KR102218267B1 - 성상교세포 특이적 핵산 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

성상교세포 특이적 핵산 압타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 성상교세포 특이적 핵산 압타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 의해 개시되는 내용에 따른 성상교세포 특이적 핵산 압타머는 DNA 압타머이다.

Description

성상교세포 특이적 핵산 압타머 및 이의 용도 {Astrocyte-specific nucleic acid aptamer and use thereof}
본 명세서에 의해 개시되는 내용은 성상교세포 특이적 핵산 압타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 성상교세포 특이적 DNA 압타머에 관한 것이다.
성상교세포 (Astrocyte)는 포유류의 중추신경계(CNS, central nervous system)의 30% 정도를 구성하는 신경교세포(glial cell)의 일종으로, 신경교세포 중 가장 많이 존재한다. 성상교세포는 혈액뇌관문(Blood-Brain Barrier)을 포함하여 뇌와 척수를 지지하고 있으며, 노폐물제거, 식세포 작용, 신경세포 (Neuron) 영양분 공급 및 이온농도조절 등을 통한 신경세포 발생에도 관여한다. 또한 중추신경계의 질병이나 손상에 대한 복구와 성상교세포의 활성이 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있어 중추신경계 치료법 개발을 위하여 성상교세포를 연구하는 것은 중요하다. 특히 중추신경계 치료를 위해 신경줄기세포 (neural stem cell, NSC)로 부터 성상교세포와 신경세포를 특이적으로 분화시키거나 체세포에서 신경세포를 분화시기거나 성상교세포에서 신경세포를 분화시키는 직접 교차분화 (direct conversion) 방법이 보고된 바 있다. 그럼에도 불구하고 성상교세포는 in vivo 환경에서 비슷한 형태와 특성을 공유하고 있는 다양한 세포들로 구성되어 있어 다양성(diversity)과 이질성(heterogeneity)이 광범위하게 존재한다. 실제 치료나 질병에 직접적으로 연관되어 있는 활성 성상교세포(reactive astrocyte)에서도 유전자 발현 패턴, 형태(morphology), 분화 등에서 다양성이 존재하는 것으로 알려져 있다.
이러한 다양성에도 불구하고, 현재 성상교세포를 확인하기 위한 과정은 성상교세포에서 특이적으로 발현되는 유전자와 단백질 바이오마커를 이용하여 RT-qPCR 및 면역조직화학염색(immunohistochemistry)에 의존하고 있다. 몇가지 잘 알려진 바이오마커로서 교섬유산성단백질(GFAP, Glial fibrillary acidic protein), GLT-1(glutamate transporter) 또는 GLAST(Glutamate apartate transporter), Aldh1L1(aldehyde dehydrogenase 1 family member L1), Glutamine synthase, and S100β(calcium-binding protein) 등이 알려져 있다. 이 중 GFAP은 활성 성상교세포의 주요 표지자로서 널리 사용되어오고 있으나, 세포 내 존재하는 중간 필라멘트(intermediate filament) 단백질로서 모든 성상교세포에 존재하지는 않고, 성상교세포의 주요 stem branch에만 염색되거나, 성상교세포 이외에도 다양한 세포에서도 염색될 수 있는 단점이 있으며, 무엇보다 살아있는 성상교세포에서는 GFAP을 이용하여 성상교세포를 분리하거나 타겟하는 것은 불가능하다. 다른 astrocyte 표지자들도 살아있는 성상교세포를 특이적으로 인식하는데 많은 문제점을 가지고 있다. 따라서 현재까지 살아있는 성상교세포막에만 특이적으로 인식할 수 있는 표지자 및 항체는 전무한 실정이며 성상교세포의 다양성과 기능 연구를 위해서는 공통적인 표지자의 발굴이 시급히 요구되고 있다.
현재 성상교세포를 확인하기 위한 과정은 성상교세포에서 특이적으로 발현되는 유전자와 단백질 바이오마커를 이용하여 RT-qPCR 및 면역조직화학염색(immunohistochemistry)에 의존하고 있다. 몇가지 잘 알려진 바이오마커로서 교섬유산성단백질(GFAP, Glial fibrillary acidic protein), GLT-1(glutamate transporter) 또는 GLAST(Glutamate apartate transporter), Aldh1L1(aldehyde dehydrogenase 1 family member L1), Glutamine synthase, and S100β(calcium-binding protein) 등이 알려져 있다. 이 중 GFAP은 활성 성상교세포의 주요 표지자로서 널리 사용되어오고 있으나, 세포 내 존재하는 중간 필라멘트(intermediate filament) 단백질로서 모든 성상교세포에 존재하지는 않고, 성상교세포의 주요 stem branch에만 염색되거나, 성상교세포 이외에도 다양한 세포에서도 염색될 수 있는 단점이 있으며, 무엇보다 살아있는 성상교세포에서는 GFAP을 이용하여 성상교세포를 분리하거나 타겟하는 것은 불가능하다. 다른 astrocyte 표지자들도 살아있는 성상교세포를 특이적으로 인식하는데 많은 문제점을 가지고 있다. 따라서 현재까지 살아있는 성상교세포막에만 특이적으로 인식할 수 있는 표지자 및 항체는 전무한 실정이며 성상교세포의 다양성과 기능 연구를 위해서는 공통적인 표지자의 발굴이 시급히 요구되고 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 목적은, 성상교세포에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머를 제공하는데 있다.
일 예로, 상기 압타머는 다음과 같은 구성을 가질 수 있다.
성상교세포에 특이적으로 결합하는 압타머로서, 상기 압타머는 단일가닥이고, 이 때, 상기 압타머는 80개 이하의 뉴클레오타이드로 구성되고, 이 때, 상기 압타머는 1개 이상의 스템-루프(stem-loop)구조를 포함하고, 이 때, 적어도 하나의 상기 스템-루프 구조 중 스템구조는 서열 5'-CCGATT-3'과 5'-AATCGG-3' 간의 상보적 결합 갖거나, 또는 적어도 하나의 상기 스템-루프 구조 중 루프구조는 15개 이상 25개 이하의 뉴클레오타이드로 구성된 것을 포함하는 압타머일 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 다른 일 목적은, 성상교세포에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머를 수 개 포함하는 압타머 다량체를 제공하는데 있다.
일 예로, 상기 압타머 다량체는 다음과 같은 구성을 가질 수 있다.
압타머 다량체로서,
모티프(motif), 이 때, 상기 모티프는 제1 프래그먼트 및 제2 프래그먼트를 포함하는 제1 단일가닥, 및 제3 프래그먼트 및 제4 프래그먼트를 포함하는 제2 단일가닥을 포함하며, 상기 제2 프래그먼트는 상기 제3 프래그먼트와 상보적으로 결합되는 것이고,
제1 링커 및 성상교세포와 특이적으로 결합하는 제1 압타머, 이 때, 상기 제1 링커는 폴리뉴클레오타이드이고, 이 때, 상기 제1 링커와 상기 제1 압타머는 서로 연결되어 있고, 이 때, 상기 제1 링커와 상기 제1 프래그먼트는 상보적으로 결합되고, 이 때, 상기 제1 압타머는 적어도 하나 이상의 스템-루프 구조를 포함하는 80mer 이하의 폴리뉴클레오타이드이고,
제2 링커 및 성상교세포와 특이적으로 결합하는 제2 압타머, 이 때, 상기 제2 링커는 폴리뉴클레오타이드이고, 이 때, 상기 제2 링커와 상기 제2 압타머는 서로 연결되어 있고, 이 때, 상기 제2 링커와 상기 제4 프래그먼트는 상보적으로 결합되고, 이 때, 상기 제2 압타머는 적어도 하나 이상의 스템-루프 구조를 포함하는 80mer 이하의 폴리뉴클레오타이드인 것을 포함하는 압타머 다량체 일 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 다른 일 목적은 핵산 압타머를 이용하여 성상교세포 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
일 예로, 압타머 또는 압타머 다량체 중 어느 하나 이상을 포함하는 성상교세포 검출용 센서 일 수 있다.
