CN108070035A - 可诱导性遗传重组酶系统CrexER - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可诱导性遗传重组酶系统CrexER，该CrexER是一种融合蛋白，该融合蛋白是重组酶Cre、雌激素受体ER以及重组酶Dre特异性识别的重组位点rox融合形成的蛋白。本发明还提供该融合蛋白的编码序列、含该编码序列的核酸构建物、宿主细胞等。本发明利用Dre‑rox同源重组的先行发生诱导Cre‑loxP同源重组的随后发生，实现了A‑Dre和B‑Cre标记细胞交集(A+B+)的靶向操纵。本发明极大的拓展了遗传靶向操纵的应用范围，为更为精准的遗传靶向操纵和生物医学研究提供了宝贵的策略。

Description

可诱导性遗传重组酶系统CrexER
技术领域
本发明涉及可诱导性遗传重组酶系统CrexER。
背景技术
过去的10年中，在小鼠模型中使用的基因遗传操纵技术大大推进了对许多人类疾病的了解，其中最为广泛应用的基因遗传操纵工具主要基于Cre-loxP同源重组系统。到目前为止，成千上万的含有Cre或loxP位点的遗传工具小鼠被用来解决有关细胞谱系、器官发育、组织再生和疾病等各种问题。这个基因靶向系统的精准度很大程度上取决于Cre表达的特异性，通常Cre是在某个基因启动子的驱动下表达。尽管传统的基于Cre-loxP同源重组的遗传操纵技术具有非常强大的功能，但是当Cre的表达特异性或精准度不够高时，就会造成很多实验结果解释的不准确甚至出现较大争议。因此，发展出更为精准的基因靶向操纵系统将极大的推进基因体内的功能性研究。更广泛来讲，更为精准的基因靶向操纵系统将会为众多领域的基础研究和疾病临床治疗带来巨大的推进作用。
发明内容
本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是重组酶Cre、雌激素受体ER以及重组酶Dre特异性识别的重组位点rox融合形成的蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述重组酶Cre的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-344位所示。
在一个或多个实施方案中，所述雌激素受体ER的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第355-673位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方式中，所述rox位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第345-354位所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端分别是重组酶Cre、rox重组位点、雌激素受体ER和rox重组位点。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，选自：
(1)本文融合蛋白的编码序列；
(2)(1)所述序列的互补序列。
在某些实施方案中，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:1或其互补序列。
本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述多核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述核酸构建物还在所述多核苷酸序列的两侧分别含有5’同源臂和3’同源臂。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是重组表达载体或基因敲入载体。
在某些实施方案中，所述基因敲入载体是以pBR322为骨架构建的载体。
本发明第四方面提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的基因敲入载体，和任选的利用CRISPR/Cas9技术将所述基因敲入载体中本发明融合蛋白的编码序列敲入细胞基因组中目标位置所需的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述试剂包括Cas9酶或其表达载体和sgRNA或其表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述Cas9酶为来自化脓链球菌的Cas9(SpCas9)、来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)或来自嗜热链球菌的Cas9(St1Cas9)。
本发明第五方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本文所述的重组表达载体或基因敲入载体，或基因组中组合了本文所述融合蛋白的编码序列或其互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞或低等真核细胞。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞来自高等生物，为体细胞。
本发明第六方面提供本文所述的融合蛋白、其编码序列、含所述编码序列的表达载体或基因敲入载体在遗传靶向操纵中的应用。
附图说明
图1：基于两种彼此排他性同源重组系统的CrexER工作原理。(a)ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠与报告基因小鼠Rosa26-rox-LacZ和Rosa26-loxP-LacZ小鼠交配后取E9.5天胚胎X-gal染色结果，结果显示只能发生Cre-loxP和Dre-rox同源重组反应，而不会发生Cre-rox和Dre-loxP同源重组反应。(b)ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠与报告基因小鼠Rosa26-rox-RFP和Rosa26-RFP小鼠交配后取E9.5天胚胎结果。(c)示意图表示利用A-Dre和B-Cre的交叉靶向操纵A+B+细胞。(d)利用A-Dre和B-CrexER的靶向操纵工作原理。
