KR19980703238A

KR19980703238A - 답즙산염-자극 리파제(ｂｓｓｌ)의 발현을 위한 ｄｎａ 분자

Info

Publication number: KR19980703238A
Application number: KR1019970706642A
Authority: KR
Inventors: 고우탐 다스
Original assignee: 클래스빌헬름슨; 아스트라악티에볼라그
Priority date: 1995-03-23
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 1998-10-15
Also published as: IL118335A0; AU5165696A; WO1996037622A1; SE9501939D0; EE9700321A; HUP9802388A2; JP2000510683A; EP0832257A1; TR199701010T1; PL322848A1; CZ297397A3; TW434314B; CN1185812A; RU2157847C2; HUP9802388A3

Abstract

본 발명은 메틸 요구주 효모인 피키아 파스토리스 내에서의 담즙산염-자극 리파제 (BSSL) 발현 방법에 사용하기 위한 DNA 분자, 재조합 벡터 및 세포 배양액에 관한 것이다.

DNA 분자는 (a) 인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체인 폴리펩티드 코딩 영역; (b) 상기 폴리펩티드 코딩 영역의 5'-말단에 연결된, (a), (b) 및 (c)를 포함하는 DNA 분자로 형질전환된 피키아 파스토리스 세포로부터 상기 폴리펩티드의 분비를 지시할 수 있는 신호 펩티드의 코딩 영역; 및 (c) 상기 (a) 및 (b)에서 정의된 상기 코딩 영역에 조작가능하게 연결된, 피키아 파스토리스의 메탄올 옥시다제 프로모터 또는 기능상 균등한 프로모터를 포함한다.

Description

답즙산염-자극 리파제(ＢＳＳＬ)의 발현을 위한 ＤＮＡ 분자

답즙산염-자극 리파제 (BSSL; EC3.1.1.1) (Wang Hartsuck, 1993 참조)는 대부분의 인간 유즙의 지방 분해 활성을 갖는다. 이 리파제의 특징은 유화된 장쇄 트리아실글리세롤에 대한 활성을 위해 1차 담즙산염을 필요로 한다는 것이다. BSSL은 지금까지 인간, 고릴라, 고양이 및 개의 유즙에서만 발견되었다 (Hernell et al., 1989).

BSSL은 수유 유아의 장에서 유즙 지질의 분해에 있어 중요한 역할을 한다 (Fredrikzon et al., 1978). BSSL은 유즙을 분비하는 유선에서 인체에서 합성되고 유즙과 함께 분비된다 (Blaeckberg et al., 1987). BSSL은 전체 유단백질의 약 1%를 차지한다 (Blaeckberg Hernell, 1981).

그 자신의 BSSL 생성이 결핍된 유아, 특히 미숙 유아의 지방 흡수 및 성장에서 BSSL이 주요 성장 제한 인자이고 정제 효소가 포함된 유아용 유동식의 보충이 상기 유아의 소화 및 성장을 상당히 개선시킨다는 것이 제시되었다 (오클라호마 메디칼 리써치 파운데이션(Mediacl Research Foundation)의 미국 특허 제4,944,944호). 이것은 비교적 고비율의 트리글리세라이드를 함유하고 식물 또는 비인간 유단백질 공급원을 기초로 한 유아용 유동식의 제조에 임상적으로 중요한데, 그 이유는 이들 유동식을 공급한 유아가 BSSL을 첨가하지 않은 경우에 지방을 분해할 수 없기 때문이다.

유즙 BSSL과 췌장 카르복실산 에스테르 하이드롤라제 (CEH)의 cDNA 구조가 특성화되었고 (Baba et al., 1991; Hui and Kissel, 1991; Nilsson et al., 1991; Reue et al., 1991), 유즙 효소 및 췌장 효소가 CEL이라는 동일한 유전자의 생성물이라는 결론이 도출되었다. CEL 유전자의 cDNA 서열 (서열 1)은 미국 특허 제5,200,183 (오클라호마 메디칼 리써치 파운데이션); 국제 출원 공개 제W91/18293호 (Aktiebolaget Astra); Nilsson 등 (1990); 및 Baba 등 (1991)에 개시되어 있다. 23 아미노산의 신호 서열을 포함하여 BSSL 단백질의 추정 아미노산 서열은 서열 목록에 서열 2로 나타내었고, 722 아미노산의 천연 단백질 서열은 서열 3으로 나타내었다.

이 단백질의 C-말단 영역은 11 아미노산 잔기의 반복체 16개 및 11 아미노산 보존 스트레치를 순서대로 함유한다. 천연 단백질은 글리코실화가 높고 관찰된 분자량의 분포가 다양한 것으로 보고되었다. 이것은 글리코실화 정도의 다양성에 의한 것으로 설명할 수 있을 것이다 (Abouakil et al., 1988). 이 단백질의 N-말단의 1/2은 아세틸 콜린 에스테라제 및 일부 기타 에스테라제와 상동성이다 (Nilsson et al., 1990).

