WO2013118967A1 - 시겔라 소네이의 침입성 플라스미드 항원 h 단백질과 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

시겔라 소네이의 침입성 플라스미드 항원 h 단백질과 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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dna aptamer
dna
shigella
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김양훈
송명섭
엄현주
이상희
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충북대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a DNA aptamer specifically binding to IpaH (Invasion Plasmid Antigen H) protein of Shigella sonnei and its use.
  • IpaH Invasion Plasmid Antigen H
  • Bacterial dysentery a water-borne infectious disease belonging to the first group of statutory infectious diseases, is caused by a heterogeneous bacterium called Shigella, which causes mucus after a few days of incubation, vomiting, abdominal pain, fever and time. Sexual bloody stool appears and is a serious disease that leads to death by infecting toxic dysentery with neurological symptoms and causing complications such as lighter syndrome, hemolytic uremic syndrome and sepsis. Bacteritis is typically transmitted through the stool-oral route, but a small number of 10-100 infections can cause infection, so contact infection is also common. Around 165 million bacterial cases are reported worldwide each year, especially in developing countries, with 69 percent of bacterial cases occurring in children under five, causing serious social problems.
  • Shigella the main causative agent of bacterial dysentery, which causes damage to health, environment and socioeconomics, invades the mucosa of the colon of the human body, proliferates in mucosal epithelial cells, and destroys epithelial cells.
  • Shigella flexneri is predominantly isolated and Shigella dysenter iae is known to occur indigenously or epidemicly, while in developed countries, Shigella sonnei It is reported as the main causative organism.
  • the frequency of bacterial dysplasia in Korea has increased rapidly since 1998, resulting in more than 1,117 patients in 2003.
  • Bacterial dysentery which has been designated as one of the statutory infectious diseases, has been investigated as one of the most common infectious diseases each year.
  • a method for detecting and confirming Shigella sonnai is mainly used for a culture-based diagnostic method.
  • bacterial specimens from Shigella Sonei's stool or rectal specimens are referred to a public health center to isolate bacterial infections.
  • the conventional method requires a long time to detect and identify Shigella sonnai because it must go through the step of separating and culturing the causative organism from the sample, and the bacteria in Shigella cannot survive more than 24 hours in vitro.
  • accurate detection is difficult.
  • the gene structure of Shigella genus is very similar to E. coli, so it is very difficult to distinguish the two strains only by biochemical tests, and it is a high-risk pathogen that can cause enough pathogenicity with only 10-100 cells. , The development of diagnostic techniques with high sensitivity is needed.
  • PCR polymerase chain reaction
  • immunological diagnostic method using an antibody target specific pathogenic factors of Shigella Sonei, which can detect specific causative organisms more sensitively and faster than conventional sample culture methods.
  • the main pathogenic agents used are IpaH (Invasion plasmid antigen H), Shiga toxin, Shigella enterotoxin 1, Shigella enterotoxin 2, etc.
  • the IpaH protein encoded in the ipaH gene increases the expression of Shigella sonnai after epithelial cell invasion of the host, and is secreted outside the epithelial cell to act as an effector to control the inflammatory reaction of the host. It is known. Since the pathogenic factors show higher specificity in infection when compared to other pathogenic agents, the use of these pathogenic factors is increasing in various diagnostic techniques for early detection of Shigella sonnai (Park, Jin Heung, et al., 2005, Korean). J Clin Microbiol 8 172-178).
  • Shigella sonye detection method based on the above PCR and immunological diagnostic method has the advantage that it is sensitive and faster than the conventional culture-based detection method, but in order to increase the detection efficiency, such as DNA extraction and protein extraction Expensive analytical equipment for sample pretreatment and analysis of results is required, resulting in very low field coverage. Therefore, there is an urgent need to develop a highly efficient Shigella sony detection system that can process large samples accurately, quickly and simply.
  • many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
  • the present inventors have fabricated a DNA aptamer that specifically binds to the IpaH protein expressed in Shigella sonnai strains to develop a method that can more accurately, quickly and simply detect Shigella sonnai than conventional detection methods. I tried to study. As a result, we succeeded in producing and screening DNA aptamers that bind specifically to IpaH, a pathogenic protein of Shigella sonei, and specifically bind the DNA aptamers. The present invention has been completed by suggesting a new diagnostic technique that can be used to replace the conventional bacterial dysentery diagnostic method.
  • an object of the present invention is to provide a DNA aptamer specifically binding to Shigella sonye IpaH protein.
  • Another object of the present invention to provide a diagnostic or Shigella sonye detection composition for bacterial heterogeneity comprising the DNA aptamer as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting Shigella sonye IpaH protein comprising the DNA aptamer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting Shigella sonye IpaH protein in order to provide information necessary for the diagnosis of bacterial dysentery.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting Shigella sonei.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing bacterial dysentery.
  • the invention provides a DNA aptamer specifically binding to Shigella sonei (Invasion plasmid antigen H) protein.
  • the DNA aptamer is an oligonucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 19 sequences.
  • the DNA aptamer is an oligonucleotide having a nucleotide sequence having at least 90% identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 19 sequences.
  • the present invention provides a composition for diagnosing or detecting Shigella sonye of bacterial heterogeneity comprising the DNA aptamer as an active ingredient.
  • the present invention provides a kit for detecting Shigella sonye IpaH protein comprising the DNA aptamer.
  • the kit is in the form of a chip in which the DNA aptamer is immobilized on the chip.
  • the kit is in the form of a microarray in which DNA aptamers are immobilized on a substrate.
  • a method for detecting Shigella sonye IpaH protein through binding reaction of DNA aptamer and Shigella sonye IpaH protein from a biological sample to provide information necessary for diagnosis of bacterial dysentery comprising the steps of: (a) contacting the biological sample with the DNA aptamer; And (b) identifying the IpaH protein bound to the DNA aptamer.
  • the present invention provides a method for detecting Shigella sonei, comprising the steps of: (a) contacting a biological sample with the DNA aptamer; And (b) identifying the IpaH protein bound to the DNA aptamer.
  • the present invention provides a method for diagnosing bacterial heterogeneity, comprising the steps of: (a) contacting a biological sample with the DNA aptamer; And (b) identifying the IpaH protein bound to the DNA aptamer.
  • the biological sample is blood, saliva, tear fluid, urine, synovial fluid, mucus, cells, tissues, or cell culture.
  • the content of the present invention will be described in more detail.
  • Characteristics of Shigella Sonei IpaH (Invasion plasmid antigen H) Protein The present invention relates to a DNA aptamer that specifically binds to the IpaH protein of Shigella sonei, one of the causative agents of bacterial dysentery.
  • IpaH protein is It is a major pathogenic determinant of the genus Shigella encoded by the ipaH gene and is present in the pathogenic plasmid, some of which also exist in the chromosome.
  • IpaH protein acts as an effector to control the inflammatory response of the host.
  • the present invention relates to a DNA aptamer (DMA oligonucleotide) that specifically binds to IpaH, a pathogenic protein of Shigella sonei.
  • DMA oligonucleotide specifically binds to IpaH, a pathogenic protein of Shigella sonei.
  • DNA aptamer refers to a DNA nucleic acid molecule capable of high affinity and specific binding to a particular molecule.
  • DNA aptamer is used interchangeably with “DNA oligonucleotide”.
  • oligonucleotide generally refers to a nucleotide polymer having less than about 200 lengths, which may include DNA and RNA, and is preferably a DNA nucleic acid molecule.
  • the nucleotides can be any substrate that can be introduced into the polymer by deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases and / or analogs thereof, or by DNA or RNA polymerase or by synthetic reactions. If modifications to the nucleotide structure are present, such modifications may be added before or after the synthesis of the oligonucleotide polymer. Nucleotide sequences may be interrupted by non-nucleotide components. Oligonucleotides can be further modified after synthesis, for example by binding to a label.
  • DNA aptamers of the invention can typically be obtained by in vitro selection methods for binding of target molecules.
  • Methods of selecting aptamers that specifically bind to a target molecule are known in the art.
  • organic molecules, nucleotides, amino acids, polypeptides, marker molecules on the cell surface, ions, metals, salts, and polysaccharides can be suitable target molecules that separate aptamers that can specifically bind to each ligand.
  • Screening of aptamers can use in vivo or in vitro selection techniques known by the Systematic Evolution of Ligands by Exponent ia 1 Enrichment (SELEX) method.
  • the DNA aptamer specifically binding to the IpaH protein of the present invention is preferably a DNA oligonucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 19 sequences.
  • DNA aptamers of SEQ ID NO: 1 to 19 of the present invention is assumed to form a secondary structure shown in Figures 6a and 6b herein.
  • the DNA aptamer of the present invention while retaining the property of binding to Shigella sonye IpaH protein, while having a DNA having a sequence ' substantially identical to the nucleotide sequence of any one of the first to 19th sequence It is also understood to include nucleotides.
  • nucleotide sequence of the present invention and any other sequence as described above are maximally treated, and algorithms commonly used in the art (Smith and Waterman, Adv. Ap l. Math. 2: 482 ( 1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988 Higgins and Sharp, CABI0S 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc.Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Ap l. BioSci.
  • Detection and kit for IpaH protein using DNA aptamer specifically binding to IpaH protein The DNA aptamer of the present invention can effectively detect Shigella sonye IpaH protein by using the property of specifically binding to IpaH protein.
  • the detection of the IpaH protein is based on a method of detecting the binding complex of the IpaH protein and the DNA aptamer specifically binding to the IpaH protein.
  • DNA aptamers that specifically bind to the IpaH protein of the present invention may be labeled with fluorescent, radioactive or chemical substances, for example, fluorescein (fulorescein), Cy3, Nucleotides labeled with Cy5, biotin or modified with primary amines may be included.
  • fluorescent, radioactive or chemical substances for example, fluorescein (fulorescein), Cy3, Nucleotides labeled with Cy5, biotin or modified with primary amines may be included.
  • DNA aptamers that specifically bind to the IpaH protein of the invention can be biotinylated, and biotinylated DNA aptamers are successfully immobilized on streptavidin-coated substrates. Can be.
