KR102139288B1

KR102139288B1 - 아크로포라 디기티페라 유래의 신규한 적색 형광 단백질

Info

Publication number: KR102139288B1
Application number: KR1020190037741A
Authority: KR
Inventors: 남기현
Original assignee: 고려대학교산학협력단
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2020-07-29

Abstract

본 발명은 아크로포라 디기티페라(Acropora digitifera) 유래의 신규한 적색 형광 단백질에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, pH 9.0에서 최대 형광을 방출하고, pH 5.0 이상에서 발색단의 형광 상태가 확인되며, pH 4.0에서는 비형광 상태를 나타내며, 또한, 567 ㎚에서 여기(excitation) 최대치(peak)를 나타내며, 612 ㎚에서 방출(emission) 최대값를 나타내어 기존의 널리 이용되어온 DsRed보다 넓은 Stroke shift (45 ㎚)를 가지는 신규의 적색 형광 단백질을 제공하는 것이다. 이에, 본 발명의 적색 형광 단백질은 FRET 및 dual-color imaging 등을 통해 단백질 위치 확인, 세포 내 물질의 매커니즘 및 운동성 확인, 동물에서 유전자 발현 확인 등 다양한 세포생물학 및 분자생물학의 연구에 활발하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

아크로포라 디기티페라 유래의 신규한 적색 형광 단백질{Novel red fluorescence protein derived from Acropora digitifera}

본 발명은 아크로포라 디기티페라(Acropora digitifera) 유래의 신규한 적색 형광 단백질에 관한 것이다.

형광 단백질(fluorescence protein: FP)은 분자 및 세포 생물학에서 매우 유용한 광학 마커 (optical marker)로서 표적 단백질의 위치 정보 (localization), 생체 표적 분자들의 상호작용 (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer), pH 센싱 또는 금속 바이오 센싱을 포함하여 다양한 생물학 및 분자 정보를 제공한다. 형광 단백질 이외에도 표지자 기능을 수행할 수 있는 것들은 여러 가지가 있지만, 형광 단백질을 이용한 표지 방법은 기존의 염색 방법과 다르게 세포가 살아있는 상태에서 관찰할 수 있다는 장점이 있으며, 주로 녹색 형광 단백질(Green fluorescence protein, GFP)가 사용되고 있다.

형광 단백질은 β-barrel 구조를 나타내며 형광 특성을 제공해주는 3개의 아미노산은 고리화, 탈수 및 산화 과정을 거쳐 발색단(chromopore)을 형성한다. FP는 발색단과 주변 수소 결합 네트워크 따라 고유의 광학적 특성 (예를 들어, quantum yield, Stoke shift, excitation, emission 등)을 나타낸다. 세포생물학 및 분자생물학에서 새로운 분광학적 특성이 있는 FP를 발굴하기 위하여 주요 아미노산 변이 및 신규 형광 단백질 발굴은 지속해서 수행되고 있다.

아크로포라(Acropora) 종은 인도 대서양에 지배적으로 분포하는 산호초이며, Acropora digitifera (Staghorn coral)는 오키나와에 지배적으로 분포하고 있는 산호이다. 유전체 및 계통 발생 분석 결과, A. digitifera는 가장 큰 FP 계열을 암호화하고 있음이 밝혀졌고, Genome-wide 분석에 기초하여, A. digitifera에서 3 개의 chromoprotein 유전자뿐만 아니라 1개의 Cyan FP, 5개의 Green FP 및 1개의 Red FP를 발견했다(Shinzato 등). 이후 정량적 PCR (qPCR) 바탕으로, 4 개의 A. digitifera 표본에서 31~35개의 FP 서열의 존재가 밝혀졌다(Takahashi-Kariyazono 등).

