PT804457E - Proteinas verdes fluorescentes modificadas - Google Patents

Description

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ DESCRICÃO "Proteínas verdes fluorescentes modificadas"

Antecedentes da invenção A presente invenção refere-se genericamente aos campos da biologia e da química. Mais particularmente, a invenção é dirigida a proteínas fluorescentes modificadas e a métodos para a sua preparação e utilização. A presente invenção foi realizada com suporte governamental sob a subvenção n°.NS27177, concedida pelo National institute of Health. O Governo tem certos direitos sobre a presente invenção.

Na bioquímica, na biologia molecular e nos diagnósticos médicos, é frequentemente desejável adicionar um marcador fluorescente a uma proteína de modo a que a proteína possa ser facilmente localizada e quantificada. Os procedimentos normais para a marcação requerem que a proteína reaja de forma covalente com corantes fluorescentes in vitro, e depois seja de novo purificada para remover o excesso de corante e qualquer proteína danificada. Quando se pretende utilizar a proteína marcada no interior de células, normalmente estas tem que ser micro-injectada; esta é uma operação difícil e demorada que não pode ser realizada em grandes números de células. Estes problemas podem, contudo, ser eliminados unindo uma sequência nucleotídica que codifica para a proteína de interesse com a sequência para uma proteína naturalmente fluorescente, e depois expressando a proteína de fusão. A proteína verde fluorescente (GFP) da medusa Aequorea victoria é uma proteína notável com forte absorvância no visível e fluorescência a partir de um cromóforo p-hidroxibenzilidenoimidazolona, que é gerado por ciclização e oxidação da sequência Ser-Tyr-Gly da própria proteína nas posições 65 a 67. Tem sido reportada uma sequência de ADNc [SEQ ID N0:1] para um isotipo de GFP [Prasher, D.C. et a!., Gene, 111, 229-233 (1992)]; a cionagem deste ADNc permitiu a expressão da GFP em diferentes organismos. A verificação de que a proteína expressa se torna fluorescente em células de uma vasta variedade de organismos [Chalfie, M. et ai., Science, 263, 802-805 (1994)] torna a GFP uma poderosa nova ferramenta na biologia molecular e celular e 2 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ indica que a ciciização oxidativa tem que ser espontânea, ou dependente apenas de enzimas e reagentes ubíquos.

Uma questão principal na fotofísica das proteínas é como um único cromóforo pode originar amplos espectros diferentes dependendo do seu ambiente local da proteína. Esta questão recebeu a maior atenção em relação às múltiplas cores de pigmentos visuais de base retiniana [Merbs, S.L. & Nathans, J. Science, 258, 464-466 (1992)], mas é também importante nas GFP. A GFP de Aequorea e a do cnidário ReniHa reniformis partilham o mesmo cromóforo, embora a GFP de Aequorea tenha dois picos de absorvância, a 395 e 475 nm, enquanto a GFP de ReniHa tem apenas um único pico de absorvância a 498 nm, com um coeficiente de extinção monomérico cerca de 5,5 vezes superior ao do pico principal a 395 nm da proteína de Aequorea [Ward, W.W. em Bioluminescence and Chemiiuminescence (eds. DeLuca, M.A. & MaElroy, W.D.) 235-242 (Academic Press, New York, 1981)]. Os espectros do cromóforo isolado e da proteína desnaturada a pH neutro não coincidem com os espectros da proteína nativa [Cody, C.W. et ai., Biochemistry 32, 1212-1218 (1993)].

Para muitas aplicações práticas, o espectro da GFP de ReniHa seria preferível à de Aequorea, devido ao facto de a discriminação de comprimentos de onda entre diferentes fluoróforos e a detecção de transferência de energia de ressonância serem mais fáceis se os espectros componentes forem altos e estreitos em vez de baixos e largos. Adicionalmente, o pico de excitação a maiores comprimentos de onda (475 nm) da GFP de Aequorea é quase ideal para conjuntos de filtros de fluoresceína e é resistente a fotodecaímento, mas tem menor amplitude que o pico a comprimento de onda mais curto, a 395 nm, que é mais susceptível a fotodecaímento [Charlie et ai, (1994) supra]. Por todas estas razões, seria claramente vantajoso converter o espectro de excitação da GFP de Aequorea num único pico, e preferivelmente a comprimentos de onda maiores.

Existe também a necessidade na arte de proteínas que fluoresçam a diferentes comprimentos de onda. As variantes de proteínas fluorescentes com diferentes cores seriam também muito úteis para comparações simultâneas de múltiplos destinos de proteínas, linhagens evolucionárias e níveis de expressão génica.

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Em acordo, é um objectivo da presente invenção proporcionar proteínas fluorescentes melhoradas que não sofram das desvantagens da GFP de Aequorea nativa.

Sumário da invenção

De acordo com a presente invenção, determinou-se que determinadas modificações na sequência polipeptídica de uma GFP de Aequorea do tipo selvagem [SEQ ID NO:2] conduzem à formação de produtos possuindo espectros de excitação e emissão marcadamente diferentes, dos de produtos correspondentes derivados da GFP do tipo selvagem. Cores visivelmente distintas e/ou intensidades crescentes de emissão tornam estes produtos úteis numa vasta variedade de contextos, tais como na localização de expressão diferencial de genes e na localização de proteínas.

Breve descricão dos desenhos A invenção pode ser mais bem compreendida com referência aos desenhos anexos, nos quais: A Fig. 1 compara diferentes versões de GFP por electroforese em gel e coloração com azul de Coomassie; A Fig. 2 ilustra um esquema biossintético proposto para GFP;

As Figs. 3a e 3b ilustram os espectros de excitação e de emissão de GFP do tipo selvagem e de um primeiro grupo de mutantes;

As Figs. 4a e 4b ilustram os espectros de excitação e de emissão de GFP do tipo selvagem e de um segundo grupo de mutantes; A Fig. 5 ilustra a taxa de formação do fluoróforo na GFP do tipo selvagem e no mutante Ser 65-»Thr;

As Figs. 6a e 6b ilustram o comportamento da GFP do tipo selvagem e do mutante Ser 65->Thr, respectivamente, por irradiação progressiva com luz ultravioleta; e

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ A Fig. 7 ilustra os espectros de excitação e emissão de fluorescência de um terceiro grupo de mutantes de GFP.

Descricão detalhada da invenção A GFP foi expressa em E. coii sob o controlo de um promotor de T7 para a análise quantitativa das propriedades da proteína recombinante. A electroforese em gel sob condições desnaturantes apresentou a proteína com o peso molecular esperado (27 kDa) como uma banda dominante (Fig. 1), que pode ser quantificada simplesmente por densitometria da coloração com azul de Coomassie. A GFP recombinante solúvel provou ter espectros idênticos e a mesma ou mesmo ligeiramente maior fluorescência por mole de proteína como GFP purificada de Aequorea victoria, mostrando que a proteína solúvel em E. coii sofre as correctas dobragem e ciclização oxidativa com uma eficiência tão elevada como na medusa.