图2：Nrg1-CrexER遗传标记验证交叉重组策略可行性。(a)Nrg1-CrexER小鼠构建策略示意图。(b)Nrg1-CrexER小鼠E12.5胚胎ESR免疫荧光染色结果。(c)利用CAG-Dre、Nrg1-CrexER和Rosa26-RFP三种小鼠交叉重组进行遗传标记的策略。R1表示Dre-rox同源重组反应，R2表示Cre-loxP同源重组反应。(d)Nrg1-CrexER；Rosa26-RFP小鼠E12.5胚胎的全标本拍照和切片NeuN(神经元细胞标记蛋白)和RFP免疫荧光结果，结果在没有他莫昔芬诱导的情况下，并没与检测到RFP+信号。(e)CAG-Dre；Nrg1-CrexER；Rosa26-RFP小鼠E12.5胚胎的全标本拍照和切片NeuN和RFP免疫荧光结果，结果检测到了RFP+信号。
图3：Nrg1-CrexER和Nrg1-CreER小鼠的比较验证。(a)Nrg1基因于E12.5胚胎的原位杂交检测结果。(b)利用Nrg1-CrexER和Rosa26-RFP小鼠的遗传重组策略。(c)Nrg1-CrexER；Rosa26-RFP小鼠E12.5胚胎切片NeuN和RFP的免疫荧光染色结果，他莫昔芬诱导时间为E10.5天。(d)Nrg1-CreER小鼠构建策略示意图。(e)Nrg1-CreER；Rosa26-RFP小鼠E12.5胚胎切片NeuN和RFP的免疫荧光染色结果，左边一组他莫昔芬诱导时间为E10.5天，右边一组无他莫昔芬诱导。
图4：利用Apln和Wt1两种基因通过交叉重组技术特异性标记冠状血管内皮细胞。(a)利用Apln-DreER、Wt1-CreER和Ai66小鼠进行交叉重组特异性标记冠状血管内皮细胞策略。R1表示Dre-rox同源重组反应，R2表示Cre-loxP同源重组反应。(b)Apln-DreER；Wt1-CreER；Ai66小鼠出生后第8天(P8)的心脏全标本拍照和切片RFP免疫荧光染色结果，他莫昔芬诱导时间为P5。(c)Apln-DreER；Wt1-CreER；Ai66小鼠P8的多个器官全标本拍照结果，他莫昔芬诱导时间为P5。(d，e)Apln-DreER；Wt1-CreER；Ai66小鼠P8的心脏和其他多种器官的切片的CDH5和RFP免疫荧光染色结果，他莫昔芬诱导时间为P5。
图5：Wt1-CrexER基因敲入小鼠构建策略。
图6：Tie2-Dre基因敲入小鼠的构建及验证。(a)Apln-Cre；Rosa26-RFP小鼠E13.5胚胎和心脏及肺的全标本明场及荧光拍照结果。结果显示Apln-Cre介导的遗传重组没有特异性的标记血管内皮细胞。(b)Tie2-Dre小鼠构建策略。(c)Tie2-Dre；Rosa26-rox-RFP小鼠(P0)多个器官的全标本名场及荧光拍照结果。(d，e)Tie2-Dre；Rosa26-rox-RFP小鼠心脏和肝脏切片的RFP和VE-CAD免疫荧光染色结果。
图7：利用Tie2-Dre；Wt1-CrexER交叉重组特异性靶向标记心脏冠状血管内皮细胞。(a)Tie2-Dre和Wt1-CrexER各自标记器官示意图。(b)利用Tie2-Dre；Wt1-CrexER交叉重组特异性靶向标记心脏冠状血管内皮细胞的工作原理。(c)6周大小的Tie2-Dre；Wt1-CrexER小鼠多个器官切片的CDH5和tdTomato免疫荧光染色结果。(d，e)6周大小的Tie2-Dre；Wt1-CrexER小鼠心脏全标本拍照结果及切片的CDH5和tdTomato免疫荧光染色结果。
具体实施方式
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本文提供一种可诱导性同源重组酶CrexER，利用Dre-rox同源重组的先行发生诱导Cre-loxP同源重组的随后发生，实现了A-Dre和B-Cre标记细胞交集(A+B+)的靶向操纵。
具体而言，本文的同源重组酶CrexER含有Cre重组酶、ER和rox序列。
适用于本文的Cre重组酶可以是本领域周知的Cre重组酶，其基因编码区序列全长1029bp(EMBL数据库登录号X03453)，编码由343个氨基酸组成的38kDa的单体蛋白。Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即loxP位点，能介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。适用于本文的Cre重组酶也包括保留了重组酶酶活的Cre的突变体。在某些实施方案中，适用于本发明同源重组酶CrexER的Cre重组酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-344位所示。
Dre是一种与Cre相类似的同源重组酶，与Cre特异性的识别loxP位点类似，Dre特异性识别另外一个重组位点rox。在某些实施方案中，适用于本发明的rox位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第345-354位所示。
优选的是，本文的同源重组酶CrexER中包括两个rox位点。更优选地，本文的同源重组酶CrexER从N端到C端依次为Cre重组酶、rox位点、ER和rox位点。在示例性的实施方案中，雌激素受体(ER)的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第355-673位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，本文的同源重组酶CrexER的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本文包括编码本文所述同源重组酶CrexER的多核苷酸序列或其互补序列。本文的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。在某些实施方案中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本文所述的核苷酸序列可采用本领域常规方法制备得到，例如可采用常规的合成方法制备得到。