또 다른 목적은 핵산 압타머를 이용한 성상교세포의 진단용 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1내지 10로 표시되는 핵산서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 핵산서열을 포함하고, 성상교세포에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머를 제공한다.
또한, 상기 핵산 압타머, 이의 화학적 변형, 또는 이의 생물학적 변형을 포함하는 핵산 압타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 성상교세포의 검출방법을 제공한다.
또한, 상기 핵산 압타머, 이의 화학적 변형, 또는 이의 생물학적 변형을 포함하는 핵산 압타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 성상교세포의 진단 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 상기 핵산 압타머 또는 이의 변형을 포함하는 핵산 압타머를 함유하는 성상교세포 진단용 또는 검출용 키트를 제공한다.
또한, 상기 성상교세포 진단용 또는 검출용 센서 또는 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 성상교세포 검출방법을 제공한다.
상기 센서 또는 키트는 형태가 정해진 것은 아니며, 성상교세포를 진단하거나 검출할 수 있는 모든 형태의 물건을 포함하는 개념이다.
단일가닥 DNA 압타머는 표적 세포인 성상교세포에 대해 높은 결합력과 특이성을 지니고 있어 짧은 시간 내에 반응이 완료되고, 항체에 비해서 구조적으로 보다 안정하므로, 보다 손쉽게 성상교세포를 검출하는 장치, 센서 또는 키트를 만들어 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 성상교세포 특이적 결합을 통하여 성상교세포만을 분리해내는 기술에도 이용가능 할 것으로 기대된다.
도 1은 일 실시예에 따른 MACS(Magnetic Activated Cell Sorting)-assisted SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)의 개요를 나타낸다.
도 2는 일 실시예에 따른 Cell-SELEX 과정에서의 압타머의 결합여부 확인을 위한 RT-qPCR(Real-Time quantitative PCR) 결과를 나타내며, 구체적으로 13라운드 이후 MACS를 포함시키니 이전보다 큰 폭으로 binding affinity가 증가한 것을 보여주는 것이다.
도 3는 일 실시예에 따른 Cell-SELEX 과정에서의 압타머의 결합여부 확인을 위한 RT-qPCR(Real-Time quantitative PCR) 결과를 나타내며, 17라운드에서 가장 높은 binding affinity를 보여주는 것이다.
도 4 내지 도 6은 일 실시예에 따른 압타머 후보군과 프라이머가 연결된 구조를 도식화 한 것이다.
도 7 및 도 8은 일 실시예에 따른 압타머 후보군의 성상교세포에 대한 결합력 검증 결과를 나타낸다.
도 9는 일 실시예에 따른 압타머 후보군의 성상교세포 및 뉴런에 대한 결합력 검증 결과를 RT-PCT을 통하여 나타낸 것이다.
도 10은 일 실시예에 따른 압타머 후보군을 이용한 성상교세포 이미징을 나타낸다.
도 11은 일 실시예에 따른 압타머 후보군을 이용한 성상교세포 이미징과 항-GFAP 항체를 이용한 염색 결과를 비교한 것으로서, 알려진 Astrocyte marker 와 Aptamer의 신호가 같은 세포에서 나오는지 확인함을 목적으로 하는 것이다.
도 12 및 도 13은 일 실시예에 따른 압타머 후보군이 종 특이성을 갖는지 여부에 대한 확인결과를 나타낸다.
도 14 및 도 15는 일 실시예에 따른 압타머 삼량체를 준비하는 과정 및 합성 결과에 대한 자료이다.
도 16은 일 실시예에 따른 5주간 진행되는 conversion 과정을 압타머를 사용하여 모니터링 한 것으로 선정된 압타머의 성상교세포 특이적 결합력을 이용하여 일차 성상교세포의 분화를 모니터링 할 수 있음을 확인한 자료이다.
도 17 내지 도 19는 일 실시예에 따른 삼량체를 사용하여 conversion 과정을 모니터링 한 결과이다.
도 20은 일 실시예에 따른 Astrocyte aptamer를 coating 한 polymer가 성상교세포에 specific하게 internalized되는지 확인한 결과자료이다.
도 21 및 도 23는 일 실시예에 따른 압타머 다량체의 구조를 나타낸 것이다.
도 22 및 도 24는 일 실시예에 따른 압타머 다량체 및 특정 물질이 결합된 구조를 나타낸 것이다.
본 명세서에 개시된 내용을 기술하기 위하여, 본 명세서에 여러 용어들이 정의될 것이다. 이러한 용어들에 더하여, 필요한 경우 기타 용어들이 본 명세서 내의 다른 곳에서 정의된다. 본원에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 업계 용어들은 업계에서 인정되는 의미를 가질 것이다. 상충되는 경우, 본 명세서의 정의에 의해 해석될 수 있다.
용어 '약'이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
이하, 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 상세히 설명한다.
압타머(aptamer)
용어 "압타머"는 특정 표적분자 또는 표적세포에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 서열과 그 서열을 갖는 입체구조를 가진 핵산을 지칭한다.
DNA 압타머는 특정 분자 또는 세포에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미하는 것으로서, 단일 가닥인 DNA 핵산 분자를 의미한다.
RNA 압타머는 특정 분자 또는 세포에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수
있는 RNA 핵산 분자를 의미하는 것으로서, 단일 가닥인 RNA 핵산 분자를 의미한다.
명세서에 기재된 발명의 일 구현예로, 압타머는 표적분자 또는 표적세포에 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 가지는, 비교적 짧은 길이의, 20mer 내지 80mer의 핵산서열을 갖는다.
명세서에 기재된 발명의 일 구현 예로, 압타머는 한 개의 스템-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 구현 예로, 압타머는 두 개의 스템-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 구현 예로, 압타머는 세 개의 스템-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 구현 예로, 압타머는 네 개의 스템-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있다.
상기 복수개의 스템 루프 구조는 서로 동일한 크기의 것일 수 있다.
상기 복수개의 스템 루프 구조는 서로 다른 크기의 것일 수 있다.
스템-루프 구조는 스템구조 및 루프구조로 이루어져있다.
항체와 비교할 때 압타머는 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다.
(1) 화학적 합성이 용이하며 또한 비교적 작고 단순한 분자이므로 여러 가지 필요한 변형이 가능하다.
(2) SELEX 과정을 통해 선택성과 친화도를 극대화할 수 있다.
(3) 화학적 합성으로 만들어지므로 순도가 높다.
(4) 동물에 주입하여 항체를 생성하기 어려운 독소 등에 대한 압타머의 개발이 가능하다.
(5)열에 안정하여 실온에서 장기간 보존도 가능하다.
(6) 생체 내 면역반응을 거의 일으키지 않는다.
상기 압타머의 서열은, 예를 들어, 진화분자공학에 의해 개발된 핵산 서열일 수 있다. 상기 표적분자에 강하게 결합하는 압타머는 셀렉스(SELEX) 기술을 이용하여 정제할 수 있다.
SELEX는 큰 규모의 무작위 시퀀스인 oligonucleotide library내에서 특정 분자를 표적으로 하는 압타머를 도출하는 과정이다. SELEX에서, oligonucleotide library를 표적 분자와 반응시켜, 표적 분자에 결합하지 않는 sequence들을 제거하고, 표적 분자와 결합한 sequence들은 분리하여 PCR (polymerase chain reaction)을 통해 증폭해 낸 후, 앞선 과정을 수 차례 반복하여 최종적으로 목표 분자와 가장 강력하게 결합한 sequence만을 압타머 후보군으로 선별한다.