As bactérias também continham corpos de inclusão consistindo em proteínas indistinguíveis da proteína recombinante solúvel ou da de medusa em géis desnaturantes (Fig. 1). Contudo, este material era completamente não fluorescente, faltando-lhe as bandas de absorvância no visível do cromóforo, e não podia ser tornado fluorescente mesmo quando solubilizado e submetido a protocolos que renaturam a GFP [Ward, W.W. & Bokman, S.H., Biochemistry 21, 4535-4540 (1982); Surpin, M.A. & Ward, W.W., Photochem. Photobiol. 49, Resumo, 25S (1989)]. Portanto, a proteína dos corpos de inclusão parecia permanentemente incapaz de gerar o cromóforo interno. Pode ser gerada uma etapa intermediária interessante na maturação da proteína fazendo o crescimento das bactérias anaerobicamente. A proteína solúvel parecia novamente a mesma que a GFP nos géis desnaturantes (Fig. 1) mas não era fluorescente. Neste caso, a fluorescência desenvolveu-se gradualmente após a admissão de ar, mesmo quando a síntese de proteína fresca era bloqueada utilizando puromicina e tetraciclina. Evidentemente, a proteína solúvel não fluorescente sintetizada sob condições anaeróbicas estava pronta a tornar-se fluorescente uma vez readmitido o oxigénio atmosférico. A fluorescência por molécula de proteína aproximou-se do seu valor final assimptótico com um curso no tempo exponencial simples e uma constante de velocidade de 0,24±0,06 h'1 (a 22°C) medida em células intactas com inibidores da síntese de proteínas ou num lisado em que as proteínas solúveis e cofactores estavam mil vezes mais diluídos. Esta cinética de pseudo-primeira ordem sugere fortemente

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ que não são necessários enzimas ou cofactores para o passo final da formação do fluoróforo em GFP.

Determinou-se portanto que a formação do fluoróforo final requer oxigénio molecular e prossegue na proteína do tipo selvagem com uma constante de tempo de »4h a 22°C e p02 atmosférica. Era independente da diluição, implicando que a oxidação não necessita de enzimas ou de cofactores.

Uma interpretação molecular é apresentada na Fig. 2. Se a apoproteína acabada de traduzir (topo, à esquerda) se evade à precipitação em corpos de inclusão, o grupo amino de Gly 67 pode ciclizar com o grupo carbonilo de Ser 65 para formar uma imidazolidin-5-ona, onde o processo pararia (topo no centro) se estiver ausente 02. Esperar-se-ia que a nova ligação dupla N = C promoveria a desidrogenação para formar um cromóforo conjugado; sabe-se que, de facto, as imidazolidin-5-onas sofrem a formação auto-oxidativa de ligações duplas na posição 4 [Kjaer, A., Acta Chem. Scand. 7, 1030-1035 (1953); Kidwai, A.R. & Devasia, G.M., J. Org. Chem. 27, 4527-4531 (1962)], que é exactamente o que é necessário para completar o fluoróforo (topo, à direita). As espécies protonada e desprotonada (em cima e em baixo, à direita) podem ser responsáveis pelos picos de excitação a 395 e 470-475 nm, respectivamente. Os estados excitados dos fenóis são muito mais ácidos do que os seus estados fundamentais, de modo que a emissão apenas será proveniente de uma espécie desprotonada. O ADNc de GFP de Aequorea foi submetido a mutagénese aleatória por tratamento com hidroxilamina ou reacção em cadeia com polimerase. Aproximadamente seis mil colónias bacterianas em placas de ágar foram iluminadas com excitação alternada a 395 e 475 nm e inspeccionadas visualmente quanto a propriedades de excitação alteradas ou emissão de cores.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporcionam-se modificações que resultam num desvio na razão dos dois picos de excitação do produto após oxidação e ciclização, em relação ao tipo selvagem. Encontraram-se três mutantes com alterações significativas na razão dos dois picos de excitação principais (Tabela I). As mutações foram sequenciadas e recombinadas com o gene do tipo selvagem de diferentes maneiras para eliminar mutações neutras e atribuir os efeitos de fluorescência a

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 6 substituições únicas de aminoácidos, excepto quanto ao H9, onde duas mutações vizinhas não foram ainda separadas. Estavam todas na parte do terminal C da proteína (Tabela i), afastadas, na sequência primária, do cromóforo formado pelos resíduos 65-67.

Estas e outras modificações são aqui definidas com referência à sequência de aminoácidos [SEQID NO:2] codificada pelo ADNc reportado [SEQIDNO:1]; o primeiro aminoácido identificado é o que se encontrou no local indicado na sequência reportada, enquanto que o segundo indica a substituição encontrada na forma modificada. O produto fluorescente derivado de uma sequência polipeptídica de GFP do tipo selvagem ou modificada, após oxidação e ciclização já não é, falando rigorosamente, um simples polipéptido; contudo, faz-se aqui por vezes referência, por simplicidade, a polipéptido [e.g., "GFP do tipo selvagem" ou "GFP modificada") quando o que se pretende é óbvio do contexto. Em comparação com a GFP do tipo selvagem, H9 (Ser 202-»Phe, Thr 203-^1 le) tinha fluorescência aumentada a 395 nm de excitação; P9 (lie 1 67->Val) e P11 (lie 1 67—>Thr) eram mais fluorescentes a 475 nm de excitação.

Uma possibilidade para estas perturbações espectrais em P9 e P11 é o facto de a mutação em lie 1 67 desviar uma carga positiva para ligeiramente mais próximo do grupo fenólico do fluoróforo; isto deve aumentar a percentagem de anião fenólico, que é provavelmente a espécie responsável pelo pico de excitação a 470-475 nm, e desviar o pico de emissão hipsocromicamente. Contudo, o grupo fenólico ionizável da hipótese teria que estar encoberto no interior da proteína a pH normal, pois a razão dos picos a 471 a 396 nm nos mutantes não pode ser mais afectada pelo pH externo até este ter aumentado para 10, imediatamente abaixo do limiar para desnaturação. A sensibilidade ao pH da GFP do tipo selvagem é semelhante [Ward, W.W. et a!., Photochem. Photobiol. 35, 803-808 (1982)].