재조합 BSSL은 적합한 숙주, 예를 들면 이. 콜리 (E. coli), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 포유동물 세포주에서 발현시켜 생성시킬 수 있다. 산업적 생산이 가능하도록 생산 비용을 저하시킬 수 있는 BSSL 발현계의 스케일-업을 위해서 이종 발현계의 이용을 생각할 수 있다. 상기한 바와 같이, 인간 BSSL은 C-말단에 11 아미노산의 반복체 16개를 갖는다. 이 반복체 영역의 생물학적 의미를 규명하기 위해 반복체 영역의 일부 또는 전부가 결여된 인간 BSSL의 다양한 변이체를 작제하였다 (Hansson et al., 1993). 예를 들면, 변이체 BSSL-C (서열 4)는 아미노산 잔기 536 내지 568 및 아미노산 잔기 591 내지 711이 결실되었다. 포유동물 세포주 C127 숙주 및 소 유두종 바이러스 발현 벡터를 사용한 발현 연구는 다양한 변이체가 활성 형태로 발현될 수 있음을 보여주었다 (Hansson et al., 1993). 이 발현 연구를 통하여 인간 BSSL 내의 프롤린 풍부 반복체는 BSSL의 촉매 활성 또는 담즙산염 활성화에 필수적이지 않다는 결론을 얻었다. 그러나, 포유동물 발현계에서의 BSSL 또는 그의 변이체의 생성은 통상의 치료용으로는 지나치게 비용이 많이 소요될 수 있다.

효모와 같은 진핵세포계는 재조합 DNA에 의해 코딩되는 특정 폴리펩티드의 생성을 위해 원핵세포계의 사용에 비해 상당한 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 효모는 일반적으로 세균보다 높은 세포 밀도로 성장할 수 있고 발현된 폴리펩티드에 대하여 생물학적 활성에 상당히 중요한 글리코실화를 시킬 수 있음이 입증되었다. 그러나, 효모 사카로마이세스 세레비지애의 숙주 유기체로서의 사용은 종종 재조합 단백질의 저조한 발현 수준 및 분비를 야기한다 (Cregg et al., 1987). 에스. 세레비지애에서의 이종 단백질의 최대 수준은 전체 세포 단백질의 5% 내이다 (Kingsman et al., 1985). 숙주로서 사카로마이세스 세레비지애를 사용할 경우의 다른 결점은 재조합 단백질이 과도하게 글리코실화되어 글리코실화 포유동물 단백질의 활성에 영향을 끼칠 수 있다는 것이다.

피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)는 고조절성 메탄올 이용 경로를 갖기 때문에 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 메탄올을 이용하여 성장할 수 있는 메틸 의존성 효모이다 (Ellis et al., 1985). 피. 파스토리스는 또한 효율적인 높은 세포 밀도 발효 공학에 이용할 수 있다. 따라서, 재조합 DNA 공학 및 효모 형질전환의 효율적인 방법은 메탄올 옥시다제 프로모터 기초 발현계를 사용하여 이종 단백질의 다량 발현을 위한 숙주로서 피. 파스토리스의 개발을 가능하게 하였다 (Cregg et al., 1987).

피키아 파스토리스의 용도, 예를 들면 인간 종양 괴사 인자 (EP-A-0263311); 보르데텔라 (Bordetella) 페르탁틴 항원 (WO91/15571); B형 간염 표면 항원 (Cregg et al., 1987); 아프로티닌 (WO92/01048)과 같은 이종 단백질의 발현을 위한 숙주로서의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 활성을 갖는 가용성 분비 형태로 이종 단백질을 성공적으로 발현시키는 것은 다양한 인자, 예를 들면 신호 펩티드의 적합한 선택, 신호 펩티드와 성숙 단백질 사이의 융합 연결부의 적합한 제조, 성장 조건 등에 영향받는다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 종래의 발현계가 갖는 상기한 결점을 극복하고 다른 유기체에서의 생성에 필적하거나 이보다 우수한 수율을 효율적인 생산 비용으로 인간 BSSL을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 이 목적은 피키아 파스토리스 세포 내에서의 BSSL 발현 방법을 제공함으로써 달성되었다.

따라서, 본 발명에 따르면 인간 BSSL 및 변이체 BSSL-C는 피. 파스토리스로부터 활성 형태로 발현될 수 있음이 판명되었다. 천연 신호 펩티드 뿐만 아니라 에스. 세레비지애 인버타제 단백질에서 유도된 이종 신호 펩티드를 사용하여 성숙 단백질을 적합하게 프로세싱된 활성 형태로 배양 배지에 위치시킬 수 있었다.

본 발명은 메틸 요구주 효모인 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 내에서의 답즙산염-자극 리파제 (BSSL) 발현 방법에 사용하기 위한 DNA 분자, 재조합 벡터 및 세포 배양액에 관한 것이다.

제1 특징에서 본 발명은

(a) 인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체인 폴리펩티드 코딩 영역;

(b) 상기 폴리펩티드 코딩 영역의 5'-말단에 연결된, (a), (b) 및 (c)를 포함하는 DNA 분자로 형질전환된 피키아 파스토리스 세포로부터 상기 폴리펩티드의 분비를 지시할 수 있는 신호 펩티드의 코딩 영역; 및

(c) 상기 (a) 및 (b)에서 정의된 상기 코딩 영역에 조작가능하게 연결된, 피키아 파스토리스의 메탄올 옥시다제 프로모터 또는 기능상 균등한 프로모터

를 포함하는 DNA 분자를 제공한다.