한편, 4개의 A. digitifera 콜로니의 게놈(genome)으로 부터 16-22개의 단/중파장 (short-/middle-wavelength emission) 형광 발산, 3-6개의 중/장파장 (middle-/long-wavelength emission) 형광 발산, 및 8-12 개의 (chromoprotein clades) 비형광 단백질을 추측되었으며, 다양한 FP중 적색 형광 단백질 (Red fluorescent protein)은 자가형광 (autofluorescence) 감속, 낮은 빛 산란 (light-scattering) 그리고 낮은 수준의 광독성 (phototoxicity)를 나타내는 장점이 있는바, 본 발명자들은 생물학 연구에 다양한 형광 단백질 라이브러리(library) 구축을 위하여 A. digitifera 유래의 적색 형광 단백질을 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2018-0097956

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 세포생물학 및 분자세포생물학에서 다양한 연구목적에 따라 이용 가능한 새로운 적색 형광 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 적색 형광 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 및 상기 세포로부터 적색 형광 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 적색 형광 단백질의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 적색 형광 단백질의 pH 측정, 금속 검출 용도와 연구 목적인 표적 단백질의 위치 정보, 생체 표적 분자들의 상호작용 등을 확인하기 위한 표지로서의 용도를 제공한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 적색 형광 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 단백질은 아크로포라 디기티페라(Acropora digitifera) 유래의 형광 단백질일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 단백질의 148번째 아미노산은 시스테인(Cysteine)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 적색 형광 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서 상기 세포는 대장균(E.coli)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포를 배양하여 상기 적색 형광 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 적색 형광 단백질의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 포함하는 pH 측정용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 포함하는 금속 이온 측정용 바이오 센서를 제공한다.

본원의 적색 형광 단백질(AdRed)는 pH 9.0에서 최대 형광을 방출하고, pH 5.0 이상에서 발색단의 형광 상태가 확인되며, pH 4.0에서는 비형광 상태를 나타낸다. 또한, AdRed는 567 ㎚에서 여기(excitation) 최대치(peak)를 나타내며, 612 ㎚에서 방출(emission) 최대값를 나타내어 기존의 널리 이용되어온 DsRed보다 넓은 Stroke shift (45 ㎚)를 가진다. 이에, 본원의 AdRed는 FRET 및 dual-color imaging 등을 통해 단백질 위치 확인, 세포 내 물질의 매커니즘 및 운동성 확인, 동물에서 유전자 발현 확인 등 다양한 세포생물학 및 분자생물학의 연구에 활발하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 AdRed의 질량 및 분광학 분석의 결과 도면이다. 겔 여과 크로마토그래피분석 결과 AdRed는 158kDa의 4량체이며, LED 노출과 형광 현미경 관찰 결과 AdRed는 적색 형광을 발함을 알 수 있다.
도 2는 다양한 pH에서 AdRed의 흡광도 스펙트럼을 분석한 결과 도면이다. 발색단의 양성화 (protonation)와 탈양자화 (deprotonation)는 각각 파란색과 빨간색 화살표로 표시하였다.
도 3은 pH에 따른 AdRed의 형광 방출 강도를 측정한 결과 도면이다.
도 4는 AdRed의 형광을 분석하여 표준화된 AdRed의 여기(excitation, 567㎚, 점선) 및 방출(emission, 612㎚, 실선) 스펙트럼 나타낸 도면이다.
도 5a 내지 도 5c는 AdRed의 사량체 결정 구조 도면이다. 구체적으로 도 5a는 AdRed 사량체 결정 구조 배열이고[발색단(chromophore, XYG)은 막대로 표시], 도 5b 및 도 5c는 각각 분자 A-B 및 분자 A-C의 이량체 계면에서의 수소 결합 및 염 다리의 확대 도면이다.
도 6a 내지 도 6c는 AdRed 발색단의 환경을 나타낸 도면이다. 보다 구체적으로, 도 6a는 AdRed 발색단의 최종 2Fo-Fc 전자 밀도지도(2.0 σ, 회색 그물)이고, 도 6b는 cis 형태의 AdRed 발색단을 나타낸 것이고, 도 6c는 AdRed 발색단 부근의 수소 결합 네트워크을 나타낸 도면이다.
도 7a 내지 도 7c는 공지의 적색 형광 단백질과 AdRed 단백질의 구조 및 돌연변이를 비교 확인한 도면이다. 구체적으로 도 7a는 AdRed와 zRFP574의 서열을 비교한 것이고(발색단 염기 서열은 빨간색 별표. AdRed 발색단의 Tyr67의 hydroxyl group 및 zRFP574의 수소 결합 네트워크상의 상호 작용하는 잔기는 각각 적색 및 분홍색 삼각형으로 표시), 도 7b는 AdRed 및 zRFP574의 발색단 환경의 중첩 정도를 비교한 것이고, 도 7c는 AdRed-Cys148Ser의 형광 스펙트럼을 분석한 도면이다. 도 7c에서 AdRed-Cys148Ser의 여기(560㎚, 빨간색 점선) 및 방사(599㎚, 빨간색 실선)는 야생형 AdRed (회색 선)와 비교했을 때 파란색으로 이동하였음을 확인할 수 있다.