De acordo com outro aspecto da invenção, identificou-se um mutante P4 (Tyr 66->His) que era excitável por ultravioleta e fluorescia azul brilhante em contraste com o verde da proteína do tipo selvagem. Os máximos de excitação e de emissão estavam desviados hipsocromicamente 14 e 60 nm, respectivamente, dos da GFP do tipo selvagem. O ADN mutado foi sequenciado e verificou-se que continha cinco substituições de aminoácidos, apenas uma

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ das quais se provou ser crítica: a substituição de Tyr 66 no centro do cromóforo por Hys (correspondente a uma alteração na sequência de ADNc de GFP [SEQ ID NO: 1 ] em 196-198 de TAT para CAT). A surpreendente tolerância à substituição neste resíduo chave inspirou a realização de mutagénese dirigida ao local adicional para Thr e Phe nesta posição. O Thr originou comprimentos de onda de excitação e de emissão intermediários entre Tyr e His (Tabela I) mas era apenas fracamente fluorescente, talvez devido à ineficiência da dobragem ou da formação do cromóforo devido a considerações estereoquímicas. O Phe originou fraca fluorescência com um máximo de excitação a 358 nm e um máximo de emissão a 442 nm. Em acordo, prosseguindo com este aspecto da invenção, proporcionam-se proteínas GFP modificadas que fluorescem a diferentes comprimentos de onda (preferivelmente, diferentes em pelo menos 10 nm e mais preferivelmente, em pelo menos 50 nm) em relação à proteína nativa, por exemplo, aquelas em que Tyr 66 é substituído por His ou Trp.

Numa concretização adicional deste aspecto da invenção, identificou-se um mutante duplo Y66H, Y145F, que tinha quase os mesmos comprimentos de onda que o mutante simples Y66H mas quase o dobro da intensidade, devido principalmente a uma maior eficiência quântica de fluorescência. O mutante duplo desenvolveu também a sua fluorescência durante o crescimento de um dia para o outro, enquanto o mutante simples precisava de vários dias.

De acordo com concretizações adicionais deste aspecto da invenção, um primeiro ciclo de mutagéneses para aumentar a intensidade de Y66H originou M153T/V163A/N212K como substituições adicionais. Este mutante foi submetido a outro ciclo de mutagéneses, resultando mais dois conjuntos, N146I e 1123V/Y145H/H148R (Tabela II). A eficiência quântica destes mutantes é agora comparável à da GFP do tipo selvagem. O agrupamento das substituições nos resíduos 145 a 163 sugere que aqueles resíduos estão relativamente próximos do cromóforo e que reduções de tamanho das suas cadeias laterais podem ser compensadoras do grande tamanho do triptofano em comparação com a tirosina.

Prosseguindo com ainda outro aspecto da presente invenção, proporcionam-se proteínas GFP modificadas que proporcionam uma

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 8 fluorescência substancialmente mais intensa por molécula do que a proteína do tipo selvagem. As modificações em Ser 65 para Ala, Leu, Cys, Vai, lie ou Thr, proporcionam proteínas com espectros mais brilhantes, desviados para o vermelho, em relação ao da proteína nativa. Em particular, o mutante de Thr (correspondente a uma alteração na sequência de ADNc de GFP [SEQ ID NO:1] em 193-195 de TCT para ACT) e o mutante de Cys (correspondente a uma alteração na sequência de ADNc de GFP [SEQ ID N0:1] em 193-195 de TCT para TGT) são cerca de seis vezes mais brilhantes do que o tipo selvagem quando excitados na banda de comprimentos de onda preferida acima de 450 nm. Em consequência, estas proteínas modificadas são superiores às proteínas do tipo selvagem para praticamente todas as aplicações. Adicionalmente, a intensidade destas proteínas modificadas coincide com a intensidade reportada na literatura para a GFP de Renilla; assim, estas proteínas obviam claramente as objecções à obscuridade da GFP de Aequorea. De facto, especuia-se que os cromóforos nestas proteínas modificadas podem exibir a intensidade óptima que podia ser atingida com uma estrutura genérica derivada do cromóforo de GFP de Aequorea. Em particular, estas mutações proporcionam produtos que exibem uma ou mais das características proeminentes que se seguem, que as distinguem claramente em relação ao produto correspondente de uma GFP do tipo selvagem: reduzida eficiência de excitação por comprimentos de onda entre cerca de 350 e 420 nm; eficiência de excitação e de emissão melhorada quando excitadas com comprimentos de onda maiores do que cerca de 450 nm; resistência aumentada a desvios induzidos pela luz no espectro de excitação; e cinéticas mais rápidas de produção de fluoróforo. Em contraste, as mutações para Trp, Arg, Asn, Phe e Asp, não proporcionaram intensidade meihorada. A mutagénese de S65T para desviar mais os seus comprimentos de onda para o vermelho originou M153A/K238E (Tabela II) como a variante de GFP com o máximo de excitação ao maior comprimento de onda ainda descrito, 504 nm vs. 490 nm para S65T. Surpreendentemente, o pico de emissão praticamente não variou (514 nm vs. 51 1 nm), de modo que a separação entre os picos de excitação e de emissão (desvio de Stokes) é extremamente estreito, apenas de 10 nm. Este é um dos menores valores reportados para qualquer fluoróforo em solução aquosa à temperatura ambiente. Tal como na série da Y66W, a M153 parece ser influente. Sem dúvida que K238E é importante, pois verificou-se que esta substituição não tinha efeito em outros mutantes. 9 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ

Como será prontamente aparente aos que trabalham no campo, para proporcionar a proteína fluorescente desejada não seria necessário incluir a sequência completa da GFP. Em particular, espera-se que pequenas deleções em cada extremidade da sequência da proteína tenham pouco ou nenhum impacto sobre o espectro de fluorescência da proteína. Portanto, numa sequência de GFP mutante ou do tipo selvagem, para os fins da presente invenção, estão contemplados não apenas as sequências polipeptídicas e oligonucleotídicas completas aqui discutidas, mas também suas porções funcionalmente equivalentes {i.e., porções das sequências polipeptídicas que exibem as propriedades de fluorescência desejadas e das sequências oligonucleotídicas que codificam estas sequências polipeptídicas). Por exemplo, embora o cromóforo em si (posição 65-67) seja obviamente crucial, as localizações de mutações neutras conhecidas sugerem que os aminoácidos 76-115 são menos críticas para as propriedades espectroscópicas do produto. Em adição, como será imediatamente aparente aos que trabalham no campo, a utilização de vários tipos de sequências de fusão que aumentam o comprimento da proteína resultante e servem alguns propósitos funcionais na preparação ou na purificação da proteína serão também de rotina e estão contemplados no âmbito da presente invenção. Por exemplo, é prática comum adicionar sequências de aminoácidos incluindo uma marca de poli-histidina para facilitar a purificação das proteínas produto. Como estas fusões não alteram significativamente as propriedades proeminentes das moléculas que as compreendem, GFP modificadas como aqui descrito incluindo estas sequências de fusão em cada uma das suas extremidades estão claramente contempladas no âmbito da presente invenção.

