CN111848767A - 一种湛蓝色荧光蛋白及其构建方法和在蛋白质防晒剂制备中的应用 - Google Patents

一种湛蓝色荧光蛋白及其构建方法和在蛋白质防晒剂制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质构建领域，具体涉及一种湛蓝色荧光蛋白及其构建方法以及它们在蛋白质防晒剂制备中的应用，进一步涉及一种包含该湛蓝色荧光蛋白的防晒剂。一种湛蓝色荧光蛋白，其为以下（a）或（b）的蛋白质：（a）由SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）在（a）的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有湛蓝色荧光蛋白活性的由（a）衍生的蛋白质。湛蓝色荧光蛋白具有pH不敏感性、光稳定性等特性，发色团能够吸收长波长紫外线（UVA）并释放大于400 nm的荧光，同时芳香族氨基酸含量较高（9.2%），能够吸收中波长紫外线（UVB）并释放UVA，UVA可通过能量共振转移进一步被发色团吸收，因此UFP具有开发成为蛋白类防晒剂的可能。

Description

一种湛蓝色荧光蛋白及其构建方法和在蛋白质防晒剂制备中 的应用
技术领域
本发明属于蛋白质构建领域，具体涉及一种湛蓝色荧光蛋白及其构建方法以及它们在蛋白质防晒剂制备中的应用，进一步涉及一种包含该湛蓝色荧光蛋白的防晒剂。
背景技术
上世纪六十年代初，Shimomura首次从水母中分离出绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)，此蛋白在高温下稳定(Tm＝78℃)[1]。荧光蛋白(fluorescentprotein，FP)是一类能被特定波长的紫外线激发产生荧光的蛋白，第65、66、67位氨基酸形成发色团[2]。发色团的光学性质由一个与α-螺旋共价结合并埋藏在β-桶状结构内的三肽(残基65-67)的自催化形成[3]。66位的芳香族氨基酸和咪唑啉酮基团的形成与发色团的缀合及其表现的广谱性质密切相关，将66位氨基酸突变成酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸或组氨酸等芳香族氨基酸会强烈影响光谱[4]。通过GFP-Phe66突变获得了一个蓝色的荧光分子(marine fluorescent protein，UFP，激发峰为355nm、发射峰为424nm)，但它的量子产率较低[5]。进一步突变GFP-Phe66的T65Q、Y145G、H148S、T203V位点后，得到湛蓝色荧光蛋白Sirius，亮度比GFP-Phe66提高25倍[5]，目前该蛋白主要应用在细胞成像[6]、荧光探针[7]等方面。
鉴于紫外线对皮肤的损伤作用[8]，以及人们对紫外线防护意识的逐渐增强，人们需求更加安全、高效的防晒剂，新型防晒剂的研发也成为许多科研工作者的重要研究方向。目前,市场上防晒产品中的防晒剂主要为化学吸收剂和物理屏蔽剂，一些化学吸收剂在长时间光照下,会发生分解反应，产生对人体有害的自由基或中间产物[9,10]，或由于分子量过小渗透进入皮肤[11,12]。物理屏蔽剂主要为TiO2和ZnO，随着纳米防晒剂的发展，该类防晒剂常常制备成直径小于100nm的不溶性颗粒，但许多研究报道，由于这些颗粒过小，易渗透皮肤进入血液对人体造成伤害[13,14]。生物工程类防晒剂(如表皮生长因子、超氧化物歧化酶等)是利用生物工程技术研制出的防晒产品，其防晒效果主要是通过调节皮肤免疫功能,增加细胞活性,抵御及修复辐射损伤,进而加强化学防晒剂的防晒效果,发挥辅助协同的作用，而以蛋白质作为主要防晒剂未见相关报道[8]。