  • the composition for detecting IpaH protein may be provided in the form of a kit.
  • the kit comprises a DNA oligonucleotide having a nucleotide sequence selected from the group consisting of the first to nineteenth sequences or a sequence having 90% or more identity with the sequence as an active ingredient.
  • the kit of the present invention may be immobilized on a chip or a substrate of the DNA aptamer, specifically, may be in the form of a microarray in which the DNA aptamer is immobilized on the substrate.
  • a microarray refers to an array (array) in which DNA nucleic acid material is densely attached to a specific region of a substrate.
  • the immobilization of DNA aptamers on chips or substrates can employ methods known in the art.
  • “Substrate” in the kit of the present invention means a support having suitable firmness or semi-rigidity, for example glass, membrane, slide, filter, chip, wafer, fiber, magnetic beads or nonmagnetic beads, gel , But not limited to tubing, plates, polymers, microparticles, and capillaries.
  • the DNA aptamer of the present invention is immobilized on the substrate. This immobilization is carried out by chemical bonding methods or by covalent binding methods such as UV.
  • DNA Oligonucleotides can be bound to glass surfaces that have been modified to include epoxy compounds or aldehyde groups, and can also be bound by UV at the plysine coating surface.
  • the DNA oligonucleotide may be bound to the substrate via a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
  • the DNA aptamers of the invention can be biotinylated, for example, which can be successfully bound onto a strapavidin coated substrate.
  • Kits in the present invention may further comprise instructions or labels for using the kit to detect IpaH protein in a sample. Diagnosis or detection of Shigella sonnai using aptamers that specifically bind to IpaH protein
  • the DNA aptamer specifically binding to the IpaH protein of the present invention can be used to directly detect Shigella sonnai bacteria or to diagnose bacterial dysentery caused by Shigella sonnai.
  • the DNA aptamer of the present invention can be used for diagnosis of bacterial dysentery or Shigella sonye detection.
  • the present invention provides a method for detecting IpaH protein through binding reaction of IpaH protein with DNA aptamer specifically binding to IpaH protein of the present invention from a biological sample of a patient to provide information necessary for diagnosis of bacterial dysentery. do.
  • biological sample may include blood, saliva, tear fluid, urinary fluid, synovial fluid, mucus, cells, tissues, and other tissues and body fluids; cell culture supernatants, ruptured eukaryotic cells and bacteria Expression systems and the like are also included, but are not limited thereto.
  • the biological sample preferably comprises a fecal or the like of the patient.
  • the present invention relates to DNA aptamers which bind to Shigella sonye IpaH protein and bind with a strong binding force and various uses thereof.
  • the DNA aptamer of the present invention has a specific and strong binding property to Shigella sonye IpaH protein, it can be usefully used for the detection of IpaH protein, the detection of Shigella sonei, and the diagnosis of bacterial nature. Can be.
  • the present invention relates to DNA aptamers that specifically bind to IpaH proteins and various uses thereof.
  • the DNA aptamer of the present invention has a characteristic of strongly binding to IpaH protein, which is a pathogenic protein of Shigella sonne, and thus can be confirmed whether Shigella sonne is present through specific detection of IpaH protein in a biological sample. . Therefore, the DNA aptamer of the present invention can be used for diagnosis of bacterial dysentery or Shigella sonye detection.
  • the DNA aptamer of the present invention is expected to be able to diagnose bacterial dysfunction more quickly and economically.
  • FIG. 1 is a diagram showing the ipaH gene cloning process and results for securing the IpaH protein expressed by the U> aH gene of Shigella sonnai.
  • Lane M 1 kb DNA marker (Elpis biotech, Korea)
  • lane 1 ipaH gene amplified by the PCR technique
  • lane 2 P GEX-4T-1 expression vector extracted DNA confirmed
  • Lane 3 Amplified Shigella sonye ipaH gene by PCR method using BamHI I Xhol restriction enzyme
  • lane 4 pGEX-4T-l expressing vector DNA using BamHI I Xhol restriction enzyme This is the result of the cut
  • lane 5 Shigella sonei's ipaH gene was cloned into the PGEX-4T-1 expression vector
  • lane 6 Shigella sonye's ipaH gene was cloned into the pGEX-4T-1 expression vector BamHI.
  • lane M 100 bp DNA marker (Elpis biotech, Korea).
  • 2 is a diagram showing the results of analysis by SDS-PAGE (12%) after purifying and concentrating the GST fusion IpaH protein produced therefrom after transducing vector expressing recombinant IpaH protein into E. coli.
  • Lane M protein size marker (Elpis biotech, Korea)
  • lane 1 purified and concentrated GST fusion IpaH protein.
  • Figure 3 is a diagram showing the result of amplifying the random DNA aptamer using the PCR technique.
  • Lane M 100 bp DNA marker
  • lane 1 DNA aptamer amplified by the PCR technique.
  • FIG. 4 shows the results obtained by comparing the ssDNA prepared by the PCR method with the ssDNA recovered using the heat-schepting technique and the strap avidin through 10% acrylamide gel electrophoresis.
  • Lane M 100 bp DNA marker
  • lane 1 dsDNA
  • lane 2 ssDNA.
  • FIG. 5 shows the amount of DNA aptamer specifically binding to GST fusion IpaH protein or DNA aptamer or IpaH protein that binds to GST fusion IpaH protein recovered in each SELEX round, which was performed to prepare DNA aptamer specifically binding to IpaH protein. It is the result which showed quantitatively.
  • FIGS. 6A and 6B illustrate secondary structures of DNA aptamers IpaH—1 to IpaH-19 that specifically bind to 19 IpaH proteins selected during SELEX for DNA aptamers specifically binding to IpaH proteins.
  • Figure 7 IpaH protein immobilization on the surface of the sensor chip CM5 having a carboxyl group, binding between the DNA aptamer specifically binding to the IpaH protein and IpaH protein, IpaH protein to isolate the DNA aptamer specifically binding to the IpaH protein
  • Figures show the steps of regenerating the sensor chip.
  • FIG. 8 is a diagram showing a schematic diagram of a bacterial dysentery diagnostic kit that specifically binds to IpaH protein.
  • Panel (a) shows a schematic diagram of the overall structure of the bacterial heterogeneity diagnostic kit and panel (b) shows a schematic diagram of the construction of the bacterial heterogeneity diagnostic kit.
  • Figure 9 is a schematic diagram showing the diagnostic principle of the bacterial dysentery diagnostic kit using 3 ⁇ 4 timer specifically binding to the IpaH protein.
  • Panel (a) shows a schematic of the results when the sample of the kit of Figure 8 does not contain the IpaH protein.
  • Panel (b) shows IpaH protein A schematic view of the results obtained when the included sample was treated in a diagnostic kit of the present invention incorporating 3 ⁇ 4 timer specifically binding to IpaH protein was shown.
  • Figure 10 shows the results of confirming the efficacy of the Shigella Sonei IpaH protein detection kit prepared using the IpaH protein binding DNA aptamer of the present invention.
  • Panel is a simple kit for detecting Shigella Sonei IpaH protein prepared to have the configuration shown in FIG. 8, and is a photograph when no sample is processed.
  • Panel (b) is a photograph of the results of the treatment of samples containing no IpaH protein.
  • Panel (c) is a photograph of the results when the sample containing IpaH protein was processed.
  • sequence information of IpaH protein was obtained from NCBI to prepare aptamers for IpaH protein expressed from ipaH gene (ABE28531.1). As a result of multiple sequence comparison with various IpaH proteins using the Clustal X program, it was confirmed that the sequence of IpaH protein obtained from NCBI has a conserved sequence at the C-terminus.
  • an expression vector including an ipaH gene was prepared as a first step.
  • a pair of DNA primers containing restriction enzyme sites were first ordered from Bioneer, Korea. -3 '(SEQ ID NO: 21 sequence)] ipaH gene was amplified by PCR using primers prepared by adding restriction sites.
  • PCR reaction composition was determined by template DM 1 ⁇ , 10 X PCR buffer 5 2.5 mM dNTP mixture 4 ⁇ , 25 ⁇ forward primer 2 ⁇ 25 yM reverse primer 2 Ex Taq polymerase (Takara, Japan) consists of 0.3 ⁇ (lunit // ⁇ ) and 35.7 water. PCR reaction conditions were first denatured at 94 ° C for 5 minutes, repeated 30 cycles of reaction for 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 64 ° C, and 30 seconds at 72 ° C, and then added for 5 minutes at 72 ° C. Reaction was used. Thereafter, the amplified ipaH gene and the PGEX-4T-1 vector were cut with the same restriction enzyme ( ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ? ⁇ ), and then ligated to produce an expression vector (see FIG. 1).
  • the recombinant IpaH protein expression vector prepared in the above Example was transformed with pTfl6 chaperone vector (Takara, Japan) BL21 (DE3) (Studier, F. A. 'and Moffatt, BA, 1986, 189, 113- In 130), the cells were transformed using electroporation, and transformant colonies resistant to ampicillin (ampici 1 ⁇ ) and chloramphenicol were selected.
  • a single clone of the transformant obtained in the above example was secured to obtain ampicillin (ampici llin, 50 and chloramphenicol, 50
  • the cells were further incubated at 18 ° C for 20 hours after addition of IPTG.
  • the cell culture solution thus obtained was centrifuged at 4 ° C. at 8,000 rpm for 10 minutes to remove supernatant and only cells were separated.
  • the cells obtained through centrifugation were resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), followed by centrifugation to wash only the cells.
  • the washed cells were resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), the cells were destroyed using an ultrasonic crusher, and then centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Isolate to protein.
  • Glutathione sepharose 4B purification kit (GE healthcare, UK) was used to purely separate and purify the GST fusion IpaH protein from the obtained active protein. Purely purified GST fusion IpaH protein was confirmed by SDS-PAGE (12%) analysis. The purified protein was subjected to dialysis with IX PBS buffer for 3 days, and then concentrated using a protein concentration kit (Sartorius stedim, Germany). Subsequently, the concentrated IpaH protein was confirmed by SDS-PAGE (12%) analysis (see FIG. 2), and then the concentration of the protein was confirmed using a Bradford assay.
