KR101399574B1 - 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법 - Google Patents

반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101399574B1
KR101399574B1 KR1020120126222A KR20120126222A KR101399574B1 KR 101399574 B1 KR101399574 B1 KR 101399574B1 KR 1020120126222 A KR1020120126222 A KR 1020120126222A KR 20120126222 A KR20120126222 A KR 20120126222A KR 101399574 B1 KR101399574 B1 KR 101399574B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gold nanoparticles
reflection
aptamer
detecting
target material
Prior art date
Application number
KR1020120126222A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140059608A (ko
Inventor
구만복
서호빈
권영섭
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020120126222A priority Critical patent/KR101399574B1/ko
Publication of KR20140059608A publication Critical patent/KR20140059608A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101399574B1 publication Critical patent/KR101399574B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Abstract

본 발명은 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표적물질에 특이적인 앱타머(aptamer) 및 상기 앱타머와 복합체를 형성하는 금 나노입자와 염을 이용하여 반사 기반 색도 분석법으로 타켓물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 반사 기반 색도 분석 방법을 이용한 타겟물질의 검출방법은 기존에 사용되고 있는 분광 광도계(UV/VIS spectrophotometer)보다 높은 농도의 금 나노 입자를 사용할 수 있어 극소량의 표적물질도 검출할 수 있으며, 사용되는 샘플의 양이 적고, 다양한 플랫폼으로 분석할 수 있기 때문에 실시간 측정 및 마이크로 채널 등의 다양한 응용이 가능하다.

Description

반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법{Method for Detecting Target Molecules Using Reflectance-based Colorimetric Analysis}
본 발명은 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표적물질에 특이적인 앱타머(aptamer) 및 상기 앱타머와 복합체를 형성하는 금 나노입자와 염을 이용하여 반사 기반 색도 분석법으로 타켓물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
기존 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)과 같은 항생제 탐지 방법 중 금 나노 입자를 이용한 색도 분석법이 잘 알려져 있다. 금 나노입자에 표적물질 특이적인 앱타머(aptamer)가 흡착되면 염(NaCl)에 의한 금 나노입자의 응집이 억제되어 붉은 색을 유지한다. 그러나 표적물질이 투입이 되면 표적물질이 표적물질에 특이적인 앱타머와 결합되게 되고, 금 나노입자는 염(NaCl)에 의한 응집 반응이 일어나 붉은색에서 푸른색으로의 색도 변화가 관찰되며, 이 변화를 분광 광도계(UV-Vis Spectrophotometer)로 측정한다 (Bao-Fen Ye et al ., Nanoscale, 4:5998, 2012; Shiping Song et al ., Trends in Analytical Chemistry, 27:108, 2008; Yeon Seok Kim et al ., Biosensors and Bioelectronics, 26:1644, 2010).
기존의 분광 광도계(UV-Vis Spectrophotometer)를 이용한 측정법은 샘플을 1㎖ 큐벳(cuvette)에 넣고 빛을 샘플에 투과시켜 샘플의 흡광도(absorbance)를 측정하게 되는데 투과된 빛의 세기가 샘플의 농도가 높으면 높을수록 약해져 측정할 수 있는 샘플의 농도에 한계가 있으며, 또한 측정 방식의 구조상 많은 양의 샘플이 필요하게 되며, 큐벳(cuvette)이 아닌 다른 형태의 플랫폼에 놓여있는 샘플 측정은 불가능하다는 문제점이 있다.