일반적으로 발색단의 중성 형태는 비형광성이지만 이온화 형태는 높은 형광성이다. pH에 의해 유도된 비형광 상태를 검증하기 위해, 우리는 다양한 pH에서 AdRed의 형광 방출을 측정했다.

본 발명자들은 세포생물학 및 분자생물학 등의 다양한 연구에 적용할 수 있는 형광 단백질 라이브러리 구축을 위하여, 종래 알려진 적색 형광 단백질과 상이한 분광학적 특성을 갖는 새로운 적색 형광 단백질을 제공하기 위하여 아크로포라 디기티페라(Acropora digitifera)에서 생체 광학 마커 및 표지로 이용할 수 있는 단백질을 확인하여 이를 AdRed를 명명하고 신규의 적색 형광 단백질로서 제공하게 되었다.

본 발명의 구체적인 실시예를 통해서, AdRed는 133kDa의 사량체이고 470㎚의 LED 빛에 노출되었을 때 적색 형광을 발하는 것을 알 수 있었다. 또한, 일반적으로 발색단의 중성 형태는 비형광성이지만 이온화 형태는 높은 형광성인바, pH에 의해 유도된 비형광 상태를 검증하기 위해, 다양한 pH에서 AdRed의 형광 방출을 측정하였고, 그 결과 AdRed는 pH 9.0에서 최대 형광을 방출하고, pH 5.0 이상에서 발색단의 형광 상태가 확인되며, pH 4.0에서는 비형광 상태를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, AdRed는 567 ㎚에서 여기(excitation) peak를 나타내며, 612 ㎚에서 방출(emission) peak를 나타내어 기존의 널리 이용되어온 DsRed보다 넓은 Stroke shift (45 ㎚)를 가지는 것을 확인할 수 있었다(실시예 2 참조).

또한, 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해서, AdRed는 11개의 β-strand과 2개의 α-helix로 구성되어 있으며, β-barrel 구조를 나타낸다. 3개의 아미노산(Asp66-Tyr67-Gly68)이 생합성된 발색단(chromophore)은 β-barrel 구조의 중앙에 위치함을 확인할 수 있었다(실시예 4 참조).

또한, 본 발명자들은 구체적인 실시예에서 전자밀도 분석을 통해 AdRed의 발색단을 분석하였으며 그 결과 148번째 아미노산인 Csy가 물 분자와 결합하여 발색단을 안정화시킴을 확인하였고, 이를 통해 148번째 아미노산이 발색단의 분광학적 특성에 영향을 미치는 것으로 예측하고 이를 검증하는 실험을 진행하였다. 보다 구체적으로 발색단 주변의 Cys148을 Ser148로 변이하여 AdRed-Cys148Ser의 스펙트럼을 분석한 결과 변이 후 여기 및 방출 최댓값이 각각 560㎚ 및 599㎚으로 확인되어 AdRed의 형광 스펙트럼에서 청색편이된 특성을 나타내었다(실시예 5 참조).

이에, 본 발명자들은 공여체와 수여체의 발광 스펙트럼에 따라 148번째 아미노산을 변이하여 적용할 수 있는 적색 형광 단백질을 제공할 수 있다.