상기 SELEX는 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, Cell-SELEX 등이 있으나, 이로 제한되는 것이 아니다.
상기 Cell-SELEX 기법은 다른 기법과 조합하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 일 실시예에 의하면, Cell-SELEX 기법 및 MACS 기법을 조합하여 MACS-assisted SELEX를 수행하였다.
명세서에 기재된 발명의 일 예로서, 압타머는 20mer 이상 100mer 이하의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 예로서, 압타머는 30mer 이상 90mer 이하의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 예로서, 압타머는 40mer 이상 80mer 이하의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 예로서, 압타머는 30mer 이상 70mer 이하의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 예로서, 압타머는 20mer 이상 60mer 이하의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 예로서, 압타머는 30mer 이상 50mer 이하의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 예로서, 압타머는 20mer 이상 50mer 이하의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 예로서, 압타머는 하기의 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 표시되는 것일 수 있다.
압타머 1-1: TGCCGAAGGTGCCGATTGAGTGAATCGGCTGTTGTTTATG (서열번호 1)
압타머 1-2: TGCCGAAGGTGCCGATTGAGTGAATCGGTTGTTGTTTATG (서열번호 2)
압타머 2: GGCCGACTTTCTCTTCTTTATATTTTACGGGTTCTTTGTG (서열번호 3)
압타머 3: GGCCGACTTTCTTTTTTTCATGTCTTACGGGTTCTTTGTG (서열번호 4)
압타머 4: GGCCGGCTTTTTCTTTTCTTTATATTTTATGGGTTCTCTGTG (서열번호 5)
압타머 5: GGCCGACTTTTTTTTTTTTTATATTTTACGGGTCCTCTGTG (서열번호 6)
압타머 6: GGCCGACTTTTTTTTTTTTATATTTTACGGGTCCTCTGTG (서열번호 7)
압타머 7: GGCCAATCTTTTTTTTTTATATTTTACGGGTCCTTTGTG (서열번호 8)
압타머 8: GGCCAACTTTTTTCTTTTTTATATTTACGGGTCTTCTGTG (서열번호 9)
압타머 9: GGCCGACTTTTTCTTTCTTATATTTTACGTGTTTTTTGTG (서열번호 10)
스크램블 압타머1: GTAGTTGTGGTGGCTACGCATCGTATCTGGTGATCAGTGA (서열번호 11)
스크램블 압타머2: TTCGGTATTTTTATTCTTTTCCCTGTTAGGCTAGTCCTGG (서열번호 12)
상기 스크램블 압타머는 각 압타머 1과 2의 음성 대조군(negative control)을 말한다.
위의 압타머들을 서열을 기준으로 두 개의 그룹으로 아래의 표와 같이 정리하여 나타낸다.
빈도(Frequency)에 표시된 숫자는 그룹에 속한 압타머 서열의 출현 개수이다.
[표 1]
Figure 112019090731510-pat00001
상기 뉴클레오타이드 서열의 변경에 의해서 서열번호 1 내지 10로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열과 90% 이상 100% 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 제공할 수 있다.
또는, 상기 핵산서열과 95% 이상 100% 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 제공할 수 있다.
또는, 상기 핵산서열과 96% 이상 100% 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 제공할 수 있다.
또는, 상기 핵산서열과 97% 이상 100% 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 제공할 수 있다.
또는, 상기핵산서열과 98% 이상 100% 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 제공할 수 있다.
또는, 상기 핵산서열과 99% 이상 100% 미만의 상동성을 가지는 핵산서열을 제공할 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 구현예로, 화학적 또는 구조적 변형을 일으킨 압타머가 제공될 수 있다.
당업자는 상기 압타머의 뉴클레오타이드 서열의 변경, 화학적 잔기 치환이나 기능성 고분자를 붙이는 등 여러 가지 변형을 용이하게 수행할 수 있다.
예를 들어, RNA를 이용한 압타머의 경우 분자적 불안정성을 극복하기 위해 라이보오스 2'-OH를 2'-F, 2'-NH2 또는 2'-O-methyl 그룹으로 치환하여 안정성을 높일 수 있다.
예를 들어, 핵산 압타머의 생체 내에서의 반감기 또는 안정성을 증가시키기 위하여 PEG, 알부민, 또는 cholesterol 등의 당업자라면 쉽게 선택할 수 있는 모든 고분자를 결합할 수 있다.
상기 뉴클레오타이드 서열의 변경이란, 유전자를 구성하는 핵산서열 내에서 인위적으로 또는 자연적으로 1개 이상의 핵산의 삽입, 결실, 역위, 또는 치환 등이 되는 것을 포함한다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 성상교세포 특이적 핵산 압타머가 제공될 수 있다.
상기 성상교세포 특이적이란 것은 성상교세포 표면의 표지단백질을 인식하는 것을 의미한다.
상기 성상교세포 특이적이란 것은 성상교세포 표면의 표지단백질과 공유결합 또는 비공유결합 할 수 있는 것을 의미한다.
상기 압타머는 DNA 압타머일 수 있다.
상기 성상교세포는 살아있는(live) 성상교세포 일 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 서열번호 1 내지 10의 서열을 가지는 압타머가 제공될 수 있다.
상기 압타머는 DNA 압타머의 일 서열에 화학적 잔기 치환이나 기능성 고분자를 붙이는 등 여러 가지 변형을 가한 것일 수 있다.
상기 압타머는 표적분자 또는 표적세포에 특이적으로 결합하는 유효한 부분을 포함한다.
상기 압타머는 성상교세포에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 압타머는 스템-루프구조를 포함할 수 있다.
는 서열번호 1 내지 10의 서열을 가지는 DNA 압타머로부터 T를 U로 치환한 것일 수 있다.
상기 압타머는 RNA 압타머의 일 서열에 화학적 잔기 치환이나 기능성 고분자를 붙이는 등 여러 가지 변형을 가한 것일 수 있다.
상기 압타머는 스템-루프구조를 포함할 수 있다.
압타머 다량체
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기의 압타머 수 개를 포함하는 것인 압타머 다량체가 제공될 수 있다.
상기 압타머 다량체는 압타머의 일 서열에 화학적 잔기 치환이나 기능성 고분자 또는 링커를 붙이는 등 여러 가지 변형을 시킨 압타머를 포함하는 것 일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기의 압타머 수 개 각각은 모티프(motif)에 결합된 것인 압타머 다량체가 제공될 수 있다.
상기 모티프란 압타머 다량체를 제조하기 위해 이용할 수 있는 구조를 갖는 모든 것을 지칭한다.
상기 모티프는 뉴클레오타이드의 집합체일 수 있다.
또한, 상기 모티프는 당업자가 당연하게 구현할 수 있는 모든 방법에 의하여 제조할 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 단일가닥 DNA는 인위적으로 제조한 것으로서, 각 단일가닥 DNA는 서로 상보적인 서열을 갖고 있을 수 있다. 또한, 상기 상보적인 서열에 의하여 모티프를 제조할 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 이상의 단일가닥 DNA이 결합되어 모티프를 형성할 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 상기 단일가닥 DNA 두 개의 조합으로 압타머 이량체를 제조하기 위한 모티프가 제공될 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 상기 단일가닥 DNA 세 개의 조합으로 압타머 삼량체를 제조하기 위한 모티프가 제공될 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 상기 단일가닥 DNA N개의 조합으로 압타머 N량체를 제조하기 위한 모티프가 제공될 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면 이량체 압타머를 제조하기 위한 모티프가 제공될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기 이량체 압타머를 제조하기 위한 모티프는 2 이상의 프래그먼트를 포함하는 단일가닥 DNA를 수 개 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 모티프는 제1 프래그먼트, 제2 프래그먼트를 포함하는 제1 단일가닥 DNA 및 제3 프래그먼트, 제4프래그먼트를 포함하는 제2 단일가닥 DNA를 포함할 수 있다.