本文也包括包含所述多核苷酸的核酸构建物。该核酸构建物含有本文所述的同源重组酶CrexER的编码序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的同源重组酶CrexER的编码序列可以多种方式被操作以保证所述重组酶的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列都可用于本发明。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。例如，可将本文的多核苷酸序列插入到重组表达载体或基因敲入载体中。
术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。表达载体还可包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本文所述的多核苷酸序列可操作性地连接到表达载体中的适当启动子上，以经由该启动子指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。当本文所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
基因敲入载体用于将本文同源重组酶CrexER敲入感兴趣基因的启动子的下游。通常情况下，基因敲入载体除含有该同源重组酶CrexER的编码序列外，还可含有同源重组所需的5’同源臂和3’同源臂。在某些实施方案中，本文的核酸构建物含有5’同源臂、CrexER的编码序列和3’同源臂。在某些实施方案中，利用市售的pBR322载体构建本文的基因敲入载体。
本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。可采用本领域技术人员熟知的方法构建含本文所述的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体或基因敲入载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
可将本文所述的载体转化适当的宿主细胞，以使其能够表达本文所述的同源重组酶CrexER。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。宿主细胞还可以是植物细胞。宿主细胞的代表性例子有：大肠杆菌；链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
转化宿主细胞后，获得的转化子可以用常规方法培养，以允许其表达本文所述的融合蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。可利用本领域已知的各种分离方法分离和纯化本文的重组融合蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的，包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
因此，本文也包括含本文所述同源重组酶或其编码序列或表达载体的宿主细胞。这种宿主细胞可组成型表达本文所述的融合蛋白，也可在一定的诱导条件下表达本文所述的融合蛋白。如何使宿主细胞组成型表达或在诱导条件下表达本发明融合蛋白的方法是本领域周知的。例如，在某些实施方案中，使用诱导型启动子构建本发明的表达载体，从而实现融合蛋白的诱导表达。
在使用基因敲入载体时，同时利用CRISPR/Cas9技术将CrexER的编码序列同源重组到感兴趣基因翻译起始位点ATG之后。Cas9可以是本领域周知的Cas9。例如，Cas9酶可以是来自不同物种的Cas9酶，包括但不限于来自化脓链球菌的Cas9(SpCas9)、来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)，以及来自嗜热链球菌的Cas9(St1Cas9)等。可以使用Cas9酶的各种已知变体，只要该Cas9酶保留其核酸酶和解旋酶活性即可。
Cas/sgRNA复合物行使功能需要在DNA的非模板链(3’到5’)有前间区序列邻近基序(PAM)。不同Cas酶，其对应的PAM并不完全相同。例如，针对SpCas9的PAM通常是NGG，如TGG；针对SaCas9酶的PAM通常是NNGRR；针对St1Cas9酶的PAM通常是NNAGAA；其中，N为A、C、T或G，R为G或A。
sgRNA通常包括两部分：靶标结合区和Cas蛋白识别区。靶标结合区与Cas蛋白识别区通常以5’到3’的方向连接。靶标结合区的长度通常为15～25个碱基，更通常为18～22个碱基，如20个碱基。靶标结合区与DNA的模板链特异性结合，从而将Cas9招募到预定位点。通常，DNA模板链上sgRNA结合区域的对侧区紧邻PAM，或者隔开数个碱基(例如10个以内，或8个以内，或5个以内)。因此，在设计sgRNA时，通常先根据所用的Cas酶确定该酶的PAM，然后在DNA的非模板链上寻找可作为PAM的位点，之后将该非模板链(3’到5’)PAM位点下游紧邻该PAM位点或与该PAM位点隔开10个以内(例如8个以内、5个以内等)的长15～25个碱基、更通常长18～22个碱基的片段作为sgRNA的靶标结合区的序列。sgRNA的Cas蛋白识别区则根据所使用的Cas蛋白而确定，这为本领域所技术人员所掌握。
当要敲入本文所述的同源重组酶CrexER的编码序列至感兴趣的基因位置时，可在插入位置(通常是感兴趣基因的翻译起始位点ATG之后)附近寻找适合的PAM位点，并据此寻找合适的Cas9，设计相应的sgRNA的Cas蛋白识别区和靶标识别区，由此构建Cas9的表达载体和sgRNA的表达载体。同时，根据待插入位置设计基因敲入载体的同源重组臂，构建含有5’同源臂、CrexER编码序列和3’同源臂的基因敲入载体。之后可将Cas9的表达载体、sgRNA的表达载体以及基因敲入载体共转感兴趣的细胞，例如小鼠的胚胎干细胞，筛选出基因组中感兴趣位置敲入了CrexER编码序列的细胞。
