CN111040037A - 一种近红外荧光蛋白与rgd多肽的融合蛋白、基因、载体和应用 - Google Patents

一种近红外荧光蛋白与rgd多肽的融合蛋白、基因、载体和应用 Download PDF

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fusion protein
glu
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Abstract

本发明公开了一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白、基因、载体和应用，所述融合蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明的近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白具备红色荧光蛋白的荧光特性和RGD多肽对肿瘤细胞的特异性识别，可以特异性识别肿瘤细胞表面过表达的整合素，利用发出近红外光，从而使其能够精确成像定位活体内的肿瘤细胞和组织。本发明的融合蛋白生物毒性低，易被生物体代谢，能够在细胞和活体水平对肿瘤细胞进行成像。

Description

一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白、基因、载体和 应用
技术领域
本发明涉及生物医学光学与分子影像技术领域，特别涉及一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白、基因、载体和应用。
背景技术
荧光成像具有方便直观，价格低廉，标记靶点多样等优点，在细胞和活体成像领域应用广泛。荧光成像探针是实现荧光成像的基础，广泛使用的荧光成像探针有绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白及其它荧光报告基团，还有荧光染料、量子点、贵金属纳米簇、碳点等，然而荧光成像探针潜在的生物毒性问题一直受到广泛关注。
荧光蛋白作为一类能够发光的蛋白质，可以通过人为的设计基因调控使其在特定的时间和空间上进行表达，同时它能够通过基因工程手段与其它的蛋白质形成融合蛋白，可在空间和时间分辨率内对生物体进行成像研究。常用的荧光蛋白的激发和发射波长较短，应用于活体内成像研究时，由于组织穿透能力低，导致成像效率低、成像效果差等问题。而近红外荧光蛋白由于其激发和发射的波长相对较长(600nm以上)，因此，它可以很好的避免上述问题，得到更广泛的应用。
现有的近红外荧光蛋白除呈二聚体或四聚体外，也有经过人工改造得到的单体，与其他蛋白质的融合性能较好，有利于检测蛋白间的相互作用；此外，近红外荧光蛋白具有较高的量子产率，因而有成像效果好，清晰度高，敏感性强等优点。
但是，近红外荧光蛋白本身只有荧光的功能，单独应用于活体内成像时，不能特异性地识别特定的细胞或组织，无法发挥光学探针的作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种编码近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白基因。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述基因的载体。
本发明的第四个目的是提供含有上述载体的宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白在制备诊断肿瘤荧光探针的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
编码一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白基因，所述基因的核苷酸序列用SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
含有上述基因的载体。
含有上述载体的宿主细胞。
近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白在制备诊断肿瘤荧光探针的应用。
本发明的优点：
本发明的近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白具备红色荧光蛋白的荧光特性和RGD多肽对肿瘤细胞的特异性识别，可以特异性识别肿瘤细胞表面过表达的整合素，利用发出近红外光，从而使其能够精确成像定位活体内的肿瘤细胞和组织。本发明的融合蛋白生物毒性低，易被生物体代谢，能够在细胞和活体水平对肿瘤细胞进行成像。
附图说明
图1为含有编码近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白基因的载体pRSET-(RGD)n-mRFP1的示意图。(其中n＝1，3，5)
图2为几种融合蛋白的SDS-PAGE电泳胶图，泳道M为蛋白质标准，泳道1为红色荧光蛋白mRFP1，泳道2-4为红色荧光蛋白和不同数量RGD多肽的融合蛋白，其具体序列如实施例1-3所描述。
图3为图2中几种融合蛋白的激发和发射光谱图。其中图3a为几种融合蛋白的激发光谱图，图3b为几种融合蛋白的发射光谱图。
图4为融合蛋白pRSET-(RGD)5-mRFP1对细胞的毒性检测实验结果。
图5为融合蛋白pRSET-(RGD)5-mRFP1活体成像实验结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1
第一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白pRSET-(RGD)1-mRFP1，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码第一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白基因，该基因的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.1中第5-18个氨基酸为RGD多肽，第23-247个氨基酸为近红外荧光蛋白mRFP1，第248-253个氨基酸为组氨酸标签，用于分离纯化。
第一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白，用下述方法制备：
(1)通过PCR方法获得SEQ ID NO.4所示的核酸序列，将该核酸序列连接至表达载体pRSET(商品)上，并转化克隆感受态细胞(BL21(DE3))(商品)，并涂布培养。培养基为LB培养基。
(2)挑取单菌落，接种培养，然后测序，取测序正确的单克隆继续培养。
(3)提取质粒并转化表达感受态细胞(BL21(DE3))，并涂布培养。
(4)扩大培养，对细菌进行离心、破碎、纯化(见实施例4)，得到第一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白pRSET-(RGD)1-mRFP1，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。见图1。
实施例2
第二种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白pRSET-(RGD)3-mRFP1，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码第二种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白基因，该基因的核苷酸序列用SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.2中第5-46个氨基酸为连续3组RGD多肽，第51-275个氨基酸为近红外荧光蛋白mRFP1，第276-281个氨基酸为组氨酸标签，用于分离纯化。
第二种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白，用下述方法制备：
(1)通过PCR方法获得SEQ ID NO.5所示的核酸序列，将该核酸序列连接至表达载体pRSET(商品)上，并转化感受态细胞(BL21(DE3))，并涂布培养。
(2)挑取单菌落，接种培养，然后测序，取测序正确的单克隆继续培养。
(3)提取质粒并转化表达感受态细胞BL21(DE3)，并涂布培养。
(4)扩大培养，对细菌进行离心、破碎、纯化(见实施例4)，得到第二种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白pRSET-(RGD)3-mRFP1，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。见图1。
实施例3
第三种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白pRSET-(RGD)5-mRFP1，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
编码第三种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白基因，该基因的核苷酸序列用SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.2中第5-74个氨基酸为连续5组RGD多肽，第79-303个氨基酸为近红外荧光蛋白mRFP1，第304-309个氨基酸为组氨酸标签，用于分离纯化。
第三种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白，用下述方法制备：
(1)通过PCR方法获得SEQ ID NO.6所示的核酸序列，将该核酸序列连接至表达载体pRSET上，并转化克隆感受态细胞(BL21(DE3))，并涂布培养。
(2)挑取单菌落，接种培养，然后测序，取测序正确的单克隆继续培养。
(3)提取质粒并转化表达感受态细胞BL21(DE3)，并涂布培养。
(4)扩大培养，对细菌进行离心、破碎、纯化(见实施例4)，得到第三种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白pRSET-(RGD)5-mRFP1，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。见图1。
实施例4
本实施例提供的纯化蛋白质的方式为金属螯合亲和层析法。