  • Example 2 Construction of DNA Aptamers
  • 100 bp template DNA containing 5 random sequences in the ratio dA: dG: dC: dT 1.5: 1.15: 1.25: 1 for the production of DNA aptamers specifically binding to the IpaH protein (5'-0 O ⁇ ) ⁇ 00 ⁇ 0 ⁇ 0 ⁇ 0 ⁇ ( ⁇ € 0 ⁇ ( ⁇ 0 ⁇ -40- ⁇ € ⁇ 0 ⁇ 0 ⁇ -3 ⁇ '; sequence 22nd sequence) and the following three primers capable of amplifying it at 76 bp were prepared (Bioneer, Korea).
  • Forward primer 2 i 25 yM biotinylated reverse primer 2 Ex Taq polymerase (Takara, Japan) consisting of 0.3 ⁇ (1 unit A) and 35.7 ⁇ distilled water.
  • PCR reaction conditions were first denatured at 94 ° C for 5 minutes, repeated 30 cycles at 94 ° C, 30 seconds at 52 ° C, and 30 seconds at 72 ° C, and then added for 5 minutes at 72 ° C. Reaction was used. After PCR reaction, 4 ⁇ was taken and the amplification product was confirmed by agarose gel electrophoresis (see FIG. 3).
  • the DNA library obtained through PCR was purified using a PCR purification kit (Qiagen, USA) and then recovered using distilled water 50 ⁇ .
  • distilled water 50 was added to the DNA library 50 ⁇ recovered using the PCR technique and the PCR purification kit, the volume: was adjusted to 100 ⁇ , and then the dsDNA was transformed into ssDNA using a heating-coo long technique. denaturation). Specifically, the dsDNA obtained in the above example was reacted at 85 ° C. for 5 minutes to denature the dsDNA to ssDNA, and immediately after the reaction was completed, the reaction solution was changed to 4 ° C. to prepare ssDNA. .
  • Each solution used in SELEX was used a GST bulk kit (GE healthcare, UK), the composition was as follows. Namely, 1 X aptamer selection solution: 10 mM PBS (pH 7.4), 2 X aptamer selection solution: 20 mM PBS (pH 7.4) 4 washing solution: aptamer selection solution, DNA aptamer elution solution: 50 mM Tris- HCl (pH 8.0), 10 mM glutathione.
  • Distilled water 10 ⁇ was added to ssDNA 40 ⁇ prepared and secured through Example 2-3, and the total reaction volume was adjusted to 100 ⁇ by the addition of 2 ⁇ DNA aptamer selection solution 50 ⁇ , followed by 5 minutes at 85 ° C. After boiling and denatured, it was cooled slowly at room temperature to form a stable three-dimensional structure of ssDNA aptamer.
  • Glutathiol is a screen for DNA aptamers that specifically bind to IpaH protein using glutathione sepharose 4B.
  • GST fusion IpaH protein was reacted with ssDNA aptamer pool.
  • the reaction solution was reacted with stirred glutathione Sepharose 4B at 4 ° C. for 1 hour with stirring. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., followed by washing three times with 1 ⁇ PBS 1 to remove the ssDNA aptamer that did not bind to the GST fusion IpaH protein.
  • DNA aptamer elution solution [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM glutathione] 100 ⁇ to elute GST fusion IpaH protein and DNA aptamer specifically binding thereto from glutathione Sepharose 4B put stylized at 4 ° C and stirred banung for 30 minutes after, and centrifuged for 10 minutes at 13,000 rpm at 4 ° C to obtain a leaching solution of the upper layer. The procedure was repeated twice to obtain an eluted solution of the upper layer.
  • the elution solution was treated with the same volume of PCI solution and centrifuged for 15 minutes at 13,000 rpm at 4 ° C. To recover only the supernatant. Subsequently, in order to recover only DNA aptamers that specifically bind to GST fusion IpaH, 1/100 volume of tRNA, 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 4.5) and 3 volumes of volume were collected in the supernatant recovered through PCI sun.
  • DNA is added to glutathione Sepharose 4B with only GST protein fixed without IpaH protein between SELEX 7 and 8 times.
  • Negative selection was performed to bind the aptamer solution (see FIG. 5).
  • GST protein was immobilized on activated glutathione sepharose 4B using 1 X aptamer selection solution, and then reacted with ssDNA aptamer pools formed at room temperature to form a three-dimensional structure. Glutathione sepharose 4B and GST were reacted. Upper ssDNA not bound to protein Aptamer solution was used for 8 SELEX.
  • Example 4 SELEX Round Screening for Optimal DNA Aptamer Screening Specificly Binding to GST Fusion IpaH Protein
  • the concentration of ssDNA eluted in each round was measured using a nano drop in order to quantitatively confirm whether SELEX continued and the affinity of the ssDNA aptamer eluted in each round.
  • the concentration of ssDNA aptamers eluted in each round using nanodrops was the highest in the 8th round after 832.6 ngA after negative screening, and the concentrations of 9th and 10th rounds were 603.7 ngA and 379.0 ng /, respectively. As a result, the concentration was lower than that of the eight rounds. Through this, it was confirmed that after the negative selection, the optimum ⁇ tammer pool that specifically binds to the GST fusion IpaH protein is an eight round pool (see FIG. 5).
  • ssDNA aptamers eluted in round 8, round 9 and round 10 after the initial DNA library and negative screening were amplified by PCR, and ssDNA was obtained by heat-cooling.
  • the ssDNA aptamer pools obtained in each of 0, 8, 9 and 10 rounds were prepared at the same concentration and reacted with the same concentration of GST fusion IpaH protein at 4 ° C. for more than 12 hours.
  • reaction solution was stirred with Glutathione Sepharose 4B activated with 1 ⁇ PBS for 1 hour, and then reacted with centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant. Afterwards, washed 3 times with 1 X PBS to GST fusion IpaH After removing the ssDNA that did not bind to the protein, the reaction was repeated with the aptamer elution solution to recover the DNA aptamer bound to the GST fusion IpaH protein.
  • Real-time PCR was performed using the Biorad's iQ SYBR Green Supermix (Biorad, USA ), real-time PCR reaction conditions are preferred, after 5 minutes denaturation at 94 ° C, 20 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 52 ° C, The reaction was repeated for 30 seconds at 72 ° C for 20 seconds, followed by reaction for 5 minutes at 72 ° C.
  • Real-time PCR results were obtained from experiments using 10-2 diluted samples as template DNA. Real-time PCR efficiencies were 73.2%, 71.66% and 56.45% for each round, and real-time PCR results were 71.66% and 56.45% using ssDNA obtained in rounds 9 and 10 as template DNA, respectively.
  • Example 5 Obtaining DNA aptamer candidates specifically binding to IpaH protein Forward primers for 8 rounds of ssDNA aptamer pool determined to have the highest binding efficiency with GST fusion IpaH protein through nanodrops and real-time PCR DsDNA was obtained by PCR using '-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (SEQ ID NO: 20 sequence) and reverse primer: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3 '(SEQ ID NO: 21 sequence). The dsDNA thus obtained was cloned using a T-blunt cloning kit (SolGent, Korea).
  • T-vector 10 ng / ⁇ ) 1 ⁇
  • PCR product 20 ng // ⁇
  • T-blunt buffer 1 ⁇ 20 ng // ⁇
  • T-blown cloning reaction solution 6 ⁇ was mixed with 100 of DH5a and subjected to a heat shock for 30 seconds at 421: followed by reaction on ice for 2 minutes.
  • an LB culture plate containing ampicillin (50 g / ml), kanamycin (50 ⁇ g / ml), X-gal (50 ⁇ g / ral), and IPTG (5; g / mO) was obtained by taking a culture of 200 ⁇ .
  • Table 2 shows IpaH protein-binding DNA aptamer screening using glutathione sepharose 4B for 19 IpaH protein-binding DNA aptamer candidates obtained using SELEX technique. The sequence is shown in detail.
  • Example 6 Determination of the structure of IpaH protein binding DNA aptamer candidate groups
  • Example 7 Affinity test between IpaH protein and IpaH binding aptamer candidate group using SPR
  • the present inventors performed a surface plasmon resonance (Surface Plasmon Resonance SPR) experiment using BIAcore 3000 (BIACORE), an SPR detection system device. It was.
  • a sensor chip CM5 GE Healthcare, UK coated with a carboxyl group was used.
  • Nhydroxysuccinimide NHS
  • EEO mixture N-ethyl-N '-(dimethyl aminopropyl) carbodi imide
  • the chip surface was coated with IpaH protein by treatment with IpaH protein solution dissolved at 60 ug / ir ⁇ in acetate (pH 4.5) buffer at a rate of 5 ⁇ / n for 10 minutes (see Figure 7).
  • 1 M ethanolamine hydrochloride (pH 8.5) was immobilized at a rate of 5 id / m on the sensor chip to which the IpaH protein was immobilized for 10 minutes to inactivate the remaining carboxyl reaction on the surface of the sensor chip.
  • Reagent And DNA aptamers were prevented from directly binding to the chip surface, and after each experiment, the sensor chip was regenerated with 1 M NaCl, 50 mM NaOH The rate parameters were obtained and quantified by BIA evaluation program (BIACORE).
  • the prepared IpaH protein-binding DNA aptamer candidate groups were prepared by dissolving them in HBS2P buffer (GE Healthcare, UK) at concentrations of 100 nM, 300 ⁇ and 500 ⁇ .
  • Prepared IpaH-binding DNA aptamer is a sensor chip (channel) 1) , DNA aptamers that specifically bind to IpaH protein by injecting IpaH-binding DNA aptamer candidate groups of various concentrations (100 nM, 300 nM, 500 ⁇ ) into a fixed sensor chip (channel 2) Affinity between candidate groups was quantified.
  • an IpaH protein detection kit including a DNA aptamer was prepared, and the detection capability of the IpaH protein was measured.
