CN114478725B - 一种链霉亲和素突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程、蛋白质工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种链霉亲和素突变体及其制备方法和应用，本发明从改造链霉亲和素突变体分子结构入手，得到热稳定性高的链霉亲和素突变体，氨基酸序列为SEQ ID NO.1；编码所述突变体氨基酸的DNA序列为SEQ ID NO.2。与现有链霉亲和素生产方法相比，本发明由于突变了链霉亲和素基因以及优化了该基因密码子，相比现有技术，使得该突变的链霉亲和素具有易于纯化，得率高以及稳定性强等特点，是一种高效生产链霉亲和素突变体的方法，该方法简单易行，成本低廉，同时获得的链霉亲和素突变体可广泛应用于组织化学中，标记效率相比野生型大大提高。

Description

一种链霉亲和素突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程、蛋白质工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种链霉亲和素突变体及其制备方法和应用。
背景技术
链霉亲和素(Streptavidin，SA)是由阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii) 分泌的一种蛋白质，它与亲和素(avidin)相似，能与生物素特异结合，但是与亲和素相比，链霉亲和素等电点低，含糖基少，在检测抗原-抗体系统时，其非特异性结合远比亲和素低，尤其在免疫组织化学和DNA分子杂交检测中，几乎无背景显色。当链霉亲和素与生物素结合，具有信号放大的功能，从而可以广泛的应用在生物传感、酶联免疫、组织化学等各个方面。链霉亲和素还可以作为大分子引发剂能够合成蛋白质-聚合偶联物，蛋白质-聚合偶联物多用于医药、纳米技术、生物工程，其合成方法一直是近些年的研究热点。
链霉亲和素是由4个相同亚基构成的四聚体蛋白质，分子质量为66kD，每个亚基约17kD。在蛋白水解酶的作用下，链霉亲和素单体N端10-12和C端 140-142间断裂，会形成核心链霉亲和素(coSA)，仍保持完整的生物素结合能力。coSA具有溶解性好，生物活性高、稳定性好、耐酸、耐尿素及盐酸胍能力强的特点，是当前国内主要使用的链霉亲和素形式。
野生型SA分子与生物素的结合速度虽然很快，但结合力不够稳定持久，它不是目前某些应用领域(如细胞生物学领域)的最佳选择。链霉亲和素应用虽然广泛，但目前国内主要依赖于进口产品，因此开发一种高效、稳定、廉价的制备方法具有重要意义。
发明内容
本发明为解决现有技术问题提供了一种易于纯化，得率高以及稳定性强的链霉亲和素突变体及其制备方法和应用。
本发明为实现上述目的，采用如下技术方案来实现：
本发明公开了一种链霉亲和素突变体，含有如SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，是通过将核心链霉亲和素的第60位的Ala突变为Pro，第68位的Lys突变为Arg。
进一步的，本发明公开了编码上述链霉亲和素突变体的核苷酸序列，含有如 SEQID NO.2所述的DNA序列。
进一步的，本发明还公开了一种表达载体，包含上述核苷酸序列。
进一步的，本发明还公开了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
进一步的，本发明还公开了含有上述链霉亲和素突变体、DNA、表达载体和/或转化细胞中的任一项或者多项的试剂盒。
进一步的，本发明公开了上述链霉亲和素突变体的制备方法，包括以下步骤：
a.全人工基因合成以及定点突变引入；
将链霉亲和素的核心氨基酸序列的第60位的Ala突变为Pro，第68位的Lys 突变为Arg，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1；
b.将上述氨基酸的突变序列的N端添加Met氨基酸作为起始密码子，根据大肠杆菌的密码子偏好性，将氨基酸序列进行密码子优化，并在其后的3’-端添加终止密码TAA；
c.添加了起始密码ATG和终止密码TAA的上述核苷酸序列通过PCR法人工合成，得到人工DNA序列SEQ ID NO.2；
d.在链霉亲和素变体序列的5’端添加限制性内切酶Nde I的酶切位点，在序列的3’端添加限制性内切酶EcoR I的酶切位点，进行全基因合成，并连接入原核表达载体pET21a的Nde I酶切位点和EcoR I酶切位点之间，得到重组原核表达质粒pET21a-SA，导入大肠杆菌细胞BL21(DE3)中，采用热激法转化细胞，在培养基中培养转化的细胞；
e.挑取转化的细胞，进行摇瓶培养，离心获得发酵菌体采用SDS-PAGE进行表达量测定，选取表达量最高的菌株，进行发酵培养，获得菌体，之后用缓冲液 PBS进行清洗离心，菌体在冰上进行超声破碎，然后进行离心，留取上清。
进一步的，本发明公开了上述链霉亲和素突变体的制备方法，还包括如下的纯化步骤:
f.将获得的上清进行离子交换层析后经分子筛除盐、超滤浓缩、最后冻干得成品酶。
进一步的，本发明公开的链霉亲和素突变体，所述链霉亲和素突变体的比活性相比野生型提高至少15％以上，在一些实施例中，能达到20％；所述链霉亲和素突变体与生物素结合的半衰期相比野生型提高至少50％以上，在一些实施例中，能达到60％。
进一步的，本发明公开的链霉亲和素突变体，所述链霉亲和素突变体的温度稳定性高于野生型至少50％以上，在一些实施例中，能达到60％。
进一步的，本发明公开的链霉亲和素突变体优选的应用于组织化学中。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种全人工基因合成的、稳定性持久、易于制备的链霉亲和素突变体的制备方法。
2.本发明公开的链霉亲和素突变体结合稳定性高：突变体与生物素结合的半衰期为10小时，而野生型为6小时。
3.本发明公开的链霉亲和素突变体标记效率高：突变体完成顺磁STV结合所用时间为20分钟，而野生型20分钟结合率不到65％。突变体结合速率增强，提高了标记效率。
附图说明
图1表示利用SDS-PAGE电泳对经纯化后的链霉亲和素突变体纯度进行检测的结果；
图2表示野生型及突变型链霉亲和素温度稳定性研究结果；
图3表示突变型与野生型链霉亲和素顺磁标记率。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
表1为本发明具体序列。
表1序列表
Figure SMS_1
实施例1
本发明的链霉亲和素突变体的制备方法，按照如下步骤进行：
a.全人工基因合成以及定点突变引入。
将链霉亲和素的核心氨基酸序列的第60位的Ala突变为Pro，第68位的Lys 突变为Arg，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
b.将上述氨基酸的突变序列的N端添加Met氨基酸作为起始密码子，根据大肠杆菌的密码子偏好性，将氨基酸序列(SEQ ID NO.1)进行密码子优化，并在其后的3’-端添加终止密码TAA。
c.添加了起始密码ATG和终止密码TAA的上述核苷酸序列通过PCR法人工合成，得到人工DNA序列SEQ ID NO.2。
d.在链霉亲和素变体序列的5’端添加限制性内切酶Nde I的酶切位点，在优化序列的3’端添加限制性内切酶EcoR I的酶切位点，进行全基因合成(北京六合华大基因科技有限公司)，并连接入原核表达载体pET21a(购自Novagen公司) 的Nde I酶切位点和EcoR I酶切位点之间，得到重组原核表达质粒pET21a-SA，导入大肠杆菌细胞BL21(DE3)中，采用热激法转化细胞，在培养基中培养转化的细胞。
e.挑取转化的细胞，进行摇瓶培养，温度37℃，200rpm过夜培养，按照体积比为1％的比例将培养的菌液接种到新鲜的含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液浓度OD600在0.8～1.2，加入诱导物 IPTG至工作浓度1mM继续培养24小时，4℃、8000rpm离心10min收集菌体。离心获得发酵菌体采用SDS-PAGE进行表达量测定，选取表达量最高的菌株，进行发酵培养，培养条件37℃、200rpm。离心(8000rpm，10min)获得菌体，之后可用缓冲液PBS进行清洗离心，重复3次。留取菌体在冰上进行超声破碎，功率200W，超声5s，间隔5s，10min，然后进行离心，留取上清。
f.将获得的上清进行离子交换层析后经分子筛除盐、超滤浓缩、最后冻干得成品酶。
用BCA法测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图1所示：M为蛋白分子量标准；S为纯化前总蛋白；SM为纯化后的链霉亲和素突变体重组蛋白。
实施例2
链霉亲和素活性测定。
采用BCA蛋白浓度测定法进行蛋白浓度的测定，以BSA作标准曲线。采用Green改良法测定链霉亲和素活性。在同等条件下，改造后获得的链霉亲和素比活性达到18U/mg，野生型的链霉亲和素比活性为15U/mg。突变体与生物素结合的半衰期为10小时，而野生型为6小时，表明突变体稳定性更持久。
实施例3
温度稳定性研究
将突变型以及野生型蛋白液分别用荧光染料CY3进行标记，标记物分别置于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃中孵育 10分钟后，置于冰中冷却1分钟，立即进行发光测定。将发光强度最高值设为100％，结果如图2所示，野生型在50℃水浴后发光强度很弱，但是突变体的发光强度在80％以上。说明突变体具有更好的热稳定性。
实施例4
链霉亲和素在组织化学中的应用(生物素-链霉亲和素系统)
细胞标记：最常用的标记方法是在细胞上标记磁粒子，为了促进其特异性吸附在细胞膜上，通常将各种材料涂覆或修饰在磁粒子表面来将其标记，应用BSA 系统高亲和力的性能来标记磁粒子，首先将生物素与标记的细胞结合，然后再使用SA磁性颗粒特异性结合带有生物素的标记细胞。根据图3结果可知，突变体完成顺磁SA结合所用时间为20分钟，而野生型20分钟结合率不到65％。综上突变型链霉亲和素的结合速率增强，大大提高了标记效率。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连博格林生物科技有限公司
<120> 一种链霉亲和素突变体及其制备方法和应用
<130> 2022
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工
<400> 1
Met Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser
1 5 10 15
Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr
20 25 30
Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg
35 40 45
Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Pro Leu Gly Trp
50 55 60
Thr Val Ala Trp Arg Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr
65 70 75 80
Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln
85 90 95
Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr
100 105 110
Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
atggctgaag ctggtatcac cggtacctgg tacaaccagc tgggttctac cttcatcgtt 60
accgctggtg ctgacggtgc tctgaccggt acctacgaat ctgctgttgg taacgctgaa 120
tctcgttacg ttctgaccgg tcgttacgac tctgctccgg ctaccgacgg ttctggtacc 180
ccgctgggtt ggaccgttgc ttggcgtaac aactaccgta acgctcactc tgctaccacc 240
tggtctggtc agtacgttgg tggtgctgaa gctcgtatca acacccagtg gctgctgacc 300
tctggtacca ccgaagctaa cgcttggaaa tctaccctgg ttggtcacga caccttcacc 360
aaagttaaac cgtctgctgc ttcttaa 387

Claims (10)

1.一种链霉亲和素突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述的链霉亲和素突变体的核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求3所述的表达载体。
5.一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的链霉亲和素突变体、权利要求2所述的核苷酸、权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的宿主细胞中的任一种或者多种。
6.如权利要求1所述的一种链霉亲和素突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 全人工基因合成以及定点突变引入；
将链霉亲和素的核心氨基酸序列的第60位的Ala突变为Pro，第68位的Lys突变为Arg，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1；
b.将上述氨基酸的突变序列的N端添加Met氨基酸作为起始密码子，根据大肠杆菌的密码子偏好性，将氨基酸序列进行密码子优化，并在其后的3’-端添加终止密码TAA；
c.添加了起始密码ATG和终止密码TAA的上述核苷酸序列通过PCR法人工合成，得到人工DNA序列SEQ ID NO.2；
d.在链霉亲和素变体序列的5’端添加限制性内切酶Nde I的酶切位点，在序列的3’端添加限制性内切酶EcoR I的酶切位点，进行全基因合成，并连接入原核表达载体pET21a的Nde I酶切位点和EcoR I酶切位点之间，得到重组原核表达质粒pET21a-SA，导入大肠杆菌细胞BL21（DE3）中，采用热激法转化细胞，在培养基中培养转化的细胞；
e.挑取转化的细胞，进行摇瓶培养，离心获得发酵菌体采用SDS-PAGE进行表达量测定，选取表达量最高的菌株，进行发酵培养，获得菌体，之后用缓冲液PBS进行清洗离心，菌体在冰上进行超声破碎，然后进行离心，留取上清。
7.如权利要求6所述的一种链霉亲和素突变体的制备方法，其特征在于，还包括如下的纯化步骤:
f.将获得的上清进行离子交换层析后经分子筛除盐、超滤浓缩、最后冻干得成品酶。
8.根据权利要求1所述的链霉亲和素突变体，其特征在于，所述链霉亲和素突变体的比活性相比野生型提高至少15%以上，所述链霉亲和素突变体与生物素结合的半衰期相比野生型提高至少50%以上。
9.根据权利要求1所述的链霉亲和素突变体，其特征在于，所述链霉亲和素突变体的温度稳定性高于野生型至少50%以上。
10.如权利要求1所述的链霉亲和素突变体在制备组织化学检测试剂中的应用。
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