용어 BSSL의 생물학상 활성 변이체는 BSSL 활성을 갖고 서열 목록의 서열 3으로 나타낸 아미노산 서열의 일부를 포함하는 폴리펩티드로서 이해된다. 용어 BSSL 활성을 갖는 폴리펩티드는 본원에서 (a) 경구 투여에 적합; (b) 특정 담즙산염에 의해 활성화됨; 및 (c) 소장의 함유물에 비특이적 리파제로서 작용함, 즉 화학적 구조 및 물리적 상태 (유화, 미셀, 가용성)에 비교적 무관하게 지질을 가수분해할 수 있음의 특성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.

상기 BSSL 변이체는 예를 들면 16개 미만의 반복 단위를 포함하는 변이체를 의미할 수 있고, 반복 단위는 서열 1에 대한 정보에서 (ix) 특징에서 반복 단위로서 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 11 아미노산의 반복 단위로서 이해될 것이다. 특히, BSSL 변이체는 아미노산 536 내지 568 및 591 내지 711이 결실된 변이체 BSSL-C일 수 있다 (서열 목록의 서열 4).

따라서, 본 발명에 따른 DNA 분자는 BSSL (서열 3) 또는 BSSL-C (서열 4)를 코딩하는 DNA 분자가 바람직하다.

그러나, 본 발명에 따른 DNA 분자는 아미노산 서열이 서열 목록의 서열 3 또는 4에 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자에 엄격하게 제한되는 것은 아니다. 오히려, 본 발명은 치환, 작은 결실, 삽입 또는 도립과 같은 변형을 포함하지만 BSSL의 생물학적 활성을 실질적으로 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 포함한다. 따라서, 상기 BSSL 변이체 코딩 DNA 분자 및 아미노산 서열이 서열 목록의 서열 3 또는 4에 나타낸 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상동성인 폴리펩티드 코딩 DNA 분자는 본 발명에 포함된다.

상기 신호 펩티드는 서열 목록의 서열 2의 아미노산 -20 내지 -1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 동일하거나 실질적으로 유사한 펩티드일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 인버타제 신호 펩티드를 포함하는 펩티드일 수 있다.

다른 특징에서 본 발명은 상기 정의된 DNA 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체 코딩 DNA 서열을 포함하고 피키아 속 세포에서 상기 DNA 서열의 발현을 조절할 수 잇는 복제가능한 발현 벡터이다. 상기 벡터는 예를 들면 플라스미드 벡터 pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) 또는 pARC 5797 (NCIMB 40722)일 수 있다.

또다른 특징에서, 본 발명은 상기 정의된 DNA 분자 또는 벡터로 형질전환된 피키아 속 세포를 포함하는 숙주 세포 배양물을 제공한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 PPF-1 또는 GS115와 같은 균주의 피키아 파스토리스 세포이다. 상기 세포 배양물은 예를 들면 PPF-1[pARC 5771] (NCIMB 40721), GS115[pARC 5799] (NCIMB 40723) 또는 GS115[pARC 5797] (NCIMB 40722) 배양물일 수 있다.

또다른 특징에서, 본 발명은 인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체 폴리펩티드가 배양 배지로 분비되는 조건 하에 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계로 이루어지는, 인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체 폴리펩티드의 생성 방법을 제공한다.

실시예 1: 피키아 파스토리스 PPF-1에서의 BSSL의 발현

1.1 pARC 0770의 작제

천연 신호 펩티드 (이하 NSP로 칭함)를 포함하여 BSSL 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 (서열 1)을 EcoRI-SacI 단편으로서 pTZ19R (Pharmacia) 내에 클로닝하였다. 컨스티튜티브 (constitutive) ADH1 프로모터의 조절 하에 발현되는 낮은 카피 넘버의 효모 발현 벡터인 에스. 세레비지애 발현 벡터 pSCW 231 (미국 뉴욕 소재의 로체스터 대학 교수 L. Prakash로부터 수득) 내에 NSP-BSSL cDNA를 2단계로 클로닝하였다. 처음에, NSP-BSSL cDNA를 pTZ19R-SP-BSSL로부터의 EcoRI-SphI 단편으로서 pYES 2.0 (미국 Invitrogen사) 내에 클로닝하였다. EcoRI/NcoI (89) 융합을 생성시키고 EcoRI 부위를 재생시킴으로써 신호 펩티드 코딩 서열 개시부의 EcoRI과 NcoI 사이의 과량의 89 염기쌍을 제거하였다. 생성 클론 pARC 0770은 본래 NcoI 부위 내에 코딩된 ATG 코돈을 포함하고, 바로 뒤에 나머지 NSP-BSSL 서열과 함께 인 프레임으로 재생성된 EcoRI 부위가 존재한다.

