CN110330558A

CN110330558A - 一种黄色荧光蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110330558A
Application number: CN201910716509.9A
Authority: CN
Inventors: 齐建国; 吴钟尧; 吴立群
Original assignee: Bomet Biotechnology (guan) Co Ltd
Current assignee: Bomet Biotechnology (guan) Co Ltd
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2039-08-05
Also published as: CN110330558B

Abstract

本发明公开了一种黄色荧光蛋白及其应用，本发明通过对野生型红色荧光蛋白DsRed2进行改造，获得发生氨基酸突变的新型黄色荧光蛋白，新型黄色荧光蛋白的原核表达可以在较短的时间内显色，且显色明显，而真核表达中显色稳定，不易被入射光淬灭，可应用于各类报告系统的荧光显色以及目的蛋白的表达定位。

Description

一种黄色荧光蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种黄色荧光蛋白及其应用。

背景技术

红色荧光蛋白是从海葵中分离出的一种新荧光蛋白基因，可以在紫外线的激发下发出红色荧光，是目前发现的具有最长激发波长与发射波长的自然发光荧光蛋白，并且它的背景干扰较小，目前已被广泛地应用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因。随着研究的深入，人们发现红色荧光蛋白DsRed2的发色团只有在寡聚化的情况下才能形成并发挥作用，寡聚化在成熟过程中起着重要的作用，但是DsRed2却成熟缓慢以及不完全，无法作为快速的报告基因应用。如何优化红色荧光蛋白，加快红色荧光蛋白的结构成熟，成为快速高效的实现重组克隆的判断的关键。

易错PCR技术是在正常PCR技术的基础上演变而来的，此技术又被称为错配PCR或倾向错误PCR，一般是利用TaqDNA聚合酶的低保真性和一些PCR反应体系中的条件，用来降低DNA复制的保真度，增加碱基在新的DNA链合成过程中的错配率，目的主要在于使得扩增产物出现数量较多的点突变。易错PCR技术也是一种体外诱导DNA序列变异的方法。最初，PCR被用于已知DNA序列的准确扩增，基于基因操作，在分子水平，PCR对于基因信息修饰方面已经变为很重要，在离模板末端的任意距离处这个技术允许PCR产物的定点诱变。易错PCR作为一种简便、有效地获得DNA序列变异的技术，在遗传和基因改良研究中具有巨大的应用前景。

本申请为了得到具有优良性状的荧光蛋白，基于易错PCR技术引入随机突变，按照大肠杆菌的优势密码子设计新的DesRed2红色荧光蛋白基因，通过添加组成型启动子与DesRed2基因组成一个表达元件，对DesRed2红色荧光蛋白基因进行错配聚合酶链式反应来随机改变红色荧光蛋白基因的DNA序列，筛选获得能够在较短时间内显色的基因序列，从而利用该序列实现重组克隆的快速、的判断。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种简单、快速、明显且稳定判断基因重组的报告基因。

本发明的第一方面提供了一种黄色荧光蛋白，所述荧光蛋白包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第41、42、44、122位中的一个或多个位点进行修饰。

进一步，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第41、42、44、122位中的至少一个被置换为SEQ ID NO.3所示的第41、42、44、122位的相应氨基酸。

进一步，所述荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有本发明第一方面所述的黄色荧光蛋白。

本发明的第三方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的黄色荧光蛋白。

本发明的第四方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第三方面所述的核酸分子。

本发明的第五方面提供了一种重组细胞，所述重组细胞包含本发明第四方面所述的载体。

本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的黄色荧光蛋白在活体成像中的应用。

本发明的第七方面提供了本发明第一方面所述的黄色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。

本发明的第八方面提供了一种定位目的蛋白在细胞、动物活体表达的方法，包括：

1)将目的蛋白基因和本发明第三方面所述的核酸分子融合；

2)将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中；

3)将融合蛋白表达载体转染细胞或活体，进行培养；

4)在激发光谱下观察目的蛋白在细胞、动物活体中的表达定位。

本发明的第九方面提供了一种快速检测克隆的方法，包括：

1)将目的蛋白基因和本发明第三方面所述的核酸分子融合；

2)将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中；

3)将融合蛋白表达载体转染细胞或活体，进行培养，观察显色情况。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种黄色荧光蛋白，该黄色荧光蛋白由DsRed2红色荧光蛋白基因突变而来，该黄色荧光蛋白荧光显色快、显色明显。