蛋白质中的芳香族氨基酸能够吸收UVB，其中酪氨酸吸收峰在275nm，释放305nm的荧光能被色氨酸(吸收峰为295nm)吸收，释放的荧光在353nm左右。UFP中芳香族氨基酸占比为9.2％，能够吸收一定的UVB，并释放UVA荧光，而UFP中的发色团(吸收峰为355nm)可通过能量共振转移吸收释放的荧光(图1)。因此，UFP理论上可吸收UVA及UVB紫外线，并释放大于400nm对人体无伤害的荧光。为探索蛋白防晒剂，通过原核表达、亲和层析纯化了UFP；为提高其纯化效率，建立了加热处理结合有机溶剂萃取法纯化荧光蛋白；为检测其吸收紫外线能力，利用大肠杆菌高表达UFP观察其抗紫外线能力，也通过紫外吸收光谱及UFP荧光光谱分析了其光学特性；为探索其对细胞的毒理性，进行了MTT法分析不同浓度蛋白对细胞株TL-OML生长的影响。该研究为进一步探讨UFP作为防晒剂的可行性，研制安全、广谱的防晒产品奠定了良好的基础。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种湛蓝色荧光蛋白，第二个目的是提供编码上述湛蓝色蛋白质的基因，第三个目的是提供一种构建上述湛蓝色蛋白质的方法，第四个目的是提供上述湛蓝色蛋白质的应用。
进一步，本申请另外还提供了一种湛蓝色荧光蛋白，其为以下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有湛蓝色荧光蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。
进一步，本申请另外还提供了一种编码上述湛蓝色荧光蛋白的基因。
优选，该基因的核苷酸序列为SEQ ID：NO.1所示的DNA分子。
进一步，本申请另外还提供了一种载体，包含所述的基因。
进一步，本申请另外还提供了一种转化体，包含所述的载体。
进一步，本申请另外还提供了一种构建上述湛蓝色荧光蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
1)利用PCR定点突变的方法获得DNA分子：根据F46L、T65Q、W66F、Q69L、Y145G、H148S及T203V位点，以pETCFP-Cl为模板，利用突变引物进行PCR定点突变；
2)所获DNA分子转化至DH5α，挑菌测序后获得突变基因UFP；
3)pETUFP-Cl和表达载体pET-24a及pHND，分别经限制性内切酶BamH I/EcoR I双酶切后，连接构建pET-24a-UFP和pHND-UFP表达载体，用于表达UFP；
4)将突变质粒转化至BL21(DE3)，接种过夜培养的菌液于液体培养基中培养，收集菌体；
5)取裂解液，悬浮菌体，混合均匀后，冰浴超声波破碎菌体，离心收集上清；
6)上清加热处理，进行有机溶剂萃取后透析除去杂质，利用3kD超滤管低速离心浓缩蛋白，根据Bradford法测定UFP蛋白浓度。
进一步，本申请另外还提供了所述方法中的突变引物序列；突变引物PCR序列下所述：
F46L-F：GACCCTGAAGCTGATCTGCACCACCG
F46L-R：CGGTGGTGCAGATCAGCTTCAGGGTC
T65Q-W66F-F：GTGACCACCCTGCAGTTTGGCGTGCAGTGC
T65Q-W66F-R：GAAGCACTGCACGCCAAACTGCAGGGTGGTCACGAG
Q69L-F：GTTTGGCGTGCTGTGCTTCAGCC
Q69L-R：GGCTGAAGCACAGCACGCCAAAC
Y145G-H148S-F：GCTGGAGTACAACGGCATCAGCAGCAACGTCTATATCACC
Y145G-H148S-R：GGTGATATAGACGTTGCTGCTGATGCCGTTGTACTCCAGCTTG
T203V-F：CCACTACCTGAGCGTGCAGTCCGCC
T203V-R：GCTCAGGGCGGACTGCACGCTCAGGTAGTGGTTG。
进一步，本申请另外还提供了所述湛蓝色荧光蛋白在制备蛋白质防晒剂中的应用。
进一步，本申请另外还提供了一种蛋白质防晒剂，其包括所述的湛蓝色荧光蛋白质。
