JP4719226B2 - 蛍光タンパク質の蛍光波長を変える方法 - Google Patents
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Description
Lippincott−Schwartz, J. G.H. Patterson, Science Vol.300, 87−91 (2003) Tsien, R.Y., Annu. Rev. Biochem. Vol.67, 509−544 (1998)を参照 Ormo, M. et al., Science Vol.273, 1392−1395 (1996) Yang, F. et al., Nature Biotech., Vol.14, 1246−1251 (1996) Cubitt, A.B. et al., Trends Biochem. Sci., Vol.20、 448−455 (1995) Matz, M.V. et al., Nature Biotech., Vol.17, 969−973 (1999) Verkhusha, et al. Nature Biotech., Vol.22, 289−296 (2004)
Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPの改変蛍光タンパク質であって、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、
その52番目のアミノ酸Hisを、
Phe、Tyr、Trpからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である;
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、
Ala、Val、Ile、Leu、Gly、Cys、Met、Ser、Thrからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である;あるいは、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、
Asp、Asn、Glu、Glnからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質である。
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、Pheで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Fである。
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、Thrで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Tである。
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、Aspで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Dである。
Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPと高い相同性を有するPontellina plutellina由来のGFP様蛍光タンパク質ppluGFP2の改変蛍光タンパク質であって、
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisに対応する、該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、
その54番目のアミノ酸Hisを、
Phe、Tyr、Trpからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である;
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、
Ala、Val、Ile、Leu、Gly、Cys、Met、Ser、Thrからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である;あるいは、
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、
Asp、Asn、Glu、Glnからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である
のいずれかであることを特徴とする改変蛍光タンパク質である。
前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、Pheで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である。
前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、Thrで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である。
前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、Aspで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である。
Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPの改変蛍光タンパク質であって、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、
その56番目のアミノ酸Tyrを、
Trpで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56Wである;
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、56番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、194番目のアミノ酸Valを、Serで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56W,V194Sである;あるいは、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、56番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、194番目のアミノ酸Valを、Serで、136番目のアミノ酸Thrを、Alaで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56W,V194S,T136Aである
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質である。
Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPと高い相同性を有するPontellina plutellina由来のGFP様蛍光タンパク質ppluGFP2の改変蛍光タンパク質であって、
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、56番目のアミノ酸Tyrに対応する、該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、
その58番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質;
