况下(实心菱形)而另一在有细胞的情况下(空心菱形)，在无细胞和有细胞的情况下，分别拟合曲线得到IC50＝109nM和119nM。
图9图示说明毛喉素剂量-应答曲线和以10000个细胞/孔的cAMP标准曲线，拟合曲线得到cAMP的IC50＝102nM、毛喉素IC50＝3.7μM。
图10图示说明下列分子：MR121-8-AHA-cAMP、ATTO590-8-AHA-cAMP以及ATTO655-8-AHA-cAMP的Stern-Vollmer图。
图11显示环腺苷酸(cAMP)的化学结构(A)和cAMP的嘌呤环(B)。
图12显示cAMP衍生物的化学结构
A)：2-(6-氨基己基)氨基-cAMP(2-AHA-cAMP)，
B)：8-羟基-cAMP(8-OH-cAMP)
C)：8-(4-巯基丁基硫)-cAMP(8-MBT-cAMP)
D)：8-(8-氨基-3，6-二氧杂辛氨基)(8-ADOA-cAMP)
E)：8-(6-氨基己基)氨基-cAMP(8-AHA-cAMP)
F)：N-6-氨基己基-cAMP
G)：2’-AEC-cAMP(AEC＝3-氨基-9-乙基咔唑)
图13图示说明高达13mM的cAMP、cGMP、cUMP和cTMP对MR121的淬灭(a)。(b)图示说明在Stern-Vollmer图中，浓度高达10μM的cAMP和cGMP对MR121的淬灭。在低浓度时，cAMP和cGMP都不淬灭MR121。
图14图示说明荧光减弱与cAMP和cGMP浓度的相关性(标准曲线)。
图15图示说明以Atto700-2-AHA-cAMP为示踪物，以抗cAMP抗体为去淬灭剂的情况下，荧光减弱与cAMP浓度的相关性(cAMP标准曲线)。拟合曲线得到IC50＝48nM。
实施例
除非另有指出，实施例中所提及的商业上可获得的试剂均根据厂商说明书使用。
试剂和使用仪器
cAMP、cGMP、2-AHA-cAMP、8-AHA-cAMP、8-ADOA-cAMP、2’-AEC-cAMP、8-MBT-cAMP、N-6-氨基己基-cAMP和8-羟基-cAMP购自Biolog Life Science Institute(28071 Bremen，Germany)，MR121 NHS酯和N-6-氨基己基-cAMP购自Roche diagnostics(Penzberg，Germany)，和Atto 700 NHS酯购自Atto-Tec GmbH(Atto-Tec GmbH，Am Eichenhang50，57076 Siegen，Germany)。小鼠抗-cAMP单克隆抗体参照Kohler和Milstein所述方法自行制备(Nature 1975，256：495-497)。
所有的实验都在含0.1％ BSA(白蛋白，牛血清≥96％，基本上无脂肪酸，A6003，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Industriestrasse 25，CH-9471Buchs，Switzerland)的PBS(pH 7.4)中进行。裂解细胞所用的是3×PBS裂解缓冲液(pH7.4)，其含有0.1％ BSA(牛血清白蛋白，组分V，≥96％，5480，Sigma-Aldrich Chemie GmbH)、0.075％ NP40(乙基苯基聚乙二醇，19628，USB Corporation，Cleveland，OH USA)以及0.3‰ NaN3(分析纯，≥99％，71290，Sigma-Aldrich Chemie GmbH)。细胞生长培养液是含有10％ FCS和1％青霉素-链霉素(Gibco 15140-122)的F-12K(Gibco 21127-002)。