本发明提供了一种黄色荧光蛋白，该黄色荧光蛋白应用于哺乳动物细胞中，显色稳定，不易被入射光淬灭。

附图说明

图1是DsYellow菌落颜色图；

图2是DsYellow的原核表达情况图；其中，图A是菌体颜色图；图B是DsYellow纯化后的蛋白颜色图；图C是DsYellow蛋白纯化后的SDS-PAGE；

图3是DsYellow的真核表达情况图。

具体的实施方式

本发明利用全基因合成的方法，按照大肠杆菌的优势密码子设计新的DesRed2红色荧光蛋白基因，通过添加组成型启动子与DesRed2基因组成一个表达元件，对DesRed2红色荧光蛋白基因进行错配聚合酶链式反应来随机改变红色荧光蛋白基因的DNA序列，筛选获得能够在16h内显色的基因序列，从而利用该序列实现重组克隆的快速的判断。

本发明中的黄色荧光蛋白是指与野生型DesRed2相比具有一个或多个氨基酸修饰的DesRed2氨基酸序列。所述修饰可以具有“保守”修饰，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。较为罕见地，变体可以具有“非保守”修饰，例如，用色氨酸替换甘氨酸。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入，或同时包括这两者。

作为优选的实施方案，本发明的黄色荧光蛋白包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第41、42、44、122位中的一个或多个位点进行修饰，所述修饰可以是删除、取代或插入；优选的，所述修饰是取代。

作为优选的实施方案，本发明的黄色荧光蛋白具有一个或多个如下的取代：H41T，N42Q，V44A，V122M。

作为一种优选的实施方案，本发明的黄色荧光蛋白具有如下的取代：H41T，N42Q，V44A，V122M。

本发明提供了一种融合蛋白，其含有本发明所述的黄色荧光蛋白，因为本发明提供的黄色荧光蛋白能较快的显色，因此，可通过基因工程的技术将其与其他目的蛋白进行融合，或者将黄色荧光蛋白标记其他的目的蛋白。通过对荧光蛋白的成像，实现目标蛋白的准确研究。

本发明提供了一种分离的核酸分子，该核酸分子可编码上述的荧光蛋白。根据密码子的简并性，在荧光蛋白的氨基酸序列确定的情况下，其相应的编码核酸序列也存在多种情况，均属于本发明的保护范围。需要说明的是，这类核酸分子的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了含有上述核酸分子的载体。载体可以是克隆载体或表达载体等，优选为表达载体。本发明对表达载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。

本发明中的用于导入载体的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，上述细胞包含(但并不限于)细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；酵母细胞；真菌细胞如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇或夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞，SP2/0，人淋巴样母细胞，COS，NSO，293T，Bowes黑素瘤细胞，HT-1080，BHK(幼仓鼠肾细胞)，HEK(人胚肾细胞)，PERC.6(人视网膜细胞)等；和植物细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

术语“导入”是指将包括编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。此导入可以通过本领域中已知的各种方法，包括磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，脂质体融合，脂转染和原生质体融合进行。此外，转染是指用病毒颗粒通过感染将期望材料递送入细胞。此外，该载体可以通过基因轰击导入宿主细胞。在本发明中，导入与转染可以互换使用。

本发明的重组细胞接着可以用于表达以及培养目的，可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。

本发明提供了黄色荧光蛋白DsYellow在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。

作为一种非限制性的实施方式，当本发明中的黄色荧光蛋白作为荧光共振能量转移受体时，可将其他蛋白如发射光谱与DsYellow激发光谱重叠的蛋白作为荧光共振能量转移供体。

作为另外一种非限制性的实施方式，当本发明的黄色荧光蛋白作为荧光共振能量转移供体时，可将其他蛋白如发射光谱与DsYellow激发光谱重叠的蛋白作为荧光共振能量转移受体。

本发明提供了黄色荧光蛋白DsYellow在活体成像中的应用。DsYellow应用于活体内成像，具有良好的成像率和成像效果，尤其适用于活体内进行多色成像中；更适用于在活体内与青色、橙色、以及红色荧光蛋白组合或者配对进行同步四色成像。其与其它蛋白进行融合或单独作为光学探针或者生物光学反应器的组成成分来检测生物体内的各种各样生理生化反应来检测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育以及疾病等方面。

本发明提供了一种筛选快速检测克隆载体的突变基因的方法，包括：

1)依据真核表达质粒pDesRed2的序列将DNA翻译成氨基酸；

2)按照密码子偏好性进行密码子优化，全基因合成获得原核表达的序列；

3)构建能够组成型表达DesRed2的表达质粒；

4)将优化的DesRed2基因克隆到线性化的表达质粒中；

5)致错PCR突变红色荧光蛋白区域；

6)克隆致错PCR产物；

7)筛选和鉴定突变片段；

8)对突变片段进行测序分析。

作为一种优选的实施方式，所述序列在大肠杆菌中表达，因此将氨基酸序列按照大肠杆菌密码子的偏好性进行密码子优化。

作为一种实施方式，能够组成型表达DesRed2的表达质粒为重组的pBM16A表达质粒，所述质粒包括组成型启动子，优化后的DesRed2E基因克隆在启动子和转录终止子之间的酶切位点中，使得DesRed2基因在组成型启动子的作用下进行组成型表达。

作为一种优选的实施方式，所述启动子为CP25。

在本发明中，可以使用本领域的任何随机突变的方法来引入突变，包括(但不限于)人工合成兼并引物引入随机突变；用化学致突剂引入随机突变；使用致突菌株，通过将基因在该菌株中传代引入随机突变；利用Taq聚合酶的错配倾向，通过错配PCR引入随机突变。作为一种优选的实施方式，引入突变的方法为错配PCR或致错PCR，通过设计错配PCR引物，进行致错PCR扩增。

作为更为优选的实施方式，致错PCR体系包括：1μM的上(下)游引物，0.2mM的dATP，0.2mM的dGTP，1mM的dCTP，1mM的dTTP，5.5mM的MgCl₂，0.1U/μl的Taq DNA聚合酶，1ng/μl的质粒。

在本发明中，在构建重组质粒时，可以根据不同的重组细胞对本发明中的核酸序列进行密码子偏好性优化，只要其可翻译成本发明所述的黄色荧光蛋白的氨基酸序列即可，也即可以编码相同的氨基酸的不同的密码子也包括在本发明中。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1黄色荧光蛋白突变的构建和筛选

1、野生型DsRed2基因在大肠杆菌中优化表达

首先将DsRed2(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)基因按照大肠杆菌的偏好密码子进行优化，优化后的基因为DsRed2E，使得基因能够在大肠杆菌中高表达，优化后的氨基酸序列同野生型序列相比，并没有发生变化。然后在基因的ORF前面加上CP25启动子(核酸序列如SEQ ID NO.2所示)，变成组成型表达款，CP25启动子启动DsRed2基因的表达。然后克隆到无启动子的载体pBM16A载体中。利用大肠杆菌的显色进行筛选。菌落显示红色为野生型。

2、易错PCR方法获得突变质粒

用易错PCR方法对序列进行错配PCR，获得PCR扩增产物，切胶纯化PCR后，将片段克隆到pBM16A载体中，转化大肠杆菌Mach1T1感受态细胞，突变在氨苄抗性的LB平板上。在肉眼条件下观察，筛选菌落呈现明显黄色的菌落。具体步骤如下：

1)配置PCR反应体系，PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

组分	终浓度
		上游引物	1μM
下游引物	1μM
		dCTP	1mM
dTTP	1mM
		dATP	0.2mM
dGTP	0.2mM
		pBM16A-CP25-DsRed2E	1ng/ul
MgCl<sub>2</sub>	5.5mM
		Taq DNA聚合酶	0.1U/μl
补水到终体积为	50μl

2)PCR扩增反应

PCR反应条件：94℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃30s)×30，72℃5min。

3)PCR产物纯化和克隆

PCR扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，条带分开后，用刀片切下800bp大小的条带后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(离心柱法)回收DNA片段。