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、58番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、197番目のアミノ酸Valを、Serで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質;あるいは
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、58番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、197番目のアミノ酸Valを、Serで、138番目のアミノ酸Thrを、Alaで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質である。
この塩基配列(配列番号:3)は、国際公開第2005/095599号パンフレットに開示されており、該CpYGFPをコードする遺伝子(cDNA)を、クローニング・ベクター:pBluescript II SKのマルチ・クローニング・サイト中に挿入したベクター:pBluescriptII SK−NFPは、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国 茨城県つくば市東1丁目1番地中央第6、郵便番号305−8566)に、受託番号FERM BP−08681として、国際寄託(平成16年3月31日付け)がなされている。
Sequence of
the humanized version of the CopGFP's open reading frame
本発明の第一の形態、第二の形態にかかる方法を適用して、作製される改変蛍光タンパク質は、上述する野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列中、1〜数個の離散的なアミノ酸を、他のアミノ酸へ置換したものであり、入手可能な、塩基配列が既知の遺伝子DNAを鋳型として、下記の実施例に記載する手法に準じて、部位特異的な変異を導入し、組換え発現タンパク質として生産できる。特に、野生型蛍光タンパク質は、何れも組換え発現が可能であり、また、改変部位は、そのタンパク質フォールディングに影響を及ぼすものでなく、野生型蛍光タンパク質が組換え発現可能な宿主において、同様の効率で実際に蛍光を発する成熟型蛍光タンパク質として、生産可能である。
Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質:CpYGFPの三次元構造を決定するため、組換え発現CpYGFPの精製済標品を用いて、結晶化を行い、得られた結晶を利用し、X線結晶構造解析を行った。
国際公開第2005/095599号パンフレットに開示する手法に従って、Chiridius poppei由来のCpYGFPをコードする遺伝子を、市販のプラスミドpET101/D−TOPO(Invitrogen 製)中に挿入し、該CpYGFPを大腸菌内で組換え発現用に利用可能な発現ベクター:pET101−NFPを作製する。
先ず、図7に示す、該CpYGPの組換え発現ベクター:pET101−NFPを用いて、大腸菌を形質転換する。得られた形質転換大腸菌に関して、選択マーカーのAmpicillin耐性遺伝子を用いて、クローン選別を行う。
結晶化は、シッティング・ドロップ蒸気拡散法を用いて行う。リザーバー溶液量100μl、ドロップとして、タンパク質溶液1μlとリザーバー溶液と同じ組成の沈澱剤溶液1μlの混合物をセットする。18℃において、約1週間保持して、ドロップ中の溶媒(水)を減少させ、タンパク質の濃縮を行って、結晶の析出を起こさせる。
組換え発現CpYGFPの結晶について、その対称性と格子定数を確認したところ、空間群 C2221、格子定数 a=113.5Å,b=133.5Å,c=108.7Åであった。
上記の“π−π stacking”が達成されると、二つのπ電子共役系の相互作用が生じ、結果的に、蛍光団のp−hydroxybenzylideneimidazolinone構造による蛍光のピーク波長(蛍光波長)、ならびに、励起スペクトル上で観測されるピーク波長は、“π−π stacking”が達成されない場合と比較して、ともに、長波長側にシフトすると予測される。実際に、52番目のアミノ酸残基を、HisからThrに置換した改変体(H53T)、HisからPheに置換した改変体(H52F)、HisからAspに置換した改変体(H52D)の三種の改変体タンパク質を組換え発現により作製し、その蛍光特性の比較を行った。
国際公開第2005/095599号パンフレットに開示する、Chiridius poppei由来のCpYGFPの組換え発現ベクター:pET101−NFP中に挿入されている、野生型CpYGFPをコードする遺伝子を鋳型として、部位特異的変異導入により、H53T、H52F、H52D改変体タンパク質三種をコードする遺伝子を調製する。
具体的には、PCR用ファワード・プライマーは、
H52Dのポイント・ミューテーション用には、
CpYGFP/H52D UP(30mer)
H52Tのポイント・ミューテーション用には、
CpYGFP/H52T UP(30mer)
H52Fのポイント・ミューテーション用には、
CpYGFP/H52F UP(30mer)
の三種を用い、一方、共通のリバース・プライマーとして、
リバース・プライマー:CpYGFP/LP153(28mer)
を用いた。
リバース・プライマー:SalI−LP1(35mer):
を用いて、塩基長673bpの増幅産物を調製した。
上述の手順で調製、精製した、H53T改変体タンパク質の組換え発現ベクター:pET101−CpYGFP−H53T、H52F改変体タンパク質の組換え発現ベクター:pET101−CpYGFP−H52F、H52D改変体タンパク質の組換え発現ベクター:pET101−CpYGFP−H52Dを利用して、下記の手順に従って、各改変体タンパク質を調製した。
各改変体タンパク質を含む上清を、アニオン交換カラム:HiTrap DEAE(Amersham Biosciences製)にかけ、溶出条件:A buffer 20mM Tris−HCl pH8.0、 B buffer 1M NaCl in A buffer、 直線勾配 0−15% B buffer(0−150mM NaCl濃度)において、1−5% B bufferの画分に該改変体タンパク質を回収した。
次いで、該回収画分を、アフィニフィカラム:HiTrap−phenylカラム(Amersham Biosciences)にかけ、溶出条件:A buffer 50mM Tris−HCl pH8.0、 B buffer 0.7M Na2SO4 in A buffer、 直線勾配 100−0% B buffer(0.7M−0M Na2SO4濃度)において、それぞれ、65%B−38%B(H52T)、62%B−0%B(H52F)、46%B―0%B(H52D)の画分に、該改変体タンパク質三種を回収した。
さらに、該回収画分を、予め、VIVASPIN20 MW10,000cutの条件で、遠心濃縮した。この濃縮サンプルを、ゲル濾過:Superdex 75(Amersham Biosciences製)にかけ、溶出条件:buffer 20mM Tris−HCl pH8.0 0.2M NaClを用いて、波長490nmに吸収を示す画分として、該改変体タンパク質を精製、回収した。なお、回収された画分に含まれるタンパク質のSDS分析を行ったところ、SDS電気泳動上で、分子量24−25kDa程度のバンドを示すタンパク質のみを含むことが確認される。