本申请由于采用了上述的技术方案，提供的湛蓝色荧光蛋白(ultramarinefluorescent protein，UFP)具有pH不敏感性、光稳定性等特性，发色团能够吸收长波长紫外线(UVA)并释放大于400nm的荧光，同时芳香族氨基酸含量较高(9.2％)，能够吸收中波长紫外线(UVB)并释放UVA，UVA可通过能量共振转移进一步被发色团吸收，因此UFP具有开发成为蛋白类防晒剂的可能。通过PCR定点突变、原核表达、亲和层析纯化获得UFP；利用加热处理并结合有机溶剂萃取建立了快速纯化荧光蛋白的方法；通过相应光谱及紫外线照射大肠杆菌存活实验初步分析了UFP吸收紫外线的能力；采用MTT法分析了UFP对细胞的毒理性。结果表明，将菌体破碎上清液进行70℃加热10min后结合有机溶剂萃取可快速纯化UFP(纯度>94.7％)，该方法也适用其它的荧光蛋白；紫外吸收光谱表明，UFP对250～400nm波长的紫外线都有一定的吸收，吸收峰位于吸收峰位于280nm(εmax280为3.27×104M-1·cm-1)和365nm(εmax365为1.54×104M-1·cm-1)；荧光光谱表明，UFP将250～400nm波长的紫外线吸收后释放的荧光大于400nm；紫外线照射大肠杆菌存活实验表明，在大肠杆菌内表达UFP可提高菌株抗紫外线的能力；MTT法毒理性分析表明，UFP(浓度<5μM)对TL–OML细胞株基本没有毒性。UFP性质稳定，具有UVB、UVA吸收能力，对细胞没有毒害作用，可作为广谱防晒剂进行应用，该结果对深入探讨利用蛋白研制防晒剂奠定了一定的基础。
附图说明
图1.简示湛蓝色荧光蛋白结构及其吸收紫外线的原理。湛蓝色荧光蛋白(UFP)的荧光色团(图中蓝色基团)可吸收UVA区段紫外线，且最大吸收峰为365nm，释放荧光波长大于400nm；芳香族氨基酸(红色标记氨基酸)可吸收UVB区段紫外线，且其释放的荧光位于310-350nm，可被UFP荧光色团吸收(它们之间的距离小于10nm，在FRET作用的范围之内)。此蛋白将具有吸收UVA和UVB的效果。
图2.Hal2-UFP融合蛋白纯化及酶切结果电泳图(M.蛋白Marker；1.PAP柱纯化Hal2-UFP样品；2.酶切后样品；3.酶切后去标签样品)。
图3.有机溶剂萃取与加热结合有机溶剂萃取UFP效果比较(M.蛋白Marker；1.诱前；2.诱后；3.上清；4.乙醇萃取后乙醇层样品；5.正丁醇萃取后水层样品；6.上清经加热处理；7.加热处理后乙醇萃取中乙醇层样品；8.加热处理后正丁醇萃取中水层样品)。
图4.加热结合有机溶剂萃取纯化不同荧光蛋白电泳图(M.蛋白Marker；1.RFP加热萃取后纯化样品；2.RFP破碎上清；3.CFP加热萃取后纯化样品；4.CFP破碎上清；5.YFP加热萃取后纯化样品；6.YFP破碎上清；7.GFP加热萃取后纯化样品；8.GFP破碎上清)
图5.E.coli表达UFP后抗紫外线结果图。
图6.UFP的紫外吸收图谱。
图7.Hal2-UFP及UFP荧光谱图。A.280nm激发波长下Hal2-UFP和UFP的荧光图谱。b为UFP，a为Hal2-UFP。B.UFP在不同激发波长下的荧光图谱。a到g依次为370，320，330，340，360，350，365nm。
图8.不同浓度、不同时间UFP2对细胞生存能力的影响。显示数据为平均值±标准差(n＝3)。
具体实施方式
1 材料和方法
1.1 材料
E.coli DH5α、BL21(DE3)感受态细胞、含ECFP(enhanced cyan fluorescentprotein,ECFP)基因的载体pETCFP-Cl购自长沙赢润生物技术公司、pHND载体(含Hal2标签)[15]及pET-24a(+)载体均由实验室保存；限制性核酸内切酶、DpnI、PCR相关试剂、T4DNA Ligase等购自宝生物工程(大连)有限公司；IPTG、EDTA、氨苄青霉素，卡纳霉素、酵母提取物、胰蛋白胨均购自Oxoid LTD(Hampshire，England)；DTT、溶菌酶、Pepstatin A购自Amresco公司；PMSF、EGTA为BBI产品；Ni-NTA His-Bind Superflow Resin购自Novagen公司；PAP Agarose购自Sigma公司；超滤管购自Millipore公司。其他常规生化试剂均购自国内公司分析纯。
1.2 ECFP基因突变引物
根据已知的基因序列，用primer premier 5.0设计引物，并由上海赛百盛生物有限公司合成，所用引物见表1。
表1本研究引物列表
Figure BDA0002572295830000051
Note:Underlined were mutation sites.
1.3 方法
1.3.1 ECFP基因定点突变
以pETCFP-Cl为模板，利用表1所列突变引物进行PCR定点突变，方法参照文献[16]。PCR产物经DpnI(终浓度为1U/μL)37℃消化模板3h后，用热激法将产物转化至DH5α。挑菌测序，获得F46L、T65Q、W66F、Q69L、Y145G、H148S及T203V位点突变基因UFP(pETUFP-Cl)。
1.3.2 UFP表达载体的构建
pETUFP-Cl通过双酶切(BamH I、EcoR I)及割胶回收获得UFP片段，同时将表达载体pET-24a和pHND进行相应的双酶切获得线性载体，两者经16℃连接过夜，将连接产物转化至BL21(DE3)，获得pET-24a-UFP和pHND-UFP表达菌株。
1.3.3 分析表达UFP的E.coli抗紫外线能力
挑取单菌落pET-24a-RFP和pET-24a-UFP至含有3mL培养基的试管中，37℃，220rpm培养过夜，分别转移至两瓶100mL液体培养基中扩大培养至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度0.5mM(另一瓶不加作为对照组)，诱导2h，取样稀释至OD600为0.55～0.65，经梯度稀释至1000个细菌每毫升，取100μL菌液涂平板后在紫外灯下(UVB，功率15～20W，照射距离为56cm)照射0，10，20，30，40，50，60s，过夜后计数，计算存活率。
1.3.4 蛋白表达与纯化
挑取pHND-UFP表达菌株单菌落至含3mL培养基(含Kana抗性)的试管中，37℃，220rpm培养过夜。将培养液转移至500mL培养基中扩大培养，培养OD600至0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，相同条件诱导3h后，收集菌体进行蛋白纯化。pHND载体纯化具体步骤参照文献[15,17]，纯化后透析获得的蛋白样品利用3kD超滤管低速离心浓缩蛋白。Hal2-UFP及UFP蛋白浓度根据Bradford法[18]测定。
1.3.5 加热结合有机溶剂提取荧光蛋白
荧光蛋白具有耐热、对pH及有机溶剂不敏感等特性，因此结合实际应用，增加UFP纯化效率，探索了加热处理结合有机溶剂萃取的纯化方法。首先，挑取单菌落pET-24a-UFP表达菌株至含3mL培养基的试管中，过夜培养后，转移至500mL的培养基中扩大培养，条件及诱导方法同步骤1.3.4。诱导3h后，收集菌体，加入50mL裂解液(50mMHepes，0.3M NaCl，溶菌酶)吹打悬浮菌体，4℃静置30min后，进行菌体破碎(超声或反复冻融)，1 4000×g离心30min得破碎上清。将上清进行加热处理，在不同温度(55，60，65，70，75℃)及不同时间(5，10，20，40min)下探索最佳处理条件。加热后，12000×g离心10min，取上清进行蛋白电泳，利用软件Visionworks中Area Density计算灰度，选取处理温度及时间。加热处理的样品进一步参照文献[19]进行有机溶剂萃取，萃取后的样品进行透析除去残余有机溶剂及小分子杂质，根据1.3.4步骤方法进行蛋白浓缩及浓度测定。
1.3.6 细胞毒理性分析
取浓缩后的蛋白样品配制成50μM蛋白溶液，并用0.22μm PVDF过滤除菌。在96孔板中，设置0.1，0.5，1.0，5.0μM四个蛋白浓度梯度处理白血病细胞株TL-OML，并设有一空白对照，5％CO2，37℃条件下分别培养24，48，72h。在培养不同时间段后的孔板中加入10μL/孔的MTT溶液，孵育3h后加入等量裂解液裂解细胞，用酶标仪测定OD595。记录每组数据并绘制不同浓度下不同时间段蛋白样品对细胞生长的影响图，分析UFP对细胞生存能力的影响。
1.3.7 光谱分析
利用安捷伦Cary 4000紫外-可见-近红外分光光度计的Scan程序，测定亲和层析纯化的UFP溶液(浓度为74.0μM)在250～550nm处的吸光值。
利用安捷伦Cary Eclipse荧光分光光度计Scan程序，检测并比较相同浓度(4.5μM)的UFP及Hal2-UFP两种蛋白在280nm激发波长下的发射波长。用相同方法，分析UFP蛋白溶液的发射峰在不同激发波长(320，330，340，350，360，365，370nm)下的变化。
2 结果分析
2.1 蛋白纯化结果
参照文献[15]方法，通过PAP琼脂柱纯化Hal2-UFP融合蛋白，再通过HRV 3CProtease酶切融合蛋白，酶切样品再次利用PAP琼脂柱除去Hal2标签，获得UFP蛋白，纯化结果见图2。
虽然通过亲和层析纯化能够获得一定纯度及含量的UFP，但对于实际应用中，存在操作复杂、成本高及周期长等缺点。为提高UFP纯化效率，采用报道的有机溶剂提取荧光蛋白方法[19]，该方法虽然具有周期短、操作简便等优点，但纯化的样品纯度有限，需进一步进行纯化(图3条带5)。荧光蛋白具有热稳定性，因此探索了不同温度及不同时间处理破碎上清纯化UFP的条件，结果表明70℃处理10min效果较好。将热处理与有机溶剂萃取相结合可建立纯化高纯度UFP的方法(图3条带8)，该方法也适合于其他荧光蛋白的纯化(图4，表2)。此外，纯化的样品含有残余有机溶剂及其他小分子杂质，需通过透析或超滤等方法除去。
表2加热结合萃取法纯化不同荧光蛋白效果
Figure BDA0002572295830000071
注：数值为至少两次独立纯化的平均值。
a总蛋白浓度根据Bradford方法测定。
b目的蛋白纯度利用软件Visionworks中Area Density计算灰度求得。
2.2 表达UFP提高E.coli抗紫外线能力的结果
为探究UFP吸收UVB的能力，在E.coli中高表达UFP，观察E.coli在紫外线照射下存活能力的变化。结果如图5所示，表明在E.coli中不表达蛋白质时，紫外线照射40s前存活率显著下降，照射60s后，细菌不存活；表达RFP后，由于蛋白质中色氨基酸及酪氨酸对UVB具有一定的吸收，因此E.coli的存活率显著增加，照射60s时具有6.2％的存活率；表达UFP后，紫外线照射60s内，细菌存活率进一步提升，表明UFP的发色团具有较好的UVB吸收能力。
含有UFP及RFP基因的E.coli培养后，分为两组，一组加IPTG诱导2h，一组不加IPTG培养2h，培养后的样品经梯度稀释，涂布在含抗性的平板中，经紫外灯照射不同时间，过夜培养后计数(UVB，功率15～20W，照射距离为56cm)，显示数据为平均值±标准差(n＝3)。
2.3 UFP蛋白光谱分析
通过PAP琼脂糖凝胶柱纯化了UFP，利用紫外分光光度计检测其在紫外线范围内的吸收能力。结果表明，UFP对250～400nm紫外线都有一定的吸收，并在280nm和360nm处有两个吸收峰(图6)。根据郎伯(Lambert)定律：A＝Kcd(其中A为吸光度，K为消光系数，c为蛋白样品浓度，d为光程)计算了两个峰值对应的消光系数，与一些已测定消光系数的防晒剂比较表明，UFP无论是λ1还是λ2的消光系数都高于比较的防晒剂(表3)。此结果表明该蛋白具有防晒剂的一般特性，能够吸收UVA及UVB，且效果较好。
表3各防晒剂消光系数
Figure BDA0002572295830000081
利用荧光分光光度计分析Hal2-UFP及UFP融合蛋白荧光特性，结果表明，280nm光线激发相同浓度UFP和Hal2-UFP时，Hal2-UFP产生325nm和436nm两个发射峰，而UFP2只产生了435nm发射峰(图7A)。证明了UFP的芳香族氨基酸被280nm激发所产生的荧光(300-400nm)可以被其自身发色团吸收，而融合蛋白中Hal2被280nm激发所产生的荧光，由于Hal2与UFP发色团的距离不满足FRET条件[20]，无法被发色团进一步吸收。在进一步分析UFP荧光特性时，用320-370nm波长激发，其发射峰都在425nm左右，表明UVA激发UFP发色团产生的荧光大于400nm，对皮肤伤害小(图7B)。
2.4 UFP2对细胞毒理性分析
为分析UFP的毒理性，用MTT法检测了UFP对细胞株TL-OML生长的影响。结果表明，不同浓度UFP样品处理细胞，培养24h及48h后的存活情况差异不显著(P>0.05)。而在5.0μM浓度下，培养72h后细胞生长有所影响，培养48h前没有影响。
3 讨论和展望
荧光蛋白是一类能被特定波长光线激发产生荧光的蛋白，分子质量约27kDa，在残基65-67间自催化形成发色团[21]。荧光蛋白具有桶状结构，性质稳定，可以抵抗多种变性剂，如绝大多数的蛋白酶、高浓度的盐(8M的尿素)等，同时具有pH非依赖性、热稳定性(Tm＝78℃)等。基于对荧光蛋白晶体结构的深入研究，人们通过突变获得了许多不同荧光性质荧光蛋白。UFP是由ECFP通过七个位点突变而来，其发色团吸收的峰值在UVA，而蛋白质中含有的芳香族氨基酸能够吸收UVB并释放UVA，由此通过能量共振转移可通过芳香族氨基酸及发色团吸收UVA及UVB，释放大于400nm的荧光(图1)。综上述，本研究利用UFP探讨了利用蛋白吸收紫外线作为防晒剂的可行性。
通过紫外光谱分析和荧光光谱分析表明，UFP能吸收250～400nm的紫外线，其中320～400nm的紫外线直接转化为425nm左右的荧光；比较UFP与Hal2-UFP在280nm激发下产生的荧光可表明，250～320nm的紫外线先转化为325nm左右的荧光，再经UFP吸收转化为超过400nm荧光。在上述过程中多余能量都以热量形式释放。由此，验证了UFP吸收UVA和UVB的良好效果。同时，大肠杆菌高表达UFP后，增加了其对UVB的抗性，进一步表明UFP作为防晒剂的可行性。目前，荧光蛋白纯化方法多样，如机萃取法[19,22]、三相分离法[23,24]、疏水层析[25]等，但UFP实际应用于防晒剂，这些方法的纯化效率有待提高。通过加热处理，可初步纯化荧光蛋白，但效果不明显，结合有机溶剂萃取后，其纯度及产量显著提高。为进一步明确UFP的安全性，我们用MTT法进行了细胞毒理性实验。结果表明此蛋白(<5M)对白血病细胞基本没有毒性，初步说明UFP蛋白的安全性，同时UFP分子量在27kDa左右，性质稳定，不会出现渗透皮肤或产生分解反应。综上几个方面可以初步明确该蛋白可作为生物类广谱防晒剂。
此工作为深入探讨和研究蛋白质作为防晒剂奠定了良好的基础。作为一类防晒剂使用，我们尚需进一步按照最新颁布的《化妆品卫生规范》进行各项指标测定；继续深入研究和挖掘该蛋白或该类蛋白应用于防晒剂的潜在可能性。
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<110> 浙江师范大学
<120> 一种湛蓝色荧光蛋白及其构建方法和在蛋白质防晒剂制备中的应用
<141> 2020-06-30
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 水母(jellyfish)
<400> 1