  • a schematic diagram showing the construction of the IpaH protein detection kit of the present invention is shown in FIG. 8. Nitrocells in the detection kit The DNA aptamer IpaH-17 of the present invention is attached to the capture line (T) on the membrane (Nitrocellulose membrane), and the strap avidin is attached to the control line (C).
  • IpaH protein specific binding DNA aptamer, IpaH-8 of the present invention was prepared by replacing an amine group at the 5 ' end.
  • a carboxylated 10 nm gold nanoparticle was treated with NHS / EDC (Amine coupling kit) at 25 ° C. for 1 hour, and then the amine-bound DNA was prepared at the 5 ′ end.
  • the reaction was added by adding aptamer to bind IpaH-8 to the gold nanoparticles.
  • the gold nanoparticles immobilized with the thus prepared IpaH protein specific binding DNA aptamer were mixed with the detection sample and reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • IpaH protein of Shigella sonei is present in the detection sample, a complex of IpaH protein-DNA aptamer-gold nanoparticles will be formed, and if no IpaH protein is present, DNA aptamer-gold nanoparticle that does not bind IpaH protein Particles will be present.
  • 10X loading buffer (2.5% Triton X-100, 500 mM Tris-HCl, 10% Tween 20, 1.5 M NaCl) was mixed with IX to the sample mixture containing gold nanoparticles.
  • the sample wells of the sample pads were loaded. The sample mixture in the sample wells moves in the direction of the adsorption pad.
  • IpaH protein of Shigella sonei is present in the detection sample, a complex of IpaH protein-DNA aptamer ⁇ gold nanoparticles will be formed. Combined with the aptamer, it can be viewed visually on the capture line. In addition, since the DNA aptamer of the complex is bound to biotin, it can be identified in the control line by binding to streptavidin of the control line (C). On the other hand, if the IpaH protein of Shigella sonnai is not present in the sample, the complex of IpaH protein-DNA aptamer-gold nanoparticles is not formed. Tamer-gold nanoparticles can be identified.
  • FIG. 10 is a photograph of the actual production of the kit of the present invention
  • Figure 10 panel (a) is a case where no sample is added
  • the panel (b ) Is the case in which the IpaH protein of Shigella sonnai is not present in the sample
  • panel (c) is the case in which the IpaH protein of the Shigella sonnai is present in the sample.

Abstract

본 발명은 시겔라 소네이 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 세균성이질의 병원성 단백질인 IpaH 단백질과 특이적으로 강하게 결합하는 특성을 갖는다. 따라서 본 발명의 DNA 앱타머는 생물학적 시료내에서 시겔라 소네이 IpaH 단백질의 특이적 검출을 통해 세균성이질의 진단 또는 시겔라 소네이 검출 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 세균성이질을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
시겔라 소네이의 침입성 플라스미드 항원 H 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도
【기술 분야】
본 발명은 시겔라 소네이 (Shigella sonnei)의 IpaH (Invasion Plasmid Antigen H, 침입성 플라스미드 항원 H) 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
【배경 기술】
제 1 군 법정전염병에 속하는 수인성 전염병인 세균성이질은 시겔라 (Shigella)라고 불리는 이질균에 의해 유발되는 질환으로 인체 내 감염 시 수 일 간의 잠복기를 거쳐 구토, 복통, 발열 및 시간이 경과됨에 따라 점액성의 혈변이 나타나며， 독성이 강한 이질균에 감염 시 신경증상을 동반하여 라이터증후군, 용혈성 요독 증후군， 패혈증과 같은 합병증을 유발함으로써 사망에까지 이르게 하는 심각한 질환이다. 세균성이질은 전형적으로 대변 -경구 경로를 통해 전파되지만 10-100 개의 적은 수로도 감염을 일으킬 수 있어 접촉감염도 흔히 발생한다. 세계적으로 매년 약 1 억 6500 만 명의 세균성이질 환자가 발생하는 것으로 보고되고 있으며 특히, 개발도상국에서는 세균성이질 환자의 69%가 5 세 미만의 아이들에게서 발생하는 것으로 알려져 있어 심각한사회적 문제를 유발하고 있다.
이와 같이 보건환경적 및 사회경제적으로 피해를 초래하는 세균성이질의 주된 원인균인 시겔라 균은 인체의 결장의 점막을 침입한 후 점막 상피세포에서 증식해 상피세포를 파괴하여 이질을 일으킨다. 개발도상국에서는 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri)가 주로 분리되고， 시겔라 디센테리에 (Shigella dysenter iae)가 토착적으로 혹은 유행적으로 발생하는 것으로 알려진 반면 선진국에서는 시겔라 소네이 (Shigella sonnei)가 주된 원인균으로 보고되고 있다. 우리나라의 세균성이질은 1998 년 이후 발생빈도가 급격히 증가하여 2003 년에는 1,117 명 이상의 환자가 발생하였다. 1 종 법정전염병으로 지정되어 있는 세균성 이질은 최근까지도 해마다 가장 많이 발생하는 전염병 중 하나로 조사되고 있다. 특히, 공식적인 발생건수가 균이 직접 분리된 예만을 집계한 것이므로 10-20%대의 국내 법정 전염병의 신고율을 감안하면 실제 발생 수는 적어도 5 배 이상일 것으로 추정되어 그 피해가 매우 심각한 실정이다. 국내 세균성이질의 주된 원인균은 시겔라 소네이이며 가장 일반적인 감염원은 대량급식 흑은 급수이며， 일부 접촉에 의한 발생도 보고되고 있다. 최근 3 년 사이에는 발생이 점차적으로 감소하는 하는 양상을 나타내고 있으나， 지구 온난화 및 극심한 기후변화에 따른 각종 병원성 미생물에 의한 보건 환경성 질환 발생 건수 및 인체 감염 및 공공 환경으로의 전염속도가 급속히 증가함에 따라 대유행을 일으킬 층분한 잠재력을 가지고 있다.
종래 시겔라 소네이의 검출 및 확인을 위한 방법은 배양 기반의 진단방법이 주로 이용되고 있다. 국내에서는 시겔라 소네이 환자의 대변이나 직장 채변한 검체를 보건소에 의뢰해 이질균을 분리해내는 방법을 이용해 세균성이질올 진단하고 있다. 그러나 기존의 방법은 검체로부터 원인균을 분리 배양하는 단계를 거쳐야하기 때문에 시겔라 소네이를 검출 및 확인하는데 까지 긴 시간이 소요될 뿐만 아니라 시겔라 속의 균체들은 체외에서 24 시간 이상 생존할 수 없다는 특징을 가지고 있어 시료 수집과 실험실로의 수송에 상당한 주의 및 기술을 필요로 하여 정확한 검출이 어려운 실정이다. 특히 시겔라 속 균주들의 유전자 구조는 대장균 (E. coli)과 매우 유사하여 생화학적 검사만으로는 두 균주의 구별이 매우 어려울 뿐만 아니라, 10-100 마리의 균체만으로도 충분히 병원성을 유발할 수 있는 고위험성 병원균이므로， 고도의 민감성을 가지는 진단기법의 개발이 필요한 실정이다.
최근 중합효소연쇄반웅 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 기법을 이용한 진단방법과 항체를 이용한 면역학적 진단방법 등의 검출 방법들이 개발 활용되고 있다. 이와 같은 방법들은 시겔라 소네이의 특징적인 병원성 인자를 표적으로 하고 있어 기존의 검체 배양 방법 보다 민감하고 빠르게 특정 원인균을 검출할 수 있다. 시겔라 소네이의 검출을 위해 주로 사용되는 주요 병원성 인자로는 IpaH (Invasion plasmid antigen H; 침입성 플라스미드 항원 H), 시가독소 (Shiga toxin), 시겔라 장내독소 1 (Shigella enterotoxin 1)， 시겔라 장내독소 2 (Shigella enterotoxin 2) 등이 알려져 있으며， 특히 ipaH 유전자에 인코딩되어 있는 IpaH 단백질은 시겔라 소네이가 숙주의 상피세포 침입 후 발현이 증가하며, 상피세포 외부로 분비되어 숙주의 염증반웅을 조절하는 효과인자 (effector) 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기한 병원성 인자는 다른 병원성 인자에 비해 균주 감염시 발생에 높은 특이성을 보이기 때문에 현재 시겔라 소네이를 조기 검출하기 위한 다양한 진단 기법에서 활용도가 높아지고 있는 추세이다 (박진흥, 외 3명， 2005, Korean J Clin Microbiol 8 172-178). 상기한 PCR 기법 및 면역학적 진단방법을 기반으로 하는 시겔라 소네이 검출 방법은 종래 배양 기반의 검출법보다 민감하고 빠르다는 장점을 지니지만 검출 효율올 높이기 위해서는 샘플 내 DNA 추출 과정 및 단백질 추출 과정 등의 샘플 전처리 과정과 결과를 분석하기 위한 고가의 분석 장비가 요구되어 현장에서의 적용 범위가 매우 낮다는 단점을 가지고 있다 . 따라서 대규모의 시료를 정확하고 빠르며， 간단하게 처리 할 수 있는 고효율의 시겔라 소네이 검출 시스템 개발이 절실히 요구된다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 종래의 검출 방법 보다 시겔라 소네이를 더욱 정확하고 신속하며 간단하게 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위해 시겔라 소네이 균주에서 발현하는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하고자 연구 노력하였다. 그 결과， 시겔라 소네이의 병원성 단백질인 IpaH 와 강력한 결합력을 가지며 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머들을 제작하고 선별하는데 성공하였으며, 상기 제작한 DNA 앱타머를 활용하여 종래 세균성 이질 진단 방법을 대체할 수 있는 새로운 진단 기법을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 시겔라 소네이 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 세균성 이질의 진단용 또는 시겔라 소네이 검출용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 시겔라 소네이 IpaH단백질 검출용 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 세균성 이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 시겔라 소네이 IpaH 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 시겔라 소네이의 검출 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 세균성이질의 진단방법을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 시겔라 소네이 (Shigella sonei) IpaH (Invasion plasmid antigen H) 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면， 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면， 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 세균성 이질의 진단용 또는 시겔라 소네이 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 시겔라 소네이 IpaH단백질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면， 상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태이다.