상기 제2 프래그먼트는 상기 제3 프래그먼트와 상보적인 서열을 가질 수 있다. 상기 제2 프래그먼트와 상기 제3 프래그먼트는 상보적으로 결합될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 상기 제4 프래그먼트는 동일한 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 상기 제4 프래그먼트는 서로 다른 서열을 가질 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 상기 이량체 압타머를 제조하기 위한 모티프에 링커 및 압타머가 결합된 압타머 다량체가 제공될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커는 폴리펩타이드 일 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 제1 링커는 서로 상보적인 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 제1 링커는 서로 상보적으로 결합될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커는 제1 압타머와 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커와 상기 제1 압타머는 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커 서열과 제1 압타머 서열 사이에 그 외의 서열이 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커 서열과 제1 압타머 서열은 직접적으로 연결된 것일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기 제1 프래그먼트, 상기 제1 링커, 및 상기 제1 압타머가 연결된 것이 제공될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기 이량체 압타머를 제조하기 위한 모티프에 제2 링커 및 제2 압타머가 더 포함된 것일 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커는 폴리펩타이드 일 수 있다.
일 예로, 상기 제4 프래그먼트와 제2 링커는 서로 상보적인 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제4 프래그먼트와 제2 링커는 서로 상보적으로 결합될 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커는 제2 압타머와 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커와 상기 제2 압타머는 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커 서열과 제2 압타머 서열 사이에 그 외의 서열이 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커 서열과 제2 압타머 서열은 직접적으로 연결된 것일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기 제2 프래그먼트, 상기 제2 링커, 및 상기 제2 압타머가 연결된 것이 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 이량체 압타머를 제조하기 위한 모티프를 이용하는 압타머 다량체는 도 21에 기재된 구성을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 이량체 압타머를 제조하기 위한 모티프를 이용하는 압타머 다량체에 특정 물질이 결합된 것이 제공될 수 있다. 예를 들어, 도 22에 기재된 구성을 가질 수 있다.
일 예로, 각 압타머에 결합된 물질은 서로 동일한 것일 수 있다.
일 예로, 각 압타머에 결합된 물질은 서로 다른 것일 수 있다.
일 예로, 압타머에 결합된 물질은 이미징 물질일 수 있다.
일 예로, 압타머에 결합된 물질은 체내 반감기 또는 안정성을 높여주는 기능을 갖는 물질, 발광할 수 있는 기능을 갖는 물질, 또는 치료기능 등의 기능을 갖는 물질일 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면 삼량체 압타머를 제조하기 위한 모티프가 제공될 수 있다.
상기 삼량체 압타머를 제조하기 위한 모티프는 3 이상의 프래그먼트를 포함하는 단일가닥 DNA를 수 개 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 모티프는 제1 프래그먼트, 제2 프래그먼트, 및 제5 프래그먼트를 포함하는 제1 단일가닥 DNA,
제3 프래그먼트, 제4프래그먼트, 및 제6 프래그먼트를 포함하는 제2 단일가닥 DNA, 및
제7 프래그먼트 내지 제9 프래그먼트를 포함하는 제3 단일가닥 DNA를 포함할 수 있다.
상기 제2 프래그먼트는 상기 제3 프래그먼트와 상보적인 서열을 가질 수 있다. 상기 제2 프래그먼트와 상기 제3 프래그먼트는 상보적으로 결합될 수 있다.
상기 제5 프래그먼트는 상기 제8 프래그먼트와 상보적인 서열을 가질 수 있다. 상기 제5 프래그먼트와 상기 제8 프래그먼트는 상보적으로 결합될 수 있다.
상기 제6 프래그먼트는 상기 제7 프래그먼트와 상보적인 서열을 가질 수 있다. 상기 제6 프래그먼트와 상기 제7 프래그먼트는 상보적으로 결합될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 상기 제4 프래그먼트는 동일한 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 상기 제9 프래그먼트는 동일한 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제4 프래그먼트와 상기 제9 프래그먼트는 동일한 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 상기 제4 프래그먼트는 서로 다른 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 상기 제9 프래그먼트는 다른 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제4 프래그먼트와 상기 제9 프래그먼트는 다른 서열을 가질 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 상기 삼량체 압타머를 제조하기 위한 모티프에 링커 및 압타머가 결합된 압타머 다량체가 제공될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커는 폴리펩타이드 일 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 제1 링커는 서로 상보적인 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제1 프래그먼트와 제1 링커는 서로 상보적으로 결합될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커는 제1 압타머와 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커와 상기 제1 압타머는 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커 서열과 제1 압타머 서열 사이에 그 외의 서열이 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 링커 서열과 제1 압타머 서열은 직접적으로 연결된 것일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기 제1 프래그먼트, 상기 제1 링커, 및 상기 제1 압타머가 연결된 것이 제공될 수 있다.
일 예로, 상기 모티프에 제2 링커 및 제2 압타머가 더 포함된 것일 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커는 폴리펩타이드 일 수 있다.
일 예로, 상기 제4 프래그먼트와 제2 링커는 서로 상보적인 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제4 프래그먼트와 제2 링커는 서로 상보적으로 결합될 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커는 제2 압타머와 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커와 상기 제2 압타머는 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커 서열과 제2 압타머 서열 사이에 그 외의 서열이 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 제2 링커 서열과 제2 압타머 서열은 직접적으로 연결된 것일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기 제2 프래그먼트, 상기 제2 링커, 및 상기 제2 압타머가 연결된 것이 제공될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기 모티프에 제3 링커 및 제3 압타머가 더 포함된 것일 수 있다.
일 예로, 상기 제3 링커는 폴리펩타이드 일 수 있다.
일 예로, 상기 제9 프래그먼트와 제3 링커는 서로 상보적인 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 제9 프래그먼트와 제3 링커는 서로 상보적으로 결합될 수 있다.
일 예로, 상기 제3 링커는 제3 압타머와 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제3 링커와 상기 제3 압타머는 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 제3 링커 서열과 제3 압타머 서열 사이에 그 외의 서열이 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 제3 링커 서열과 제3 압타머 서열은 직접적으로 연결된 것일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 상기 제9 프래그먼트, 상기 제3 링커, 및 상기 제3 압타머가 연결된 것이 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 삼량체 압타머를 제조하기 위한 모티프를 이용하는 압타머 다량체는 도 23에 기재된 구성을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 삼량체 압타머를 제조하기 위한 모티프를 이용하는 압타머 다량체에 특정 물질이 결합된 것이 제공될 수 있다. 일 예로, 도 24에 기재된 구성을 가질 수 있다.
일 예로, 각 압타머에 결합된 물질은 서로 동일한 것일 수 있다.
일 예로, 각 압타머에 결합된 물질은 서로 다른 것일 수 있다.
일 예로, 각 압타머에 결합된 물질 중 적어도 두 개는 서로 동일한 것일 수 있다.
일 예로, 압타머에 결합된 물질은 이미징 물질일 수 있다.
일 예로, 압타머에 결합된 물질은 체내 반감기 또는 안정성을 높여주는 기능을 갖는 물질, 발광할 수 있는 기능을 갖는 물질, 또는 치료기능 등의 기능을 갖는 물질일 수 있다.
압타머 컨주게이트 또는 조성물
명세서에 기재된 발명의 일 구현예로서, 압타머 컨주게이트가 제공될 수 있다.
압타머 컨주게이트란 압타머 또는 압타머 다량체에 체내 반감기 또는 안정성을 높여주는 기능을 갖는 물질, 발광할 수 있는 기능을 갖는 물질, 또는 치료기능 등의 기능을 갖는 물질이 부착된 것이다.
예를 들어, 상기 체내 반감기 또는 안정성을 높여주는 기능을 갖는 물질은 PEG, 알부민, 또는 콜레스테롤 등 일 수 있다.
예를 들어, 상기 발광할 수 있는 기능을 갖는 물질은 조영제(constant media) 또는 이미징 물질(imaging agent) 등을 일 수 있다.
예를 들어, 상기 이미징 물질은 무기황화물, 산화물, 할로겐화물 일 수 있다.
예를 들어, 상기 이미징 물질은 생물학적 마커로서 형광성 단백질(fluorescent protein)일 수 있다.
상기 형광성 단백질은 GFP(Green fluorescent protein), RFP(Red fluorescent protein), BFP(Blue fluorescent protein), 또는 CFP(Cyan fluorescent protein) 일 수 있다.
예를 들어, 상기 체내치료 기능을 갖는 물질은 치료제(therapeutic agent), 항체(antibody) 등 일 수 있다.
상기 압타머 컨주게이트는 특정 분자 또는 세포의 검출을 위하여 이용될 수 있다.
상기 압타머 컨주게이트는 특정 분자 또는 특정 세포의 진단 또는 치료를 위하여 이용될 수 있다.
상기 특정 세포는 성상교세포 일 수 있다.
상기 특정 세포는 살아있는 성상교세포 일 수 있다.
명세서에 기재된 발명의 일 구현예로서, 압타머, 압타머 다량체, 또는 압타머 컨주게이트를 유효성분으로 하는 약학적 조성물이 제공될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당업자라면 누구나 쉽게 이용할 수 있는 모든 물질을 구성요소로 할 수 있다.
압타머의 제조방법
본 명세서에 의해 개시되는 다른 양태에 따르면, 성상교세포에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머, 압타머 다량체 또는 압타머 컨주게이트의 합성 방법이 제공될 수 있다.
상기 핵산 압타머의 합성 방법은 시험관 내 합성일 수 있다. 예를 들어, 상기 시험관 내 합성은 PCR(polymerase chain reaction; 중합효소 연쇄반응)을 이용한 합성일 수 있다.
상기 핵산 압타머의 합성 방법은 세포 내 합성일 수 있다.
상기 세포 내 합성 방법은 바이오리액터(bioreactor)로부터의 합성일 수 있다.
상기 압타머 다량체의 합성 방법은 시험관 내 합성일 수 있다. 예를 들어, 상기 시험관 내 합성은 PCR(polymerase chain reaction; 중합효소 연쇄반응)을 이용한 합성일 수 있다.
상기 압타머 다량체의 합성 방법은 세포 내 합성일 수 있다.
상기 세포 내 합성 방법은 바이오리액터(bioreactor)로부터의 합성일 수 있다.
상기 압타머 컨주게이트의 합성 방법은 시험관 내 합성일 수 있다. 예를 들어, 상기 시험관 내 합성은 PCR(polymerase chain reaction; 중합효소 연쇄반응)을 이용한 합성일 수 있다.
상기 압타머 컨주게이트의 합성 방법은 세포 내 합성일 수 있다.
상기 세포 내 합성 방법은 바이오리액터(bioreactor)로부터의 합성일 수 있다.
상기 압타머 다량체는 in vitro 상태에서의 합성일 수 있다.
예를 들어, 상기 in vitro 상태에서의 합성 방법은, 고온에서 상기 압타머와 상기 모티프를 넣고 끓인 뒤, 온도를 낮추며 반응시켜 상기 압타머 다량체를 합성하는 방법일 수 있다.
압타머의 용도
본 명세서에 의해 개시되는 또다른 구현예에 따르면, 성상교세포에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머의 용도가 제공될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 또다른 구현예에 따르면, 성상교세포에 특이적으로 결합하는 압타머 다량체의 용도가 제공될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 또다른 구현예에 따르면, 성상교세포에 특이적으로 결합하는 압타머 컨주게이트의 용도가 제공될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 또다른 구현예에 따르면, 성상교세포에 특이적으로 결합하는 압타머, 압타머 다량체, 또는 압타머 컨주게이트를 유효성분으로 하는 약학적 조성물의 용도가 제공될 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 다른 구현예에 따르면, 상기 용도는 압타머를 이용한 성상교세포 표지 용도가 제공될 수 있다.
상기 표지에 있어서, 형광물질, 조영제(constant media) 또는 이미징 물질(imaging agent) 등을 이용할 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 다른 구현예에 따르면, 상기 용도는 압타머를 이용하여 특정 물질을 성상교세포로 전달(delivery)하는 용도가 제공될 수 있다.
예를 들어, 폴리머(polymer)나 나노입자(nanoparticle)의 표면에 압타머를 코팅하여 살아있는 성상교세포로 특정 물질을 전달하는 용도가 제공될 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 압타머를 이용한 성상교세포 진단 및/또는 검출 용도가 제공될 수 있다.
상기 진단 또는 검출에 있어서, 센서 또는 키트 등을 이용할 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 압타머를 이용한 성상교세포 분리 용도가 제공될 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 압타머를 이용한 성상교세포 치료 용도가 제공될 수 있다.
상기 성상교세포 치료 용도는 압타머를 치료제의 용도로 사용하는 것일 수 있다.
상기 성상교세포 치료 용도는 압타머-약물 컨주게이트(aptamer drug conjugate)를 이용한 치료제 개발일 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 일 구현예에 따르면, 치료제의 스크리닝 용도가 제공될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 명세서를 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이하의 실시 예에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이들 실시 예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로서, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
[실시예 1] MACS-assisted Cell-SELEX
성상교세포에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머를 선별하기 위하여 실험을 수행하였다. 사멸한 세포에 비특이적으로 결합하는 압타머는 가장 주요한 문제점(drawback) 중 하나이다. 그러므로 MACS를 이용한 항체 분류(Antibody sorting)하여 살아있는 성상교세포 만을 고를 수 있게 하여 기존 cell SELEX와의 차별성을 두었다.
(1) 실험 재료
타겟세포(Target Cell)인 성상교세포와 카운터 세포(Counter cell)인 뉴런(Neuron)을 준비하였다.
그 후, DNA 라이브러리(library)를 준비하였다(IDT, US)), 각 DNA는 5', 3'에 각각 15bp의 포워드 프라이머(forward primer) 및 리버스 프라이머(reverse primer) 결합 사이트(site)가 있고, 가운데 40mer 의 랜덤 서열(random sequence)로 구성된다.
하기와 같이 서열이 구성된다.
서열 5'-ATGCGGATCCCGCGC (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN) CGCGCGAAGCTTGCG-3'
포워드 프라이머 : 5'- ATGCGGATCCCGCGC-3'
리버스 프라이머 : 5'- CGCGCGAAGCTTGCG-3'
바인딩 버퍼(Binding buffer)를 준비하였다. 바인딩 버퍼는 1 liter of DPBS(Dubelcco's Phsphate-Buffered Saline), and 4.5 g of glucose, 100 mg salmon sperm DNA, 1 g BSA and 5 ml of 1 M MgCl2로 구성된다. 워싱 버퍼(Washing buffer)를 준비하였다. 워싱 버퍼는 1 liter of DPBS, and 4.5 g of glucose, 5 ml of 1 M MgCl2로 구성된다.
(2) 실험 과정
① Negative SELEX (2라운드 부터 시행하였음)
뉴런을 100pi plate에 꽉 차게 배양했다. 그 후, media를 제거하기 위해 10mL 바인딩 버퍼로 2번 워싱하였다. 아큐테이즈(Accutase) 5mL을 넣어 1차로 부유 세포를 시험관에 모으고, 추가적으로 DPBS 5mL을 넣고 세포 스크래퍼(scrapper)를 이용하여 세포를 플레이트(plate)로 부터 떼어내고 배양하였다.
300g에서 10분간 원심분리(Centrifuge)하고 350ul 바인딩 버퍼로 세포를 재부유(resuspension)하였다. 압타머가 들어있는 바인딩 버퍼와 섞은 뒤 4℃에서 배양하였다. 300g에서 10분간 원심분리 한 뒤, 상층액 450ul를 따서하여 Positive SELEX에 사용했다.