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgtgagcaa gggcgaggag 60
ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacagg 120
ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagctg 180
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgcagttt 240
ggcgtgctgt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 300
gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgt accatcttct tcaaggacga cggcaactac 360
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 420
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caacggcatc 480
agcagcaacg tctatatcac cgccgacaag cagaagaacg gcatcaaggc ccacttcaag 540
atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 600
cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcgt gcagtccgcc 660
ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 720
gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtga 759
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> 水母(jellyfish)
<400> 2
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Val Ser
1 5 10 15
Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu
20 25 30
Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu
35 40 45
Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr
50 55 60
Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gln Phe
65 70 75 80
Gly Val Leu Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp
85 90 95
Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe
115 120 125
Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
130 135 140
Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Ile
145 150 155 160
Ser Ser Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
165 170 175
Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu
180 185 190
Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu
195 200 205
Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Val Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp
210 215 220
Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala
225 230 235 240
Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
245 250
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaccctgaag ctgatctgca ccaccg 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggtggtgca gatcagcttc agggtc 26
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgaccaccc tgcagtttgg cgtgcagtgc 30
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagcactgc acgccaaact gcagggtggt cacgag 36
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtttggcgtg ctgtgcttca gcc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggctgaagca cagcacgcca aac 23
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctggagtac aacggcatca gcagcaacgt ctatatcacc 40
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtgatatag acgttgctgc tgatgccgtt gtactccagc ttg 43
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccactacctg agcgtgcagt ccgcc 25
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctcagggcg gactgcacgc tcaggtagtg gttg 34

Claims (10)

1.一种湛蓝色荧光蛋白，其为以下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）在（a）的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有湛蓝色荧光蛋白活性的由（a）衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为SEQ ID：NO.1。
4.一种载体，包含权利要求2或3所述的基因。
5.一种转化体，包含权利要求4所述的载体。
6.一种构建权利要求1所述的湛蓝色荧光蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1）利用PCR定点突变的方法获得DNA分子：根据F46L、T65Q、W66F、Q69L、Y145G、H148S及T203V位点，以pETCFP-Cl为模板，利用突变引物进行PCR定点突变；
2）所获DNA分子转化至DH5α，挑菌测序后获得突变基因UFP；
3）pETUFP-Cl和表达载体pET-24a及pHND，分别经限制性内切酶BamH I/EcoR I双酶切后，连接构建pET-24a-UFP和pHND-UFP表达载体，用于表达UFP；
4）将突变质粒转化至BL21（DE3），接种过夜培养的菌液于液体培养基中培养，收集菌体；
5）取裂解液，悬浮菌体，混合均匀后，冰浴超声波破碎菌体，离心收集上清；
6）上清加热处理，进行有机溶剂萃取后透析除去杂质，利用3 kD超滤管低速离心浓缩蛋白，根据Bradford法测定UFP蛋白浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1）的突变引物PCR序列如下所述：
F46L-F：GACCCTGAAGCTGATCTGCACCACCG
F46L-R：CGGTGGTGCAGATCAGCTTCAGGGTC
T65Q-W66F-F：GTGACCACCCTGCAGTTTGGCGTGCAGTGC
T65Q-W66F-R：GAAGCACTGCACGCCAAACTGCAGGGTGGTCACGAG
Q69L-F：GTTTGGCGTGCTGTGCTTCAGCC
Q69L-R：GGCTGAAGCACAGCACGCCAAAC
Y145G-H148S-F ：GCTGGAGTACAACGGCATCAGCAGCAACGTCTATATCACC
Y145G-H148S-R ：GGTGATATAGACGTTGCTGCTGATGCCGTTGTACTCCAGCTTG
T203V-F：CCACTACCTGAGCGTGCAGTCCGCC
T203V-R：GCTCAGGGCGGACTGCACGCTCAGGTAGTGGTTG。
8.用于权利要求4所述方法中的突变引物序列；突变引物PCR序列如下所述：
F46L-F：GACCCTGAAGCTGATCTGCACCACCG
F46L-R：CGGTGGTGCAGATCAGCTTCAGGGTC
T65Q-W66F-F：GTGACCACCCTGCAGTTTGGCGTGCAGTGC
T65Q-W66F-R：GAAGCACTGCACGCCAAACTGCAGGGTGGTCACGAG
Q69L-F：GTTTGGCGTGCTGTGCTTCAGCC
Q69L-R：GGCTGAAGCACAGCACGCCAAAC
Y145G-H148S-F ：GCTGGAGTACAACGGCATCAGCAGCAACGTCTATATCACC
Y145G-H148S-R ：GGTGATATAGACGTTGCTGCTGATGCCGTTGTACTCCAGCTTG
T203V-F：CCACTACCTGAGCGTGCAGTCCGCC
T203V-R：GCTCAGGGCGGACTGCACGCTCAGGTAGTGGTTG。
9.权利要求1所述湛蓝色荧光蛋白在制备蛋白质防晒剂中的应用。
10.一种蛋白质防晒剂，其包括权利要求1所述的湛蓝色荧光蛋白质。
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