CN116023460B - 一种StayGold黄色荧光蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种StayGold黄色荧光蛋白及其应用，涉及重组蛋白技术领域，该StayGold黄色荧光蛋白为StayGold的氨基酸序列中包含了192位赖氨酸突变酪氨酸氨基酸，即可将绿色的荧光StayGold蛋白变成黄色的YStayGold。本发明提供的YStayGold的最大激发波长为500nm，最大发射波长为515nm。本发明提供的YStayGold具有很强的热稳定性，Tm大于95℃。比市场上常用的YFP黄色荧光蛋白的Tm值高出15℃，且荧光强度也高出8倍，说明YStayGold黄色荧光蛋白明显比市场上常用的YFP黄色荧光蛋白具有更广阔的应用市场。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白技术领域，具体涉及一种StayGold黄色荧光蛋白及其应用。
背景技术
运用荧光蛋白监测细胞活动、标记蛋白表达的技术已经深入蛋白质组学的研究。最早的荧光蛋白是在1962年由下村修等人在Aequorea victoria水母中发现的绿色荧光蛋白。在绿色荧光蛋白蛋白广泛应用后，科学人员发现单纯的绿色荧光蛋白通常不能完全满足研究需要，比如在很多实验中需要同时标记两种以上的细胞或蛋白。因此，科研人员后期通过研究绿色荧光蛋白的结构特点，通过对绿色荧光蛋白的某些氨基酸进行突变，从而获得了不同颜色的变种蛋白，如黄色、蓝色、青色以及红色等。多种颜色荧光蛋白的发现不仅为科研提供了方便，同时也扩展了荧光蛋白的应用市场。
Hirano，Masahiko等人在2022年从Cytaeis uchidae水母中发现了一种新的绿色荧光蛋白StayGold，该荧光蛋白的光稳定性比目前常用的荧光蛋白都高出一个数量级，已经很好地应用于观察内质网的动态成像[Hirano，Masahiko et al.“A highlyphotostable and bright green fluorescent protein.”Nature biotechnology，10.1038/s41587-022-01278-2.25Apr.2022]，该荧光蛋白比目前常用的绿色荧光蛋白具有更强的光稳定性，提示着其具有更广泛的应用市场。目前对于该绿色荧光蛋白的开发研究还欠缺，因其绿色荧光稳定性比其他荧光蛋白要强，因此基于其绿色荧光设计出其变种蛋白，也具有很高的市场应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有StayGold绿色荧光蛋白的一些应用限制，提供了一种StayGold黄色荧光蛋白及其应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供一种StayGold黄色荧光蛋白，命名为YStayGold，该StayGold黄色荧光蛋白序列为野生型StayGold蛋白的突变序列，且所述突变序列中的突变为K192Y，即野生型StayGold蛋白的第192位氨基酸残基由赖氨酸突变成酪氨酸，即可将绿色的荧光StayGold蛋白变成黄色的YStayGold。
进一步改进在于，所述StayGold黄色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述StayGold黄色荧光蛋白。
进一步改进在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒为含有上述多核苷酸且能够翻译表达出上述StayGold黄色荧光蛋白的表达载体。
进一步改进在于，所述表达载体为pET-28a载体。
本发明还提供一种蛋白表达系统，为转入上述重组质粒的大肠杆菌BL21菌株。
本发明还提供一种上述StayGold黄色荧光蛋白的制备方法，构建pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-YStayGold(K192Y)重组质粒并转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中表达所述重组质粒，再使用亲和层析His FF富集纯化获得所述黄色荧光蛋白。
本发明还提供一种上述StayGold黄色荧光蛋白在检测蛋白的标记、表达定位中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明根据现有的研究结果，扩展了StayGold蛋白的应用，在绿色荧光蛋白的基础上开发了一种新的黄色YStayGold蛋白。该黄色荧光蛋白有很强的热稳定性，Tm约为95℃，比市场上常用的YGFP的Tm值高出15℃，且荧光强度也高8倍。YStayGold黄色荧光蛋白比市场上常用的YFP黄色荧光蛋白具有更广阔的应用市场。
附图说明
图1为YStayGold小量表达检测图；
图2为YStayGold与StayGold、YFP颜色对比图；
图3为YStayGold镍柱纯化图；
图4为YFP镍柱纯化图；
图5为YStayGold与StayGold、YFP激发波长和发射波长测定图；
图6为YStayGold与YFP黄色荧光蛋白Tm值检测图；
图7为YStayGold与YFP黄色荧光蛋白荧光强度检测图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1YStayGold蛋白质粒构建及表达
2.1.1YStayGold质粒构建
本发明用基因合成技术获得StayGold的基因，其基因是合成在pET28a载体上，获得pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-StayGold质粒。YStayGold的质粒是以StayGold的基因为模板，设计K192Y突变氨基酸引物：
正向引物：ATCACTGGATTCGTTATCAATACACACAAA；
反向引物：TTTGTGTGTATTGATAACGAATCCAGTGAT；
按照常规定点突变PCR的方法，获得pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-YStayGold(K192Y)重组质粒。所有重组质粒均测序正确。YStayGold的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码YStayGold蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.1.2YStayGold小量表达
将构建成功且测序正确的pET28a-6His-Strep II-TEV-GG-YStayGold(K192Y)重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌斑至5mL LB液体培养基中，37℃培养，待菌液OD600至0.6-0.8时取少量菌液用loading buffer进行固定，并取少量菌液加入甘油冻至-80℃，剩余菌液加入0.5mM IPTG诱导4个小时后，收集菌体并取诱导后菌液进行SDS-PAGE检测。根据SDS-PAGE结果可知YStayGold有明显表达(图1)。
2.2YStayGold蛋白质纯化