볼 발명의 다른 구현예에 의하면， 상기 키트는 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 세균성 이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해， 생물학적 시료로부터 DNA 앱타머와 시겔라 소네이 IpaH 단백질과의 결합 반웅을 통해 시겔라 소네이 IpaH 단백질을 검출하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 방법을 제공한다: (a) 상기 DNA 앱타머에 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 IpaH단백질을 확인하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시겔라 소네이의 검출 방법올 제공한다: (a) 상기 DNA 앱타머에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 IpaH 단백질을 확인하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 세균성 이질의 진단 방법을 제공한다: (a) 상기 DNA 앱타머에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 IpaH 단백질을 확인하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 의하면， 상기 생물학적 시료는 혈액， 타액, 누액, 요액, 활액， 점액， 세포， 조직， 또는 세포 배양액이다. 이하에서 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다 . 시겔라 소네이 IpaH (Invasion plasmid antigen H) 단백질의 특징 본 발명은 세균성 이질의 원인균 중에 하나인 시겔라 소네이의 IpaH 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다. IpaH 단백질은 ipaH 유전자에 의해 인코딩된 시겔라 속의 주요 병원성 결정인자로서 병원성 플라스미드 (virulence plasmid)에 존재하며， 일부는 염색체에도 존재한다. 시겔라 속의 ipaH 유전자의 발현은 숙주의 상피세포 침입 후 증가하고, 숙주의 상피세포 내로 침입한 시겔라는 IpaH 단백질을 분비하며， IpaH 단백질은 숙주의 염증반웅을 조절하는 효과인자 역할을 한다. 시겔라 소네이 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머
본 발명은 시겔라 소네이의 병원성 단백질인 IpaH 와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 (DMA올리고뉴클레오타이드)에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "DNA 앱타머" 는 특정 분자에 고친화성 및 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 "DNA 앱타머" 는 "DNA올리고뉴클레오타이드" 와흔용하여 사용한다.
본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오타이드" 는 일반적으로 길이가 약 200 개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며， 이에는 DNA 및 RNA 가 포함될 수 있으며， 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드， 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및 /또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반웅에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우， 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에， 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 표적 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드， 세포 표면상의 마커분자， 이온， 금속， 염， 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Li gands by Exponent i a 1 Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다 (Ellington et al., Nature 346, 818-22， 1990； 및 Tuerk et al . , Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981， W0 00/20040, 미국특허 5 ,270， 163， Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994) , Mannironi et al . , Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 96:3606-3610 (1999)， Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), W0 99/54506, W0 99/27133, W0 97/42317 및 미국특허 5，756，291 에 기재되어 있으며， 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열의 DNA 앱타머는 본 명세서 도 6a 및 도 6b에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.
또한, 본 발명의 DNA 앱타머는 시겔라 소네이 IpaH 단백질과 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열과 실질적인 동일성을 나타내 '는 서열을 갖는 DNA올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 얼라인하고， 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Ap l. Math. 2:482 (1981) Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48： 443 (1970)； Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol. 24： 307-31 (1988)； Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988)； Higgins and Sharp, CABI0S 5:151-3 (1989)； Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881—90 (1988)； Huang et al., Comp. Ap l . BioSci . 8:155-65 (1992) and Pearson et al. , Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95%의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98%의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 활용한 IpaH 단백질의 검출 및 이를 위한 키트 본 발명의 DNA 앱타머는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 특성을 이용하여 시겔라 소네이 IpaH 단백질올 효과적으로 검출할 수 있다. 본 발명에서 IpaH 단백질의 검출은 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 IpaH 단백질의 결합 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 상기 결합 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 본 발명의 IpaH 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 형광물질, 방사성물질 또는 화학물질로 표지할 수 있으며, 예컨대, 플루오레세인 (fulorescein), Cy3, Cy5, 비오틴 (biotin)으로 표지하거나 1 차 아민 (primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함시킬 수 있다. 예를 들어， 본 발명의 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 비오티닐화 (biotinylated)화될 수 있고， 비오티닐화된 DNA 앱타머는 스트랩트아비딘 (streptavidin)이 코팅된 기판상에 성공적으로 고정될 수 있다. 기판상에 고정화된 본 발명의 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 IpaH 단백질과 결합하여 이를 포획할 수 있으며， 이와 같이 포획된 IpaH 단백질은 다시 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 포획 유무를 시각화 할 수 있다. 본 발명에서 IpaH 단백질 검출용 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 키트는 서열목톡 제 1 서열 내지 제 19 서열로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열 또는 이 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 갖는 DNA 을리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 키트는 DNA 앱타머가 칩 또는 기판상에 고정화할 수 있으며， 구체적으로 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다. 본 명세서에서 상기 용어 "마이크로 어레이" 는 기판의 특정의 영역에 DNA 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이 (배열)를 의미한다. DNA 앱타머를 칩이나 기판상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 키트에서 "기판 " 은 적합한 견고성 또는 반ᅳ견고성을 갖는 지지체를 의미하며， 예컨대, 유리， 막 (membrane), 슬라이드， 필터, 칩， 웨이퍼, 파이버， 자기성 비드 또는 비자기성 비드， 겔， 튜빙， 플레이트， 고분자， 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV 와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어， DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고， 또한 플리라이신 코팅 표면에서 UV 에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 을리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어， 비오티닐화화될 수 있고， 이는 스트랩트아비딘이 코팅된 기판상에 성공적으로 결합될 수 있다. 본 발명에서의 키트는 시료 중의 IpaH 단백질 검출에 키트를 사용하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 활용한 세균성이질의 진단 또는 시겔라 소네이 검출
시료내 IpaH단백질의 검출 및 분석은 세균성이질의 스크리닝, 진단, 및 시겔라 소네이 균의 검출에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 따라서， 본 발명의 IpaH 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 시겔라 소네이균을 직접 검출하거나 시겔라 소네이가 원인균인 세균성 이질의 진단하는 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 환자의 검체로부터 IpaH 단백질의 유무를 확인함으로써, 세균성이질의 진단 또는 시겔라 소네이 검출 방법에 활용할 수 있다. 본 발명은 세균성이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료로부터 본 발명의 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 IpaH 단백질과의 결합반웅을 통해 IpaH 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 는 혈액， 타액， 누액， 요액， 활액， 점액， 세포， 조직， 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며ᅳ 세포 배양 상등액， 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만， 이에 한정되지는 않는다. 구체적으로 시겔라 소네이는 장의 상피세포에 침입한 후 IpaH 단백질을 발현 및 분비함으로써， 환자의 분변 등에서 IpaH 단백질의 수준이 증가된다. 따라서， 상기 생물학적 시료는 바람직하게는 환자의 분변 등을 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(i) 본 발명은 시겔라 소네이 IpaH 단백질에 특이적이며 강한 결합력으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다. (ii) 본 발명의 DNA 앱타머는 시겔라 소네이 IpaH 단백질에 특이적이며 강하게 결합하는 특성을 가지므로， IpaH 단백질의 검출 용도， 시겔라 소네이의 검출 용도 및 세균성이질의 진단 용도에 유용하게 사용될 수 있다.
(iii) 본 발명의 DNA 앱타머를 이용한 시겔라 소네이의 검출 방법은
PCR 증폭 과정이나 항원 -항체 반웅을 요구하지 않으므로 간단하고 저비용으로 신속하게 수행할 수 있는 이점이 있다.
【유리한 효과】
본 발명은 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 시겔라 소네이의 병원성 단백질인 IpaH 단백질과 특이적으로 강하게 결합하는 특성을 가짐으로써 생물학적 시료내에서 IpaH 단백질의 특이적 검출을 통해 시겔라 소네이의 존재 여부를 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 DNA 앱타머는 세균성이질의 진단 또는 시겔라 소네이 검출 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 세균성이질을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 시겔라 소네이의 U>aH 유전자에 의해 발현되는 IpaH 단백질을 확보하기 위한 ipaH 유전자 클로닝 과정 및 결과를 나타낸 그림이다. 레인 M: 1 kb DNA 마커 (Elpis biotech, Korea)이고, 레인 1: ipaH 유전자를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과이며， 레인 2: PGEX-4T-1 발현 백터의 DNA를 추출하여 확인한 결과이며, 레인 3: PCR 기법을 이용해 증폭한 시겔라 소네이의 ipaH 유전자를 BamHI I Xhol 제한효소를 이용하여 자른 결과이며， 레인 4: pGEX-4T-l 발현 백터 DNA 를 BamHI I Xhol 제한 효소를 이용하여 자른 결과이며， 레인 5: 시겔라 소네이의 ipaH 유전자를 PGEX-4T-1 발현 백터에 클로닝한 결과이며， 레인 6: 시겔라 소네이의 ipaH 유전자로 클로닝된 pGEX-4T-l 발현 백터를 BamHI I Xhol 제한 효소로 잘라 클로닝을 확인한 결과이며， 레인 M: 100 bp DNA 마커 (Elpis biotech, Korea)이다. 도 2 는 재조합 IpaH 단백질을 발현하는 백터를 대장균에 형질도입한 후 이들로부터 생산되는 GST 융합 IpaH 단백질을 정제 및 농축한 후 SDS- PAGE(12%)로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 레인 M: 단백질 사이즈 마커 (Elpis biotech, Korea)이며, 레인 1: 정제 및 농축한 GST 융합 IpaH 단백질이다.
도 3 은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과를 나타내는 도이다. 레인 M: 100 bp DNA마커이고， 레인 1: DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과이다.
도 4 는 PCR 기법을 통하여 제작한 dsDNA 와 열 -넁각기법과 스트랩트아비딘을 이용하여 회수한 ssDNA 를 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 비교하여 확인한 결과이다. 레인 M: 100 bp DNA 마커이고, 레인 1: dsDNA이며， 레인 2: ssDNA이다.