② Positive SELEX
성상교세포를 위와 같은 과정으로 준비하여 500uL 바인딩 버퍼에 재부유하였다. Negative SELEX로부터 얻은 상층액을 세포와 모두 합쳐 4℃에서 인큐베이션 하였다. 300g의 상태에서 10분간 원심분리 하여 1ml 워싱 버퍼로 3번 워싱하고, Anti-GLAST로 MACS로 sorting 하여 살아있는 성상교세포만 골라낸다.이 과정은 14라운드부터 추가된 것이다.
③ Elution
MACS로 sorting 하여 얻은 세포를 300g 상태에서 10분간 원심분리 하여 상층액을 버리고 500ul 증류수에 재부유하였다. 95℃에서 10분간 끓이고(boiling) 5분 간 13100g 상태에서 원심분리 후 상층액만 취했다. PCR로 압타머 라이브러리(aptamer library)를 증폭하여 다음 라운드에 사용하였다.
④ Selecting pressure
압타머 라이브러리 의 양은 4nmol에서 35pmol까지 단계적으로 감소시켰다. 타겟 세포(Target cell)와의 결합 시간(binding time)은 1시간에서 10분 까지 감소하였다. 카운터 세포(Counter cell)와의 결합 시간은 1라운드에서는 0분, 2라운드 부터 30분으로 시작하여 1hr까지 증가하였다.
이 때, 14라운드부터 MACS를 추가하였다.
다음 라운드에 사용할 단일가닥 DNA 라이브러리를 증폭하여 준비하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
⑤ Sequential Linear PCR
23ul Eluate, 2X Go Taq(Promega, US) 25ul, 25uM Forward primer 1ul, 25uM reverse primer 1ul 를 섞어 5회 실행하였다. 상기 과정에서 얻은 PCR 결과물을 주형(template)으로 사용하여 5ul Template, 2X Go Taq 25ul, 25uM Forward primer 1ul, 25uM reverse primer 1ul, 18ul DW 를 섞어 5회, 10회, 15회 실행하였다.
3% 아가로스 겔(Agarose gel)에 내려서 증폭을 확인하고, 원하는 70bp ds-DNA만 있는 조건으로 8개를 시행하였다. 3% 아가로스 겔에 내려 겔 익스트랙션(gel extraction)하여 dsDNA를 준비하였다.
⑥ Asymmetric PCR
상기 ①에서 준비된 dsDNA를 주형으로로 사용하여 asymmetric PCR을 진행하였다. 1ul Tempalte, 2X Go Taq 25ul, 25uM Forward primer 1ul, 2.5uM reverse primer 1ul, DW 22ul 를 섞어 15회, 20회, 25회 실행하였다. 아가로스 겔 로 확인한 뒤, 70bp ssDNA가 제일 많이 증폭된 조건으로 24개의 PCR을 진행하였다.
Gel extraction 하여 240ul nuclease free-Water로 용리(Elution)하였다.
⑦ Concentration and buffer change
10K Amicon 필터에 14000g의 상태로 10분간 원심분리 하였다. 400ul 1X DPBS 추가하였고, 상기 원심분리 과정을 반복하였다. Filter 위의 샘플(sample)만 취했다.
⑧ Refolding before use
모든 SELEX 라운드를 포함한 압타머와 타겟 바인딩 전에 압타머 라이브러리 또는 선정된 압타머를 리폴딩(refolding)시키는 과정을 진행하였다. 95℃에서 10분간 끓인 뒤, 10분간 얼음으로 빠르게 식혔다
[실시예 2] 압타머와의 결합 확인을 위한 RT-qPCR
압타머가 타겟 성상교세포 표면에 잘 붙고 있는지 그리고 Cell-SELEX가 제대로 진행되고 있는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 세포를 준비하여 워싱 버퍼로 2번 워싱하였다. 하나의 샘플당 세포 100000개, 압타머 150ng이 들어가도록 하여 최종적으로 200ul의 용량을 30분간 4℃에서 인큐베이션 하였다. 300g 상태에서 10분간 원심분리하여 2번 워싱하였다. 200ul 증류로 재부유하고 1 또는 2ul를 따서 주형으로 사용하였다. qPCR은 Total 25ul로 준비하였으며, 12.5ul 2X SYBR Taq, 1ul 25uM Forward primer, 1ul 25uM Reverse primer, Template, DW를 섞은 뒤, 20사이클 반복하여 Cq값을 분석하였다. 2^-Cq로 계산하여 비교하였다.
그 결과, 13라운드까지는 MACS가 포함되지 않았지만, 성상교세포에 대한 압타머 결합량이 라이브러리에 비해 증가하였고, MACS를 결합시킨 14라운드 이후부터는 이전보다 큰 폭으로 압타머 결합양이 증가하였다(16라운드) (도 2).
MACS가 포함된 라운드 (14-20, 여기서는 15, 17, 20만을 측정함)만을 비교하였을 때 17라운드에서 가장 높은 압타머 결합량을 보였다. 20라운드에서 감소한 것으로 보아 이전 라운드에서 결합된 압타머가 선택적으로 포화(saturation)되었을 가능성이 높다고 판단하여 17라운드에 결합된 압타머 풀(pool)을 최종적으로 시퀀싱(sequencing)하였다.
[실시예 3] 성상교세포에 특이적으로 결합된 압타머의 시퀀싱을 통한 identification
모니터링 결과 가장 결합 친화도(binding affinity)가 좋았던 라운드의 산물로부터 압타머 후보군(Aptamer candidate)을 찾기 위한 시퀀싱을 수행하였다. 시퀀싱은 13라운드와 (MACS 미포함), 17라운드 (MACS포함)에서 각각 수행하였다.
(1) 실험 재료
T-vector cloning vector, ligase, competent cell, 이중가닥 DNA(Double stranded DNA), LB media, Mini prep kit 를 준비하였다.
(2) 실험 방법
MACS를 도입하기 전 최종 라운드인 12,13라운드와 MACS를 도입한 후 제일 좋은 라운드인 17라운드를 시퀀싱하였다.
① TA cloning
Taq polymerase를 이용하여 linear PCR하여 dsDNA를 준비하였다. T-Vector 와 dsDNA를 붙이고(ligation), 4℃에서 보관하였다. 컴퍼턴트 세포(Competent cell)에 형질전환(transformation)하여 37℃ 항생제 LB plate에 배양했다,
② Plasmid-Miniprep for sequencing
싱글 콜로니(Single colony)를 멸균된 파이펫 팁으로 취하여 37℃의 LB media 5mL 에 배양했다. 4000g 에서 5분간 원심분리하여 모든 펠렛으로부터 플라스미드를 미니프렙(miniprep)하여 준비 하였다. 50ul 증류수에 일루션(Elution)하여 시퀀싱 하였다. 총 100개 colony를 시퀀싱을 하였으며 multialignment를 하여, 첫째, 출연 빈도가 높은 서열, 둘째, 안정한 서열(낮은 자유에너지) 순으로 후보를 선정하였다.
[실시예 4] 최종 발굴된 압타머 후보군
압타머의 2차 구조는 mfold web server(M. Zuker. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415, 2003.)에서 분석되었고 프라이머(primer)를 포함한 총 70mer의 2차 folding 구조를 확인하였다. 압타머 1-1, 1-2 및 2의 서열은 5'에서 3'순으로 서열번호 1 내지 3에 표기하였으며, 압타머 1-1과 1-2의 차이는 서열 하나의 차이인 것을 확인하였다.
각 압타머 1과 2의 음성 대조군(negative control)인 스크램블 압타머(scramble aptamer)를 서열번호 11 및 12로 표기하였다.