2.2.1YstayGold大量表达
将明显表达YStayGold的菌株接种至50mL LB液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1L LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.6-0.8时加入0.5mM IPTG 15℃培养过夜，5000rpm离心收集菌体。
2.2.2YStayGold重组蛋白纯化
将收集的菌块进行称重，按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析His FF富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡His FF柱，将所有细胞上清挂柱后，用不同梯度的咪唑溶液洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE检测，纯化结果如图3所示，YStayGold蛋白明显表达、纯度较好。
将YStayGold与StayGold蛋白的颜色进行对比，见图2，根据图2的结果可知StayGold蛋白颜色为绿色，YstayGold蛋白颜色为黄色，表明192位的赖氨酸突变成酪氨酸后，获得了绿色StayGold的变种黄色荧光蛋白YStayGold。
2.2.3YFP重组蛋白纯化
为了将YStayGold与其他黄色荧光蛋白的性能进行比较，同样地在原核表达系统中表达了YFP重组蛋白(蛋白序列见SEQ ID NO.3)。YFP蛋白的表达方法与YStayGold相同，因为YFP蛋白N端带有Flag标签，因此纯化时是用Anti-Flag G1柱子进行纯化，具体方案为：将收集的菌块进行称重，按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(100mM Hepes(pH7.5)，150mM NaCl)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析Anti-Flag G1富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡Anti-Flag G1柱，将所有细胞上清挂柱后，用200ng/ul的多肽洗脱，收集洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE检测，纯化结果如图4所示，YFP蛋白明显表达、纯度较好。其颜色见图2，从颜色上看，YFP与YStayGold颜色相当。
2.3YStayGold全波长扫描
根据纯化后蛋白的颜色可以大致判断YStayGold为黄色荧光蛋白，为了进一步测定YStayGold的激发和发射波长，用酶标仪进行了测定。同时也对YFP蛋白的激发波长和发射波长进行了测定，具体操作流程如下：
将待检测的StayGold、YstayGold和YFP蛋白浓度稀释为0.50mg/ml，用全波长扫描仪分别扫描两个蛋白的最大吸收波长，实验结果见图5，其中StayGold的最大吸收波长为480nm、YStayGold的最大吸收波长为500nm、YFP的最大吸收波长为510nm。在确定好三个蛋白的吸收波长后，分别用相应的波长作为激发光，检测三个蛋白的最大发射波长，图5结果显示StayGold的最大发射波长为510nm、YStayGold的最大发射波长为515nm、YFP的最大发射波长为521nm。因此StayGold绿色荧光蛋白的激发波长为480nm，发射波长为510nm；YStayGold蛋白的激发波长为500nm，发射波长为515nm。YFP的激发波长为510nm，发射波长为521nm。从StayGold和YStayGold两个蛋白的激发波长和发射波长来看，YStayGold的波长比StayGold蛋白要高，也能说明192位的赖氨酸突变成酪氨酸后，使StayGold绿色荧光转变成黄色荧光。
2.4YStayGold热稳定检测
为了研究YStayGold蛋白的热稳定性，将其与市场上常用的黄色荧光蛋白YFP进行Tm值的比较。具体的实验操作如下：
取20μL蛋白浓度稀释为0.50mg/mL的上述2种蛋白分别加到384孔实验板中，震荡离心后，将实验板置于取样架上，使用Nano DSF毛细管吸样，保证样品充满整个毛细管。将毛细管放入nanoDSF仪器中，设置初始温度为20℃，以每分钟升温2.0℃的速度最终上升到90℃终止。仪器将会依照设置好的参数进行升温和实时检测。Tm值测试的结果如图6所示，YFP的Tm值为79.1℃；YStayGold的Tm值太高，超出了仪器检测的最高值，根据其Tm的曲线来看，其Tm值约为95℃。实验表明本发明的YStayGold的热稳定性比市场上常用的黄色荧光蛋白要好，具有更好的应用场景。
2.5YStayGold蛋白荧光强度检测
为了研究YStayGold的荧光强度，选择纯化后的YStayGold蛋白，同时与纯化后的YFP蛋白进行荧光强度的比较。
具体的实验操作如下：
分别取10μL 2种不同的荧光蛋白于384孔的反应板中，加入10μL反应缓冲液(50mMTris-HCl pH 8.0，150mM NaCl)，用全波长扫描仪进行读数，YStayGold设置激发波长为500nm，发射波长为510nm、YFP设置激发波长为510nm，发射波长为521nm。实验数据如图7所示，YStayGold的荧光信号比YFP高出8倍。表明本发明的YStayGold的荧光强度比市场上常用的黄色荧光蛋白要强，具有更广泛的应用场景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种StayGold黄色荧光蛋白，其特征在于，该StayGold黄色荧光蛋白序列为野生型StayGold蛋白的突变序列，且所述突变序列中的突变为K192Y，即野生型StayGold蛋白的第192位氨基酸残基由赖氨酸突变成酪氨酸，所述StayGold黄色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的StayGold黄色荧光蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为含有如权利要求2-3任一所述的多核苷酸且能够翻译表达出如权利要求1所述StayGold黄色荧光蛋白的表达载体。
5.根据权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述表达载体为pET-28a载体。
6.一种遗传工程菌株，其特征在于，为转入权利要求5所述重组质粒的大肠杆菌BL21菌株。
7.一种如权利要求1所述的StayGold黄色荧光蛋白的制备方法，其特征在于，构建所述黄色荧光蛋白的重组质粒并转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中表达所述重组质粒，再使用亲和层析His FF富集纯化获得所述黄色荧光蛋白。
8.一种如权利要求1所述的StayGold黄色荧光蛋白在检测蛋白的标记和蛋白的表达定位中的应用，其特征在于，所述应用为不涉及人或动物疾病的诊断或治疗的应用。
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