1.2 pARC 5771 플라스미드의 작제

BSSL 발현에 적합한 발현 벡터를 작제하기 위해서 BSSL 단백질을 그 천연 신호 펩티드와 함께 코딩하는 cDNA 단편을 피. 파스토리스 발현 벡터 pDM 148를 사용하여 클로닝하였다. 벡터 pDM 148 (UCSD의 Dr. S. Subramani로부터 수득)은 다음과 같이 작제하였다: 메탄올 옥시다제 (MOX1) 유전자의 상류의 비해독 영역 (5'-UTR) 및 하류 비해독 영역 (3'-UTR)을 PCR에 의해 단리하고 이. 콜리 벡터 pSK⁺(미국 Stratagene사로부터 구입가능)의 다중 클로닝 서열 (MCS)에 나란히 위치시켰다.

추정 피. 파스토리스 형질전환체의 적합한 선별을 위해 에스. 세레비지애 ARG4 유전자 코딩 DNA 서열 및 그 자신의 프로모터 서열을 pSK-에 삽입하였다. 생성 구조체 pDM148은 다음과 같은 특징을 갖는다: pSK-의 MCS 영역에 MOX의 5'-UTR, 에스. 세레비지애 ARG4 게놈 서열 및 MOX의 3'-UTR이 클로닝됨. MOX의 5'-UTR과 ARG4 게놈 서열 사이에 일련의 특유한 제한 부위 (SalI, ClaI, EcoRI, PstI, SmaI 및 BamHI)이 존재하고, 여기에 피. 파스토리스 내에서 MOX 프로모터의 조절 하에 발현시키기 위해 임의의 이종 단백질 코딩 서열을 클로닝할 수 있다. 상기 발현 카세트의 피. 파스토리스 염색체 내의 MOX1 좌위 내로의 통합을 촉진하기 위해서 발현 카세트를 NcoI 제한 효소를 사용한 분해에 의해 pSK- 벡터의 나머지로부터 절단할 수 있다.

pDM 148 내에 클로닝된 피. 파스토리스의 MOX1의 5'-UTR의 길이는 약 500 bp인 반면에, pDM148 내에 클로닝된 피. 파스토리스의 3'-UTR의 길이는 약 1000 bp이었다. NSP-BSSL cDNA 서열을 pDM148 내의 5'-UTR과 에스. 세레비지애 ARG4 코딩 서열 사이에 삽입하기 위해서 cDNA 삽입체 (SP-BSSL)를 EcoRI 및 BamHI (약 2.2 kb DNA 단편)을 사용한 분해에 의해 단리하고 pDM 148 내의 EcoRI과 BamHI 부위 사이에 클로닝하였다.

생성 구조체 pARC 5771 (NCIMB 40721)은 피. 파스토리스 MOX1 5'-UTR, NSP-BSSL 코딩 서열, 에스. 세레비지애 ARG4 유전자 서열, 및 피. 파스토리스의 MOX1 유전자의 3'-UTR을 순서대로 함유하고, MOX1의 5'-UTR 내지 MOX1의 3'-UTR의 전체 DNA 세그먼트는 pSK-의 MCS에 클로닝되었다.

1.3 피. 파스토리스 숙주 PPF-1 내에서의 BSSL의 형질전환

피. 파스토리스 숙주 PPF-1 (his4, arg4; Phillips Petroleum Co.사로부터 수득) 내에서 BSSL를 발현시키기 위해 플라스미드 pARC 5771을 NotI으로 분해시키고 전체 분해 혼합물 (전체 DNA 10 ㎍)을 사용하여 PPF-1을 형질전환시켰다. 사용한 형질전환 프로토콜은 본질적으로 크레그 (Cregg) 등에 의해 1987년 기술된 효모 스페로플라스트 방법이었다. Arg+ 군체를 선별할 수 있도록 하기 위해 형질전환체를 아르기닌 부재 최소 배지 상에 생성시켰다. 형질전환체를 함유하는 생성 상부 아가를 떠내어 물 중에서 균질화시키고 효모 세포를 아르기닌 부재 최소 글루코스 배지 상에 플레이트 당 약 250 군체로 플레이팅하였다. 이어서, 변이체 군체를 최소 메탄올 플레이트 상에 대한 레플리카 플레이팅에 의해 동정하였다. 전체 형질전환체의 약 15%가 Mut^s(메탄올 느린 성장) 표현형인 것으로 입증되었다.

1.4 BSSL를 발현하는 형질전환체의 선별

리파제 발현에 대한 다량의 형질전환체를 신속하게 선별하기 위해서 리파제 플레이트 분석법을 개발하였다. 상기 플레이트의 제조 방법은 다음과 같다: 2% 아가로스 (최종) 용액에 10x Na-콜레이트 수용액을 최종 농도 1%로 첨가하였다. 지질 기질 트리부틴을 혼합물에 최종 농도 1% (v/v)로 첨가하였다. 형질전환체의 성장을 뒷받침하기 위해서 혼합물을 추가로 0.25% 효모 질소 베이스 (최종) 및 0.5% 메탄올 (최종)로 보충하였다. 성분을 적절하게 혼합하고 3 내지 5 mm의 두께로 플레이트 상에 부었다. 혼합물이 고형으로 된 후 형질전환체를 플레이트 상에 스트리킹하고 플레이트를 37℃에서 더 인큐베이션하였다. 리파제 생성 클론은 클론 주위에 투명 원광 (halo)을 보였다. 전형적인 실험에서 총 93 형질전환체 중에서 7 형질전환체가 BSSL 생성 형질전환체로서 동정되었다. 스트리킹된 군체 주위에 가장 큰 원광을 생성한 2개의 클론 (번호 39 및 86)을 추가의 특성화를 위해 떠내었다.