De modo semelhante, em adição às mutações específicas aqui reveladas, é bem entendido pelos que trabalham no campo, que em muitas circunstâncias, modificações em localizações particulares na sequência poiipeptídica podem não ter efeito sobre as propriedades do polipéptido resultante. Ao contrário das mutações específicas aqui descritas em detalhe, outras mutações proporcionam polipéptidos que têm propriedades essencialmente ou substancialmente indistinguíveis das dos polipéptidos específicos aqui revelados. Por exemplo, verificou-se que as seguintes substituições são neutras [i.e., não têm impacto significativo sobre as propriedades do produto): Lys 3->Arg; Asp 76-»Gly; Phe 99-^lle; Asn105-»Ser; Glu 115—>Val; Thr 225-»Ser; e Lys 238->Glu. Estes polipéptidos equivalentes (e sequências oligonucleotídicas que codificam

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ estes polipéptidos) são também considerados dentro do âmbito da presente invenção. Em geral, as sequências polipeptídicas e oligonucleotídicas da presente invenção (em adição a conterem peio menos uma das mutações específicas aqui identificadas) serão pelo menos 85% homólogas, mais preferivelmente pelo menos 90% homólogas, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% homólogas, à GFP do tipo selvagem aqui descrita. Devido à diferença significativa nas propriedades observadas após introdução das modificações especificadas numa sequência de GFP, a presença das modificações especificadas em relação à sequência reportada correspondente para a GFP do tipo selvagem [SEQ ID N0:2] são consideradas centrais para a invenção.

As sequências oligonucleotídicas da presente invenção são particularmente úteis em processos para a marcação de polipéptidos de interesse, e.g., através da construção de genes que codificam proteínas de fusão fluorescentes. A marcação com fluorescência através da fusão de genes é específica dos locais e elimina a presente necessidade de purificar e marcar proteínas in vitro e de as micro-injectar nas células. As sequências que codificam as GFP modificadas da presente invenção podem ser utilizadas para uma vasta variedade de finalidades como é bem conhecido dos que trabalham no campo. Por exemplo, as sequências podem ser empregues como genes repórter para monitorizar a expressão da sequência a elas fundida; ao contrário de outros genes repórter, as sequências não requerem substratos nem ruptura celular para avaliar se a expressão foi conseguida. De modo semelhante, as sequências da presente invenção podem ser utilizadas como um meio para localizar a linhagem de um gene a elas fundido durante o desenvolvimento de uma célula ou de um organismo. Adicionalmente, as sequências da presente invenção podem ser utilizadas como um marcador genético; células ou organismos marcados desta maneira podem ser seleccionados por, e.g., classificação de células activadas por fluorescência. As sequências da presente invenção podem também ser utilizadas como uma marca fluorescente para monitorizar a expressão proteica in vivo, ou para codificar dadores ou aceitadores para transferência de energia de ressonância de fluorescência. Outras utilizações para as sequências da presente invenção serão prontamente aparentes aos que trabalham no campo, como o serão técnicas apropriadas para a fusão de um gene de interesse com uma sequência oligonucleotídica da

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ presente invenção no enquadramento de leitura correcto e num vector de expressão adequado de modo a conseguir a expressão da sequência combinada. A disponibilidade de várias formas de GFP com estas diferentes propriedades espectrais deverá facilitar a avaliação a duas cores de expressão diferencial de genes, destino evolucionário, ou tráfego de proteínas. Por exemplo, se for desejado pesquisar uma droga que é específica para activar a expressão do gene A mas não do gene B, pode-se fundir o ADNc para uma cor de GFP à região promotora do gene A e fundir o ADNc para outra cor à região promotora do gene B. Ambas as construções seriam transferidas para células alvo e as drogas candidatas poderiam ser ensaiadas para determinar se estimulam a fluorescência da cor desejada, mas não a fluorescência da cor indesejada. De modo semelhante, pode-se testar a expressão simultânea de A e B procurando a presença de ambas as cores em simultâneo.

Outro exemplo, para examinar a relação precisa, temporal ou espacial, entre a produção ou a localização das proteínas recombinantes X e Y no interior de uma célula ou de um organismo, podem-se fundir genes para diferentes cores de GFP aos genes para as proteínas X e Y, respectivamente. Se desejado, podem ser incluídas sequências de ADN que codificam espaçadores oligopeptídicos flexíveis para permitir que domínios ligados funcionem autonomamente numa única construção. Examinando o aparecimento das duas cores distinguíveis de fluorescência nas mesmas células ou organismos, podem-se comparar e contrastar a produção ou a localização das proteínas X e Y com muito mais precisão e menos variabilidade biológica do que se tivessem que se comparar em dois conjuntos separados de células ou organismos, cada um contendo apenas uma cor de GFP fundida a cada proteína X ou Y. Outros exemplos da utilidade das duas cores serão óbvios para os peritos na arte.

As mutações adicionais para tornar mais brilhantes as variantes Y66H e Y66W de GFP melhoram a possibilidade de utilizar duas ou três cores de proteína fluorescente para traçar a expressão diferencial de genes, localizações de proteínas ou destinos de células. Por exemplo, os mutantes P4-3 (Y66H/Y145F), W7 (Y66W/N146I/M153T/V163A/N212K) e S65T, podem todos ser distinguidos um dos outros. P4-3 é especificamente detectado excitando a 290-380 nm e recolhendo a emissão a 420-460 nm. W7 é especificamente detectado excitando a 410-457 nm e recolhendo a emissão a 12 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 465-495 nm. S65T é especificamente detectado excitando a 483-493 nm e recolhendo a emissão a comprimentos de onda superiores a 510 nm. Bactérias portadoras destas três proteínas são prontamente discriminadas num microscópio utilizando os filtros que deixam passar as bandas dos comprimentos de onda anteriores. 0 cromóforo em GFP está bem encoberto no interior do resto da proteína, tanto que a obscuridade dos mutantes pontuais originais era presumivelmente devida a erros de emparelhamento estereoquímicos entre o aminoácido substituído e a cavidade optimizada para tirosina. A localização das mutações benéficas implica que os resíduos 145-163 estão provavelmente próximos do cromóforo. O mutante M153A/S65T tem os maiores comprimentos de onda e o menor desvio de Stokes de qualquer proteína fluorescente conhecida que não utiliza um cofactor. A invenção pode ser mais bem compreendida com referência aos exemplos que se seguem, que se destinam a apenas ilustrar e não a limitar em qualquer sentido o âmbito da invenção que é definido pelas reivindicações em anexo.

Exemplo 1

Amplificou-se a região de codificação do clone de GFP 10.1 [Prasher et al. (1992), supra] por PCR, para criar locais NdeI e BamH\ nas extremidades 5' e 3', respectivamente, e clonou-se por trás do promotor de T7 de pGEMEX2 (Promega) substituindo a maior parte do gene 10 de T7. Transformou-se o piasmídeo resultante na estirpe JM109(DE3) (Promega Corp., Madison, Wl) e conseguiu-se um alto nível de expressão crescendo as culturas a 24°C até à saturação sem indução por IPTG. Para preparar extractos solúveis, recolheram-se 1,5 ml de suspensão celular, lavaram-se e ressuspenderam-se em 1 50 μΙ de Tris/HCI 50 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM. Adicionaram-se lisozima e ADNase I a 0,2 mg/ml e 20 ,ug/ml, respectivamente, e incubaram-se as amostras em gelo até ocorrer a lise (1-2 horas). Clarificaram-se então os lisados por centrifugação a 12 000 x g durante 15 minutos. Obtiveram-se os corpos de inclusão como descrito na literatura [Sambrook, J. et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.2, 17.37-17.41 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)].