4)片段连接和转化

回收的DNA片段用pBM16A Toposmart克隆试剂盒对片段进行克隆连接，按照试剂盒说明书进行，步骤如下：

2.5μl的连接产物到100μl刚刚融化的Mach1T1感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴20-30min。42℃水浴中热击30s。立刻置于冰水浴中2min。加入900μl无菌的不含抗生素的SOC或LB，37℃，200rpm振荡培养60min。4000rpm离心1min，去掉部分上清，保留100μl用移液器轻吹菌体，充分悬浮菌液，取全部菌液涂布，然后37℃培养过夜(12-16h)。

5)测序验证

挑选呈明显黄色的菌落摇菌进行测序。

3、结果

结果如图1所示，其中，其中，上半部分为含pBM16A-DsYellow质粒的Mach1T1菌，呈现黄色，下半部分为含pUC19质粒的Mach1T1细菌，呈现白色。测序结果显示，该质粒发生了4个位点的突变，H41T，N42Q，V44A，V122M，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，含有CP25启动子的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，将该黄色荧光蛋白命名为DsYellow蛋白。

实施例2 DsYellow黄色荧光蛋白基因的原核表达

为了进一步分析获得的DsYellow黄色荧光蛋白基因的功能，将DsYellow基因通过TOPO克隆构建到pBM30载体中，并且让DsYellow蛋白的N端带上6His标签用于纯化。常规方法进行诱导表达，用Ni-IDA磁性琼脂糖介质进行纯化。

1、BL21(DE3)感受态细胞的制备和转化

将-70℃冻存的BL21(DE3)菌株划线在无抗性的LB平板上，置于37℃培养过夜。次日，挑取一个新鲜的BL21(DE3)单菌落，接种到5mL的LB培养基中，37℃振荡培养2-5h，OD600达到0.5左右，取l.5mL菌液于无菌离心管中，冰水浴中放置10min。4℃条件下5000rpm离心2min，弃上清，用200μL CaCl₂(0.1M)溶液轻轻重悬，冰上放置10min，4℃条件下5000rpm离心2min，弃上清。用100μL CaCl₂(0.1M)溶液重悬，4℃放置备用。

2、重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞

将5μL的pBM30-DsYellow质粒加入到100μL的BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，将离心管放入42℃水浴中热休克90s，立即将离心管置于冰浴中保持2min。每管加入800μL的LB培养基，然后放入37℃摇床中200rpm培养45min，取出离心管5000rpm离心5min，弃去600μL上清，将沉淀的细菌混匀并涂布在含有50μg/mL的硫酸卡那霉素的LB平板上，待液体吸干后，倒置平板，于37℃培养箱中培养12-16h。

3、重组质粒的表达鉴定

挑取3-5个硫酸卡那霉素的LB平板上长出的单菌落，每个菌落接种于5mL的含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床中200rpm过夜培养。次日将过夜培养的菌液按1:20的比例接种于5mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm震荡培养2h，至OD600达到0.5-0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM于37℃诱导培养4h，取200μL样品离心，细菌沉淀用20μL水重悬，加上20μL的2×SDS上样缓冲液，100℃煮10min。取20μL进行10％浓度的SDS-PAGE电泳，电泳结束后，考马斯亮蓝R250染色以确定重组蛋白是否表达。

4、原核表达DsYellow蛋白的可溶性检测

取10mL过夜培养物接种于300mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃200rpm震荡培养3-4h，至OD600达到0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM于37℃诱导培养4h，5000rpm离心10min收集菌体，弃上清，用50mL的50mM TrisHCl缓冲液重悬沉淀，加入终浓度为500μg/mL的溶菌酶。-20℃反复冻融1-2次。进行超声破碎，工作时间4s，间隔时间8s，工作次数99次，重复一遍，待菌液清亮时，4℃，10,000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀，取20uL的上清和沉淀悬浮液，加上20μL的2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，100℃煮10min。取20μL进行10％浓度的SDS-PAGE电泳分析，确定表达产物是可溶性的(存在上清中)还是以包涵体形式存在(沉淀中)。