도 5 는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위하여 실시한 각 SELEX 라운드에서 회수된 GST 융합 IpaH 단백질과 톡이적으로 결합하는 DNA 앱타머 또는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 양을 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 6a 및 도 6b 은 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 선별된 19 개의 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 IpaH— 1 내지 IpaH- 19의 2차 구조를 나타낸 도면이다. 도 7 은 카르복실기를 가지고 있는 센서 칩 CM5 표면에 IpaH 단백질 고정， IpaH 단백질과 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머간의 결합， IpaH 단백질에서 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 분리하여 센서칩을 재생하는 각 단계들을 도면으로 나타낸 도이다.
도 8 은 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 세균성 이질 진단 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. 패널 (a)는 세균성 이질 진단 키트의 전체 구조에 대한 모식도를 단편으로 나타내고 있으며 패널 (b)는 세균성 이질 진단 키트의 구성에 대한 모식도를 나타낸다.
도 9 는 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 ¾타머를 이용한 세균성이질 진단 키트의 진단 원리를 모식도로 나타낸 도면이다. 패널 (a)는 도 8 의 키트에 IpaH 단백질을 포함하지 않은 시료를 처리하였을 때 나타나는 결과 양상을 모식도로 나타내었다. 패널 (b)는 IpaH 단백질이 포함된 시료를 IpaH 단백질에 특이적으로 결합하는 ¾타머를 내장한 본 발명의 진단 키트에 처리하였을 때 나타나는 결과 양상을 모식도로 나타내었다.
도 10 은 본 발명의 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머를 사용하여 제작한 시겔라 소네이 IpaH 단백질 검출용 키트의 효능을 확인한 결과를 나타낸다. 패널 )는 도 8 의 구성을 갖도록 제작한 시겔라 소네이 IpaH 단백질 검출용 간이 키트이며， 아무런 시료를 처리하지 않았을 때의 사진이다. 패널 (b)는 IpaH 단백질을 포함하지 않은 시료를 처리하였을 때의 결과 사진이다. 패널 (c)는 IpaH 단백질을 포함하는 시료를 처리하였을 때의 결과 사진이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
실시예 실시예 1: 시겔라 소네이 균주의 /치 전자 선정, 클로닝, 재조합
IpaH단백질의 발현 및 정제
1-1. /pa^유전자의 선정
시겔라 소네이 C 7 e//a sonne i)를 특이적으로 검출할 수 있는 타겟을 선정하기 위해 시겔라 소네이의 병원성 유전자에 대해 문헌 조사를 실시하였다. 시겔라 소네이의 주요 병원성 유전자는 대부분 병원성 플라스미드에 존재하며 주요 병원성 유전자로는 침입성 플라스미드 항원 invasion pi asm id antigen)인 /paB , /psC, /paD , i dA 와 sen, ial 등이 있다. 특히 ,
Figure imgf000014_0001
유전자는 시겔라 속의 염색체와 플라스미드에 다수로 존재하기 때문에 보다 민감하게 진단할 수 있는 장점을 가지고 있다. 우선 ipaH유전자로부터 발현되는 IpaH 단백질에 대한 앱타머를 제작하기 위해 NCBI 로부터 IpaH 단백질의 서열정보를 얻었다 (ABE28531.1). Clustal X 프로그램을 이용하여 여러 종류의 IpaH 단백질과 다중 서열 비교를 한 결과， NCBI 에서 얻은 IpaH 단백질의 서열은 C-말단에 보존 서열을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. /；이유전자 클로닝 활성형의 재조합 IpaH 단백질을 대량으로 확보하기 위한 재조합 균주 개발을 위하여 일차적인 단계로 ipaH 유전자를 포함하는 발현 백터를 제작하였다. 우선 제한효소 자리를 포함한 DNA 프라이머 (primer) 한 쌍을 바이오니아 (Bioneer, Korea)로부터 주문 제작하였다 [정방향 프라이머: 5'- ATCGGATCCCTCACATGGAACAATCTC-3' (서열목록 제 20 서열)， 역방향 프라이머: 5'-ATCCTCGAGATTCTCTTCACGGCTTCT-3' (서열목록 제 21 서열)] · 제한효소 자리를 첨가하여 제작한 프라이머를 이용한 PCR 기법을 이용하여 ipaH 유전자를 증폭하였다. PCR 반응액 조성은 주형 DM 1 ≠, 10 X PCR 완충용액 5 각 2.5 mM dNTP 흔합물 4 ≠, 25 μΜ 정방향 프라이머 2 μί 25 yM 역방향 프라이머 2
Figure imgf000015_0001
Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 μί (lunit//^)와 35.7 의 물로 이루어져 있다. PCR 반웅 조건은 우선 94°C에서 5 분간 변성시키고， 94°C에서 30 초， 64°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 30 초간 반웅을 30 주기 반복한 후, 72°C에서 5 분간 추가로 신장시키는 반웅을 이용하였다. 이후, 증폭된 ipaH 유전자와 PGEX-4T-1 백터를 동일한 제한효소 (쑈 ¾τίΠΛϊ ?Ι)로 자른 후, 라이게이션하여 발현 백터를 제조하였다 (도 1 참고).
1-3. 재조합 IpaH 단백질 발현 백터의 숙주세포 내 도입을 통한 재조합 균주 제작과 IpaH 단백질의 발현 및 정제
상기 실시예에서 제조한 재조합 IpaH 단백질 발현 백터를 pTfl6 샤페론 백터 (chaperone vector; Takara, Japan)로 형질 전환된 BL21 (DE3) (Studier, F. Α.' and Moffatt, B. A., 1986, 189， 113-130)에 전기천공법 (electroporation)을 이용하여 형질전환 시킨 후， 암피실린 (ampici 1 Πη)과 클로람페니콜 (chloramphenicol)에 내성이 있는 형질전환체 콜로니를 선별하였다.
상기 실시예에서 획득한 형질전환체의 단일 클론을 확보하여 암피실린 (ampici llin, 50 과 클로람페니콜 (chloramphenicol， 50
//g/ )이 포함된 LB(0.5"¾ 효모 추출물, V 박토-트립톤, 1% NaCl) 배지에 12 시간 이상 종균 배양하였다. 종균 배양액의 일부를 본 배양 배지에 접종 (1%)한 다음 18°C에서 180 rpm 으로 배양하여， 재조합 IpaH 단백질의 발현을 세포의 성장과 함께 유도하였다. 단， pGEX-4T-l 발현 백터에 클로닝된 재조합 ipaH 유전자의 발현은 배양액의 0D600 가 0.4 에 이르렀을 때에 IPTGCisopropylthio-p-D-galactoside)를 0.5 mM을 첨가하여 IpaH 단백질의 과발현을 유도하였다. IpaH 단백질을 과발현하기 위하여 IPTG 첨가 후 18°C에서 20 시간 더 배양하였다. 이렇게 획득한 세포 배양액은 4°C에서 8,000 rpm 으로 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체만을 따로 분리하였다. 원심분리를 통해 얻은 균체는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 재현탁한 후 다시 원심분리하여 균체만을 획득하는 과정을 통하여 균체를 세척하였다. 이후， 세척된 균체는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 재현탁한 후， 초음파분쇄기를 이용하여 균체를 파괴하한 후， 4°C에서 8,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하여 활성형 단백질과 비활성형 단백질로 분리하였다. 획득한 활성형 단백질에서 GST 융합 IpaH 단백질을 순수 분리 정제하기 위하여 글루타티온 세파로오스 4B(glutathione sepharose 4B) 정제 키트 (GE healthcare, UK)를 이용하였다. 순수 분리 정제한 GST 융합 IpaH 단백질은 SDS-PAGE (12%) 분석을 통하여 확인하였다. 정제한 단백질은 IX PBS 버퍼로 투석을 3 희 진행한 후， 단백질 농축 키트 (Sartorius stedim, Germany)를 이용하여 농축하였다. 이어서， 농축한 IpaH 단백질을 SDS-PAGE (12%) 분석을 통하여 확인한 후 (도 2 참고)， 브래드포드 분석법 (Bradford assay)을 이용하여 단백질의 농도를 확인하였다. 실시예 2: DNA 앱타머의 제작
2-1, PC 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭
IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위해 40 개의 랜덤 서열을 dA ： dG ： dC ： dT = 1.5 ： 1.15 ： 1.25 ： 1 비율로 포함하고 있는 100 bp 의 주형 DNA (5'- 0ΟΤ ΤΑ00Α0Τ0Α0ΤΑΤΑ(ΗΪΑαΑΤΑ€0Α( ΤΤΑΤΤ0ΑΑπ- 40-ΑΟΑπα€Α0ΤΤΑΟΤΑΤ0Τ-3· '； 서열목록 제 22 서열)와 이를 76 bp 로 증폭할 수 있는 다음의 3 종류의 프라이머를 제작하였다 (Bioneer, 한국). 정방향 프라이머: 5'- ATACCAGCTTATTC AATT-3' (서열목록 제 23 서열)， 역방향 프라이머: 5'- AGATTGCACTTACTATCT-3 ' (서열목록 제 24 서열), 비오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머: 5'ᅳ비오틴 -AGATTGCACTTACTATCT-3 ' (서열목록 제 25 서열). 임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며， 76 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응액 조성은 주형 DNA 1 id, 10X PCR 완충용액 5 ^， 각 2.5 mM dNTP 흔합물 4 μ免, 25 μΜ 정방향 프라이머 2 i , 25 yM 비오티닐화된 역방향 프라이머 2 Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ≠ (1 unitA )와 35.7 ^의 증류수로 이루어져 있다. PCR 반웅 조건은 우선 94°C에서 5 분간 변성시키고， 94°C에서 30 초， 52°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 30 초간 반웅을 20 주기 반복한 후， 72°C에서 5 분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반웅 후 4 ^를 취하여， 아가로스 겔 전기영동을 통하여 증폭 산물을 확인하였다 (도 3 참고). PCR 을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ≠를 이용하여 회수하였다.