1.5 PPF-1 [pARC 5771]로부터 BSSL의 발현

섹션 1.4에서 기술한 2개의 형질전환체 번호 39 및 86을 떠내어 BMGY 액체 배지 (1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤, 아미노산 부재 1.34% 효모 질소 베이스, 100 mM KPO₄완충액, pH6.0, 400 ㎍/l 비오틴, 및 2% 글리세롤) 중에서 24시간 동안 30℃에서 성장시켜 배양액의 A₆₀₀이 40에 도달하도록 하였다. 배양액을 펠렛으로 침강시키고 A₆₀₀= 300에서 BMMY (BMGY에 2% 글리세롤 대신에 0.5% 메탄올이 첨가됨) 배지에 재현탁시켰다. 유도된 배양액을 진탕하면서 30℃에서 120시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양 상등액을 효소 활성 분석, SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블로팅에 의한 BSSL의 발현 분석을 위해 상이한 시점에서 회수하였다.

1.6 클론 번호 39 및 86의 배양 상등액에서 BSSL 효소 활성의 검출

섹션 1.5에서 기술한 유도 배양액 번호 39 및 86의 세포 부재 배양 상등액에서 효소 활성을 측정하기 위해서 배양액을 원심분리하여 세포 부재 상등액 2 ㎕에 대하여 허넬(Hernell) 및 올리베크로나 (Olivecrona)에 의해 기술된 방법 (1974)에 따라 BSSL 효소 활성을 분석하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 두 개의 배양액은 모두 유도 96시간 후에 최대 활성을 갖는 BSSL 효소 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

1.7 PPF-1:pARC 5771 형질전환체 (번호 39 및 86)의 배양 상등액의 웨스턴 블롯 분석

PPF-1 [pARC 5771] 형질전환체의 배양 상등액 번호 39 및 86 내의 재조합 BSSL의 존재를 측정하기 위해서 배양액을 섹션 1.5에서 기술한 바와 같이 성장시키고 유도하였다. 배양액을 유도 후에 상이한 시점에서 회수하고 항 BSSL 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 그 결과는 배양 상등액 내에 BSSL의 존재를 116 kDa 밴드로서 나타내었다.

실시예 2: 피키아 파스토리스 GS115 내에서의 BSSL의 발현

2.1 pARC 5799의 작제

5'-MOX UTR 및 3'-MOX UTR이 적합하게 규정되지 않았고 pDM 148 벡터에는 피키아 염색체 내에 통합된 BSSL의 카피 넘버를 모니터할 임의의 다른 적합한 마커 (예를 들면 G418 내성 유전자)가 결여되었기 때문에 천연 BSSL의 cDNA 삽입체를 그 신호 펩티드와 함께 다른 피. 파스토리스 발현 벡터인 pHIL D4 내에 클로닝하였다. 통합 플라스미드 pHIL D4는 Phillips Petroleum Company로부터 구입하였다. 이 플라스미드는 5'-MOX1, 알콜 옥시다제 프로모터의 약 1000 bp 세그먼트 및 특유한 EcoRI 클로닝 부위를 포함하였다. 또한, 알콜 옥시다제 종결 서열을 함유하는 약 250 bp의 3'-MOX1 영역, EcoRI 부위를 순서대로 포함하였다. 종결 영역 뒤에는 숙주 세포 GS115에서 HIS4 결함 유전자에 상보성인 2.8 kb 단편 상에 포함된 피. 파스토리스 히스티디놀 탈수소효소 유전자 HIS4가 존재한다 (하기 참조). 3'-MOX1 DNA를 함유하는 650 bp 영역을 5'-MOX1 영역과 함께 부위 지향 통합에 필요한 HIS4 유전자의 3'-말단에 융합시켰다. pUC-4K (PL-Biochemicals)로부터의 세균 카나마이신 내성 유전자를 HIS4 유전자의 3'에 존재하는 3'-MOX1 영역과 HIS4 사이의 특유한 NaeI 부위에 삽입시켰다.

pHIL D4의 특유한 EcoRI 부위에 NSP-BSSL 코딩 cDNA 단편을 클로닝하기 위해 BamHI-EcoRI 분해 부위를 갖는 이중가닥 올리고 링커를 BamHI 분해 플라스미드 pARC 5771에 라이게이션시키고 전체 NSP-BSSL 코딩 서열을 2.2 kb EcoRI 단편으로서 분리하였다. 이 단편을 pHIL D-4의 EcoRI 부위에 클로닝하고 제대로 방향잡힌 플라스미드를 pARC 5799 (NCIMB 40723)으로 명명하였다.