본 발명의 적색 형광 단백질은 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques), 액상 합성 기술, 유전자 클로닝 방법 등에 따라 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 적색 형광 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 AdRed를 암호화하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 이에 상보적인 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 의미이며, 실질적으로 상보적인 서열이란 모든 뉴클레오티드가 상보가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지는 않지만 그럼에도 불구하고 특정 조건 하에서 두 핵산 가닥이 안정한 혼성체를 형성할 수 있는 서열을 갖는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥의 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide)의 중합체를 의미하며, 자연의 폴리뉴클레오타이드 유사체를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "벡터 (vector)"는 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

본 명세서에 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터에 삽입되는 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환된 것일 수 있다. 숙주에 따라 단백질로 전사 및 번역을 선호하는 코돈이 존재하는데, “코돈 최적화”란 상기 폴리뉴클레오티드를 형질전환시키려는 숙주가 선호하는 코돈으로 치환함으로써 본원 발명의 AdRed의 발현 효율을 증가시키는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “형질전환”은 하나 이상의 숙주 내에 외부 유전자를 전달하는 것을 의미하며, 이때, 외부 유전자의 전달이란 타겟 유전자를 숙주의 게놈 상에 삽입하거나 게놈과 분리되어 독자적으로 전사, 번역, 및 복제가 가능하도록 전달하는 것을 의미한다.

상기 재조합 발현 벡터를 안정적이고 연속적으로 클로닝 또는 발현할 수 있는 숙주는 제한이 없으나, 그 비제한적인 예로서, 원핵세포로는 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵세포로는 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 내로의 전달은, 당업계에 널리 알려진 전달 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

실시예 1. 코돈 최적화된 AdRed 유전자 확보

AdRed 단백질을 과발현하기 위하여 산호에서 보고된 AdRed 유전자를 포함하여 대장균(E.coli)에서의 보다 효과적인 발현이 가능한 codon usage를 이용하여 코돈 최적화된 유전자를 합성하였다. 코돈 최적화된 AdRed 유전자 디자인은 (주) 바이오니아에서 수행되었다. 산호의 AdRed 유전자는 서열번호 2로 구성되며, 코돈 최적화된 AdRed의 유전자는 서열번호 3으로 구성된다.

실시예 2. 분광학 분석

상기 실시예 1에서 확보한 코돈 최적화된 AdRed를 이용하여 E.coli BL21 (DE3)를형질전환시키고, 상기 형질전환 대장균을 배양하여 AdRed를 수득하여 분광학 분석을 실시하였다. 질량 분석은 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 수행하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 AdRed는 133kDa의 사량체(tetramer)이고, 정제된 AdRed 단백질은 가시광선에서 보라색을 나타내었으며, 470㎚의 LED 빛에 노출되었을 때 적색 형광을 나타냈다.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 다양한 pH에서 AdRed의 흡광도 스펙트럼을 분석한 결과, AdRed는 pH 8.0 용액에서 567㎚에서 높은 흡광값을 나타내었고, 567㎚ 흡광 밴드는 pH가 증가함에 따라 흡광값이 커지는 반면, 422㎚의 흡광 밴드의 진폭은 감소하였다. 422 및 567㎚ 흡광 peak은 발색단의 페놀성 하이드록실기 (hydroxyl-group)의 중성 및 이온화 상태에 각각 상응한다.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 다양한 pH에서 AdRed의 형광 방출을 측정한 결과, 567㎚에서 AdRed의 형광 방출 강도는 발색단의 이온화된 형태의 진폭과 일치하였고, pH 5.0 이상에서 발색단의 형광 상태를 갖으며. pH 4.0 이하에서 비형광 상태를 갖고, 형광 강도의 최대치는 pH 9.0에서 확인할 수 있었다.

흡광도 및 형광 방출의 pH 의존성으로부터 결정된 바와 같이, 명백한 pKa 값은 4.0이었다. 형광 스펙트럼은 각각 567㎚와 612㎚에서 여기(excitation)와 방출 (emission) peak을 나타내었다 (도 4).

실시예 3. 단백질 결정 분석

pH 5.6에서 1.8 ÅA 해상도의 AdRed 결정 구조를 결정했으며 (표 1 참조), 상기 실시예 2의 결과를 기초로 이는 해당 구조의 발색단이 형광 상태임을 의미한다(도 2 참조).