当要构建动物模型，例如小鼠模型时，可利用本文提供的同源重组酶CrexER及其编码序列、基因敲入载体等，采用本领域周知的技术构建。
因此，在某些实施方案中，本文还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文的同源重组酶CrexER或本文所述的基因敲入载体。试剂盒中还可含有利用CRISPR/Cas9技术将所述基因敲入载体中本发明融合蛋白的编码序列敲入细胞基因组中目标位置所需的试剂。这类试剂包括但不限于Cas9的表达载体和相应的sgRNA的表达载体。在某些实施方案中，试剂盒中还可包括PCR所需的试剂等。在某些实施方案中，试剂盒中还含有诱导剂如他莫昔芬。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一、材料和方法
1、实验材料：
试剂：RFP抗体、NeuN抗体、CDH5抗体、DAPI、他莫昔芬(他莫昔芬)、多聚甲醛(PFA)、蔗糖、PBS缓冲液、OCT包埋剂、驴血清、Triton X-100、X-gal、戊二醛、EGTA、MgCl2、重铬酸钠、NP-40和磷酸钠，购自商业途径。
设备：ZEISS体式显微镜(AXIO Zoom.V16)、Olympus激光共聚焦显微镜(FV1200)。
2、实验方法
(1)小鼠构建
Nrg1-CrexER小鼠构建策略：使用CRISPR/Cas9技术将CrexER序列同源重组到Nrg1的翻译起始位点ATG后面，并在CreXER后面接入PolyA以终止反应。
所用Cas9酶为SpCas9酶；所用sgRNA的靶标识别区为：
CGGATCACCTCCAGAAGGCC(SEQ ID NO:3)
表达载体构建：以小鼠基因组为模板，使用引物5’arm-F和5’arm-R PCR扩增出5’arm；使用引物3’arm-F和3’arm-R PCR扩增出3’arm；同时合成出CREXER序列。PBR322质粒使用HindIII和BamHI双酶切，回收6000bp左右条带与5’arm，CREXER，3’arm四片段进行In-Fusion反应(使用TaKaRa的In-fusion HD Cloning kit)，获得knock in载体。载体经测序验证完全正确。载体构建用引物如下(SEQ ID NO:4－7)：
WT1-CreXER小鼠构建策略：使用CRISPR/Cas9技术将CrexER序列同源重组到WT1的翻译起始位点ATG后面，并在CreXER后面接入PolyA以终止反应。所用Cas9酶为SpCas9酶；所用sgRNA的靶标识别区为：
TCAAGGCAGCGCCCACACCC(SEQ ID NO:8)
表达载体构建方法同Nrg1CreXER小鼠表达载体构建方法，所用引物如下所示(SEQID NO:9－12)：
5’arm-F ACCTCCTATCCTGAGACCACCTTC
5’arm-R ATCTTTAACCCTGATCCTGGCAAT
3’arm-F TCCCACATCAGGCACATGAGTAAC
3’arm-R GGAAGGAAGGACGAGTGTCAAAGT
免疫组化：将取出的组织放入4％PFA中固定1个小时，之后用PBS洗3次，每次5分钟，然后将组织放入30％蔗糖溶液中脱水过夜，最后用OCT包埋。将10um的冰冻切片至于室温晾干，用PBS洗2次，每次5分钟；用含5％驴血清和0.1％Triton X-100的PBS封闭液室温封闭30分钟；用含2.5％驴血清和0.1％Triton X-100的PBS稀释一抗，然后四度孵育一抗过夜；之后用PBS清洗片子，并室温孵育相应的二抗半个小时候，二抗同样使用含2.5％驴血清和0.1％Triton X-100的PBS稀释；然后用PBS洗去二抗，用含有DAPI的封片剂封闭片子。最后使用Olympus激光共聚焦显微镜(FV1200)拍摄图片。
X-gal染色：取出E9.5的小鼠胚胎，至于固定液(0.2％戊二醛，5mM EGTA，和100mMMgCl2的PBS溶液)中固定30分钟；之后用缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液，含2mM MgCl2、0.01％脱氧胆酸钠和0.02％NP-40)清洗3次，每次10分钟；清洗之后将胚胎置于含1mg/ml X-gal的缓冲液中37度染色过夜，染色过程中避光处理；最后将染色好的胚胎用缓冲液清洗，并使用ZEISS体式显微镜(AXIO Zoom.V16)拍摄图片。
二、结果
1、基于Cre-loxP和Dre-rox系统的CrexER同源重组酶的设计及工作原理
为了实现更为精准的靶向遗传操纵，我们拟将两种同源重组系统(Cre-loxP和Dre-rox)结合起来。Dre是一种与Cre相类似的同源重组酶，与Cre特异性的识别loxP位点类似，Dre特异性识别另外一个重组位点rox。为了验证这两个系统是否具有各自内部的忠实性和彼此之间的排他性，我们分别将全身持续性表达Cre的小鼠(ACTB-Cre)和全身持续性表达Dre的小鼠(CAG-Dre)与报告基因小鼠Rosa26-RFP和Rosa26-rox-RFP交配，取E9.5-E10.0胚胎分析。结果显示，ACTB-Cre；Rosa26-RFP和CAG-Dre；Rosa26-rox-RFP全身表达红色荧光蛋白RFP，而ACTB-Cre；Rosa26-rox-RFP和CAG-Dre；Rosa26-RFP胚胎则完全没有检测RFP阳性信号(图1b)。我们利用另外两组LacZ报告基因小鼠也得到了类似的结果(图1a)。
这些结果说明Cre-loxP和Dre-rox系统能够保持各自系统内部的忠实性和彼此之间的排他性。基于这个特性，本文设想将这个两个系统结合起来应用，本文的目标是利用不同启动子驱动的Cre和Dre实现二者交叉部分的靶向操纵(图1c)。
为了使最终输出的是基于Cre-loxP的遗传重组，本文设计了一个上述两种同源重组反应依次发生的交叉性遗传重组系统。具体来说，本文设计了一个类似于CreER的可诱导性遗传重组酶CrexER，CrexER是将原来的CreER在雌激素受体(ER)序列的两侧各插入了一个rox位点(图1d)，在没有Dre重组酶存在的情况下，CrexER的功能与CreER基本一样，但是当有Dre存在时，Dre将会识别CrexER上的rox位点，发生同源重组反应，将原来的CrexER变为了Cre，Cre将最终可以作用在具有loxP位点的小鼠上，而此时的Cre-loxP同源重组只是发生在Dre和Cre同时表达的细胞内，从而实现了不同启动子驱动的Dre和Cre交叉性基因靶向操纵。
2、CrexER小鼠的构建及验证
为了验证CrexER工具小鼠是否按照我们设计的工作原理来工作，我们构建了Nrg1-CrexER基因敲入小鼠(图2a)，我们以雌激素受体(ESR)免疫荧光染色代表Nrg1的表达谱。结果显示，Nrg1在胚胎时期主要表达在神经嵴细胞中(图2b)，这与Nrg1原位杂交的结果相一致(图3a)。同时Nrg1-CrexER的遗传谱系与Nrg1-CreER基本一致，在他莫昔芬(tamoxifen)诱导后，二者都主要标记小鼠神经嵴细胞(图3b-e)，提示CrexER可以作为与CreER基本等同的诱导性同源重组酶来使用。
接下来，为了验证CrexER是否能够成功的经过Dre-rox遗传重组后变成正常功能的Cre来使用，我们将Nrg1-CrexER与CAG-Dre和Rosa26-RFP小鼠交配，使CAG-Dre将Nrg1-CrexER中的ER切掉，使其变成Nrg1-Cre，此时Nrg1-Cre便直接与Rosa-RFP发生Cre-loxP同源重组反应，从而在Nrg1表达的细胞及其后代中表达红色荧光蛋白RFP(图2c)。我们将CAG-Dre；Nrg1-CrexER；Rosa26-RFP与其同窝对照组Nrg1-CrexER；Rosa26-RFP进行比较，发现在没有他莫昔芬诱导的情况下，前者主要在其神经嵴细胞中表达了红色荧光蛋白RFP，而后者却基本没有红色信号出现(图d，e)。以上结果说明由Dre介导的Cre表达是可行的，CrexER可以用来作为交叉性的基因靶向操纵工具。
3、利用交叉重组技术进行心脏冠状血管的精确靶向标记
血管存在于多种组织器官当中，并在组织器官生理稳态和损伤再生中具有非常重要的作用，然而血管内皮细胞在不同的组织中以及在不同的生理状态下都是不同的，所以，研究某种特定性组织器官中的血管内皮细胞对于了解不同组织器官中血管内皮细胞的功能非常重要，然而这一目标很难实现，因为很难找到只存在于某一特定器官血管内皮细胞中的分子标记基因。在此，我们将以冠状血管内皮细胞的特异性靶向标记为例来阐述交叉性基因靶向操纵研究。在该项研究中，需要找到两种分子标记基因，需要满足的条件是这两种分子标记基因的交集标记冠状血管内皮细胞。最近有报道指出间皮细胞标记基因Wt1也表达在冠状血管内皮细胞中，但是不表达在其他器官的血管内皮细胞中，另一种分子标记基因Apln主要表达在冠状血管内皮中，而Wt1与Apln的交集主要是冠状血管内皮细胞。为此，我们首先将Apln-DreER和Wt1-CreER小鼠和报告基因小鼠Rosa26-rox-stop-rox-loxp-stop-loxp-RFP(Ai66)交配，来初步确定上述两种基因是否可以实现交叉性靶向遗传标记冠状血管内皮细胞(图4a)。我们将上述三基因型小鼠在出生后第5天进行他莫昔芬诱导，于3天后收取各种组织器官，结果只在心脏的冠状毛细血管即Wt1和Apln的交集处检测到报告基因RFP的表达(图4)，说明基于两种不同分子标记基因来特异性标记某一特定器官中的血管内皮细胞是可以实现的。
接下来，我们将要探索是否能够利用我们的CrexER系统，通过Wt1和Apln两种分子标记基因，来特异性靶向标记心脏冠状血管内皮细胞。我们通过将CrexER cDNA序列插入到Wt1基因的启动子后面构建了Wt1-CrexER基因敲入小鼠(图5)。
尽管Apln-DreER在经过他莫昔芬诱导后能够较特异性的标记冠状血管内皮细胞，然而Apln-Cre却几乎标记了所有组织器官的细胞(图6a)，这就使得我们无法利用Apln-Dre与Wt1-CrexER进行交叉性靶向标记实验。因此我们选用了另外一种血管内皮细胞标记基因Tie2，并构建了Tie2-Dre基因敲入小鼠(图6b)，通过与Rosa26-rox-RFP小鼠交配验证其构建成功，Tie2-Dre主要标记了各种器官的血管内皮细胞(图6c-e)。
基于Tie2-Dre与Wt1-CrexER各自的标记区域(图7a)，我们利用二者与报告基因Rosa26-RFP交配在一起进行交叉性特异靶向标记冠状血管内皮细胞(图7b)，RFP和血管内皮细胞标记基因CDH5免疫荧光染色结果显示，RFP主要表达在心脏冠状血管内皮细胞中，而在其他器官中RFP只有零星的表达(图7c-e)。综上，通过CrexER交叉靶向标记技术，我们成功的做到了只标记心脏血管内皮细胞，而不标记其他器官中的血管内皮细胞，为精准的靶向遗传标记提供了很好的一个例子。
总结
在这项研究中，我们将Cre-loxP和Dre-rox两种同源重组系统结合起来，构建了新的可诱导性同源重组酶CrexER，该技术利用Dre-rox同源重组的先行发生诱导Cre-loxP同源重组的随后发生，实现了A-Dre和B-Cre标记细胞交集(A+B+)的靶向操纵。我们利用Tie2-Dre；Wt1-CrexER特异性标记心脏冠状血管内皮细胞为例具体说明了如何应用该系统。该技术极大的拓展了遗传靶向操纵的应用范围，为更为精准的遗传靶向操纵和生物医学研究提供了宝贵的策略。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 173956
<130> 可诱导性遗传重组酶系统CrexER
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2049
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2049)
<223> 同源重组酶CrexER的编码序列
<400> 1
atgggctcca atttactgac cgtacaccaa aatttgcctg cattaccggt cgatgcaacg 60
agtgatgagg ttcgcaagaa cctgatggac atgttcaggg atcgccaggc gttttctgag 120