5、DsYellow蛋白的Ni-IDA琼脂糖磁珠亲和层析

1)将装有Ni-IDA琼脂糖磁珠的试剂瓶充分混匀。吸取100μl混匀好的磁珠到一个1.5ml的离心管中。

2)加入400μl的Binding Buffer(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，5mM imidazole，0.05％Tritonx-100，pH 8.0)，颠倒混匀10s。

3)将离心管置于磁力架上，静止10s，然后转动一下离心管，静止30s，磁珠都被吸附到磁铁的一侧，小心吸掉上清。

4)加入500μl的Binding Buffer,颠倒混匀10s，将离心管置于磁力架上，静止10s，然后转动一下离心管，静止30s，磁珠都被吸附到磁铁的一侧，小心吸掉上清。

5)将500μl离心处理好的含组氨酸标签蛋白的样本和500ul Binding Buffer等体积混匀。

6)将步骤5)中准备好的样本加入到含有清洗好珠子的1.5ml离心管中。颠倒混匀，在摇床上晃动20-30min。

7)将离心管置于磁力架上，收集磁珠，小心倒掉上清。

8)加入500μl的Wash Buffer(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，50mM imidazole，0.05％Tritonx-100，pH 8.0)，颠倒混匀10s。用磁力架收集磁珠。倒掉上清。

9)加入500μl的Wash Buffer，重复步骤8)。

10)加入100μl的Elution Buffer(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，300mMimidazole，pH 8.0)。室温放置2min洗脱蛋白。

11)用磁力架收集磁珠。小心吸取液体，此液体中含有纯化好的目的表达蛋白。

12)可加入100μl的Elution Buffer。重复步骤10)-11)，再次收集从磁珠上洗脱下来的目的蛋白。

13)用SDS-PAGE方法对样本进行蛋白纯度分析，用Bradford或BCA蛋白定量分析蛋白的浓度。

6、结果

结果如图2所示，pBM30-DsYellow质粒转化BL21(DE3)细菌，经诱导剂IPTG诱导，离心后菌体颜色呈黄色(图2A上)，不含质粒的则呈白色(图2A下)；纯化后的DsYellow蛋白呈现黄色(图2B左)，而对照50nM TrisHcl缓冲液则呈现透明色(图2B右)；且亲和具有较高的纯度(图2C)。

实施例3DsYellow基因的真核表达

为了进一步分析获得的DsYellow基因的功能，依据获得的DsYellow蛋白的氨基酸序列，按照人偏好密码子进行优化，进行全基因合成(核酸序列如SEQ ID NO.5所示)。通过TOPOsmart克隆方法克隆到pBM40载体上。大量提取质粒并转染人HEK293细胞。在人细胞中进行表达。步骤如下：

1.转染前18～24h接种HEK293细胞到24孔细胞板中，每孔5～10×10⁴细胞，1ml完全培养基。

2.将2μg质粒DNA稀释到50μl生理盐水中，将6μl转染试剂稀释到50μl生理盐水中。标注质粒和转染剂。

3.将稀释好的DNA液体加到稀释好的转染剂的管子中，用洗头轻轻吹打混匀，室温放置5min。

4.将上述混合物直接加入到细胞培养基中，轻摇细胞板或用加样器吸打混匀。

5.将细胞板移至37℃、5％CO₂孵箱中进行培养。

6.转染24h后，荧光显微镜观察细胞的发光情况。

7、结果

结果如图3所示，在用荧光显微镜观察，蓝光激发，细胞显示黄色。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 博迈德生物科技（固安）有限公司

<120> 一种黄色荧光蛋白及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> Discosoma sp.

<400> 1

Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Leu

225

<210> 2

<211> 784

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctttggcag tttattcttg acatgtagtg agggggctgg tataatcaca tagtactgtt 60

cgggatcctt aagaatgggt ctagaattaa agaggagaaa ttaagcatgg caagcagtga 120

aaatgtgatt accgaattca tgcgttttaa agttcgtatg gaaggtaccg tgaatggcca 180

tgaatttgaa attgaaggtg aaggtgaagg ccgcccgtat gaaggtcaca acaccgtgaa 240

actgaaagtt accaaaggtg gtccgctgcc gtttgcatgg gatattctga gcccgcagtt 300

tcagtatggt agtaaagttt atgttaagca tccggcagat attccggatt ataaaaaact 360

gagctttccg gaaggtttta aatgggaacg tgttatgaat tttgaggatg gtggtgtggc 420

aaccgtgacc caggatagca gcctgcagga tggctgtttt atctataaag tgaaattcat 480

cggcgtgaat tttccgagtg atggtccggt tatgcagaaa aagactatgg gctgggaagc 540

aagtaccgaa cgtctgtatc cgcgtgatgg cgttctgaaa ggtgaaaccc ataaagcact 600

gaaactgaaa gatggtggtc attatctggt ggaattcaaa agtatctata tggcaaaaaa 660

gccggttcag ctgccgggtt attattatgt tgatgccaaa ctggatatca ccagtcataa 720

tgaagattat accattgtgg aacagtatga acgtaccgaa ggtcgtcatc atctgtttct 780

gtaa 784

<210> 3

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Met Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Leu

225

<210> 4

<211> 784

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctttggcag tttattcttg acatgtagtg agggggctgg tataatcaca tagtactgtt 60

cgggatcctt aagaatgggt ctagaattaa agaggagaaa ttaagcatgg caagcagtga 120

aaatgtgatt accgaattca tgcgttttaa agttcgtatg gaaggtaccg tgaatggcca 180

tgaatttgaa attgaaggtg aaggtgaagg ccgcccgtat gaaggtaccc agaccgccaa 240

actgaaagtt accaaaggtg gtccgctgcc gtttgcatgg gatattctga gcccgcagtt 300

tcagtatggt agtaaagttt atgttaagca tccggcagat attccggatt ataaaaaact 360

gagctttccg gaaggtttta aatgggaacg tgttatgaat tttgaggatg gtggtgtggc 420

aaccgtgacc caggatagca gcctgcagga tggctgtttt atctataaaa tgaaattcat 480

cggcgtgaat tttccgagtg atggtccggt tatgcagaaa aagactatgg gctgggaagc 540

aagtaccgaa cgtctgtatc cgcgtgatgg cgttctgaaa ggtgaaaccc ataaagcact 600

gaaactgaaa gatggtggtc attatctggt ggaattcaaa agtatctata tggcaaaaaa 660

gccggttcag ctgccgggtt attattatgt tgatgccaaa ctggatatca ccagtcataa 720

tgaagattat accattgtgg aacagtatga acgtaccgaa ggtcgtcatc atctgtttct 780

gtaa 784

<210> 5

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccagca gcgagaacgt gatcaccgag ttcatgagat tcaaggtgag aatggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggcagacc ctacgagggc 120

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgagccccc agttccagta cggcagcaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgagctt ccccgagggc ttcaagtggg agagagtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggccaccgt gacccaggac agcagcctgc aggacggctg cttcatctac 360

aagatgaagt tcatcggcgt gaacttcccc agcgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggccagcac cgagagactg taccccagag acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagagcatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcaccagcc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagagaac cgagggcaga 660

caccacctgt tcctgtaa 678

Claims

1.一种黄色荧光蛋白，其特征在于，所述荧光蛋白包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第41、42、44、122位中的一个或多个位点进行修饰。

2.根据权利要求1所述的黄色荧光蛋白，其特征在于，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第41、42、44、122位中的至少一个被置换为SEQ ID NO.3所示的第41、42、44、122位的相应氨基酸。

3.根据权利要求2所述的黄色荧光蛋白，其特征在于，所述荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种融合蛋白，其特征在于，含有权利要求1-3任一项所述的黄色荧光蛋白。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3任一项所述的黄色荧光蛋白。

6.一种载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求6所述的载体。

8.权利要求1-3任一项所述的黄色荧光蛋白在活体成像中的应用。

9.权利要求1-3任一项所述的黄色荧光蛋白在作为荧光共振能量转移受体或供体中的应用。

10.一种定位目的蛋白在细胞、动物活体表达的方法，其特征在于，包括：

1)将目的蛋白基因和权利要求5所述的核酸分子融合；

2)将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中；

3)将融合蛋白表达载体转染细胞或活体，进行培养；