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Tal como ilustrado na Fig. 1, os extractos solúveis de E. coti que expressam GFP apresentam uma banda predominante que está ausente nos extractos das células de controlo e tem a mesma mobilidade electroforética que a GFP nativa isolada da medusa A. victoria. Os corpos de inclusão das células com expressão consistem principalmente em GFP não fluorescente que tem a mesma mobilidade que a GFP solúvel. A GFP solúvel não fluorescente de culturas crescidas anaerobicamente é também uma banda principal com a mobilidade correcta. Os extractos solúveis dos clones mutados H9, P9, P11 e P4, novamente contêm uma proteína dominante com essencialmente o mesmo peso molecular. A mutagénese aleatória do ADNc de GFP foi realizada aumentando a taxa de erro da reacção em cadeia com polimerase com MnCI2 0,1 mM, dATP 50 UM e dGTP, dCTP, e dTTP 200 μΜ [Muhlrad, D., et aL, Yeast 8, 79-82 (1992)]. Ligou-se o produto a pGEMEX2 e subsequentemente transformou-se em JM109(DE3). As colónias no ágar foram visualmente pesquisadas quanto a diferentes cores de emissão e razões de intensidade quando excitadas a 475 vs. 395 nm.

As Figs. 3a e 3b ilustram os espectros de excitação e de emissão das GFP do tipo selvagem e mutantes. Nas Figs. 3a e 3b: tipo selvagem, ----- S202F,T203I; -------- I167T; ........................ Y66W; --------- Y66H. As amostras eram fracções solúveis de E. co/i que expressavam as proteínas a um alto nível, excepto Y66W, que foi obtido com muito baixo rendimento e medido em células intactas. A autofluorescência foi desprezável para todos os espectros com excepção dos de Y66W, cujo espectro de excitação abaixo de 380 nm pode estar contaminado por autofluorescência. Os espectros de excitação e de emissão foram medidos com larguras de bandas de 1,8 nm e o conjunto de comprimentos de onda não varrido regulado para o pico apropriado. Os espectros de excitação foram corrigidos com um contador quântico de rodamicina B, enquanto os espectros de emissão (excepto o de Y66W) foram corrigidos para as eficiências do monocromador e do detector utilizando os espectros de correcção fornecidos pelo fabricante. Todas as amplitudes foram arbitrariamente normalizadas para um valor máximo de 1,0. Uma comparação da intensidade a iguais concentrações de proteína é proporcionada na Tabela I. 14 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ

Tabela I

Características de GFP mutadas vs. do tipo selvagem Variante Mutação Máximos de Máximos de Fluorescência excitação (nmf emissão(nm)b relativac tipo selvagem Nenhuma 396 (476) 508 (503) (=100%) H9 Ser 202-xPhe, 398 511 11 7%d Thr 203—»lle P9 lie 167^Val 471 (396) 502 (507) 1 66 %e P11 lie 167-VThr 471 (396) 502 (507) 188%e P4 Tyr 66-»His 382 448 57%f W Tyr 66—»Trp 458 480 n.d. a Os valores entre parêntesis são picos de menor amplitude b Os valores primários foram observados quando se excitou no pico de excitação principal; os valores entre parêntesis foram observados quando se iluminou no pico de excitação de menor amplitude c Foram utilizadas quantidades iguais de proteína com base na densitometria de géis corados com Azul de Coomassie (Fig. 1) d Compararam-se os máximos de emissão dos espectros registados com excitação a 395 nm. e Compararam-se os máximos de emissão dos espectros registados com excitação a 475 nm. f Integrou-se o espectro de emissão de P4 registado com excitação a 378 nm e comparou-se com o espectro de emissão integrado do tipo selvagem registado com excitação a 475 nm; corrigiram-se ambas as características, de excitação e de emissão.

Exemplo 2

Realizou-se a mutagénese dirigida ao oligonucleótido no codão para Ser-65 do ADNc de GFP pelo método da literatura [Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 488] utilizando a versão 2 do estojo de mutagénese in vitro com fagemídeo Muta-Gene, disponível no comércio de Bio-Rad, Richmond, CA. O método emprega uma estirpe hospedeira bacteriana deficiente para dUTPase (dut) e uracil-N-glicosilase (ung), que resulta numa substituição ocasional de timina por uracilo no ADN recentemente sintetizado. Quando se utiliza ADN contendo uracilo como molde do tipo selvagem para a mutagénese in vitro dirigida ao oligonucleótido, a cadeia complementar (mutante) pode ser sintetizada na presença de desoxinucleótidos, ligase e polimerase utilizando o 15 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ oligonucleótido mutagénico para iniciar a síntese de ADN; a versão 2 do estojo utiliza ADN-polimerase de T7 não modificada para sintetizar a cadeia complementar. Quando a molécula heterodúplice é transformada num hospedeiro com uma uracil-N-glicosilase activa (que cliva a ligação entre a base uracilo e a molécula de ribose, originando um local apirimídico), a cadeia do tipo selvagem contendo uracilo é inactivada, resultando um enriquecimento na cadeia mutante.

Clonou-se a região de codificação do ADNc de GFP no local BamYW do fagemídeo pRSETB de Invitrogen (San Diego, CA). Esta construção foi introduzida na estirpe CJ236 de E. co!i mutante duplo dut, ung, proporcionada com o estojo Muta-Gene e superinfectada com fago ajudante VCSM13 (Stratagene, LaJolla, CA) para produzir partículas fagemídicas com ADN de cadeia simples contendo alguns uracilos em vez de timina. Purificou-se o ADN contendo uracilo para servir como moldes para a síntese in vitro das segundas cadeias utilizando os nucleótidos mutagénicos como iniciadores.

Transformaram-se os híbridos de ADN na estirpe XLIblue (disponível de Stratagene), que tem uma uracil-N-glicosilase funcional; esta enzima inactiva a cadeia de ADN do tipo selvagem progenitora e selecciona clones mutantes. Isolou-se ADN de várias colónias e verificou-se quanto à mutação correcta por sequenciação.