catacctgga aaatgcttct gtccgtttgc cggtcgtggg cggcatggtg caagttgaat 180
aaccggaaat ggtttcccgc agaacctgaa gatgttcgcg attatcttct atatcttcag 240
gcgcgcggtc tggcagtaaa aactatccag caacatttgg gccagctaaa catgcttcat 300
cgtcggtccg ggctgccacg accaagtgac agcaatgctg tttcactggt tatgcggcgg 360
atccgaaaag aaaacgttga tgccggtgaa cgtgcaaaac aggctctagc gttcgaacgc 420
actgatttcg accaggttcg ttcactcatg gaaaatagcg atcgctgcca ggatatacgt 480
aatctggcat ttctggggat tgcttataac accctgttac gtatagccga aattgccagg 540
atcagggtta aagatatctc acgtactgac ggtgggagaa tgttaatcca tattggcaga 600
acgaaaacgc tggttagcac cgcaggtgta gagaaggcac ttagcctggg ggtaactaaa 660
ctggtcgagc gatggatttc cgtctctggt gtagctgatg atccgaataa ctacctgttt 720
tgccgggtca gaaaaaatgg tgttgccgcg ccatctgcca ccagccagct atcaactcgc 780
gccctggaag ggatttttga agcaactcat cgattgattt acggcgctaa ggatgactct 840
ggtcagagat acctggcctg gtctggacac agtgcccgtg tcggagccgc gcgagatatg 900
gcccgcgctg gagtttcaat accggagatc atgcaagctg gtggctggac caatgtaaat 960
attgtcatga actatatccg taacctggat agtgaaacag gggcaatggt gcgcctgctg 1020
gaagatggcg atctaacttt aaataattgg cattatttaa agttactcga gccatctgct 1080
ggagacatga gagctgccaa cctttggcca agcccgctca tgatcaaacg ctctaagaag 1140
aacagcctgg ccttgtccct gacggccgac cagatggtca gtgccttgtt ggatgctgag 1200
ccccccatac tctattccga gtatgatcct accagaccct tcagtgaagc ttcgatgatg 1260
ggcttactga ccaacctggc agacagggag ctggttcaca tgatcaactg ggcgaagagg 1320
gtgccaggct ttgtggattt gaccctccat gatcaggtcc accttctaga atgtgcctgg 1380
ctagagatcc tgatgattgg tctcgtctgg cgctccatgg agcacccagt gaagctactg 1440
tttgctccta acttgctctt ggacaggaac cagggaaaat gtgtagaggg catggtggag 1500
atcttcgaca tgctgctggc tacatcatct cggttccgca tgatgaatct gcagggagag 1560
gagtttgtgt gcctcaaatc tattattttg cttaattctg gagtgtacac atttctgtcc 1620
agcaccctga agtctctgga agagaaggac catatccacc gagtcctgga caagatcaca 1680
gacactttga tccacctgat ggccaaggca ggcctgaccc tgcagcagca gcaccagcgg 1740
ctggcccagc tcctcctcat cctctcccac atcaggcaca tgagtaacaa aggcatggag 1800
catctgtaca gcatgaagtg caagaacgtg gtgcccctct atgacctgct gctggaggcg 1860
gcggacgccc accgcctaca tgcgcccact agccgtggag gggcatccgt ggaggagacg 1920
gaccaaagcc acttggccac tgcgggctct acttcatcgc attccttgca aaagtattac 1980
atcacggggg aggcagaggg tttccctgcc acagctctaa ctttaaataa ttggcattat 2040
ttaaagtta 2049
<210> 2
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(682)
<223> 同源重组酶CrexER的氨基酸序列
<400> 2
Met Gly Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro
1 5 10 15
Val Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe
20 25 30
Arg Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser
35 40 45
Val Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp
50 55 60
Phe Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Ala Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu
85 90 95
Asn Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn
100 105 110
Ala Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala
115 120 125
Gly Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp
130 135 140
Gln Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asn Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala
165 170 175
Glu Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly
180 185 190
Arg Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala
195 200 205
Gly Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg
210 215 220
Trp Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe
225 230 235 240
Cys Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln
245 250 255
Leu Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu
260 265 270
Ile Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser
275 280 285
Gly His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly
290 295 300
Val Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn
305 310 315 320
Ile Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met
325 330 335
Val Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp Leu Thr Leu Asn Asn Trp His Tyr
340 345 350
Leu Lys Leu Leu Glu Pro Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala Asn Leu
355 360 365
Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser Leu Ala
370 375 380
Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp Ala Glu
385 390 395 400
Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro Phe Ser Glu
405 410 415
Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu Leu Val
420 425 430
His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val Asp Leu Thr
435 440 445
Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu Ile Leu
450 455 460
Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Val Lys Leu Leu
465 470 475 480
Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys Cys Val Glu
485 490 495
Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser Ser Arg Phe
500 505 510
Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys Ser Ile
515 520 525
Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr Leu Lys
530 535 540
Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp Lys Ile Thr
545 550 555 560
Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln
565 570 575
Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His Ile Arg
580 585 590
His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys
595 600 605
Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Ala Ala Asp Ala His
610 615 620
Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val Glu Glu Thr
625 630 635 640
Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser His Ser Leu
645 650 655
Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro Ala Thr Ala
660 665 670
Leu Thr Leu Asn Asn Trp His Tyr Leu Lys
675 680
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> sgRNA
<400> 3
cggatcacct ccagaaggcc 20
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> 引物
<400> 4
cgcggtcgac aagctcagca tggaagctat ctgta 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> 引物
<400> 5
ccggatcacc tccagaaggc ccgccctctc tcaca 35
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<223> 引物
<400> 6
gcttttgttg gtggcagtgg taggacatgg agatttatcc cccaga 46
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> 引物
<400> 7
cgagaagctt gtcgactctc ccaattacac ctgga 35
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> sgRNA
<400> 8
tcaaggcagc gcccacaccc 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 引物
<400> 9
acctcctatc ctgagaccac cttc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 引物
<400> 10
atctttaacc ctgatcctgg caat 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 引物
<400> 11
tcccacatca ggcacatgag taac 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 引物
<400> 12
ggaaggaagg acgagtgtca aagt 24

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是重组酶Cre、雌激素受体ER以及重组酶Dre特异性识别的重组位点rox融合形成的蛋白。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，
所述重组酶Cre的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-344位所示；
所述雌激素受体ER的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第355-673位氨基酸残基所示；和/或
所述rox位点的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第345-354位所示。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端分别是重组酶Cre、rox重组位点、雌激素受体ER和rox重组位点；
优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种多核苷酸序列，选自：
(1)权利要求1－3中任一项所述的融合蛋白的编码序列；
(2)(1)所述序列的互补序列；
优选地，所述编码序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求4所述的多核苷酸序列；
优选地，所述核酸构建物是重组表达载体或在权利要求4所述的多核苷酸序列两端分别含有5’同源臂和3’同源臂的基因敲入载体。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：
(1)表达权利要求1－3中任一项所述的重组蛋白；
(2)含有权利要求4所述的多核苷酸序列；和/或
(3)含有权利要求5所述的重组表达载体或基因敲入载体。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求5所述的基因敲入载体，和任选的利用CRISPR/Cas9技术将所述基因敲入载体中所含的权利要求4所述的多核苷酸序列敲入细胞基因组中目标位置所需的试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括Cas9酶或其表达载体和sgRNA或其表达载体。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas9酶为来自化脓链球菌的Cas9(SpCas9)、来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)或来自嗜热链球菌的Cas9(St1Cas9)。
10.权利要求1－3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4所述的多核苷酸序列或权利要求5所述的表达载体或基因敲入载体在遗传靶向操纵中的应用。
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