2-2. 가열 -냉각 (heating-coolong) 기법을 활용한 ssDNA 제작
PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ≠ 에 증류수 50 를 첨가하여 부피:를 100 ^로 조정한 후， 가열 -냉각 (heating-coo long) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성 (denaturation)하 였다. 실험 방법을 구체적으로 설명하면， 상기 실시예에서 획득한 dsDNA를 85°C에서 5분 동안 반웅하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후， 반웅 종료 후 즉시 반응액을 4°C로 넁각 시켜 ssDNA를 제작하였다.
2-3. ssDNA의 선별 및 회수
가열 -냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA산물 중 비오틴이 결합되어 있는 ssDNA와 프라이머 (primer)를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확 보하기 위하여， 상기 실시예에서 획득한 100 의 반웅액에 스트랩트아비딘 (Pierce, USA) 50 ^를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액 은 4°C, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리한 후， 상층 액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol： chloroform: isoamylalcohol = 25 ： 24 ： 1) 용액을 처리한 후 4°C에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리 하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA(sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3M 소듐 아세테이트 (sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피 의 100% 에탄을을 첨가하여 -70°C에서 1시간 이상 반웅시켰다. 반웅 후에 는 4°C에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회 수한 ssDNA는 65°C에서 건조시킨 후， 50 ^의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ^를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 dsDNA와 비교 하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 4 참고 )· 실시예 3: SELEX 기법을 이용한 재조합 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별
3-1. SELEX에 이용되는 각 용액의 조성
SELEX 에 이용한 각 용액은 GST bulk kit (GE healthcare, UK)를 이용하였으며， 조성은 다음과 같았다. 즉， 1 X 앱타머 선별 용액: 10 mM PBS (pH 7.4)， 2 X 앱타머 선별 용액: 20 mM PBS (pH 7.4)ᅳ 세척 용액: 앱타머 선별 용액， DNA 앱타머 용출 용액: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM 글루타티온 (glutathione).
3-2. SELEX 이용될 DNA 앱타머 구조 제작
상기 실시예 2-3 을 통하여 제작 확보한 ssDNA 40 ^에 증류수 10 ^를 첨가하고， 2 X DNA 앱타머 선별 용액 50 ^를 첨가하여 전체 반웅 부피를 100 μί로 조정하고， 85°C에서 5 분간 끓여 변성시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.
3-3. 글루타티은 세파로오스 4B(glutathione sepharose 4B)를 이용한 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별
상기 실시예 1ᅳ3에서 획득한 55 ng 의 GST융합 IpaH 단백질 10 μ免 (14.5 pmol)를 상기 실시예 3ᅳ2 에서 획득한 ssDNA 앱타머 풀 (145 pmol)과 흔합한 후， 1 X ¾타머 선별 용액으로 전체 반응 부피를 100 로 조정하였으며， 이후 4°C에서 12 시간 이상 반웅시켰다. 글루타티온 세파로오스 4B 를 활성화하기 위하여 글루타티은 세파로오스 4B 200 ^에 1 X PBS 1 ^을 넣고 4°C에서 20 분 동안 교반하며 반웅시켜 활성화시킨 후， 4°c 서 13,000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하여 상충액을 제거했다. 상기 과정을 2회 반복한 후 GST융합 IpaH 단백질과 ssDNA 앱타머 풀을 반응시킨 반웅액을 활성화된 글루타티온 세파로오스 4B 와 4°C에서 1 시간 동안 교반하며 반웅시켰다. 이후， 4°C에서 13,000 rpm 으로 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후， 1 X PBS 1 을 넣어 세척하는 과정을 3 회 반복하여 GST 융합 IpaH 단백질과 결합하지 못한 ssDNA 앱타머를 제거하였다. 글루타티온 세파로오스 4B로부터 GST융합 IpaH단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 용출하기 위하여 DNA 앱타머 용출 용액 [50 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 10 mM 글루타티온 (glutathione)] 100 ^를 넣어 4°C에서 30 분 동안 교반하며 반웅시켰으며， 이후， 4°C에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층의 용출 용액을 얻었다. 상기 과정을 2 회 반복하여 상층의 용출 용액을 획득하였다. GST 융합 IpaH 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머간의 결합물에서 GST 융합 IpaH 단백질을 제거하기 위하여, 용출 용액에 동일 부피의 PCI 용액을 처리한 후 4°C에서 13,000 rpm 으로 15 분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 이후, GST 융합 IpaH 와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수하기 위하여 PCI 볕을 통하여 회수된 상층액에 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3M 소듐 아세테이트 (pH 4.5)와 3 배부피의 100% 에탄홀을 첨가하여 - 70°C에서 1 시간 이상 반웅시켰고, 반응액을 4°C에서 13,000 rpm 으로 20 분간 원심 분리하였다. 이를 통하여 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수할 수 있었으며， 희수된 DNA 앱타머는 65°C에서 건조시킨 후， 50 의 증류수에 녹였다.
3-4. 네가티브 선별 (Negative Select ion)을 통한 비특이적 DNA 앱타머 제거
IpaH 단백질이 아닌 GST 단백질과 글루타티온 세파로오스 4B 에 결합하여 선별된 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 7 회와 8 회 사이에 IpaH 단백질 없이 GST 단쌕질만 고정되어 있는 글루타티온 세파로오스 4B 에 DNA 앱타머 용액을 결합하는 네가티브 선별 (negative selection, NS)을 진행하였다 (도 5 참조). 1 X 앱타머 선별 용액을 이용하여 활성화된 글루타티온 세파로오스 4B에 GST단백질을 고정시킨 후, 상온에서 넁각시켜 3 차원 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 풀을 반응시켰으며， 글루타티온 세파로오스 4B 와 GST 단백질에 결합하지 않은 상층의 ssDNA 앱타머 용액을 8회 SELEX에 이용하였다. 이후 상기 실시예 3-3의 방법으로 SELEX 를 총 10 회까지 진행하였으며, SELEX 의 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 앱타머 풀과 GST 융합 IpaH 단백질의 반웅 시간을 즐였으며， 횟수가 거듭될수록 반웅 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 IpaH 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다. 실시예 4: GST 융합 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 최적 DNA 앱타머 선별을 위한 SELEX 라운드 선별
4-1. 나노 드롭 (Nano drop)을 이용한 각 라운드의 친화성 확인
SELEX를 10회 까지 마친 후 SELEX 계속 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 의 농도를 나노 드롭 (Nano drop)을 이용하여 측정하였다. 나노 드롭을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 네가티브 선별 이후에 8 라운드의 농도가 832.6 ngA 로 가장 높았으며， 9 라운드와 10 라운드의 농도는 각각 603.7 ngA 와 379.0 ng/ 로 8 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 네가티브 선별 이후， GST 융합 IpaH 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적 ■ 타머 풀은 8 라운드 풀임을 확인할 수 있었다 (도 5 참고).
4-2. 실시간 (Real time) PCR 기법을 이용한 최적 라운드 확인
SELEX 를 10 회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR 을 수행하였다. 우선 초기 DNA 라이브러리와 네가티브 선별 이후인 8 라운드， 9 라운드， 10 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR 기법을 이용하여 증폭하고， 가열 -냉각 기법을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 0， 8， 9， 10 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀은 동일한 농도로 준비하여 동일한 농도의 GST 융합 IpaH 단백질과 4°C에서 12 시간 이상 반웅시켰다. 반웅액은 1 X PBS 로 활성화된 글루타티온 세파로오스 4B 와 1 시간 동안 교반하며 반웅시킨 후 4°C에서 13,000 rpm 으로 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이후， 1 X PBS 로 3 회 세척하여 GST 융합 IpaH 단백질과 결합하지 못한 ssDNA 를 제거 한 후 앱타머 용출 용액과 반웅시켜 GST 융합 IpaH 단백질과 결합한 DNA 앱타머를 회수하였다. 회수한 GST 융합 IpaH 단백질과 결합한 DNA 앱타머 에 동일 부피의 PCI 를 처 리하여 GST 융합 IpaH 단백질을 제거한 후， 회수 용액의 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피 의 3 M 소듐 아세테이트 ( 4.5)와 3 배 부피의 100% 에 탄올을 첨가하여 - 70°C에서 1 시간 이상 반웅시 켰다 . 회수된 DNA 는 85°C에서 건조시 킨 후， 50 ^의 증류수에 녹였다 . 이를 통하여 획득된 각 ssDNA 들은 각각 100， 10-1 , 10-2 로 회석하여 실시간 PCR 의 주형 DNA 로 사용하였다 . 실시간 PCR 은 Biorad 사의 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며 , 실시간 PCR 반응 조건은 우선， 94°C에서 5 분 변성 이후， 94°C에서 20 초， 52°C에서 20 초 , 그리고 72°C에서 20 초간 반웅하는 과정을 30 주기 반복한 후， 72°C에서 5 분간 연장시 키는 반웅 조건으로 반웅을 진행하였다 . 실시간 PCR 결과는 10-2 로 희석된 샘플을 주형 DNA 로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다 . 실시간 PCR 효율은 각 라운드별로 각각 73.2%， 71.66% , 56.45%였으며， 9 라운드와 10 라운드에서 획득한 ssDNA 를 주형 DNA 로 이용한 실시간 PCR 결과 효율은 71.66% , 56.45%로 8 라운드의 결과 보다 효율이 떨어지는 것으로 보아 더 이상 SELEX 를 진행이 필요 없음을 확인할 수 있었다 (표 1 참고) . 이는 나노 드롭을 이용하여 확인한 라운드에서 회수된 ¾타머 농도 측정 결과와도 일치하는 것을 확인할 수 있었다 . 나노 드롭 결과 및 실시간 PCR 결과를 통하여 8 라운드의 앱타머 풀이 GST 융합 IpaH 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다 .