이 발명 기술의 효과를 입증하기 위해 타겟 물질의 한 예로 사용된 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)은 테트라사이클린(tetracycline) 계열의 항생물질로Streptomyces rimosus와 기타 Streptomyces에 의해 생산되며, 박테리아의 필수 단백질 생산을 방해하여 작동한다. 이 단백질이 없으면 박테리아가 성장 및 증식을 할 수 없다. 옥시테트라사이클린은 Chlamydia , Mycoplasma , Propionibacterium acnes , Haemophilus influenzae에 의한 감염 치료에 사용되며, 가축 및 가금류의 질병과 감염을 방지하기 위해 구강 투여 또는 근육 주사를 통해 사용된다. 옥시테트라사이클린의 부작용으로 위장, 감광성 알레르기 반응과 치아, 뼈와 같은 칼슘이 풍부한 장기를 손상시킬 수 있다. 때문에 옥시테트라사이클린은 특정 조건을 제외하고 12세 미만의 아동과 임신한 여성의 치료에 사용되지 않는다. 가축에 투입된 옥시테트라사이클린은 음식물, 식수에 잔류 될 수 있기 때문에 이를 감지하는 센서의 개발이 다양하게 이루어지고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 표적물질에 특이적인 앱타머 및 상기 앱타머와 복합체를 형성하는 금 나노입자와 염을 이용한 타겟물질 검출에 있어서, 금 나노입자의 응집정도를 반사 기반 색도 분석법으로 측정하면 효과적으로 표적물질의 검출이 가능한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 표적물질에 특이적인 앱타머 및 상기 앱타머와 복합체를 형성하는 금 나노입자와 염을 이용하여 반사 기반의 색도 분석법으로 표적물질을 검출하는 방법 및 이를 이용한 앱타센서를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 금 나노입자 표면에 타겟물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 흡착시키는 단계; (b) 타겟물질을 첨가하여 상기 앱타머와 타겟물질 사이의 특이적 결합에 의한 앱타머-타겟물질 복합체를 형성시켜, 금 나노입자를 유리시키는 단계; 및 (c) 염을 첨가하여 유리된 금 나노입자를 응집시켜 색상변화를 유도시킨 다음, 금 나노입자의 응집정도를 반사 방식 기반의 색도 분석법으로 측정하는 단계를 포함하는 반사 기반 색도 분석법을 이용한 타겟물질의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 반사 기반 색도 분석 방법을 이용한 타겟물질의 검출방법은 기존에 사용되고 있는 분광 광도계(UV/VIS spectrophotometer)보다 높은 농도의 금 나노 입자를 사용할 수 있어 극소량의 표적물질도 검출할 수 있으며, 사용되는 샘플의 양이 적고, 다양한 플랫폼으로 분석할 수 있기 때문에 실시간 측정 및 마이크로 채널 등의 다양한 응용이 가능하다.
도 1은 반사 기반의 색도 분석 앱타센서의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 금 나노입자의 표면에서 반사가 가장 잘 일어나는 각도를 선별하기 위하여 다양한 반사각에서 측정한 그래프이다.
도 3은 다양한 농도의 금 나노입자의 응집에 따른 색도 변화를 분광 광도계를 이용하여 측정한 그래프이다.
도 4는 다양한 농도의 금 나노입자의 응집에 따른 색도 변화를 반사 기반의 색도 분석방법을 이용하여 측정한 그래프이다.
도 5는 다양한 농도의 염 농도에 따른 금 나노입자의 응집 정도를 반사 기반의 색도 분석방법을 이용하여 측정한 그래프이다.
도 6은 반사 기반의 색도 분석 방법을 이용해 옥시테트라사이클린을 농도별로 측정한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일관점에서, (a) 금 나노입자 표면에 타겟물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 흡착시키는 단계; (b) 타겟물질을 첨가하여 상기 앱타머와 타겟물질 사이의 특이적 결합에 의한 앱타머-타겟물질 복합체를 형성시켜, 금 나노입자를 유리시키는 단계; 및 (c) 염을 첨가하여 유리된 금 나노입자를 응집시켜 색상변화를 유도시킨 다음, 금 나노입자의 응집정도를 반사 방식 기반의 색도 분석법으로 측정하는 단계를 포함하는 반사 기반 색도 분석법을 이용한 타겟물질의 검출방법에 관한 것이다.
본원에서 "앱타머(aptamer)"란, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 타켓물질은 옥시테트라사이클린인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 옥시테트라사이클린을 포함한 항생제, 저분자물질, 단백질 및 핵산 등을 검출할 수 있다.