精製済改変体タンパク質について、25mM Tris−HCl (pH 8.0)、0.1M NaCl中に溶解した溶液サンプルを用いて、蛍光スペクトルと、励起スペクトルの測定を行った。対比のため、野生型CpYGFPについても、前記バッファ溶液中に溶解した溶液サンプルを用いて、蛍光スペクトルと、励起スペクトルの測定を行った。蛍光スペクトルの測定は、室温(25℃)において、日立製蛍光測定装置F−4500を使用して行った。一方、励起スペクトルの測定は、蛍光スペクトル中の極大ピーク波長において、蛍光強度もモニターして行った。
上記の蛍光団に対して、“π−π stacking”を起こすHis52を他のアミノ酸残基で置き換える改変以外に、蛍光団を形成する“GYG”中のTyr56を、Trpで置き換える改変体タンパク質を作製し、極めて興味ある結果を得た。
国際公開第2005/095599号パンフレットに開示する、Chiridius poppei由来のCpYGFPの組換え発現ベクター:pET101−NFP中に挿入されている、野生型CpYGFPをコードする遺伝子を鋳型として、部位特異的変異導入により、蛍光団を形成する“GYG”を“GWG”に置き換えた改変体タンパク質をコードする遺伝子を調製する。
Tyr56をコードするコドンTACを、TrpをコードするコドンTGGに置換するため、下記のプライマーを利用して、PCR法により、DNA断片を作製する。すなわち、PCR用ファワード・プライマーとして、その5’末端に上記のコドン変換を施した、下記のプライマーを使用する。
PCR用ファワード・プライマーは、
Y56Wのポイント・ミューテーション用には、
CpYGFP/Y56W UP(27mer)
一方、リバース・プライマーとして、Tyr56をコードするコドンTACより上流側の部分的塩基配列(塩基番号135−165;下記部分配列)に対して、相補的な塩基配列を有するプライマーを利用する。
すなわち、PCR用リバース・プライマーには、下記の塩基配列を有するCpYGFP LP165(31mer)を用いる。
CpYGFPの組換え発現ベクター:pET101−NFPを鋳型として、上記(II−1)に記載する条件で、該プラスミドの全長に相当する、約6.4kbpのPCR増幅産物を調製した。また、PCR増幅後に行う、
調製されたPCR増幅産物の精製;
精製済み約6.4kbpのPCR増幅産物からライゲーション反応による環状プラスミドの作製;
TOP10 cellの形質転換と、培養によるプラスミドの増幅;
増幅したプラスミドの回収、ならびに、タンパク質コード領域の塩基配列の解析;
以上の各工程も、上記(II−1)に記載する条件、手順に従って実施する。
Tyr56のTrpへの置換に加え、Val194をコードするコドンGTCを、SerをコードするコドンAGCに置換するため、下記のプライマーを利用して、PCR法により、DNA断片を作製する。すなわち、PCR用リバース・プライマーとして、その相補的塩基配列は上記のコドン変換を施したものとなる、下記のプライマーを使用する。
V194Sのポイント・ミューテーション用には、
リバース・プライマーは、
CpYGFP V194S LP(25mer)
を用いて、その相補鎖を用いて翻訳される際に、下記のようなアミノ酸残基の変換がなされる。
一方、ファワード・プライマーは、
CpYGFP UP587(28mer)
を用いて、Val194をコードするコドンGTCの直ぐ下流側の部分的塩基配列(塩基番号587−614部分)に相当する塩基配列を有するプライマーを利用する。
調製されたPCR増幅産物の精製;
精製済み約6.4kbpのPCR増幅産物からライゲーション反応による環状プラスミドの作製;
TOP10 cellの形質転換と、培養によるプラスミドの増幅;
増幅したプラスミドの回収、ならびに、タンパク質コード領域の塩基配列の解析;
以上の各工程も、上記(II−1)に記載する条件、手順に従って実施する。
Tyr56のTrpへの置換、Val194のSerへの置換に加え、Thr136をコードするコドンACGを、AlaをコードするコドンGCCに置換するため、下記のプライマーを利用して、PCR法により、DNA断片を作製する。すなわち、PCR用リバース・プライマーとして、その相補的塩基配列は上記のコドン変換を施したものとなる、下記のプライマーを使用する。
T136Aのポイント・ミューテーション用には、
リバース・プライマーは、
CpYGFP T136A LP(22mer)
を用いて、その相補鎖を用いて翻訳される際に、下記のようなアミノ酸残基の変換がなされる。
一方、ファワード・プライマーは、
CpYGFP UP412(21mer)
を用いて、Asp138をコードするコドンGTCを5’末端とする部分的塩基配列(塩基番号412−432部分)に相当する塩基配列を有するプライマーを利用する。
調製されたPCR増幅産物の精製;
精製済み約6.4kbpのPCR増幅産物からライゲーション反応による環状プラスミドの作製;
TOP10 cellの形質転換と、培養によるプラスミドの増幅;
増幅したプラスミドの回収、ならびに、タンパク質コード領域の塩基配列の解析;
以上の各工程も、上記(II−1)に記載する条件、手順に従って実施する。
リバース・プライマー:SalI−LP1(35mer):
を用いて、塩基長673bpの増幅産物を調製した。
上述の手順で調製、精製した、Y56W改変体タンパク質の組換え発現ベクター:pET101−CpYGFP−Y56W;Y56W,V194S改変体タンパク質の組換え発現ベクター:pET101−CpYGFP−Y56W,V194S;Y56W,V194S,T136A改変体タンパク質の組換え発現ベクター:pET101−CpYGFP−Y56W,V194S,T136Aを利用して、下記の手順に従って、各改変体タンパク質を調製した。
各改変体タンパク質を含む上清を、アニオン交換カラム:HiTrap DEAE(Amersham Biosciences製)にかけ、溶出条件:A buffer 20mM Tris−HCl pH8.0、 B buffer 1M NaCl in A buffer、 直線勾配 0−20% B buffer(0−200mM NaCl濃度)にかけた。
前記のカラム精製済改変体タンパク質について、20mM Tris−HCl pH8.5中に希釈した溶液サンプルを用いて、蛍光スペクトルと、励起スペクトルの測定を行った。蛍光スペクトルの測定は、室温(25℃)において、日立製蛍光測定装置F−4500を使用して行った。一方、励起スペクトルの測定は、蛍光スペクトル中の極大ピーク波長において、蛍光強度をモニターして行った。
Claims (19)
- Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPの改変蛍光タンパク質であって、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、
その52番目のアミノ酸Hisを、
Phe、Tyr、Trpからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である;
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、
Ala、Val、Ile、Leu、Gly、Cys、Met、Ser、Thrからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である;あるいは、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、