최종 발굴된 압타머 후보군 서열을 아래와 같이 표로 정리하였다.
하기의 압타머는 5' 말단 및 3' 말단에 15mer의 프라이머를 각각 포함한 것이다.
No. 압타머 5'에서 3'순 서열
(프라이머(15mer)-압타머(40mer)-프라이머(15mer) 순서임)
1 1-1 ATG CGG ATC CCG CGC TGC CGA AGG TGC CGA TTG AGT GAA TCG GCT GTT GTT TAT GCG CGC GAA GCT TGC G
2 1-2 ATG CGG ATC CCG CGC TGC CGA AGG TGC CGA TTG AGT GAA TCG GTT GTT GTT TAT GCG CGC GAA GCT TGC G
3 2 ATG CGG ATC CCG CGC GGC CGA CTT TCT CTT CTT TAT ATT TTA CGG GTT CTT TGT GCG CGC GAA GCT TGC G
4 Scramble 1 ATG CGG ATC CCG CGC GTA GTT GTG GTG GCT ACG CAT CGT ATC TGG TGA TCA GTG ACG CGC GAA GCT TGC G
5 Scramble 2 ATG CGG ATC CCG CGC TTC GGT ATT TTT ATT CTT TTC CCT GTT AGG CTA GTC CTG GCG CGC GAA GCT TGC G
[실시예 5] 압타머 후보를 이용한 성상교세포에 대한 결합력 검정압타머후보의 결합 친화도를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
모니터링의 준비 방법과 동일하나 최종 부피 12.5ul 에 2ul의 주형을 넣어주고, 20회 반복 수행하였다. 이 때, 압타머 1은 압타머 1-2로 진행하였다. 성상교세포와 신경세포수 (약 100,000개) 는 동일하게 사용하고 각 압타머의의 농도를 0-500nM 범위에서 다르게 넣어준 이후, 워싱과정을 거쳐 최종 세포에 결합된 압타머의 양을 RT-qPCR를 통해 분석하였다.
사용된 압타머 후보군은 모두 non-labeled full length aptamer이며 IDT에서 합성하였다. RT-qPCR에서 사용한 SYBR green 의 End point 형광신호를 노멀라이즈(normalize) 하여 미카앨리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식으로 도식화하였다. 두 실험 모두 세 번 반복하여 평균 내었다.
그 결과, 압타머 1-1 및 압타머 2가 성상교세포에 대하여 결합 친화도를 가지며, 압타머 1-1이 압타머 2보다 성상교세포에 대하여 높은 결합 친화도와 특이성을 가지는 것을 확인하였다.
[실시예 6] 발굴된 성상교세포 압타머를 이용한 성상교세포 이미징(imaging)
발굴된 성상교세포 압타머(Astrocyte aptamer)를 13-13까지 사용하여 성상교세포 이미지(Astrocyte imaging)를 비교하였다. 압타머의 염색은 실시예 11-1의 방법을 사용하였다.
그 결과, 압타머 신호(Aptamer signal)가 나오는 부분은 뉴런이 아니라 성상교세포인 것을 확인하였다.
[실시예 7] 성상교세포-압타머 imaging과 GFAP antibody 염색의 비교
알려진 성상교세포 마커(Astrocyte marker)와 압타머의 신호가 같은 세포에서 나오는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
그 결과, 압타머 신호가 나오는 부분과 성상교세포 마커인 GFAP의 신호가 나오는 부분이 일치하는 것을 확인하였다.
스크램블 압타머(Scramble aptamer)의 경우에는 Ast17-30과 비교하여 압타머의 신호가 거의 관찰되지 않았음
[실시예 8] 압타머의 종 특이성 확인(Rat, Mouse astrocyte에 대한 binding 비교)
이미징은 ALEXA488-Ast17-30 250nM을 사용하였다.
FACS의 경우 Cell을 떼서 0, 125nM, 250nM, 500nM을 바인딩 시켜 이미징 하여 확인하였다.
confocal 400배로 관찰한 결과, Mouse 와 Rat Astrocyte에 비슷한 수준으로 압타머가 붙는 것이 관찰되었다.
[실시예 9] 압타머 삼량체(trimer) 준비
압타머의 하나인 Ast17-30 전체 길이는 70mer이다. 이 중 유효한 부분을 제외한 나머지부분을 잘라내어 Truncated 압타머(t압타머)를 제조하였다(tAst17-30).
Trimer 준비하였다. Y 모양의 모티프를 제작하기 위해 도 13과 같이 상보서열을 가지고 있는 단일가닥 DNA를 합성하였다. 95℃도에서 2분 끓이고 1℃/1min 속도로 4℃ 까지 식혔다. 5' 위치에 링커(linker)가, 3' 위치에 형광물질이 달린 tAst17-30을 들어 있는 Y 모티프보다 3배 높은 몰 수(mole) 넣어주었다. 20℃에서 1시간동안 반응시켰다. 3% Agarose gel에서 제대로 합성 되었음을 확인하였다. 상기 과정을 통해 준비된 trimer는 별도의 정제 없이 그대로 실험에 사용하였다.
[실시예 10] 삼량체(Trimer)를 사용한 Rat Astrocyte to Neuron precursor cell conversion 모니터링
컨버젼(conversion) 과정을 5주동안 모니터링 하였다. Expantion 된 세포(Exp)가 1주차에 해당하며, 이후 4주동안 컨버젼을 진행하였다(도 16). 성상교세포는 GFAP로, 신경전구세포(Neural precursor cell)는 NESTIN로 염색하여 모니터링 하였다. 양성 대조군(Positive control)은 래트(Rat)의 성상교세포 샘플이며, 컨버젼샘플은 분화가 진행중인 샘플이다.
250nM 삼량체를 사용하여 컨버젼을 모니터링하였다. 250nM ALEXA488이 붙은 삼량체를 사용하여 FACS로 컨버젼을 모니터링하였다. 그 결과, 선정된 압타머의 성상교세포 특이적 결합력을 이용하여 일차 성상교세포의 분화가 모니터링 되었다.
[실시예 11] 기타 실험
실시예 11-1. 압타머 염색
(1) 실험 준비
압타머 결합을 위하여 ALEXA488-aptamer, 압타머 바인딩 버퍼, Dextran Sulfate(DxSO4) 6uM, 압타머 워싱버퍼를 준비하였다. 상기 버퍼는 SELEX 준비과정시 버퍼와 동일한 버퍼를 사용하였다.
상기 바인딩 버퍼는 블락킹 물질(blocking agent)인 salmon sperm DNA 변성(denaturation)을 위해 95도에서 15분 끓이고 얼음에서 15분 식혀 준비하였다.
상기 압타머 준비는 95도에 5분 끓이고 실온(Room Temperature)까지 서서히 식혀(15분) 리폴딩(refolding)시켰다.
상기 세포는 24-well plate에 커버 글래스(cover glass)를 넣어 꽉 차게 키워 준비하였다.
(2) 실험 과정
우선 1ml 워싱 버퍼로 2번 워싱하여 미디아(media)를 제거하였다. 바인딩 버퍼와 DxSO4 500ul 넣고 37℃에서 10분간 블락킹(Blocking) 하였다. 블락킹 용액(blocking solution)을 제거하고, 바인딩 버퍼와 DxSO4 200ul가 섞인 용액에 압타머를 준비하여 세포에 처리(treat)한 뒤, 37℃에서 1시간동안 암실에서 배양하여 압타머를 세포에 바인딩시켰다. 500ul 워싱 버퍼로 3분씩 3번 워싱하였다. 4% 포름알데히드 용액으로 10분간 실온의 암실에서 보관하였다. DPBS 500ul 로 5분씩 3번 워싱하였다. 슬라이드 글라스(slide glass)에 DAPI와 mounting medium 한방울 떨어뜨리고 그 위에 커버글라스를 덮고 주변에 묻은 미디아(media)를 제거하였다. 커버글라스 주변을 투명 매니큐어로 고정하여 컨포컬 관찰하는 시간까지 4℃의 암실에 보관하였다.
실시예 11-2. IHC
(1) 실험 준비
1차 안티바디(primary antibody(anti-GFAP, anti-Tuj1)), 형광처리된 2차 안티바디(fluorophore labeled secondary antibody), 1차 안티바디 블락킹 버퍼(blocking buffer(0.1% BSA/PBS에 NGS(normal goat serum) 10%, TX100(Triton-X 100) 0.3%)), 1차 안티바디 바인딩 버퍼(0.1% BSA/PBS에 NGS 10%), 2차 안티바디 바인딩 버퍼(0.1% BSA/PBS), washing buffer(0.1% BSA/PBS), fixative solution(4% Formaldehyde in DPBS)를 준비하였다.
(2) 실험 방법
① 압타머 처리 후, 고정 후 하기의 과정을 진행하였다.
1st Ab binding
0.1% BSA/PBS를 플레이트 벽 쪽으로 300μL 정도 쏴서 5분간 인큐베이션 한 뒤, 3회 워싱하였다. 0.1% BSA/PBS에 NGS(normal goat serum) 10%, TX100(Triton-X 100) 0.3%로 섞어 300μL 처리 후 실온에서 1시간동안 블락킹 하였다. 0.1% BSA/PBS에 NGS 10%, primary Ab 1/2000으로 섞어 200μL 처리 후 4℃에서 보관하였다. 이 때, anti-astrocyte는 Anti-GFAP, anti-neuro은 anti-Tuj1를 사용하였다.
2nd Ab binding
0.1% BSA/PBS를 플레이트 벽 쪽으로 300μL 정도 쏴서 5분간 인큐베이션 한 뒤, 3회 워싱하였다. 0.1% BSA/PBS에 Ab 1/500으로 섞어 200μL 처리 후 1시간동안 실온의 암실에서 보관하였다. 0.1% BSA/PBS를 플레이트 벽 쪽으로 300μL 정도 쏴서 5분간 인큐베이션 한 뒤, 2회 워싱하였고, 그 이후에 PBS로 2회 워싱하였다. 슬라이드 글라스에 DAPI가 포함된 봉입제(mounting medium) 한방울 떨어뜨리고 그 위에 커버글라스를 덮고 주변에 묻은 봉입제를 제거하였다. 커버글라스 주변을 투명 매니큐어로 고정하여 컨포컬 관찰하는 시간까지 4℃의 암실에 보관하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY <120> Astrocyte-specific nucleic acid aptamer and use thereof <130> CP18-237 <150> KR 10-2018-0122835 <151> 2018-10-15 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 1 tgccgaaggt gccgattgag tgaatcggct gttgtttatg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 2 tgccgaaggt gccgattgag tgaatcggtt gttgtttatg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 3 ggccgacttt ctcttcttta tattttacgg gttctttgtg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 4 ggccgacttt ctttttttca tgtcttacgg gttctttgtg 40 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 5 ggccggcttt ttcttttctt tatattttat gggttctctg tg 42 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 6 ggccgacttt tttttttttt atattttacg ggtcctctgt g 41 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 7 ggccgacttt ttttttttta tattttacgg gtcctctgtg 40 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 8 ggccaatctt ttttttttat attttacggg tcctttgtg 39 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 9 ggccaacttt tttctttttt atatttacgg gtcttctgtg 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 10 ggccgacttt ttctttctta tattttacgt gttttttgtg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 11 gtagttgtgg tggctacgca tcgtatctgg tgatcagtga 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 12 ttcggtattt ttattctttt ccctgttagg ctagtcctgg 40

Claims (10)

  1. 성상교세포에 특이적으로 결합하는 압타머로서,
    상기 압타머는 단일가닥이고, 80개 이하의 뉴클레오타이드로 구성되며,
    이 때, 상기 압타머는 서열번호1 내지 10중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    압타머.
  2. 삭제
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 서열번호1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드의 제1 말단 또는 제2 말단; 또는
    상기 서열번호1 내지 10 중 어느 하나와 상보적인 폴리뉴클레오타이드의 제1 말단 또는 제2 말단에 프라이머 서열을 더 포함하는,
    압타머.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 압타머는 무기황화물, 산화물, 할로겐화물, 조영제 또는 형광성 단백질 중 하나인 이미징 물질(imaging agent)과 연결된 것인
    압타머.
  5. 압타머 다량체로서,
    모티프(motif),
    - 이 때, 상기 모티프는 제1 프래그먼트 및 제2 프래그먼트를 포함하는 제1 단일가닥, 및 제3 프래그먼트 및 제4 프래그먼트를 포함하는 제2 단일가닥을 포함하며,
    상기 제2 프래그먼트는 상기 제3 프래그먼트와 상보적으로 결합되는 것임-;
    제1 링커 및 성상교세포와 특이적으로 결합하는 제1 압타머,
    - 이 때, 상기 제1 링커는 폴리뉴클레오타이드이고,
    이 때, 상기 제1 링커와 상기 제1 압타머는 서로 연결되어 있고,
    이 때, 상기 제1 링커와 상기 제1 프래그먼트는 상보적으로 결합되고,
    이 때, 상기 제1 압타머는 80mer 이하의 폴리뉴클레오타이드이고,
    이 때, 상기 제1 압타머는 서열번호1 내지 10중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고 -; 및
    제2 링커 및 성상교세포와 특이적으로 결합하는 제2 압타머,
    - 이 때, 상기 제2 링커는 폴리뉴클레오타이드이고,
    이 때, 상기 제2 링커와 상기 제2 압타머는 서로 연결되어 있고,
    이 때, 상기 제2 링커와 상기 제4 프래그먼트는 상보적으로 결합되고,
    이 때, 상기 제2 압타머는 80mer 이하의 폴리뉴클레오타이드이고,
    이 때, 상기 제2 압타머는 서열번호1 내지 10중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함함 -;
    을 포함하는,
    압타머 다량체.
  6. 제5 항에 있어서,
    상기 압타머 다량체는
    모티프,
    - 이 때, 상기 모티프는 제5 프래그먼트를 더 포함하는 제1 단일가닥,
    제6 프래그먼트를 더 포함하는 제2 단일가닥, 및
    제7 프래그먼트 내지 제9 프래그먼트를 포함하는 제3 단일가닥을 더 포함하고,
    이 때, 상기 제5 프래그먼트는 상기 제8 프래그먼트와 상보적으로 결합되고,
    이 때, 상기 제6 프래그먼트는 상기 제7 프래그먼트와 상보적으로 결합되고 -; 및
    제3 링커 및 성상교세포와 특이적으로 결합하는 제3 압타머,
    - 이 때, 상기 제3 링커는 폴리뉴클레오타이드이고,
    이 때, 상기 제3 링커와 상기 제3 압타머는 서로 연결되어 있고,
    이 때, 상기 제3 링커와 상기 제9 프래그먼트는 상보적으로 결합되고,
    이 때, 상기 제3 압타머는 80mer 이하의 폴리뉴클레오타이드이고,
    이 때, 상기 제3 압타머는 서열번호1 내지 10중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함함 -;
    을 포함하는
    압타머 다량체.
  7. 제5 항에 있어서,
    상기 압타머는 무기황화물, 산화물, 할로겐화물, 조영제 또는 형광성 단백질 중 하나인 이미징 물질(imaging agent)과 연결된 것인
    압타머 다량체.
  8. 제1항, 제3항, 제4항의 압타머 또는 제5 항 내지 제7 항의 압타머 다량체 중 어느 하나 이상을 포함하는 성상교세포 검출용 센서.


  9. 삭제
  10. 삭제
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