所有的荧光强度测量都是通过装备有高压氙弧灯的平板::显示荧光读出器(Evotec Technologies GmbH，Schnackenburgallee 114，D-22525Hamburg，Germany)来完成，使用630nm的激发滤光器(带宽50nm)和695nm的发射滤光器(带宽55nm)测量MR121，使用655nm的激发滤光器(带宽50nm)和710nm的发射滤光器(带宽40nm)测量Atto 700。通过使用衰减滤光器和改变曝光时间，将荧光强度调节到所用iCCD相机最强信号的约60％。寿命的测量是通过平板::显示TRF读出器(Evotec TechnologiesGmbH，Schnackenburgallee 114，D-22525 Hamburg，Germany)来进行，该仪器使用OPO系统作为光源(GWU Lasertechnik Vertriebsgesellschaftm.b.H.，50374 Erftstadt，Germany)，激发波调至630nm且发射波调至695nm。
所有实验都是在384孔微量滴定板(Costar 384，黑色透明(black withclear)、平底、组织培养处理的，Prod.No.3712)中完成的。总测定体积在30-40μl之间变动。
实施例1：MR121的淬灭
1.1 环核苷酸的淬灭能力
将20μl MR121(溶于PBS，终浓度20nM)和20μl溶于PBS的淬灭剂(测定中DMSO的终浓度为1.25％)加入微量滴定板。室温培育30分钟之后测量荧光和寿命。测试的环核苷酸浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4及12.8mM。
较高浓度的cGMP能淬灭MR121(图13a)。然而，由于cGMP在测定中达不到这种浓度，这种淬灭并不会影响该测定窗。在浓度较低，最高至10μM的情形下(与细胞内浓度范围相对应)，cAMP和cGMP都不会淬灭荧光团(图13b)。在用MR121-2-AHA-cAMP示踪的置换测定中，用cAMP或cGMP置换的测定窗其I/I0从1(结合抗体使MR121-2-AHA-cAMP去淬灭)变为1.7(由2-AHA-cAMP淬灭MR121)。
1.2用cAMP衍生物淬灭
为了分析淬灭的机制，测量游离MR121的荧光强度和荧光寿命作为不同分子(色氨酸、cAMP、2-AHA-cAMP、8-AHA-cAMP、8-ADOA-cAMP、2’-AEC-cAMP、N-6-氨基己基-cAMP、8-MBT-cAMP及8-羟基-cAMP，见图4、5)的函数。
将20μl MR121(溶于PBS，终浓度20nM)和20μl溶于PBS的淬灭剂(测定中DMSO的终浓度为1.25％)加入微量滴定板。室温培育30分钟之后测量荧光和寿命。使用色氨酸的测定中观察到荧光强度的减弱而荧光寿命并没有变化。令人惊讶的是，2-AHA-cAMP、8-AHA-cAMP、8-ADOA-cAMP、8-MBT-cAMP及8-羟基-cAMP的荧光强度都有显著减弱(同时荧光寿命不变)，而cAMP、2’-AEC-cAMP及N-6-氨基己基-cAMP一点都没有显示出来淬灭。由参考文献2-5项类推我们得出结论，MR121与2-AHA-cAMP、8-AHA-cAMP、8-ADOA-cAMP、8-MBT-cAMP及8-羟基-cAMP形成无荧光的基态复合物，但是不与cAMP、2’-AEC-cAMP及N-6-氨基己基-cAMP形成此类复合物。
在2-AHA-、8-AHA-及8-ADOA-cAMP中，连接体是通过胺键与腺苷酸的嘌呤环系统直接偶联，在8-MBT-cAMP中通过硫，和在8-羟基-cAMP中通过氧键与腺苷酸的嘌呤环系统直接偶联。然而，在N-6-氨基己基-cAMP和2’-AEC-cAMP中，连接体是偶联于腺苷酸的胺基基团或者核糖部分。显然，腺苷酸的修饰导致了其环系统电子态的变化，这种变化随后促进其与嗪染料形成复合物。
在图5中，对所有研究的cAMP衍生物进行荧光强度变化(I0/I)的作图。缔合常数Ks的计算是从图的线性区域(最高至3.2mM)而来，8-AHA-cAMP、8-ADOA-cAMP、2-AHA-cAMP、8-MBT-cAMP及8-羟基-cAMP分别对应于514M-1、475M-1、512M-1、758M-1和236M-1。该淬灭非常有效，大多数cAMP衍生物的Ks值与文献中报道的色氨酸的Ks值(约220M-1)相比是后者的两倍以上。