Para expressar as proteínas mutantes, as construções de ADN obtidas por mutagénese foram transformadas na estirpe BL21 (DE3)LysS de E. coli (Novagen, Madison, Wl), que tem uma cópia cromossómica de polimerase de T7, para conduzir a expressão a partir do promotor forte de T7. À temperatura ambiente, cresceram-se culturas de 3 ml até à saturação (tipicamente, de um dia para o outro) sem indução. Recolheram-se as células de 1 ml de cultura, lavaram-se e finalmente suspenderam-se em 100μΙ de Tris 50 mM, pH 8,0, NaCI 300 mM. Lisaram-se então as células através de três ciclos de congelação/descongelação (azoto líquido/banho de água a 30°C). Obteve-se a fracção solúvel transformando os resíduos celulares e as células não rebentadas em pelete numa microcentrífuga.

Para facilitar a purificação das proteínas recombinantes, o vector utilizado funde uma marca de histidina (6 His consecutivos) com o terminal N das proteínas expressas. A forte interacção entre os hexâmeros de histidina e os 16 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ iões Ni2* permitiu a purificação das proteínas numa resina NI-NTA (disponível comercialmente de Qiagen, Chatsworth, CA). Carregaram-se micro-colunas (volume de leito de 10 μΙ) com 100 μΙ de extracto solúvel (em Tris 50 mM, pH 8,0, NaCI 300 mM), lavaram-se com 10 volumes de leito do mesmo tampão e com 10 volumes do tampão contendo imidazolo 20 mM. Eluiram-se então as proteínas recombinantes com o mesmo tampão contendo imidazolo 100 mM.

Correram-se alíquotas das proteínas GFP mutantes purificadas juntamente com GFP do tipo selvagem num gel de poliacrilamída desnaturante. Corou-se o gel com Azul de Coomassie e quantificaram-se as bandas de proteínas por varrimento num densitómetro. Com base nestes resultados, utilizaram-se quantidades iguais de cada versão de proteína para correr os espectros de excitação e emissão de fluorescência.

As Figs. 4a e 4b comparam-se com os espectros de excitação e de emissão dos mutantes em Ser 65 e o tipo selvagem. Na Fig. 4a:- S65T; ----- S65A;-------- S65C; --------- tipo selvagem (emissão a 508 nm). Na

Fig. 4b:- S65T;-----S65A;------ S65C;.................... tipo selvagem (excitação a 395 nm); -------tipo selvagem (excitação a 475 nm). Mediram-se os espectros de excitação e de emissão com larguras de bandas de 1,8 nm e o comprimento de onda não varrido regulado para o pico apropriado. Como é aparente da Fig. 4b, os três mutantes exibiram intensidade de emissão substancialmente mais elevada em relação à proteína do tipo selvagem. A Fig. 5 ilustra as taxas de formação de fluoróforo na GFP do tipo selvagem e no mutante Ser 65^.Thr. Cresceram-se anaerobicamente E. coli que expressam GFP mutante ou do tipo selvagem. No tempo = 0, expôs-se cada amostra ao ar; evitaram-se o crescimento e a síntese de proteína adicionais transferindo as células para meio isento de nutrientes contendo também azida de sódio como inibidor metabólico. Subsequentemente, monitorizou-se a fluorescência em função do tempo. Para cada cultura, expressaram-se as intensidades de fluorescência como uma fracção da intensidade de fluorescência finai obtida a t = 18 a 20 horas, depois da oxidação ter prosseguido até estar completa. Da Fig. 5, é aparente que o desenvolvimento da fluorescência prossegue muito mais rapidamente no mutante do que na GFP do tipo selvagem, mesmo após normalização da intensidade absoluta (Figs. 4a e 4b). Portanto, quando o desenvolvimento da fluorescência da GFP é utilizado

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 17 como um ensaio para a activação do promotor e para a expressão génica, o mutante origina claramente uma medida mais rápida e fiel do que a proteína do tipo selvagem.

As Figs. 6a e 6b ilustram o comportamento da GFP do tipo selvagem e do mutante Ser 65-»Thr, respectivamente, após progressiva irradiação com luz ultravioleta. Os números indicam minutos de exposição a iluminação de 280 nm; a intensidade foi a mesma para ambas as amostras. A GFP do tipo selvagem (Fig. 6a) sofreu foto-isomerização, como mostrado pela grande alteração no formato do espectro de excitação. A iluminação com UV de banda larga (240-400 nm) causou um comportamento qualitativamente semelhante mas com menor aumento de amplitude na região dos 430-500 nm do espectro. A foto-isomerização não foi reversível por repouso no escuro. Esta foto-isomerização seria claramente indesejável para a maioria das utilizações da GFP do tipo selvagem pois a proteína rapidamente perde intensidade quando excitada no seu pico principal próximo de 395 nm. O mutante (Fig. 6b) não apresentou esta foto-isomerização ou desvio espectral.

Exemplo 3 ADNc de GFP codificando para Tyr 66^>His (Y66H), Tyr 66—»Trp (Y66W) ou Ser 65—»Thr (S65T), foram separadamente submetidos a adicional mutagénese por reacção em cadeia com polimerase, e transformados em E. cofi para pesquisa visual de colónias com intensidades ou cores não usuais. O isolamento, a caracterização espectral (Tabela II e Fig. 7) e a sequenciação de ADN originaram várias variantes adicionais úteis. A mutagénese aleatória do ADNc de GFP foi realizada aumentando a taxa de erro da PCR com MnCI2 0,1 mM e concentrações de nucleótidos desequilibradas. Os mutantes de GFP, S65T, Y66H e Y66W tinham sido clonados no local BamH\ do vector de expressão pRSETB (Invitrogen), que inclui um promotor de T7 e uma marca de poli-histidina. A região de codificação da GFP (apresentada a negrito) foi flanqueada pelas seguintes sequências a 5' e a 3': 5'-G GAT CCC CCC GCT GAA TTC ATG ... AAA TA A TAA GGA TCC-3'. O iniciador a 5' para a PCR mutagénica foi o iniciador de T7 que corresponde à sequência do vector; o iniciador a 3' foi 5'-GGT AAG CTT TTA TTT GTA TAG TTC ATC CAT GCC-3', específico para a extremidade 3' de GFP, criando um local de restrição Hind\\\ próximo do codão de paragem. A amplificação

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ decorreu ao longo de 25 ciclos {1 min a 94°C, 1 min a 52°C, 1 min a 72°C) utilizando a polimerase AmpliTaq da Perkin Elmer. Realizaram-se quatro reacções separadas em que a concentração de um nucleótido diferente foi diminuída de 200 μΜ para 50 μΜ. Os produtos da PCR foram combinados, digeridos com BamHI e Hind\\\ e ligados ao corte de pRSETB com BamYW e Hind\\\. Dializou-se a mistura de ligação contra água, secou-se e subsequentemente transformou-se na estirpe bacteriana BL21 (DE3) por electroporação (50 μΙ de células electrocompetentes em cuvetes de 0,1 cm, 1900 V, 200 ohm, 25 pF). Pesquisaram-se visualmente as colónias em ágar quanto à intensidade como descrito atrás. Sequenciaram-se os clones seleccionados com a versão 2 do estojo Sequenase de United States Biochemical.