상기 타겟물질은 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "시료"란, 테트라사이클린계 화합물을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 금 나노입자는 염화금(HAuCl4)을 시트로산 염 (citrate)으로 환원시켜 제조되며, 11 내지 15 nm 크기를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 앱타머 흡착 금 나노입자는 2 내지 10nM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 반사를 기반으로 하여 금 나노입자의 응집 정도에 따른 색 변화를 측정하기 위하여 반사방식의 분석 장비를 구축하였으며, 반사방식의 분석 장비의 Optical fiber는 각도를 조절할 수 있는 홀더에 고정되어 있고, 하나의 Optical fiber에서 HL-2000-FHSA에서 나오는 빛을 샘플에 투영시켜주면 샘플에 의해 반사된 빛이 다른 하나의 Optical fiber로 들어가게 된다. 이 빛은 Optical fiber를 따라 연결된 USB4000에서 각 파장대별 반사광의 intensity를 측정하여 결과를 얻게 된다 (도 1).
본 발명에 있어서, 상기 금 나노입자는 2 내지 10nM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 10nM의 앱타머 흡착 금 나노입자를 첨가한다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 염은 0.1 내지 0.01M의 염화나트륨(NaCl)을 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.1M의 염화나트륨을 첨가한다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 반사 측정 장치의 평면과 입사광선 사이의 각도를 40 내지 70°로 하여, 550 내지 650nm에서 반사된 빛을 측정하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 40°의 반사각에서 520nm, 650nm에서 측정한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 금 나노 입자의 표면에서 반사가 가장 잘 일어나는 각도를 선별하기 위하여, 실시예 1의 반사 측정 장치의 평면과 입사광선 사이의 각도를 40°, 50°, 60° 및 70°로 조절하여 실험을 수행한 결과, 반사 측정 장치의 평면과 입사광선 사이의 각도를 40°로 하여 측정하였을 때, 520nm에서 피크가 다른 각도에 비해 뾰족하게 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 금 나노입자의 적당한 농도를 선별하기 위하여, 2nM, 4nM, 6nM, 8nM 및 10nM의 금 나노입자를 이용하여 실험을 수행한 결과, 분광 광도계를 이용하여 측정한 경우, 금 나노입자의 농도에 따라 흡광도 값이 불안정하게 나타났으나(도 3), 반사 기반의 분석 장비에서 측정한 경우, 높은 농도의 금 나노입자에서도 반사 측정값이 안정하게 측정되며, 피크가 분명하게 관찰되는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명에 사용되는 금 나노입자의 농도는 10nM로 정하였다.
또한, 실험 과정에서 추가되는 염(NaCl)의 농도에 따른 금 나노입자의 응집도를 측정하기 위하여, 0.1M, 0.05M, 0.025M, 0.017M의 염화나트륨(NaCl)을 첨가하여 실험을 수행한 결과, 0.1M의 염화나트륨을 첨가하였을 경우, 금 나노입자가 완전히 응집되는 것을 관찰하였으며(도 5), 본 발명에서 사용되는 염화칼슘의 농도는 0.1M로 정하였다.
본 발명의 일 실시에에서, 본 발명의 반사 기반 색도 분석법을 이용하여 옥시테트라사이클린을 검출하기 위해, 11.11nM 농도의 금 나노 입자 51.3㎕와 19.9μM 옥시테트라사이클린 특이적인 앱타머 2.85㎕를 버퍼용액(조성)에 넣고 상온에서 30분간 반응시켜 금 나노 입자 표면에 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 앱타머를 흡착시켰다. 그 후 Binding buffer (100mM NaCl, 20mM Tris-Cl, 2mM MgCl2, 5mM KCl and 1mM CaCl2, pH 7.6) 에 녹아있는 옥시테트라사이클린 2.85ul를 첨가하여, 30분간 반응시켜 앱타머-타겟 반응을 유도한 후, 57㎕의 샘플을 준비된 플레이트에 로딩하고 3㎕의 2M NaCl를 첨가하여 앱타머와 결합되어 있지 않은 금 나노입자의 응집을 유도하였다. 반응 2분 후에, 반사각을 40°로 설정하여 520nm, 650nm에서 금 나노입자의 응집정도를 반사 기반의 분석 장비를 이용하여 측정한 결과, 1nM 까지 옥시테트라사이클린의 검출이 가능하였으며, UV/VIS 분광 광도계로 관찰한 경우에는 25nM 까지 검출할 수 있는 것으로 나타나, 반사 기반의 색도 분석 방법으로 검출할 경우 민감도가 25배 향상된 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 반사 기반의 색도 분석 방법을 이용한 타겟물질 검출방법은 민감도가 매우 향상되어 식품이나 물 등에 극히 미량 존재하는 항생물질 또는 무극성의 저분자량의 물질의 검출에 적합하다.
본 발명의 타겟물질에 특이적으로 결합하는 앱타머, 앱타머 흡착 금 나노입자 및 염을 이용하여 타겟물질에 의해 앱타머와 결합하지 않은 금 나노입자의 응집 반응에 따른 색상변화를 반사 기반 분석법을 이용하여 타겟물질 검출용 앱타센서에 활용할 수 있다.
상기 검출 센서 시스템은, 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 타겟물질 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
앱타머 흡착 금 나노입자의 제조
앱타머 흡착 금 나노입자를 만드는데 이용하기 위해 시트로산염 (citrate)로 안정화된 금 나노입자를 생성하였다. 큰 비커에 HCl과 HNO3를 3:1 비율로 섞어서 왕수를 만들어 준비한 뒤, 금 나노입자를 만드는데 사용할 200 ml 플라스크와 자석을 적어도 15분 이상 담가두어 오염물질을 제거하였다. 위와 같이 준비한 플라스크에 3차 증류수를 98 ml 넣고 핫플레이트 위에서 저어주면서(stirring) 50 mM의 HAuCl4 용액을 2㎖ 첨가하여 HAuCl4의 최종 농도가 1 mM이 되도록 하였다. 이 용액이 끓기 시작하면 빠르게 38.8 mM의 시트르산나트륨(sodium citrate) 용액을 10 ml 첨가하였다. 그러면 용액의 색이 밝은 노란색에서 짙은 붉은색으로 1분 안에 변화하였다. 20분 더 끓인 뒤에는 상온에서 식을 때까지 교반하면서 놔두었다. 만드는 과정에서 응집된 금 나노입자 혹은 그 외의 불순물을 제거하기 위해, 상기의 용액을 0.45㎛ 나이트로셀룰로오스(nitrocellulose) 필터 페이퍼를 이용하여 여과하여 11 내지 15nm의 크기를 가지는 금 나노입자를 제작하였으며, 완성된 금 나노입자는 4 ℃에 냉장 보관하였다.
반사 방식의 분석 장비 구축
본 발명에서는 리플렉턴스를 기반으로 하여 금 나노입자의 응집 정도에 따른 색 변화를 측정하기 위하여, 압티클 파이버(Optical fiber), USB4000 분광분석기(Ocean Optics (USA)) 및 HL-2000-FHSA (Ocean Optics (USA))를 이용하여 분석하였다.
Optical fiber는 각도를 조절할 수 있는 홀더에 고정되어 있고, 하나의 Optical fiber에서 HL-2000-FHSA에서 나오는 빛을 샘플에 투영시켜주면 샘플에 의해 반사된 빛이 다른 하나의 Optical fiber로 들어가게 된다. 이 빛은 Optical fiber를 따라 연결된 USB4000에서 각 파장대별 반사광의 intensity를 측정하여 결과를 얻게 된다. 이 분석 장비의 모식도는 도 1에 나타내었다.
샘플은 아크릴과 유리 재질의 웰(well;지름 8mm, 높이 1mm) 에 로딩하였으며, 본 발명에서는 520nm, 650nm에서 신호의 세기(signal intensity)를 계산하여 금 나노 입자의 응집 정도를 분석하였다.
반사 방식의 분석 조건 최적화
(1) 반사각
본 발명의 금 나노 입자의 표면에서 반사가 가장 잘 일어나는 각도를 선별하기 위하여, 실시예 1의 반사 측정 장치의 평면과 입사광선 사이의 각도입사 광선의 각도를 40°, 50°, 60° 및 70°로 조절하여 실험을 수행하였다.
금 나노입자 10nM와 염화나트륨(NaCl) 0.1M을 증류수(distilled water)에 첨가하여 반응시킨 후, 평면과 입사광선 사이의 각도입사 광선의 각도를 40°, 50°, 60° 및 70°로 조절하여 반사 흡광도를 즉정하였다.
그 결과, 반사 측정 장치의 평면과 입사광선 사이의 각도입사 광선의 각도를 40°로 하여 측정하였을 때, 520nm, 650nm에서 피크가 잘 표현된 것을 확인할 수 있다 (도 2).
(2) 금 나노입자의 농도
또한, 본 발명의 금 나노입자의 적당한 농도를 선별하기 위하여, 2nM, 4nM, 6nM, 8nM 및 10nM의 금 나노입자를 이용하여 실험을 수행하였다.
다양한 농도의 금 나노입자와 염화나트륨(NaCl) 0.1M을 증류수(distilled water)에 첨가하여 응집시킨 후, 반사 측정 장치의 평면과 입사광선 사이의 각도입사 광선의 각도를 40°한 반사 기반 측정방법과 분광 광도계(spectrophotometer)에서 측정하였다.
그 결과, 분광 광도계를 이용하여 측정한 경우, 금 나노입자의 농도에 따라 흡광도 값이 불안정하게 측정되는(도 3)는 반면, 반사 기반의 분석 장비에서 측정한 경우, 높은 농도의 금 나노입자에서도 반사 측정값이 안정하게 측정되며, 피크가 분명하게 관찰되는 것을 확인할 수 있었으며(도 4), 적정 금 나노입자의 농도는 10nM로 정하였다.
(3) 금 나노입자 응집도 측정
실험 과정에서 추가되는 염(NaCl)의 농도에 따른 금 나노입자의 응집도를 측정하기 위하여, 0.1M, 0.05M, 0.025M, 0.017M의 염화나트륨(NaCl)을 첨가하여 실험을 수행하였다.
금 나노입자 10nM과 염화나트륨의 농도를 0.1M, 0.05M, 0.025M, 0.017M로 다르게 증류수(distilled water)에 첨가하여 금 나노입자의 응집을 유도하였으며, 반사각을 40°로 설정하여 520nm에서 금 나노입자의 응집정도를 반사 기반의 분석 장비를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 0.1M의 염화나트륨을 첨가하였을 경우, 금 나노입자가 완전히 응집되는 것을 관찰하였으며(도 5), 적정 염화칼슘의 농도는 0.1M로 정하였다.
금 나노 입자를 이용한 옥시테트라사이클린 검출 방법
본 발명에서 금 나노입와 반사 기반 색도 측정방법을 이용하여 표적물질의 검출 유무를 확인하기 위하여, 옥시테크라사이클린 검출을 수행하였다.
금 나노 입자는 상기 실시예 1에서 제조된 금 나노 입자를 증류수로 세척하여 준비하였으며, 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 앱타머는 다음의 서열번호 1과 같이 준비하였다.