当MR121-2-AHA-cAMP与cAMP特异的抗体相结合，这种无荧光的复合物不能形成，并且观察到MR121荧光强度的增强(图6)。在含有0.1％BSA的PBS中测量20nM游离的MR121、20nM MR121-2-AHA-cAMP(淬灭最强)的荧光强度，以及20nM MR121-2-AHA-cAMP和1000nM抗体的混合物(去淬灭最强)的荧光强度。
与游离的MR121(100％)相比，示踪物显示的荧光强度为25％。抗体A去淬灭荧光至61％，抗体B去淬灭荧光至87％。显然，去淬灭的程度也依赖于抗-cAMP抗体的结合亲和力以及构成抗体结合结构域的氨基酸序列。在抗体结合域附近存在的色氨酸可以在一定程度上淬灭MR121的荧光。这便能解释不同的抗体显示出不同的去淬灭程度。
对于该测定，关键在于，所用的抗体要识别作为示踪物的经过标记和修饰的cAMP和细胞产生的“纯的”cAMP。为了进一步改善该试验，我们使用了抗体A，尽管其去淬灭效果相较而言差于抗体B。可是抗体A能更有效的用cAMP置换示踪物，而且对于发展强有力的测定法，这个全淬灭-全去淬灭窗已经足够好。
实施例2：抗cAMP抗体Kd值的测定
抗-cAMP抗体(抗体A)与MR121-2-AHA-cAMP的结合亲和力，是通过在1×裂解缓冲液中用抗体滴定示踪物的几个浓度(2，6，10，15和20nM)而测定的。将20μl抗-cAMP稀释液加入384孔微量滴定板，一组四个重复。接着将20μl MR121-2-AHA-cAMP加入每个孔内，在384孔摇动器上室温孵育30分钟，然后进行荧光强度读数。通过将未加入抗体的数值设定为0％使数据归一化。图7显示了相应的滴定曲线。由四参数模型拟合得出Kd值，在不同的示踪物浓度下Kd值在25到29nM之间。
实施例3：剂量-应答曲线
cAMP
基于Kd＝28nM，选用40nM抗-cAMP抗体和20nMMR121-2-AHA-cAMP对cAMP进行灵敏检测，cAMP的IC50值在100nM左右。图8显示了两条cAMP标准曲线，一条在无细胞的情况下，一条在有细胞的情况下。对于无细胞情况下的标准曲线，将20μl稀释于含0.1％BSA的PBS中的cAMP在384孔微量滴定板中滴定，接着加入10μl检测混合物(120nM抗-cAMP抗体和60nM MR121-2-AHA-cAMP溶于3×裂解缓冲液中)。对于有细胞情况下的标准曲线，按照10,000个细胞/孔(CHO-K1)在25μl培养液中铺板，在37℃保持20小时。然后去除培养液，加入20μl稀释于含0.1％ BSA的PBS中的cAMP，接着加入10μl检测混合物。培养板接着在384孔摇动器上室温孵育，最后读出荧光信号。两条标准曲线测定的IC50值相似(在无细胞和有细胞的情况下，分别为109nM和119nM，见图8)。
从时间和对DMSO和BSA的耐受性的方面考虑，在无细胞的情形下，用裂解缓冲液中的检测复合物检验了cAMP标准曲线的稳定性。高达5％的DMSO和0.8％的BSA不会改变IC50值，并且也没有观察到信号上重大的跌落。信号和IC50值稳定了至少六小时。
图15显示了cAMP剂量-应答曲线，该曲线是在5nMAtto 700-2-AHA-cAMP示踪物和5nM抗体，IC50值为48nM的条件下完成的。将cAMP稀释于含0.1％ BSA的PBS中。在384孔微量滴定板中滴定20μl的cAMP稀释液，并加入10μl检测混合物。培养板接着在384孔摇动器上室温孵育，最后读出荧光信号。
cGMP
图14显示了cAMP和cGMP标准曲线的对比，所述曲线是在20nMMR121-2-AHA-cAMP示踪物和40nM抗体，cAMP的IC50值为134nM及cGMP的IC50值为387nM的条件下完成的。IC50值以及cAMP和cGMP的灵敏度依赖于抗体的选择。不同的抗体可能对于cGMP更敏感，而对cAMP则不那么敏感。
cAMP和cGMP稀释于含0.1％ BSA的PBS中。对于无细胞的标准曲线，20μl的cAMP稀释液和20μl的cGMP稀释液将在384孔微量滴定板中被滴定，并加入10μl检测混合物(40nM抗-cAMP抗体和20nMMR121-2-AHA-cAMP溶于3×裂解缓冲液中)。培养板接着在384孔摇动器上室温孵育，最后读出荧光信号。