Cresceram-se culturas com células recentemente transformadas a 37°C até uma densidade óptica de 0,8 a 600 nm, depois induziram-se com isopropiltiogalactósido 0,4 mM, durante a noite, à temperatura ambiente. Lavaram-se as células com PBS, pH 7,4, ressuspenderam-se em Tris 50 mM, pH 8,0, NaCI 300 mM e lisaram-se numa prensa French. Purificaram-se as proteínas GFP marcadas com poli-histidina a partir dos lisados clarificados em colunas de quelato de níquel (Qiagen) utilizando imidazolo 100 mM no tampão anterior para eluir a proteína.

Obtiveram-se os espectros de excitação recolhendo a emissão aos comprimentos de onda dos picos respectivos e corrigiram-se através de um contador quântico de Rodamina B. Os espectros de emissão foram do mesmo modo medidos aos picos de excitação respectivos e foram corrigidos utilizando factores do fabricante do fluorómetro (Spex Industries, Edison, NJ). Nas experiências de clivagem registram-se os espectros de emissão com excitação a 368 nm. Para medir os coeficientes de extinção molar, utilizaram-se 20 a 30 pg de proteína em 1 mi de PBS, pH 7,4. Os rendimentos quânticos de GFP do tipo selvagem, e dos mutantes S65T e P4-1 foram estimados por comparação com fluoresceína em NaOH 0,1 N como padrão de rendimento quântico 0,91 [ed. Miller, J.N., Standards in Fiuorescence Spectrometry (Chapman and Hall, New York, 1981)]. Os mutantes P4 e P4-3 foram do mesmo modo comparados com 9-aminoacridina em água (rendimento quântico de 0,98). W2 e W7 foram 19 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ comparados com ambos os padrões, que felizmente originaram resultados concordantes. A Fig. 7 ilustra os espectros de excitação e de emissão de fluorescência de diferentes mutantes de GFP. Todos os espectros foram normalizados para um valor máximo de 1. Cada par de espectros de excitação e de emissão é representado por um tipo de linha diferente.

As propriedades de fluorescência dos mutantes de GFP obtidos são reportadas na Tabela II.

Tabela II Propriedades de fluorescência de mutantes de GFP Clone Mutações Max. Excit. (nm) Max. Em. (nm) Coef.extin. (M'1cm') Rendiment o quântico Y66H Y145F 381 445 14 000 0,38 Y66W N146I M153T V163A N212K 433 (453) 475 (501) 18 000 (17 000) 0,67 Y66W 432 (453) 480 10 000 (9 600) 0,72 P4-3 W7 W2 P4-1

I123V Y145H H148R M153T V163A N212K S65T 504 (396) M153A K238E 514 14 500 (8 600) 0,54

86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 20

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: The Regents of the University of Califórnia (B) RUA: 1111 Franklin Street, 1 2,h floor (C) CIDADE: Oakiand (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 94607-5200

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PROTEÍNAS VERDES FLUORESCENTES

MODIFICADAS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: EP 95939898.3 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 13 de Novembro de 1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 717 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..717 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 21(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1 :

ATG AGT AAA GGA GAA GAA Wt i TTC ACT GSA 377 37 C CCA ATT CTT GTT 43 Met Ser Lys 3ly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val ?ro t le Leu Val * 5 10 15 GAA TTA GAT 357 3A7 S7T AAT auu CAC AAA TTT TCT GTC ACT 3uA GAS 96 3lu Lau Asa Gly ASO Vai Asn Gly Mis Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 •337 GAA 337 GAT GCA ACA TAC 3GA AAA ctt ACC CTT AAA TTT ATT TGC 144 Gly Aso Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe I le Cys 35 43 45 act ACT uuA AAA C7A CCT 377 "Gu w*»A ACA CTT i U ACT ACT TTC 152 Thr Thr 3ly -ys Leu Pro Val Pra Trp 3ra Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 TCT TA7 GGT G7T CAA "GC TTT "CA AGA TAC CCA GAT —A j ATG AAA 240 Ser Tyr Gly Vai Gin Cys Phe Ser Arg 'yr =ra Asp His Met Lys Arg 65 70 75 30 CA i GAC TTT 7TC AAG AGT 3CC A j 3 ccc GAA 337 TAT 37A CAG GAA AGA 238 His Aso =he Phe Lys Ser Ala Met Pra 31 u Gly Tyr Vai Gin Glu Arg 35 90 95 ACT ATA TT TTC AAA 3A7 CAC 3uu .AAC TAC .AAG ACA wU JC. GAA 5 > C 336 Thr * L 2 Tie Phe Lys ASD Aso Gly Asn Tyr -ys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 AAG ' 7 GAA 351 GAT ACC w i 1 377 AAT AGA A í U 3AG "TA .AAA 337 ATT 334 Lys Phe 3Lu Gly Asa "hr Leu Vai Asn Arg Γ le Glu Leu Lys Gly I le - *15 ‘20 125 GAT TTT .AAA GAA 3A7 GGA AAC i i uuA AAA . . 3AA "AC AAC •o2 Aso -ys 3lu ASO 31V Asn * ' S .eu Gly His ‘-ys -3U 3LU -yr Asn *.30 135 :40 TAT AAC CAC AAT >j i A "AC 1 i v. A j 3 JUΛ uAC AAA —AA .AAG AA i Ό un 430 Tyr Asn Ser His Asn Vai Tyr lis Het Ala ASO Lys Gin -ys Asn Glv 145 150 *55 160 ATT AAA --- AAC TTC AAA r\ i . ACA CAC AAC •Λ í ! JKK jA 1 JUlA AGC 31 . Ξ23 Γ Le -ys V a l Asn Phe Lys 11 e A - — .-U 3 His Asn I L s Glu Aso GLy Ser Vai 165 170 :73 CAA CTA GCA GAC CAT : A f CAA —AA .AAT ACT /A A i < JUU GAT JUV. GC7 576 Gin -eu A k. a Aso His tyr 3l n 3 In Asn Thr = ra 11 e siy ASO Gly 180 135 •90 'J 1 W CTT TTA CCA GAC AAC CA7 TAC C7G τη— ACA CAA TCT CTT . 4-SJ ó24 Vai Leu Leu Pro Aso Asn HÍS ’yr Leu Ser Thr Gin Ser n L a Leu Ser •95 200 203 AAA 3A7 CCO AAC GAA AAG AGA GAC CAC * Λ | u J l w CTT CTT GAG ""T 3»A 672 Lys Aso Pra Asn Glu Lys Arg Aso His Met /ai. Leu L2U Glu ?hQ '/ai 210 215 220 ACA 3CT 3CT 555 ATT ACA CAT Guu ATS GAT GAA CTA 7AC AAA TA 717 Thr Ala Ala Gly I le Thr His Gly Met ASO Glu Leu Tyr -ys 230 235 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 238 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: 2286 744ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ

Met Ser Lys Gly Glu Glu Lau Phe Thr Gly Vai val Pro Ile Leu Val 1 5 10 «5 Glu Leu Asp Gly Asp Vai Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu 3ly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe I Le Cys 35 40 45 Thr Thr 3ly Lys Lau Pro Vai Pro Tro Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 ao 3er "yr Gly 7a l Gin -ys Phe Ser ΑΓ3 "yr 3γό Asp His Met -ys Arg 65 70 75 30 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met ; 3ro Glu : Gly "yr Val Gtn Glu Arg 35 90 95 Thr I le Phe Phe -ys Asp Asp Gly Isn Tyr : -ys Thr . Arg Ala Glu Val ιαα '.os no

Lys Phe Glu Gly Aso Thr Lau Vai Asn Arg :Le Glu Lau Lys Gly Ile 115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ila Leu Gly His Lys Lau Glu "yr Asn 130 135 ’yr Asn Ser His Asn Vai Tyr 11 e 145 '50 I la Lys Val Asn Phe Lys ’ le Arg 165 Gin Leu Ala Asd Hl S yr Gin Gin :ao Val Leu Leu 3ro Asd Asn His yr '95 200 Lys asd 3ro Asn aiU -ys Arg Asa 210 215 Thr Ala Ala Gly Ile "hr HlS Gly 320 40 Met Ata Asd 155 Lys Gin Lys Asn Gly 160 His Asn 170 Ile giu Asp Gly Ser 175 Val Asn 135 Thr I í e Gly Asd 190 Gly 3ro uSU Ser 'hr Gin Ser 205 Ala Lau Ser His Met Val Leu 220 «eu * 1 , JLij Phe Val Met Asd 235 _eu "yr Lys

Lisboa, -5. JUL 20QÍ

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_____ JOÃO

CUNHA FERREIRA

Àg. Of. Pr. Ind Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims (21)

1. 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES

   1. Proteína fluorescente possuindo uma sequência polipeptídica que é modificada por substituição de aminoácidos em comparação com a sequência polipeptídica da GFP do tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO:2, em que a referida modificação da sequência polipeptídica resuita num espectro de excitação e/ou de emissão diferente, apresentando o espectro de emissão cores distintas visíveis e/ou intensidades aumentadas de emissão em comparação com a GFP do tipo selvagem, ou suas porções ou fusões funcionalmente equivalentes.
2. 2. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína exibe uma alteração na razão de dois picos de excitação principais em relação ao produto correspondente derivado da GFP do tipo selvagem.
3. 3. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína exibe fluorescência aumentada a um pico a comprimento de onda mais curto dos dois picos de excitação principais.
4. 4. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína compreende uma substituição de Ser 202 por Phe e uma substituição de Thr 203 por lie.
5. 5. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína exibe fluorescência aumentada a um pico a comprimento de onda maior dos dois picos de excitação principais.
6. 6. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 5, em que a proteína compreende uma substituição de ile 167 por Vai ou Thr.
7. 7. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 5, em que a proteína compreende uma substituição de Ser 65 por Thr, uma substituição de Met 1 53 por Ala e uma substituição de Lys 238 por Glu.
8. 8. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína exibe fluorescência a um comprimento de onda mais curto do que o produto correspondente derivado da GFP do tipo selvagem.

   86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 2/4
9. 9. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 8, em que a proteína compreende uma substituição de Tyr 66 por His ou Trp.
10. 10. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 8, em que a proteína compreende uma substituição de Tyr 66 por His e uma substituição de Tyr 1 45 por Phe.
11. 11. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 8, em que a proteína compreende uma substituição de Tyr 66 por Trp, uma substituição de Asn 146 por lie, uma substituição de Met 153 por Thr, uma substituição de Vai 1 63 por Ala e uma substituição de Asn 21 2 por Lys.
12. 12. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 8, em que a proteína compreende uma substituição de Tyr 66 por Trp, uma substituição de lie 123 por Vai, uma substituição de Tyr 145 por His, uma substituição de His 148 por Arg, uma substituição de Met 153 por Thr, uma substituição de Vai 1 63 por Ala e uma substituição de Asn 212 por Lys.
13. 13. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína exibe emissão aumentada relativamente ao produto correspondente derivado da GFP do tipo selvagem.
14. 14. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 13, em que a proteína compreende uma substituição de Ser 65 por um aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste em Ala, Cys, Thr, Leu, Vai e lie.
15. 15. Proteína fluorescente de acordo com a reivindicação 14, em que o aminoácido é Cys ou Thr.
16. 16. Sequência nucleotídica substancialmente pura que codifica para uma forma modificada de uma sequência polipeptídica de GFP de Aequorea do tipo selvagem de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15.
17. 17. Método para a monitorização da expressão de um gene que codifica um polipéptido, compreendendo: a formação de uma sequência combinada compreendendo o gene e a sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 16, em que na sequência

    86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 3/ 4 combinada tanto ο gene como a sequência nucleotídica estão no mesmo enquadramento de leitura; e a observação de fluorescência característica de um produto derivado de uma sequência polipeptídica codificada pela sequência nucleotídica, indicando a fluorescência a expressão de uma proteína de fusão codificada pela sequência combinada.
18. 18. Método para a monitorização simultânea da expressão de um primeiro gene e de um segundo gene numa única células, tecido ou organismo, codificando o primeiro gene um polipéptido diferente do polipéptido codificado pelo segundo gene, compreendendo o referido método: a formação de uma primeira sequência combinada compreendendo o primeiro gene e uma primeira sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 16, em que na primeira sequência combinada tanto o primeiro gene como a primeira sequência nucleotídica estão no mesmo enquadramento de leitura; a formação de uma segunda sequência combinada compreendendo o segundo gene e uma segunda sequência nucleotídica seleccionada de entre o grupo que consiste numa sequência nucleotídica que codifica para uma GFF do tipo selvagem e uma sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 1 6 diferente da primeira sequência nucleotídica, em que na segunda sequência combinada tanto o segundo gene como a segunda sequência nucleotídica estão no mesmo enquadramento de leitura; e a observação de fluorescência característica de produtos derivados de sequências polipeptídicas codificadas pelas primeira e segunda sequências nucleotídicas, indicando a fluorescência a expressão de proteínas de fusão codificadas pelas sequências combinadas.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que são pesquisados agentes quanto à sua utilidade na activação da expressão de pelo menos um dos primeiro e segundo genes. 86 744 ΕΡ Ο 804 457/ΡΤ 4/4
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que são comparadas as localizações de proteínas expressas pelos primeiro e segundo genes.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que é determinada a sequência temporal da expressão dos primeiro e segundo genes. Lisboa, "5. JOL. 2001 Por THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA - O AGENTE OFICIAL -

    I EngT DA I Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA