CN115819620A

CN115819620A - 可用于抗体定点偶联的融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN115819620A
Application number: CN202211168833.XA
Authority: CN
Inventors: 冯延叶; 柴智; 王嘉渊; 徐福桥; 吴海; 赖煦卉
Original assignee: Shanghai Yingji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Yingji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-09-24
Filing date: 2022-09-24
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明提供一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白及其应用。本发明融合蛋白主要由改造的抗体Fc亲和蛋白结合单体avidin蛋白融合而成，实现抗体Fc亲和蛋白直接与带有biotin标记的分子偶联，不再使用点击化学方案，这样大大简化了抗体Fc亲和蛋白Protein G的生产与使用难度，生产中不再需要通过点击化学活化Protein G蛋白，运输储存条件不再受到严格控制，甚至可以实现一步法抗体分子偶联等。

Description

可用于抗体定点偶联的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具有涉及一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白及抗体定点偶联的方法和应用。

背景技术

抗体偶联是指在抗体分子上进行化学物质(如小分子药物、核酸分子、荧光基团等)的修饰。抗体偶联的应用广泛，包括抗体药物偶联、流式抗体荧光偶联、单细胞标记抗体核酸偶联、抗原检测抗体偶联等。

抗体偶联技术主要分为非定向偶联和定点偶联两大类。其中，非定向抗体偶联一般采用点击化学方式，将功能性基团(小分子、核酸、蛋白等)连接到抗体的特定氨基酸残基上，如NH₂、COOH、SH等。由于抗体上通常存在较多的NH₂、COOH、SH等氨基酸残基位点，导致偶联发生位点不确定。

目前，定点抗体偶联技术主要有如下几种：

a)抗体序列引入非天然氨基酸作为定点活性基团，通过非天然氨基酸可以实现抗体与功能基团位点的特异性偶联。这类方案需要定向改造抗体序列，可用于抗体开发数量较少的ADC药物开发领域，不适合大规模货架抗体产品的定点偶联。

b)酶法偶联：通过一些特殊工具酶引入额外序列实现定向偶联位点，特殊工具酶如谷氨酰胺转移酶、分选酶StrA、甲酰甘氨酸生成酶、类异戊二烯转移酶等。然而这类方案在大规模货架抗体上使用受限，一些需要改造抗体序列、一些原因是效率较低等。

c)亲和偶联：通过一些定向亲和抗体的分子，如Protein A、Protein G、aptamer等，锚定在抗体Fc片段上，提供并实现定向偶联位点。这类方案可以在大规模货架抗体上使用，比较灵活。

目前，商业化的亲和偶联技术产品如AlphaThera Inc的oYo-link抗体偶联技术，其核心是采用Protein G工程化改造蛋白，在Protein G蛋白上引入点击化学活性基团。oYo抗体偶联技术操作过程是，首先工程化改造的Protein G与抗体Fc定向结合，一个Fc片段可以结合一个或两个Protein G蛋白，然后活化的功能基团(如核酸、燃料等上带有Azide)与Protein G上点击化学活性基团(如DBCO)反应，从而实现定点偶联。

oYo-link抗体偶联技术方案需要改造Protein G蛋白序列，通过酶法或化学法引入点击化学活性基团，因此在偶联反应期间需要优化控制点击化学物质浓度比例，偶联反应需要控制溶液试剂干扰，活化的Protein G运输保存及其使用必须严格控制保存条件与使用时间，否则Protein G蛋白上DBCO基团暴露在空气里发生快速氧化失效。

另外，JPWO2008130053A1提供了一种Fusion protein of protein G andavidins的融合方案，核心蛋白protein G采用野生型protein G蛋白，单体亲和素结合蛋白采用单体形式的链霉素亲和蛋白。JPWO2008130053A1为了降低protein G的非特异性结合，也采用了protein G蛋白子结构域区域，未做亲和力提高突变措施，这导致protein G蛋白的Fc亲和能力大大降低；JPWO2008130053A1采用的单体形式链霉素亲和蛋白也存在生物素亲和下降困扰，Kd值降低到nM级别。DeMonte，Structure based engineering ofstreptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate，2013年发表了工程改造的单体形式链霉素亲和蛋白的Kd值在0.53～0.78nM。因此，有必要进一步探究能够提升应用效果的可用于抗体定点偶联的融合蛋白方案。

发明内容

基于此，有必要提供一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白及抗体定点偶联的方法和应用，采用非点击化学方案，运输储存条件不再受到严格控制，使用快捷方便。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白，所述融合蛋白主要由抗体Fc亲和蛋白序列和生物素亲和蛋白单体序列融合而成，且所述抗体Fc亲和蛋白序列为：

MTFKLIINGKTLKGEITIEAVDAAEAEKIDKQYANDYGIDGEWTYDDATKTFTVTE。

所述生物素亲和蛋白单体序列选自单体avidin序列，序列为：

EFGPAIWQGQDTFQYVPTTEGSFDASNFKDFSSIASASSSWQNQHGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAEGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIDFSVKWNNSTENCNSNTQWTGYAQVNGNNTEIVTRWNLKYE。

优选地，所述还包括融合蛋白连接子序列。所述融合蛋白由抗体Fc亲和蛋白序列、单体avidin序列、linker以及His-tag纯化标签序列组成，序列如下SEQ ID NO：1所示。

本发明还可以提供一种抗体融合蛋白标记复合物，采用上述融合蛋白与抗体和与生物素标记分子反应制备而成。

本发明还可以提供一种检测靶抗原的试剂盒，包含上述融合蛋白或者上述抗体融合蛋白标记复合物。

本发明还可以提供一种抗体定点偶联的方法，采用上述融合蛋白与抗体和与生物素标记分子反应。优选地，融合蛋白、抗体、与生物素标记分子反应的摩尔比为1.5:1:2。

本发明还可以提供一种编码上述融合蛋白的基因，以及包含上述基因的表达载体。

本发明还提供上述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：合成编码上述融合蛋白的基因，并克隆到载体中；转化大肠杆菌，诱导表达，收集菌体；将菌体进行破碎，离心，收集包涵体沉淀；将包涵体沉淀转入变性溶液中处理，再复性处理，得复性蛋白溶液；将复性蛋白溶液过Ni柱、离子交换柱除杂，获得融合蛋白粗品；将融合蛋白粗品透析至含稳定剂的PBS缓冲液中，冻存，即得。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

与现有依靠点击化学方案的抗体定点偶联方案相比，本发明的融合蛋白主要由改造的抗体Fc亲和蛋白序列、生物素亲和蛋白单体序列融合而成。本发明依靠改造抗体Fc的高亲和力、单体avidin与biotin标记分子的高亲和力可以实现定点偶联，使得融合蛋白的亲和力达到nM级别或以上。同时，本发明融合蛋白可以高效、稳定表达，客户端运输储存及使用快捷方便，且性价比高。

尤其是，pfGA(protein fusion of protein G and monomeric Avidin)融合蛋白可以满足大部分货架抗体产品的偶联，操作非常方便。客户只需要准备或购买货架抗体、pfGA蛋白、生物标记分子等，按序添加实现抗体与分子定向偶联获得抗体-pfGA-标记分子的复合物。

附图说明

图1为抗体-pfGA-标记分子的复合物结构示意图。

图2为试验例3中抗体-融合蛋白(pfGA)-biotinlyted DNA解离速率测定统计图。

图3为试验例4中抗体定点偶联用于单细胞表面抗原标记与分类图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

试验例1

抗体定点偶联方案是包括抗体、融合蛋白、生物素标记分子三部分，三者形成抗体-融合蛋白-生物素标记分子的复合物，达到抗体定点偶联目的。

本试验例抗体定点偶联的融合蛋白的设计主要考虑包括两部分组成：一是改造的抗体Fc亲和蛋白；二是单体形式的生物素亲和蛋白，如moneric streptavidin、monomericrhizavidin。

Streptavidin是一个同源四聚体蛋白，分子量较大，每个亚基可以结合一分子biotin，结合能力在fM级别。如果考虑Streptavidin用于定点偶联的话，需要失活三个亚基结合biotin能力，保留一个结合biotin的亚基。进一步，通过基因工程技术发现，单体形式的streptavidin结合biotin能力降低到nM级别，可见DeMonte，2013年发表了工程改造的单体形式链霉素亲和蛋白的Kd值在0.53～0.78nM(Structure based engineering ofstreptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate)。

Rhizavidin是一个同源二聚体蛋白，每个亚基可以结合一分子biotin。通过结构分析和基因工程改造，单体形式的rhizavidin仍然保留了很强的biotin结合能力，达到了pM级别，且蛋白分子量比较小。Lee，2016年报告了一种工程化改造的单体rhizavidin蛋白Kd值达到37pM@37℃(A Rhizavidin Monomer with Nearly Multimeric Avidin-LikeBinding Stability Against Biotin Conjugates)。因此，rhizavidin来源的单体形式蛋白作为抗体定点偶联的候选蛋白之一。

另外，抗体Fc片段高亲和力蛋白一般有Protein A、Protein G等蛋白。Protein G或Protein A是有多个重复子结构域组成的，这些结构域可以结合抗体的Fc片段或Fab片段，具有抗体多位点能力，或引起抗体的间接连接。如果Protein G用于抗体定点偶联，需要失活Fab结合能力，需要保留一个结构域，实现定点结合Fc片段特性。

为了进一步降低Protein G蛋白分子大小，发明人团队截取了单个蛋白子结构域，分子量约有8KDa，并进行了定点突变：

N37Y消除其Fab结合能力；

F30D可以显著提高其Fc亲和力5倍左右。

结合大量的探索研究，发明人团队构建几种不同融合形式的融合蛋白，主要考虑单体avidin和改造的Protein G蛋白(抗体Fc亲和蛋白序列)在N端或C端位置，His-tag纯化标在N端或C端位置。

其中，改造的Protein G蛋白位置和单体avidin在C端位置的融合方案可以明显提高蛋白表达与可溶程度，而改造的Protein G蛋白在C端位置和单体avidin在N端位置的融合方案的蛋白表达与可溶程序明显降低。GS linker不影响蛋白表达与可溶，但为了蛋白结构柔性，融合方案采用了GS linker。由于改造的Protein G蛋白在N端位置和单体avidin在C端位置的融合方案表现更好，纯化标签只能放在融合蛋白C端，这样不影响改造的ProteinG蛋白的亲和活性。

最终确定：将改造的Protein G蛋白与单体avidin融合在一起，暂定命名为protein fusion of protein G and monomeric Avidin(pfGA)。

改造的Protein G能够特异性结合抗体Fc片段，单体avidin上有一个生物素结合位点，能够与biotin标记的分子结合。因此，pfGA融合蛋白同时具备结合抗体Fc片段和结合biotin标记分子的能力。

优选的pfGA融合表达设计：改造的Protein G蛋白在N端位置，avidin蛋白在C端位置，His-tag纯化标签在C端位置，通过GS linker与avidin蛋白进行连接。

pfGA融合蛋白的氨基酸序列如下：

其中，pfGA融合蛋白的氨基酸序列中，下划横线区段对应改造的抗体Fc亲和蛋白序列，下划波浪线对应生物素亲和蛋白单体序列。

编码pfGA融合蛋白的基因序列如下：

CatATGACCTTCAAACTGATCATCAACGGCAAAACCCTGAAAGGTGAAATCACCATCGAAGCGGTTGATGCGGCGGAAGCGGAAAAAATCTTCAAACAGTACGCGAACGATTACGGCATCGATGGTGAATGGACCTACGATGATGCGACCAAAACCTTCACCGTTACCGAAGGCGGCAGCGGCGGCACCGAATTCGGCCCGGCGATCTGGCAGGGCCAGGATACCTTCCAGTACGTTCCGACCACCGAAGGCAGCTTCGATGCGAGCAACTTCAAAGATTTCAGCAGCATCGCGAGCGCGAGCAGCAGCTGGCAGAACCAGCACGGCAGCACCATGATCATCCAGGTTGATAGCTTCGGCAACGTTAGCGGCCAGTACGTTAACCGTGCGGAAGGCACCGGCTGCCAGAACAGCCCGTACCCGCTGACCGGCCGTGTTAACGGCACCTTCATCGATTTCAGCGTTAAATGGAACAACAGCACCGAAAACTGCAACAGCAACACCCAGTGGACCGGCTACGCGCAGGTTAACGGCAACAACACCGAAATCGTTACCCGTTGGAACCTGAAATACGAAGGCGGCAGCGGCGGTAGCGGCGGCACCCACCACCACCATCACCACTAActcgag(SEQ ID NO:2)

试验例2

本试验例提供一种pfGA融合蛋白的表达及纯化方法，包括如下步骤：

S1，合成如SEQ ID NO:2所示的pfGA基因，并克隆到pET28a载体。

S2，将pET28a载体转化至大肠杆菌BL(DE3)，37℃培养至OD_600nm到1.0，添加IPTG至终浓度1mM，继续37℃培养4小时，离心，收集菌体。

S3，将收集的菌体在1×PBST溶液里进行高压裂解破碎，离心弃上清，留沉淀；继续使用1×PBST漂洗沉淀3次，每次30min，离心弃上清，留沉淀包涵体。

S4，将包涵体溶解在变性溶液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，6M GdnHCl，5mMBeta-Me，250mM NaCl)中，离心收集上清，弃沉淀。调整上清中的变性蛋白的浓度至1mg/ml左右，变性蛋白溶液通过快速稀释方法加入到提前预冷的80倍体积的1×PBS里，放置4℃缓慢搅拌，过夜，得复性蛋白溶液。

S5，使用含10mM咪唑的溶液A(50mM Tris-HCl，pH 8.0，250mM NaCl)平衡Ni-NTA柱，将复性蛋白溶液加入到Ni柱上，使用含有50mM咪唑的溶液A漂洗Ni柱至紫外线基线稳定，然后使用含有500mM咪唑的溶液A洗脱Ni柱。

S6，继续使用HiTrap Q FF column离子交换柱进行纯化，采用线性洗脱方式(0～100％B)，收集均一对称的洗脱单峰，保证蛋白质折叠构象均一，最后得到pfGA融合蛋白。

S7，将pfGA融合蛋白粗品透析到含有50％甘油的1×PBS缓冲液溶液里，冻存到-20℃备用。

试验例3

本试验例提供pfGA融合蛋白与抗体、生物素标记分子的结合解离实验方法，包括如下步骤：

将Taq抗体、试验例2制备的pfGA融合蛋白与生物素标记的DNA分子(FAM 5'-GGTTTTTTATGCATGCTTTTTT-3'BIOTIN)分别添加到1×PBS缓冲液反应体系里，控制终浓度分别是1μM、0.7μM和0.5μM，放置25℃孵育30min。

反应产物放置37℃，每间隔1小时取样放置4℃备用，共取样10次。然后，通过native-PAGE对取样蛋白分析10次，电泳过程需要将电泳槽放置在冰浴中，保持电泳缓冲液处于预冷状态。

使用荧光拍照设备进行电泳胶图分析，计算DNA分子的结合与脱离的比例，其解离速率是2.6×10^-5s^-1。

实际上，本试验例提供一种抗体融合蛋白标记复合物，也提供了抗体定点偶联的方法，采用融合蛋白与抗体和与生物素标记的荧光DNA分子反应。优选地，融合蛋白、抗体、与生物素标记的荧光DNA分子反应的摩尔比为1.5：1：2，整体上能够保证所有抗体分子都被标记上生物素分子。

试验例4

本试验例提供单细胞分子标记测序的方法，包括如下步骤：

S1，分别将9种抗体(CD3、CD4、CD8、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD45、CD56)与对应的生物素标记的DNA分子(见下表1的CD抗体的标记核酸序列)，通过试验例2制备的pfGA融合蛋白进行偶联，即将抗体、pfGA融合蛋白与对应的生物素标记DNA分子分别添加到1×PBS缓冲液反应体系里，终浓度分别是1μM、0.7μM和0.5μM，放置25℃孵育30min，得抗体核酸偶联产物(AOC)，然后放置冰上备用。

表1CD抗体的标记核酸序列

S2，将9种抗体核酸偶联产物(AOC)按照等体积比例进行混合组成抗体核酸偶联混合物(AOCMix)，放置冰上备用。

S3，将PMBC单细胞悬浮到1×PBS缓冲溶液里。取1μL AOCMix与1百万单细胞悬浮液进行混合，4℃条件下，上下轻柔颠倒孵育30min。放入离心机中，600g离心3min，轻轻吸去上清。再用1mL Wash buffer洗一次细胞，600g离心3min，轻轻吸去上清。然后，按照10Xgenomic单细胞测序流程进行上机建库与测序。

抗体偶联用于单细胞表面抗原标记与分类的测试结果见图3。

由图3可以看出：抗体核酸偶联混合物(AOCMix)可以用于单细胞表面蛋白标记，用于细胞类型分群与表面抗原丰富检测。

另外，本发明实际还可以提供一种检测靶抗原的试剂盒，包含上述融合蛋白或者上述抗体融合蛋白标记复合物，用于靶抗原的快速检测。

实际上，上述pfGA融合蛋白可以满足大部分货架抗体产品的偶联，亲和能力优异，操作非常方便。客户只需要准备或购买货架抗体、pfGA蛋白、生物标记分子等，按序添加实现抗体与分子定向偶联获得抗体-pfGA-标记分子的复合物。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种可用于抗体定点偶联的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白主要由抗体Fc亲和蛋白序列和生物素亲和蛋白单体序列融合而成，且所述抗体Fc亲和蛋白序列为：MTFKLIINGKTLKGEITIEAVDAAEAEKIDKQYANDYGID GEWTYDDATKTFTVTE。

2.根据权利要求1所述的可用于抗体定点偶联的融合蛋白，其特征在于，所述生物素亲和蛋白单体序列选自单体avidin序列。

3.根据权利要求1或2所述的可用于抗体定点偶联的融合蛋白，其特征在于，所述还包括融合蛋白连接子序列。

4.根据权利要求3述的可用于抗体定点偶联的融合蛋白，其特征在于，述融合蛋白由抗体Fc亲和蛋白序列、单体avidin序列、linker以及His-tag纯化标签序列组成，序列如下SEQID NO：1所示。

5.一种编码权利要求1至4任一项所述的融合蛋白的基因。

6.一种包含权利要求5所述的融合蛋白的基因的表达载体。

7.一种抗体融合蛋白标记复合物，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述的融合蛋白与抗体和生物素标记分子反应制备而成。

8.一种抗体定点偶联的方法，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述的融合蛋白与抗体和生物素标记分子反应。

9.根据权利要求8所述的抗体定点偶联的方法，其特征在于，融合蛋白、抗体、生物素标记分子的反应摩尔比为1.5:1:2。

10.一种检测靶抗原的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述的融合蛋白或者权利要求7所述的抗体融合蛋白标记复合物。