实施例4：cAMP细胞测定
用CHO-K1细胞测定了毛喉素的剂量-应答曲线。2,500到20,000个细胞/孔的细胞铺在培养板中，在25μl培养液中37℃培养20小时。去除培养液，加入10μl含0.1％ BSA的PBS和1mM IBMX，细胞在37℃培养60分钟。加入10μl在PBS中的毛喉素稀释液从0.01到300μM(在20μl测定体积中的终浓度)，该稀释液中还包括0.1％ BSA以及1mM IBMX，然后在37℃再孵育30分钟。接着通过加入溶于3×裂解缓冲液中的10μl检测混合物(在30μl中终浓度为20nM MR121-2-AHA-cAMP和40nM抗-cAMP抗体)裂解细胞。培养板接着在384孔摇动器上室温孵育，最后读出荧光信号。用10,000细胞/孔的测定获得cAMP的最高水平和毛喉素的最小IC50值(3.7μM)。图9显示了毛喉素剂量-应答曲线和用10,000细胞/孔的试验的cAMP标准曲线。
实施例5：ATTO590和ATTO655的淬灭
分别在微量滴定板中加入20μl的ATTO590和ATTO655(溶于PBS中，终浓度20nM)以及溶于PBS(测定中DMSO终浓度：1.25％)的20μl淬灭剂(8-AHA-cAMP)。在室温孵育30分钟后，测量荧光和寿命。结果并入Stern-Vollmer图。缔合常数Ks的计算是从图的线性区域(最高至3.2mM)而来的。
Atto590和Atto655能被8-AHA-cAMP淬灭，其Ks值分别为Ks＝282M-1和Ks＝347M-1(图10)。

Claims (13)

1.体外检测cAMP或cGMP的方法，其包括
a)使包含cAMP的混合物与示踪物和去淬灭剂的复合物接触，其中所述示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，和
b)测量荧光变化。
2.根据权利要求1的方法，其中该混合物是细胞裂解物。
3.体外测定受体活性的方法，其中受体的信号转导包括cAMP或cGMP
a)使表达所述受体的细胞与示踪物和去淬灭剂的复合物接触，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
b)裂解细胞，和
c)测量荧光变化。
4.体外为受体筛选配体的方法，其中受体的信号转导包括cAMP或cGMP，所述方法包括
a)使候选化合物与表达所述受体的细胞接触
b)向细胞加入示踪物和去淬灭剂的复合物，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
c)裂解细胞，和
d)测量荧光变化。
5.根据权利要求3或4的方法，其中该受体为GPCR。
6.根据权利要求1-5中的任一项的方法，其中所述的cAMP淬灭剂为2-AHA-cAMP、8-AHA-cAMP、8-ADOA-cAMP、8-OH-cAMP或8-MBT-cAMP。
7.根据权利要求1-5中的任一项的方法，其中所述的cAMP淬灭剂为2-AHA-cAMP。
8.根据权利要求1-7中的任一项的方法，其中所述的荧光团为MR121、Evoblue30、JA314或Atto700。
9.根据权利要求1-8中的任一项的方法，其中将测量的荧光变化与对照进行比较。
10.根据权利要求1、2、6-9中任一项的方法的用途，其用于确定混合物中的cAMP或cGMP的浓度。
11.试剂盒，其包含去淬灭剂和共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团。
12.根据权利要求11的试剂盒，其中cAMP衍生物是2-AHA-cAMP、8-AHA-cAMP、8-ADOA-cAMP、8-OH-cAMP或8-MBT-cAMP。
13.基本如前所述的方法和用途，尤其是参考前述实施例。
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