2.2 pARC 5799의 형질전환

피. 파스토리스 내의 MOX1의 게놈 좌위에 NSP-BSSL 코딩 서열의 통합을 촉진하기 위해서 플라스미드 pARC 5799를 BglII로 분해하고 섹션 1.5에서 기술한 프로토콜에 따라 피. 파스토리스 균주 GS115 (his4) (Phillips Petroleum Company)의 형질전환에 사용하였다. 그러나, 이 경우에 선별은 His 요구주를 선별하기 위한 것이었다. 생성된 상부 아가의 연속적인 희석 플레이팅 후에 형질전환체를 회수하여 섹션 1.4에서 기술한 바와 같은 리파제 플레이트 분석으로 직접 시험하였다. 2개의 형질전환체 클론 (번호 9 및 21)을 리파제 분석 플레이트 상의 원광 크기를 기준으로 선발하여 BSSL 발현에 대해 추가로 조사하였다. 이들 클론은 Mut⁺인 것으로 판명되었다.

2.3 GS115[pARC 5799] 형질전환체 번호 9 및 21의 배양 상등액에서 BSSL 효소 활성의 측정

GS115[pARC 5799]의 2개의 형질전환된 클론 번호 9 및 21을 본질적으로 섹션 1.5에서 기술한 프로토콜에 따라 성장시켰다. 유도 후에 상이한 시점에서의 배양 상등액에 대해 섹션 1.6에서 기술한 BSSL 효소 활성을 분석하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 두 개의 배양 상등액은 모두 BSSL 효소 활성을 포함하는 것으로 판명되었고 효소 활성은 유도 72시간 후에 최대였다. 두 개의 클론은 모두 PPF-A[pARC 5771]의 클론에 비해 우수한 BSSL 발현을 보였다.

2.4 GS115[pARC 5799] 형질전환체 번호 9 및 21의 배양 상등액의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석

섹션 2.3에서 기술한 바와 같이 상이한 시점에서 수거한 배양 상등액에 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. SDS-PAGE 프로필로부터 유도된 배양액의 배양 상등액에 존재하는 전체 단백질의 약 60 내지 75%가 BSSL인 것으로 추정되었다. 단백질의 분자량은 약 116 kDa이었다. 또한, 웨스턴 블롯을 통화여 배양 상등액에 존재하는 주요 단백질이 BSSL임을 확인하였다. 이 단백질은 명백히 천연 BSSL과 동일한 분자량을 가졌다.

실시예 3: BSSL 발현의 스케일-업

3.1 형질전환된 클론 GS115[pARC 5799] (번호 21)로부터 BSSL 발현의 스케일-업

23리터 용량의 비. 브라운 (B. Braun) 발효기를 사용하였다. 1% YE, 2% 펩톤, 1.34 YNB 및 4% w/v 글리세롤을 함유하는 배지 5 리터를 121℃에서 30분 동안 고압멸균한 후 비오틴 (최종 농도 400 ㎍/l)을 필터 멸균 후에 접종 동안에 첨가하였다. 접종물로는, YNB (67%) + 2% 글리세롤 150 ml을 함유하는 합성 배지 내에 접종시킨 후 30℃에서 36시간 동안 성장시킨 GS115[pARC 5799] (번호 21)의 글리세롤 원액을 사용하였다. 발효 조건은 다음과 같다: 온도는 30℃이고, pH는 3.5 N NH₄OH 및 2 N HCl을 사용하여 5.0을 유지하고, 20 내지 40%의 공기 포화도로 산소를 용해시키고, 프로필렌 글리콜 2000을 제포제로서 사용하였다.

성장은 600 nm에서의 OD를 측정하여 일정한 간격으로 기록하였다. A₆₀₀은 24시간 경과시에 50 내지 60의 최대치에 도달하였다. 이 시점에서 용존 산소 농도의 증가로 표시되는 바와 같이 배치 성장 단계가 종결되었다.

성장 단계 직후에 유도 단계로 들어갔다. 이 단계 동안에 12 ml/l PTM1 염을 함유하는 메탄올을 공급하였다. 메탄올 공급속도는 처음 10 내지 12시간 동안에는 6 ㎕/h으로, 이후에는 매 7 내지 8시간마다 6 ml/㎕ 내지 최대 36 ml/㎕씩 점진적으로 증가시켰다. pH 조절을 위해 사용된 암모니아는 질소 공급원으로 작용하였다. 용존 산소 스파이킹을 사용하여 6 내지 8시간마다 메탄올 축적량을 조사한 결과, 전체 유도 단계 동안을 제한하는 것으로 판명되었다. 600 nm에서의 OD는 메탄올을 공급한 86시간 동안에 50 내지 60으로부터 150 내지 170으로 증가하였다. 효모 추출물 및 펩톤을 24시간마다 공급하여 최종 농도를 각각 0.25% 및 0.5%로 만들었다.

24시간 간격으로 시료를 회수하여 세포 부재 브로쓰에서 BSSL 효소 활성을 조사하였다. 또한, 브로쓰에 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.