【표 11
Figure imgf000021_0001
실시예 5: IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 확보 나노드롭과 실시간 PCR 을 통하여 GST 융합 IpaH 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 8라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 대해 정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열목록 제 20 서열)와 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열목록 제 21 서열)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA 를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA 는 T-블런트 클로닝 키트 (SolGent, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-백터 (10 ng/μΐ) 1 ^와 PCR 산물 (20 ng//^) 4 6 X T-블런트 버퍼 1 ^를 섞어서 25°C에서 5분 동안 반웅시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반웅액 6 βί는 100 의 DH5a와 섞은 후 421：에서 30초 동안 열층격 (heat shock)을 가한 후, 2 분 동안 얼음에서 반웅시켰다. 여기에 900 ^의 S0C (2% try tone, 0.5% yeast extract , 10 mM NaCl , 2.5 mM KC1 , 10 mM MgC12, 10 mM MgS04, 20 mM glucose) 배지를 첨가한 후 37°C에서 1 시간 동안 배양하였다. 이후， 200 ^의 배양액을 취하여 암피실린 (50 g/ml ) , 카나마이신 (50 ^g/ml), X-gal(50 ^g/ral), IPTG(5 ；g/mO이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB pi ate)에 스프레딩하고， 37°C에서 15 시간 동안 배양시킨 후， 32 개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 결정하였으며 (Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 중복되지 않는 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 19 개를 확보할 수 있었다. 아래 표 2 는 글루타티온 세파로오스 4B 를 활용한 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 선별 SELEX 기법을 이용하여 획득한 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 19 개에 대한 서열을 구체적으로 나타낸 것이다.
【표 2】
Figure imgf000023_0001
실시예 6 ： IpaH단백질 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정
IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute 에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 6a 및 도 6b 참고). 실시예 7: SPR 을 이용한 IpaH 단백질과 IpaH 결합 앱타머 후보군 간의 친화도 테스트
7-1. 시겔라 소네이 IpaH 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들 간의 각 친화도를 정량하기 위한 IpaH 단백질 코팅 센서 칩 제작 실험
IpaH 단백질과 상기 실시예 5 에서 획득한 앱타머 후보군들간의 친화도를 정량하기 위하여， 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance SPR) 실험을 실시하였다. IpaH 단백질과 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (GE Healthcare, UK)을 이용하였다. 우선 센서 칩 CM5 에 0.1 M 의 Nhydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M 의 N-ethyl-N' -(dimethyl aminopropyl) carbodi imide (EDO 흔합액을 5 id/min 의 속도로 10 분 동안 홀려 센서칩 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 Nᅳ히드록시석신이미드 에스테르 (N-Hydroxy- succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시켰다. NHS—에스테르로 활성화된 센서칩 CM5 의 표면에 IpaH 단백질을 고정하기 위하여 10 m 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 완충액에 60 ug/ir^의 농도로 녹아 있는 IpaH 단백질 용액을 5 ≠/ n 의 속도로 10 분 동안 처리하여 칩 표면을 IpaH 단백질로 코팅하였다 (도 7 참고). 이후 GST 융합 IpaH 단백질이 고정된 센서 칩에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드 (pH 8.5)를 5 id/m 의 속도로 10분 동안 홀려줌으로써 센서 칩 표면에 남아 있는 카르복실 반웅기를 불활성시켰다. 이러한 불활성화를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며， 각 실험 후 센서칩은 1 M NaCl , 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램 (BIACORE)으로 수득하고 정량하였다.
7-2. IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정
IpaH 단백질과 가장 높은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군을 HBS2P 버퍼 (GE Healthcare, UK)에 각 100 nM, 300 ηΜ, 500 ηΜ 의 농도로 녹여 준비하였다. 기 제작 준비된 IpaH 결합 DNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서 칩 (채널 1)， IpaH 단백질이 고정된 센서 칩 (채널 2)에 다양한 농도 (각 100 nM, 300 nM, 500 ηΜ)의 IpaH 결합 DNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 IpaH 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다. 각 IpaH 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (Kd, dissociation) 수득 결과 GST 융합 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 중 IpaHᅳ 17 앱타머의 해리상수가 2.82 X 10-12 M 으로 표적하는 IpaH 단백질에 대해 가장 높은 친화도 값을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다 (표 3 참고).
【표 3]
Figure imgf000025_0001
실시예 8: IpaH 단백질 특이 결합 DNA 앱타머를 이용한 IpaH 단백질 검출 키트의 제작
상기한 실시예의 방법을 통해 제작하여 확보한 IpaH 단백질 결합 DNA 앱타머의 산업적 이용 가능성을 확인하기 위해， DNA 앱타머가 포함된 IpaH 단백질 검출 키트를 제작하고， 이 키트의 IpaH 단백질의 검출능을 측정하였다. 본 발명의 IpaH 단백질 검출 키트의 구성을 보여주는 모식도는 도 8 에 나타내었다. 검출 키트의 니트로셀를로오스 멤브레인 (Nitrocellulose membrane)상의 Capture line(T)에 본 발명의 DNA 앱타머 IpaH-17 이 부착되어 있으며， Control line(C)에는 스트랩트아비딘이 부착되어 있다. 또한 본 발명의 IpaH 단백질 특이 결합 DNA 앱타머， IpaH- 8 에는 5' 말단에 아민기를 치환하여 준비하였다. 카르복실화된 (carboxylated) 직경 10 nm 의 금 나노입자 (gold nanoparticle)에 NHS/EDC (Amine coupling kit)를 25°C에서 1 시간 동안 처리한 후, 상기 준비한 5' 말단에 아민이 결합된 DNA 앱타머를 첨가하여 반웅시켜， 금 나노입자에 IpaH-8을 결합시켰다. 이렇게 제작한 IpaH 단백질 특이 결합 DNA 앱타머가 고정화된 금 나노입자를， 검출 시료에 흔합하여 25°C에서 1 시간 동안 반웅시켰다. 검출 시료내에 시겔라 소네이의 IpaH 단백질이 존재하는 경우 IpaH 단백질 ― DNA 앱타머 - 금 나노입자의 복합체가 형성될 것이며, IpaH 단백질이 존재하지 않는 경우 IpaH 단백질이 결합하지 않은 DNA 앱타머 - 금 나노입자가 존재할 것이다. 이어서， 금 나노입자가 포함된 시료 흔합물에 10X 로딩 버퍼 (loading buffer: 2.5% Triton X-100, 500 mM Tris-HCl, 10% Tween 20, 1.5 M NaCl)를 IX 가 되도톡 흔합한 후， 시료 패드 (sample pad)의 시료 웰 (sample well)에 로딩하였다. 시료 웰내의 시료 흔합물은 흡착 패드 (adsorption pad) 방향으로 이동한다.
검출 시료내에 시겔라 소네이의 IpaH 단백질이 존재하는 경우 IpaH 단백질 - DNA 앱타머 ᅳ 금 나노입자의 복합체가 형성될 것이며， 이 복합체에는 IpaH 단백질이 결합되어 있으므로, 이동 중에 Capture line(T)의 IpaH 앱타머와 결합되어 Capture line 에서 시각적으로 확인이 가능하다. 또한， 복합체의 DNA 앱타머는 비오틴이 결합되어 있으므로 Control line(C)의 스트렙트아비딘과 결합하여 Control line 에서도 확인이 가능하다. 반면， 검출시료내에 시겔라 소네이의 IpaH 단백질이 존재하지 않는 경우 IpaH 단백질 - DNA 앱타머 - 금 나노입자의 복합체가 형성되지 않으므로 Capture line 에서 복합체가 확인되지 않고， Control line(C)에서만 DNA 앱타머-금 나노입자를 확인이 가능하다. 즉， 시료내에 IpaH 단백질이 존재하는 경우 도 9 의 패널 (b)에서와 같이 두 개의 선인 Capture line (T) 및 Control line (C)에서 금 나노입자가 확인이 되며， 시료내에 IpaH 단백질이 존재하지 않는 경우 도 9 의 패널 (a)에서와 같이 하나의 선 [(Control line (T)]에서만 확인이 가능하다. 도 10 은 본 발명의 키트를 실제로 제작한사진이다. 도 10의 패널 (a)는 시료를 투입하지 않은 경우이며， 패널 (b)는 시료내에 시겔라 소네이의 IpaH 단백질이 존재하지 않은 경우이며， 패널 (c)는 시료내에 시겔라 소네이의 IpaH 단백질 존재하는 경우로서 테스트 라인 (T: Capture line) 및 컨트를 라인 (C: Control line) 모두에서 금 나노입자를 발색을 통해 확인할 수 있었다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
시질라 소네이 (Shigella sonei ) IpaH (Invasion plasmid antigen H) 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 .
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제 1 서열 제 19 서열로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을
Figure imgf000028_0001
올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
【청'구항 3]
제 1 항에 있어서， 상기 DNA 앱타머는 서열목록 제 1 서열 내지 제 19서열로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머 .
【청구항 4】
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 세균성 이질의 진단용 또는 시겔라 소네이 검출용 조성물.
【청구항 5】
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머를 포함하는 시겔라 소네이 IpaH 단백질 검출용 키트.
【청구항 6】
다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 DNA 앱타머와 시겔라 소네이 IpaH 단백질과의 결합 반웅을 통해 시겔라 소네이 IpaH 단백질을 검출하는 방법 :
(a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머에 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 IpaH 단백질을 확인하는 단계.
【청구항 7]
제 6 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액， 타액， 누액, 요액， 활액, 분변, 점액， 세포， 조직， 또는 세포 배양액인 것을 특징으로 하는 방법ᅳ
【청구항 8】
다음의 단계를 포함하는 시겔라 소네이의 검출 방법:
(a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 IpaH 단백질을 확인하는 단계.
【청구항 9]
제 8 항에 있어서， 상기 생물학적 시료는 혈액， 타액， 누액， 요액, 활엑， 분변， 점액, 세포， 조직， 또는 세포 배양액인 것올 특징으로 하는 방법.
【청구항 10】
다음의 단계를 포함하는 세균성 이질의 진단 방법:
(a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 IpaH 단백질을 확인하는 단계.
【청구항 11】
거 1 10 항에 있어서， 상기 생물학적 시료는 혈액， 타액, 누액， 요액， 활액， 분변， 점액, 세포， 조직, 또는 세포 배양액인 것을 특징으로 하는 방법.
PCT/KR2012/011194 2012-02-08 2012-12-20 시겔라 소네이의 침입성 플라스미드 항원 h 단백질과 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 WO2013118967A1 (ko)

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