규명된 AdRed 구조의 R_work 및 R_free는 각각 17.81% 및 20.75% 이고, 전자 밀도는 N-말단을 제외한 전체 AdRed에 대해 명확하게 관찰되었다.

Data collection
Space group	P2₁2₁2
Cell dimensions
a, b, c (ÅA)	78.618, 90.553, 73.429
Resolution (ÅA)	50.0-1.8 (1.83-1.80)
Completeness	99.5 (99.3)
Redundancy	8.1 (6.4)
I/σ(I)	33.05 (2.88)
R_merge ^a	0.062 (0.375)
Refinement statistics
Resolution (ÅA)	50.0-1.80
R_work/ R_free (%)^b	17.81 / 20.75
B-factor (Averaged)
Protein	33.51
Chromophore	26.55
Water	41.86
R.m.s deviations
Bond lengths (ÅA)	0.018
Bond angles (°)	2.023
Ramachandran plot(%)
favored	99.6
allowed	0.4

AdRed의 전체 구조는, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 11개의 β-strand과 2개의 α-helix로 구성되어 있으며, β-barrel 구조를 나타낸다. 3개의 아미노산(Asp66-Tyr67-Gly68)이 생합성된 발색단(chromophore)은 β-barrel 구조의 중앙에 위치한다. 전자 밀도 맵은 Asp66의 카르복실기(carboxyl group)를 제외한 발색단의 모든 원자가 명확히 관찰되었다. 결정구조에서 AdRed는 사량체를 형성하며, 이는 상기 실시예 2의 겔 여과 크로마토그래피 결과와 일치한다. 사량체 AdRed는 저속 성숙, pH 안정성 또는 형광 공명 에너지 전달에 영향을 줄 수 있다.

AdRed 단량체를 만들기 위한 정보를 얻기 위해 AdRed 사량체의 경계면을 분석하였다. 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 분자 A (10919.3 ÅA²)와 B (10645.9 ÅA²) 사이의 A-B 이량체 표면은 총 단량체 표면적의 9.4 %를 차지하는 1014.7 ÅA²의 매립된 표면적을 가지며, dimeric interface는 7개의 수소 결합 (Pro147-Lys151, Ser228-Gln201, Ala229-Gln201 및 Asp164-Tyr168), 12개의 salt bridge (Glu146-Lys151, Asp164-Arg178 및 Lys203-Ala231) 및 5개의 소수성 상호 작용 (Ile153-Tyr168 및 Val224-Leu230)을 가지고 있었다(표 2 참조).

Molecule A (Residue [atom])	Dist. [ÅA]	Molecule B (Residue [atom])
Hydrogen bond
Pro147 [O]	2.9	Lys151 [NZ]
Lys151 [NZ]	2.8	Pro147 [O]
Tyr168 [OH]	2.5	Asp164 [OD2]
Gln201 [OE1]	3.6	Ser228 [OG]
Gln201 [OE1]	2.9	Ala229 [N]
Ser228 [OG]	3.7	Gln201 [OE1]
Ala229 [N]	2.9	Gln201 [OE1]
Salt Bridges
Glu146 [OE2]	2.9	Lys151 [NZ]
Lys151 [NZ]	2.7	Glu146 [OE2]
Asp164 [OD1]	3.9	Arg178 [NE]
Asp164 [OD1]	2.6	Arg178 [NH2]
Arg178 [NH1]	3.1	Asp164 [OD1]
Arg178 [NE ]	2.9	Asp164 [OD2]
Arg178 [NH1]	3.2	Asp164 [OD2]
Lys203 [NZ]	2.8	Ala231 [O]
Lys203 [NZ]	3.4	Ala231 [OXT]
Ala231 [O]	3.4	Lys203 [NZ]
Ala231 [OXT]	2.9	Lys203 [NZ]
Hydrophobic
Ile153 [CD1]	3.6	Tyr168[CE2]
Tyr168[CZ]	3.5	Ile153 [CD1]
Tyr168[CE1]	3.8	Ile153 [CD1]
Val224 [CG2]	3.5	Leu230[CD1]
Leu230 [CD2]	3.4	Val224 [CG2]

또한, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 분자 A와 C 사이의 A-C 이량체 표면은 총 단량체 표면적의 8.47%를 차지하는 872.5ÅA²의 매립된 표면적을 가지며, 5개의 수소 결합 (Asp182-Asn130, Gln94-Asn130 및 Thr106-Thr106), 2개의 이온 결합 (Asp134-Arg157) 및 3개의 소수성 결합 (Leu98-Leu98, Val104-Val104 및 Thr106-Val129)을 포함함을 알 수 있었다(표 3 참조).