Asp、Asn、Glu、Glnからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質。 - 前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、52番目のアミノ酸Hisを、Pheで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Fである
ことを特徴とする請求項1に記載の改変蛍光タンパク質。 - 前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、52番目のアミノ酸Hisを、Thrで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Tである
ことを特徴とする請求項1に記載の改変蛍光タンパク質。 - 前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、52番目のアミノ酸Hisを、Aspで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Dである
ことを特徴とする請求項1に記載の改変蛍光タンパク質。 - Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPと高い相同性を有するPontellina plumata由来のGFP様蛍光タンパク質ppluGFP2の改変蛍光タンパク質であって、
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisに対応する、該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、
その54番目のアミノ酸Hisを、
Phe、Tyr、Trpからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である;
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、
Ala、Val、Ile、Leu、Gly、Cys、Met、Ser、Thrからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である;あるいは、
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、
Asp、Asn、Glu、Glnからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質である
のいずれかである
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質。 - 前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、54番目のアミノ酸Hisを、Pheで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項5に記載の改変蛍光タンパク質。 - 前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、54番目のアミノ酸Hisを、Thrで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項5に記載の改変蛍光タンパク質。 - 前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、54番目のアミノ酸Hisを、Aspで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項5に記載の改変蛍光タンパク質。 - Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPの改変蛍光タンパク質であって、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、
その56番目のアミノ酸Tyrを、
Trpで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、460nm以下の蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56Wである;
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、56番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、194番目のアミノ酸Valを、Serで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、460nm以下の蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56W,V194Sである;あるいは、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、56番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、194番目のアミノ酸Valを、Serで、136番目のアミノ酸Thrを、Alaで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、460nm以下の蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56W,V194S,T136Aである
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質。 - Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPと高い相同性を有するPontellina plumata由来のGFP様蛍光タンパク質ppluGFP2の改変蛍光タンパク質であって、
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、56番目のアミノ酸Tyrに対応する、該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、
その58番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質;
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、58番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、197番目のアミノ酸Valを、Serで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質;あるいは
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、58番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、197番目のアミノ酸Valを、Serで、138番目のアミノ酸Thrを、Alaで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質
のいずれかの改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする改変蛍光タンパク質。 - Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPの蛍光のピーク波長を長波長側あるいは短波長側にシフトさせるための、該蛍光タンパク質の改変方法であって、
該蛍光タンパク質CpYGFPに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、
その52番目のアミノ酸Hisを、
Phe、Tyr、Trpからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質;
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、
Ala、Val、Ile、Leu、Gly、Cys、Met、Ser、Thrからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質;あるいは、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、
Asp、Asn、Glu、Glnからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質
のいずれかである
ことを特徴とする蛍光タンパク質の改変方法。 - 該蛍光タンパク質CpYGFPに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、pheで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Fである
ことを特徴とする請求項11に記載の蛍光タンパク質の改変方法。 - 該蛍光タンパク質CpYGFPに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、Thrで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Tである
ことを特徴とする請求項11に記載の蛍光タンパク質の改変方法。 - 該蛍光タンパク質CpYGFPに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisを、Aspで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−H52Dである
ことを特徴とする請求項11に記載の蛍光タンパク質の改変方法。 - Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPの蛍光のピーク波長を460nm以下の短波長側にシフトさせるための、該蛍光タンパク質の改変方法であって、
該蛍光タンパク質CpYGFPに対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列(配列番号:1)中、
その56番目のアミノ酸Tyrを、
Trpで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、460nmに蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56W;
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、56番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、194番目のアミノ酸Valを、Serで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、460nmに蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56W,V194S;あるいは、
該CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、56番目のアミノ酸Tyrを、Trpで置換し、
さらに、194番目のアミノ酸Valを、Serで、136番目のアミノ酸Thrを、Alaで置換されているアミノ酸配列を有し、該CpYGFPが発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした、459nmに蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質:CpYGFP−Y56W,V194S,T136A
のいずれかである
ことを特徴とする蛍光タンパク質の改変方法。 - Chiridius poppei由来のGFP様蛍光タンパク質CpYGFPと高い相同性を有するPontellina plumata由来のGFP様蛍光タンパク質ppluGFP2の蛍光のピーク波長を長波長側あるいは短波長側にシフトさせるための、該蛍光タンパク質の改変方法であって、
該蛍光タンパク質ppluGFP2に対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記CpYGFPが有する完全長アミノ酸配列中、52番目のアミノ酸Hisに対応する、該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、
その54番目のアミノ酸Hisを、
Phe、Tyr、Trpからなる芳香族アミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、レッド・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質;
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、
Ala、Val、Ile、Leu、Gly、Cys、Met、Ser、Thrからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質;あるいは、
該ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列中、54番目のアミノ酸Hisを、
Asp、Asn、Glu、Glnからなるアミノ酸の群から選択される一つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有し、該ppluGFP2が発する蛍光のピーク波長と比較し、ブルー・シフトした蛍光のピーク波長を示す改変蛍光タンパク質
のいずれかである
ことを特徴とする蛍光タンパク質の改変方法。 - 該蛍光タンパク質ppluGFP2に対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、54番目のアミノ酸Hisを、Pheで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項16に記載の蛍光タンパク質の改変方法。 - 該蛍光タンパク質ppluGFP2に対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、54番目のアミノ酸Hisを、Thrで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項16に記載の蛍光タンパク質の改変方法。 - 該蛍光タンパク質ppluGFP2に対する改変によって作製される改変蛍光タンパク質は、
前記ppluGFP2が有する完全長アミノ酸配列(配列番号:4)中、54番目のアミノ酸Hisを、Aspで置換されているアミノ酸配列を有する改変蛍光タンパク質である
ことを特徴とする請求項16に記載の蛍光タンパク質の改変方法。
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