서열번호1:5'-CGTACGGAATTCGCTAGCGGGCGGGGGTGCTGGGGGAATGGAGTGCTGCGTGCTGCGGGGATCCGAGCTCCACGTG-3'
상기 준비된 11.11nM 농도의 금 나노 입자 51.3㎕ 용액에 19.9μM 옥시테트라사이클린 특이적인 앱타머 2.85㎕를 첨가하고, 상온에서 30분간 반응시켜 금 나노 입자 표면에 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 앱타머를 흡착시켰다. 그 후 바인딩 버퍼(Binding buffer; 100mM NaCl, 20mM Tris-Cl, 2mM MgCl2, 5mM KCl 및 1mM CaCl2, pH 7.6) 에 녹아있는 옥시테트라사이클린 2.85㎕를 첨가하여, 30분간 반응시켜 앱타머-타겟 반응을 유도한 후, 57㎕의 샘플을 준비된 웰(well)에 로딩하고 3㎕의 2M NaCl를 첨가하여 앱타머와 결합되어 있지 않은 금 나노입자의 응집을 유도하였다. 반응 2분 후에, 반사각을 40°로 설정하여 520nm, 620nm에서 금 나노입자의 응집정도를 반사 기반의 분석 장비를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 1nM 까지 옥시테트라사이클린의 검출이 가능하였으며, 기존에 분광 광도계로 관찰한 경우에는 25nM 까지 검출할 수 있는 것으로 나타난 것Yeon Seok Kim et al ., Biosensors and Bioelectronics, 26:1644, 2010)과 비교했을 때, 반사 기반의 색도 분석 방법으로 검출할 경우 민감도가 25배 향상된 것을 확인하였다.
비교예 1 : 반사 기반의 색도 분석 방법 및 분광광도계 비교
상기 실시예 4와 같이 금나노입자를 이용한 타겟물질 검출방법에서 반사방식 측정한 결과와 기존의 분광광도계를 이용한 측정결과(Yeon Seok Kim et al ., Biosensors and Bioelectronics, 26:1644, 2010)와 비교한 결과, 반사 기반의 색도 분석 방법은 기존에 사용되고 있는 UV/VIS 분광광도계의 방식의 샘플 농도의 제약을 벗어나, 높은 농도의 금 나노 입자를 이용할 수 있어 더 민감하게 타겟물질을 검출할 수 있으며, 측정되는 샘플의 양이 적어 효율적인 실험이 가능하다 (표 1).
반사 방식 측정 방법 및 분광광도계 비교
분광광도계
(Spectrophotometer)		 반사 방식 측정방법
금나노입자 농도 low high
샘플 볼륨 large small
Platform fixed various
Sensitive(LOD) ~25nM ~1nM
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 다음 단계를 포함하는 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질의 검출방법:
    (a) 금 나노입자 표면에 타겟물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 흡착시키는 단계;
    (b) 타겟물질을 첨가하여 상기 앱타머와 타겟물질 사이의 특이적 결합에 의한 앱타머-타겟물질 복합체를 형성시켜, 금 나노입자를 유리시키는 단계; 및
    (c) 염을 첨가하여 유리된 금 나노입자를 응집시켜 색상변화를 유도시킨 다음, 반사 측정 장치의 평면과 입사광선 사이의 각도를 40 내지 70°로, 입사광선 파장 및 반사광선 파장 범위를 520 내지 650nm로 하여, 금 나노입자의 응집정도를 반사 방식 기반의 색도 분석법으로 측정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 염화금(HAuCl4)을 시트로산염(citrate)으로 환원시켜 제조되며, 11 내지 15 nm 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 타겟물질의 검출방법.
  3. 제1항에 있어서 상기 금 나노입자는 2 내지 10nM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 타겟물질의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 타켓물질은 옥시테트라사이클린인 것을 특징으로 하는 타겟물질의 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 염은 0.1 내지 0.01M의 염화나트륨(NaCl)인 것을 특징으로 하는 타겟물질의 검출방법.
  6. 삭제
KR1020120126222A 2012-11-08 2012-11-08 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법 KR101399574B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120126222A KR101399574B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120126222A KR101399574B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140059608A KR20140059608A (ko) 2014-05-16
KR101399574B1 true KR101399574B1 (ko) 2014-05-27

Family

ID=50889387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120126222A KR101399574B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101399574B1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104865247B (zh) * 2015-05-25 2017-11-03 华东理工大学 基于纳米金聚集的显色方法在免疫检测中的应用
CN107677622B (zh) * 2017-11-26 2023-09-26 桂林电子科技大学 一种溶液表面反射吸光度测定装置
KR102084103B1 (ko) * 2018-12-14 2020-03-04 한국과학기술연구원 박테리아 진단키트
CN112326950A (zh) * 2020-10-20 2021-02-05 甘肃农业大学 一种t-2毒素的检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110236991A1 (en) 2005-08-11 2011-09-29 Yi Lu Aptamer-Based Colorimetric Sensor Systems
US20120202218A1 (en) 2008-09-12 2012-08-09 Modpro Ab Detection method and device based on nanoparticle aggregation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110236991A1 (en) 2005-08-11 2011-09-29 Yi Lu Aptamer-Based Colorimetric Sensor Systems
US20120202218A1 (en) 2008-09-12 2012-08-09 Modpro Ab Detection method and device based on nanoparticle aggregation

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kim, K. et al. Electrophoresis. 31(18): 3115-3120 (2010년 공개) *
Kim, K. et al. Electrophoresis. 31(18): 3115-3120 (2010년 공개)*
Kim, Y. S. et al, Biosensors and Bioelectronics. 26(4): 1644-1649 (2010년 공개) *
Kim, Y. S. et al, Biosensors and Bioelectronics. 26(4): 1644-1649 (2010년 공개)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140059608A (ko) 2014-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shenashen et al. Progress in sensory devices of pesticides, pathogens, coronavirus, and chemical additives and hazards in food assessment: Food safety concerns
Ehtesabi et al. Carbon dots—Sodium alginate hydrogel: A novel tetracycline fluorescent sensor and adsorber
CN108659833B (zh) 一种黄色荧光碳点及其制备方法和应用
CN107118758B (zh) 一种基于聚乙烯亚胺保护的金/铂双金属纳米簇荧光探针及其在检测金霉素中的应用
CN111004804B (zh) 一种用于检测恩诺沙星和环丙沙星的适配体、试剂盒及其应用
KR101399574B1 (ko) 반사 기반 색도 분석을 이용한 타겟물질 검출 방법
CN105928914B (zh) 硫化氢检测传感器及其制备方法、硫化氢的定量检测方法和细胞内硫化氢的定性检测方法
CN106052872B (zh) 一种基于纳米材料自组装的土霉素sers检测方法
Lin et al. Role of novel silicon nanoparticles in luminescence detection of a family of antibiotics
CN110437199B (zh) 一种硒半胱氨酸近红外荧光探针及其制备方法和应用
CN103995130A (zh) α1-微球蛋白检测试剂盒及其制备
Huang et al. Colorimetric detection of ciprofloxacin in aqueous solution based on an unmodified aptamer and the aggregation of gold nanoparticles
Liu et al. A facile fluorescent sensing strategy for determination of hydrogen peroxide in foods using a nanohybrid of nanoceria and carbon dots based on the target-promoted electron transfer
CN105866047A (zh) 一种检测二价汞离子的生物传感器及其制备方法
Lv et al. A gold nanoparticle based colorimetric and fluorescent dual-channel probe for acetylcholinesterase detection and inhibitor screening
CN107607722B (zh) 一种定量检测奶粉中β-乳球蛋白的方法
CN106872682A (zh) 一种检测汞离子的比色生物传感器及其制备方法
CN105623662A (zh) 凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒、应用及其制备方法
CN109668866B (zh) 一种用于水环境中碘离子检测的荧光探针制备及检测方法
Jiang et al. An innovative probe based on aluminum ion-triggered aggregation induced emission effect for ratiometric fluorescence visual detection of fluoroquinolone
KR101342080B1 (ko) 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
KR101342710B1 (ko) 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
CN104897596A (zh) 一种基于核酸适配体修饰纳米金的检测手性化合物的方法
CN104020295A (zh) 降钙素检测试剂盒及其制备
CN114034852A (zh) 基于AuNPs的LSPR比色适配体传感器检测环丙沙星的方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170328

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180406

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190411

Year of fee payment: 6