Molecule A (Residue [atom])	Dist. [ÅA]	Molecule A' (Residue [atom])
Hydrogen bond
Gln94 [O]	3.7	Asn130 [ND2]
Thr106 [OG1]	2.7	Thr106 [OG1]
Asn130 [ND2]	3.7	Gln94 [O]
Asn130 [ND2]	3.2	Asp182 [O]
Asp182 [O]	3.2	Asn130 [ND2]
Salt Bridges
Asp134 [OD2]	3.5	Arg157 [NH1]
Arg157 [NH1]	3.5	Asp134 [OD2]
Hydrophobic
Leu98 [CD2]	3.8	Leu98 [CD2]
Val104 [CG1]	3.5	Val104 [CG1]
Thr106 [CG2]	3.9	Val129 [CG2]

실시예 4. AdRed의 발색단 분석

AdRed의 전자 밀도지도 분석 결과는 도 6a 내지 6c에 나타내었다. AdRed 발색단은 Asp66에서 카르복시기가 없으며(decarboxylation), 발색단의 탈카복실화된 Asp66의 측쇄는 소수성 잔기 (Ile44, Leu204 및 Leu219) 및 수소 결합 네트워크 둘러싸여 있었다. 적색 형광 단백질에서 발색단은 추가 산화로 인해 아실이민(acylimine) 결합을 형성하며 π전자계가 확장된다. 이것은 잠재적으로 적색 이동된 흡광도 및 방출 스펙트럼을 유도한다.

또한, 전자 밀도지도에서 발색단과 Phe65의 결합이 AdRed의 발색단의 접합 확장을 나타내는 평면에 가까운 것을 관찰했다. 전자 밀도지도에서 발색단의 Tyrosine과 imidazoline 고리 사이의 시스 구조 (cis conformation)를 보였다. AdRed 발색단은 Cβ2-Cγ2에서 ~ 7°의 경사각을 갖는 대략적 평면상이다. 발색단의 Tyr67의 수산기는 ~ 0.71ÅA의 거리에서 imidazoline ring의 평면 위에 있다. imidazoline ring의 carbonyl group은 Arg95 (2.81ÅA)에 의해 배위되어 있는데, 이것은 백본(backbone) 고리화 (cyclization)의 화학적 작용에서 중요한 역할을 한다.

또한, Tyrosine의 hydroxyl group은 Csy148 (3.06 ÅA)와 물 분자 (2.93 ÅA)와 결합하여 발색단을 안정화시킨다. 진화적으로 보존된 Glu218은 발색단의 imidazoline ring의 N2 원자와 3.59 ÅA의 거리에서 상호작용하고, 발색단 부근의 수소 결합 네트워크와 FP의 분광 특성에 영향을 준다. 발색단의 바닥에서 Gln42, Glu221, His202 및 Glu150은 다른 FP에서도 발견되는 수소 결합 네트워크를 형성한다. 수소 결합 네트워크 Gln42-Glu221-His202-Glu150에서 Glu221과 His202사이의 거리는 3.61ÅA이다. 그러나, Ser223의 Oγ는 각각 Glu221의 Oε 및 Nδ His202로부터 2.55 및 2.73ÅA의 거리에 있다. 따라서, Ser223은 Glu221과 His202를 연결한다. 또한, 물 분자를 포함한 확장된 수소 결합 네트워크가 발색단 부근에서 관찰된다.

실시예 5. 공지의 적색 형광 단백질과 AdRed의 비교

5-1. zRFP574와 AdRed의 비교

AdRed의 결정 구조를 Zoanthus sp. 유래의 적색 형광 단백질 zRFP574 (PDB 코드: 2FL1)와 비교한 결과, 서로간 81.17 %의 서열 동일성을 가짐을 알 수 있었다(도 7a 참조). 보다 구체적으로, zRFP574의 발색단은 AdRed과 동일하게 탈카르복시 Asp66 측쇄를 갖는 Asp66-Tyr67-Gly68 트리 펩타이드로 구성된다. zRFP574의 형광 특성은 553㎚ 및 574㎚에서 여기 및 방출 극대값을 갖는다는 점에서 AdRed와 분광학적 특징이 다르다. zRFP574에 대한 방출을 적색편이 시키는 것 외에도 AdRed는 더 넓은 Stokes를 이동한다. AdRed 및 zRFP574의 중첩 결과 r.m.s. 편차는 Cα 원자에서 0.51ÅA의 유사성을 나타낸다. 한편, AdRed에서 발색단의 수산기는 3.06ÅA 거리에 있는 Cys148에 의해 안정화되고, zRFP574에서는 2.60ÅA 거리에서 Ser148과 상호 작용한다(도 7b 참조). 또한 AdRed에서 Glu221과 His202는 3.61ÅA 떨어져 있고 Ser223은 수소 결합 네트워크의 중간체이며 zRFP574에서는 Al222가 Ser223을 대체하고 His202와 Glu221 사이에는 3.26ÅA의 거리가 관찰된다.

이러한 구조적 차이가 분광 특성에 영향을 주는지 조사하기 위해 AdRed 발색단의 주변의 Cys148을 Ser148로 변이하였다. AdRed-Cys148Ser의 스펙트럼 분석은 AdRed 와 비교할 때 각각 7㎚와 13㎚의 파란색 이동에 해당하는 560㎚와 599㎚에서 여기와 방출 최대값을 각각 나타내었다(도 7c 참조). 상기 결과는 Cys148이 형광 여기 및 방출 최대 파장에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

5-2. DsRed와 AdRed의 비교

이어서, AdRed와 DsRed의 비교를 수행하였다. 그 결과, AdRed와 DsRed는 39.6%의 서열 동일성을 가짐을 알 수 있었다. 보다 구체적으로, AdRed와 DsRed의 중첩은 에서 r.m.s 편차는 217 Cα 원자에 대해 0.995ÅA로 매우 유사했다. 그러나 형광 특성에 중요한 발색단에서 AdRed는 탈카르복시화 형태를 갖는 Asp60-Tyr61-Gly62의 구성되는 반면, DsRed는 Asn66-Try67-Gly68의 서열을 갖는다. 또한, 발색단 부근의 수소 결합 네트워크 구성이 다르다. DsRed에서 형광 여기와 방출 최대값의 피크는 각각 558㎚와 583㎚에 존재하며, 25㎚의 Stroke shift가 있다. 한편, AdRed는 형광 여기와 방출의 최대 피크가 567㎚와 612㎚이고, DsRed보다 넓은 45㎚의 Stroke shift를 갖는다.

결과적으로, AdRed와 DsRed는 모두 적색 형광 단백질 군에 속하며, 전반적으로 유사한 구조를 나타낸다. 그러나 형광 특성, 발색단 및 발색단 환경에 현저한 차이가 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Novel red fluorescence protein derived from Acropora digitifera <130> DHP19-151 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 231 <212> PRT <213> Acropora digitifera <220> <221> VARIANT <222> (148) <223> Xaa = Cys or Ser <400> 1 Met Ala Leu Ser Lys His Gly Leu Thr Lys Asp Met Thr Met Lys Tyr 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Cys Val Asp Gly His Lys Phe Val Ile Thr Gly His 20 25 30 Gly Asn Gly Ser Pro Phe Glu Gly Lys Gln Thr Ile Asn Leu Cys Val 35 40 45 Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Glu Asp Ile Leu Ser Ala Val 50 55 60 Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Asp Tyr Pro Gln Gly Met Val 65 70 75 80 Asp Phe Phe Lys Asn Ser Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Trp Gln Arg Ser 85 90 95 Leu Leu Phe Glu Asp Gly Ala Val Cys Thr Ala Ser Ala Asp Ile Thr 100 105 110 Val Ser Val Glu Glu Asn Cys Phe Tyr His Glu Ser Lys Phe His Gly 115 120 125 Val Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Met Thr Ile Asn 130 135 140 Trp Glu Pro Cys Xaa Glu Lys Ile Ile Pro Val Pro Arg Gln Gly Ile 145 150 155 160 Leu Lys Gly Asp Val Ala Met Tyr Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gly Arg 165 170 175 Tyr Arg Cys Gln Phe Asp Thr Val Tyr Lys Ala Lys Thr Asp Ser Lys 180 185 190 Lys Met Pro Glu Trp His Phe Ile Gln His Lys Leu Thr Arg Glu Asp 195 200 205 Arg Ser Asp Ala Lys Asn Gln Lys Trp Gln Leu Ala Glu His Ser Val 210 215 220 Ala Ser Arg Ser Ala Leu Ala 225 230 <210> 2 <211> 696 <212> DNA <213> Acropora digitifera AdRed gene <400> 2 atggctctgt caaagcacgg tctaacaaag gacatgacga tgaaataccg gatggaaggg 60 tgcgtcgatg ggcataaatt tgtgatcacg ggccacggca atggaagtcc ttttgaaggg 120 aaacagacta tcaatctgtg tgtggtcgaa gggggacccc tgccattctc cgaagacatt 180 ttgtctgctg tgtttgacta cggaaacagg gtcttcactg attatcctca aggcatggtt 240 gactttttca agaattcatg tccagctgga tacacatggc aaaggtcttt actctttgaa 300 gatggagcag tttgcacagc cagtgcagat ataacagtga gtgttgagga gaactgcttt 360 tatcacgagt ccaagtttca tggagtgaac tttcctgctg atggacctgt gatgaaaaag 420 atgacaatta attgggagcc atgctgcgag aaaatcatac cagtgcctag acaggggata 480 ttgaaagggg atgtcgccat gtacctcctt ctgaaggatg gggggcgtta ccggtgccag 540 ttcgacacag tttacaaagc aaagactgac tcgaaaaaga tgccggagtg gcacttcatc 600 caacataagc tcacccggga agaccgcagc gatgctaaga accagaagtg gcaactggca 660 gaacattctg ttgcttcccg atccgcattg gcctga 696 <210> 3 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized AdRed gene <400> 3 atggctctgt caaaacacgg tctgacaaag gatatgacga tgaaatatcg gatggaaggt 60 tgcgtagatg ggcataaatt cgtgattacc ggccacggca atggtagtcc gtttgaggga 120 aaacagacta tcaatctgtg tgtagtcgaa ggcggacccc tgccatttag cgaagacata 180 cttagtgctg tatttgacta cggaaaccgc gtcttcacag attatcctca aggcatggtt 240 gattttttca aaaattcatg tccagcggga tacacatggc aacgctcttt actctttgaa 300 gatggtgccg tttgcacggc cagcgcggat atcaccgtta gtgttgaaga gaattgcttt 360 tatcacgagt ccaagtttca tggtgtgaac tttccggcag atggcccggt gatgaaaaaa 420 atgacgatta attgggagcc gtgttgtgaa aaaatcatac cggtgcctag acaggggatt 480 ttaaaaggtg atgtggccat gtatctgctt ttgaaggatg ggggccgtta ccgttgccag 540 ttcgacactg tctataaagc gaagaccgac tcgaagaaga tgcccgagtg gcattttatt 600 cagcataaac tgacccgtga agaccgcagc gatgctaaaa accagaaatg gcaactggca 660 gaacattctg ttgcatcccg ctcggcgttg gcctaa 696

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 적색 형광 단백질.
제1항에 있어서,
상기 단백질은 아크로포라 디기티페라(Acropora digitifera) 유래인 것을 특징으로 하는, 적색 형광 단백질.
제1항에 있어서,
상기 단백질의 148번째 아미노산은 시스테인(Cysteine)인 것을 특징으로 하는, 적색 형광 단백질.
제1항의 적색 형광 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제4항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
제4항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제7항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
제8항의 세포로부터 적색 형광 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 적색 형광 단백질의 제조방법.