各实施例获得的细菌破碎后，12000rpm离心20min，得到的上清液过0.45μm滤膜除去可能存在的不溶性杂质后的滤液加入到镍柱中。镍离子与目标蛋白上修饰的组氨酸标签特异性结合。在上样后带有组氨酸标签的融合蛋白特异性结合到柱子上，其他未结合的杂蛋白流出，然后用漂洗缓冲液冲洗(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，20mM imidazole，10mMTris-HCl，pH 8.0)，当测得流出液的A280浓度小于0.01mg/mL时，用洗脱缓冲液(300mMNaCl，50mM NaH2PO4，250mM imidazole，10mM Tris-HCl，pH 8.0)洗脱蛋白，收集洗脱下来的蛋白，透析或超滤除去咪唑等盐离子，用真空冷冻干燥机冻干后，-80℃保存。
对蛋白荧光性质的表征见图3。
实施例5
实施例3制备的近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白在制备诊断肿瘤荧光探针的应用：
将纯化后的融合蛋白pRSET-(RGD)5-mRFP1尾静脉注射到荷瘤小鼠体(BALB/L雌性裸鼠，体重为16-18g)内，监测到在注射后3h肿瘤部位成像效果最好。见图4和图5
实验证明，实施例1,2制备的近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白在对荷瘤小鼠监测到在注射后3h肿瘤部位成像效果好。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白、基因、载体和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Leu Met Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Met Ala Leu Glu Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu
20 25 30
Phe Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu
35 40 45
Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln
50 55 60
Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp
65 70 75 80
Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys
85 90 95
His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly
100 105 110
Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr
115 120 125
Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val
130 135 140
Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys
145 150 155 160
Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp
165 170 175
Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly
180 185 190
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195 200 205
Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Lys Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr
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Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu
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Gly Arg His Ser Thr Gly Ala His His His His His His
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Leu Met Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala
35 40 45
Leu Glu Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe
50 55 60
Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu
65 70 75 80
Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu
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100 105 110
Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp
115 120 125
Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu
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Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp
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Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp
35 40 45
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50 55 60
Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Leu Glu Met Ala
65 70 75 80
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Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln
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Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr
145 150 155 160
Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn
165 170 175
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Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro
195 200 205
Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser
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Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys
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Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys
245 250 255
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Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile
275 280 285
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His His His His His
305
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 843
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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tgtcgcggag attgcttctg cggtggaggc gggtcttgcg attgtcgcgg agattgcttc 120
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ggtgttgtta ccgttaccca ggactcctcc ctgcaagacg gtgagttcat ctacaaagtt 600
aaactgcgtg gtaccaactt cccgtccgac ggtccggtta tgcagaaaaa aaccatgggt 660
tgggaagctt ccaccgaacg tatgtacccg gaagacggtg ctctgaaagg tgaaatcaaa 720
atgcgtctga aactgaaaga cggtggtcac tacgacgctg aagttaaaac cacctacatg 780
gctaaaaaac cggttcagct gccgggtgct tacaaaaccg acatcaaact ggacatcacc 840
tcccacaacg aagactacac catcgttgaa cagtacgaac gtgctgaagg tcgtcactcc 900
accggtgctc atcaccatca ccatcac 927

Claims (5)

1.一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白，其特征是所述融合蛋白的氨基酸序列SEQID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1的一种近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白基因，其特征是所述基因的核苷酸序列用SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.含有权利要求3所述载体的宿主细胞。
5.权利要求1的近红外荧光蛋白与RGD多肽的融合蛋白在制备诊断肿瘤荧光探针的应用。
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