3.2 발효기 성장 배양액 GS115[pARC 5799] (번호 21)로부터 분비된 BSSL의 단백질 분석

세포 부재 브로쓰에서의 BSSL 효소 활성은 24시간에서의 40 내지 70 mg/l (천연 단백질에 균등량) 내지 86 내지 90시간 종결시에서의 최대 200 내지 227.0 mg/l (천연 단백질에 균등량)로 증가하였다. 세포 부재 브로쓰의 SDS-PAGE 분석은 분자량 116 kDa의 현저한 쿠마시 블루 염색 밴드를 보였다. 이 밴드의 정체는 천연 BSSL에 대해 섹션 1.7에서 기술한 바와 같이 실시된 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.

3.3 GS115[pARC 5799] (번호 21) 클론의 배양 상등액 내에 분비된 재조합 BSSL의 정제

피. 파스토리스 클론 GS115[pARC 5799]를 성장시켜 섹션 3.1에서 기술한 바와 같이 발효기에서 유도하였다. 재조합 BSSL의 정제를 위해 배양 배지 250 ml (90시간 동안 유도시킴)을 12,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 모든 입자 물질을 제거하였다. 세포 부재 배양 상등액을 10 kDa 컷오프 멤브레인을 사용하여 Amicon set up으로 한외여과하였다. 염 및 배양 상등액의 저분자량 단백질 및 펩티드를 여과 동안에 반복 희석으로 제거하였다. 상기 희석에 사용된 완충액은 pH7.4의 5 mM 바르비톨이었다. 배양 상등액의 농축 후에 5 mM 바르비톨, pH7.4 및 50 mM NaCl을 사용하여 잔류액을 250 ml로 만든 후 동일한 완충액으로 예비평형시킨 헤파린-세파로스 칼럼 (15 ml 층 용량) 상에 걸었다. 시료는 10 ml/h의 유속으로 로딩하였다. 로딩 후에 칼럼을 5 mM 바르비톨, pH7.4 및 0.1 M NaCl (200 ㎕ 세척 완충액)으로 세척하여 250 nm에서의 흡수도를 검출 수준 미만으로 도달하게 하였다. BSSL을 바르비톨 완충액 (5 mM, pH7.4) 200 ml 및 0.1 M 내지 0.7 M의 NaCl의 선형 구배를 사용하여 용출시켰다. 분획 2. 5 ml을 회수하여 260 nm에서의 흡광도를 기록함으로써 용출 단백질을 조사하였다. 단백질 함유 분획에 대해 BSSL 효소 활성을 분석하였다. 적합한 분획을 8.0% SDS-PAGE 상에서 조사하여 정제 프로필을 조사하였다.

3.4 GS115[pARC 5799]의 배양 상등액에서 분비된 정제 재조합 BSSL의 특성화

최대 BSSL 효소 활성을 보이는 (섹션 3.3에서 기술된) 분획에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 재조합 단백질의 순도가 약 90%임을 입증하였다. 정제 단백질의 분자량은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정한 바 약 116 kDa이었다. 시료를 SDS-PAGE 분석을 위해 과로딩한 경우에 저분자량 단백질 밴드를 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의해 검출할 수 있었고, 이것은 웨스턴 블롯 상에 선발되지 않은 것이었다. 정제 단백질에 대해 자동화 단백질 서열분석기로 N-말단 분석을 실시하였다. 그 결과는 이 단백질이 천연 신호 펩티드로부터 적절하게 프로세싱되었고 재조합 단백질의 N-말단 서열이 AKLGAVY임이 밝혀졌다. 정제 재조합 단백질의 특이 활성은 천연 단백질의 활성과 유사한 것으로 판명되었다.

실시예 4: 피키아 파스토리스 GS115에서 BSSL-C의 발현

4.1 pARC 5797의 작제

BSSL 변이체인 BSSL-C의 서열을 코딩하는 cDNA를 인버타제 신호 펩티드의 제1 ATG 코돈에서 시작하는 오픈 리딩 프레임의 통합성을 유지시키면서 그의 5' 말단에서 에스. 세레비지애 SUC2 유전자 생성물 (인버타제)의 신호 펩티드 코딩 서열과 융합시시켰다. 이 융합 유전자 구조체를 에스. 세레비지애 발현 벡터 pSCW231 (pSCW231은 낮은 카피 넘버의 효모 발현 벡터이고 컨스티튜티브 ADH1 프로모터의 조절 하에 발현됨) 내에 EcoRI과 BamHI 부위 사이에 클로닝하여 발현 벡터 pARC 0788을 생성시켰다.

pARC 0788을 EcoRI 및 BamHI 분해시켜 약 1.8 kb 단편을 방출시키고 이 단편을 EcoRI 및 BamHI으로 분해한 pDM148 내에 서브클로닝함으로써 피. 파스토리스 발현 벡터 pDM148 (섹션 1.2에서 기술된) 내에 융합 유전자의 cDNA를 추가로 서브클로닝하였다. 생성 구조체 pARC 5790을 BamHI으로 분해하고 물리적 구조가 BamHI-EcoRI-BamHI인 이중가닥 올리고뉴클레오티드 링커를 라이게이션시켜 구조체 pARC 5796을 생성시키고 섹션 2.1에서 기술한 전략에 따라 융합 유전자의 cDNA 단편을 단리하였다.

최종적으로, EcoRI 분해에 의해 인버타제 신호 펩티드/BSSL-C 융합 유전자를 함유하는 1.8 kb 단편을 pARC 5796으로부터 방출시키고 EcoRI 부위에서 pHIL D4 내에 클로닝시켰다. 적합한 배향으로 삽입체를 함유하는 발현 벡터를 적절한 제한 분석에 의해 확인하여 pARC 5797 (NCIMB40722)로 명명하였다.

4.2 피. 파스토리스로부터의 재조합 BSSL-C의 발현

피. 파스토리스로부터 재조합 BSSL-C를 발현시키기 위해서 피. 파스토리스 숙주 GS115를 섹션 1.3 및 2.2에서 기술한 방법에 의해 pARC 5797로 형질전환시켰다. 형질전환체에 대해 섹션 1.4 및 2.2에서 기술한 방법에 의해 리파제 생성을 조사하였다. 높은 리파제 생성 능력을 기초로 하여 리파제 플레이트 분석 검출 방법에 의해 하나의 형질전환체 (번호 3)을 선발하여 본질적으로 섹션 1.6 및 2.3에서 기술한 방법에 따라 배양 상등액에서 BSSL 효소 활성의 생성에 대해 추가로 분석하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이 GS115[pARC 5797] (번호 3)의 배양 상등액은 BSSL 효소 활성을 포함하였고 그 양이 유도 후 72시간까지 점진적으로 증가하였다.

4.3 GS115[pARC 5797] 형질전환체 (번호 3)의 배양 상등액에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석

섹션 4.2에서 기술한 바와 같이 상이한 시점에서 회수한 배양 상등액에 대해 섹션 1.7 및 2.4에서 기술한 바와 같은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. SDS-PAGE 프로필로부터 전체 세포외 단백질의 약 75 내지 80%가 BSSL-C인 것으로 추정되었다. SDS-PAGE 분석으로부터 추정된 단백질의 분자량은 약 66 kDa이었다. 웨스턴 블롯 분석에서는 66 kDa 부근에서 단지 2개의 밴드 (이중 밴드)만이 면역활성인 것으로 판명되었고, 따라서 재조합 BSSL-C의 발현을 확인하였다.

비교예: 에스. 세레비지애 내에서의 BSSL의 발현

사카로마이세스 세레비지애 내에서 BSSL을 발현시켜 보았다. BSSL은 에스. 세레비지애에서 빈약하게 분비되었고 천연 신호 펩티드는 효율적으로 작용하지 않았다. 또한, 천연 신호 펩티드는 에스. 세레비지애에서 성숙 단백질로서 분해되지 않았다.

참고 문헌

Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. and Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961, 299-308.

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Blaekberg, L. and Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225.

Blaeckberg, L., Aengquist, K.A. and Hernell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.

Cregg, J.M. et al. (1987) Bio/Technology 5, 479-485.

Ellis, S.B. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 11111-1121.

Fredrikzon, B., Hernell, O., Blaeckberg, L. and Olivercrona, T. (1978) Pediatric Res. 12, 1048-1052.

Hansson, L., Blaeckberg, L., Edlund, M., Lundberg, L., Stroemqvust, M. and Hernell, O. (1993) J.Biol. Chem. 268, 26692-26698.

Hernell, O. and Olivercrona, T. (1974) Biochim. Biophys. Acta 369, 234-244.

Hernell, O., Blaeckberg, L and Olivercrona, T. (1989) in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E, ed.) 347-354, Raven Press, NY.

Hernell, O. and Blaeckberg, L. (1982) Pediatric Res. 16, 882-885.

Hui, D.Y. and Kissel, J.A. (1990) FEBS Letters 276, 131-134.

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Nilsson, J., Blaeckberg, L., Carlsson, P., Enerbaeck, S., Hernell, O. and Bjursell, G. (1990) Eur. J. Biochem. 192, 543-550.

Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T.H., Ronk, M., Shively, J.E., Sternby, B., Borgstroem, B., Ameis, D. and Scholtz, M.C. (1991) J. Lipid. Res. 32, 267-276.

Wang, C-S, and Hartsuck, J.A. (1993) Biochim. Biphys Acta 1166, 1-19.

미생물 기탁

피키아 파스토리스 배양액 내로 도입되어 피키아 파스토리스의 형질전환에 사용된 하기 플라스미드를 영국 스코틀랜드 애버딘 소재의 더 내셔날 콜렉션즈 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 (NCIMB)에 부다페스트 조약 하에 기탁하였다. 기탁일은 1995년 5월 2일이다.

균주 [플라스미드]	NCIMB 번호
PPF-1 [pARC 5771]	40721
GS115 [pARC 5799]	40723
GS115 [pARC 5797]	40722

피키아 파스토리스 형질전환체의 배양 상등액에서의 효소 활성

유도후 경과 시간	천연 BSSL에 균등한 효소 활성 (mg/l)
	PPF-1[pARC 5771]	GS115[pARC 5799]	GS115[pARC 5797]
	번호 39	번호 86	번호 9	번호 21	번호 3
24	0.254	0.135	1.53	1.72	0.37
48	2.69	3.12	17.28	34.70	40.9
72	3.96	8.25	37.37	50.60	44.9
96	11.26	13.60	26.34	50.60	35.6
120	8.42	13.13	13.60	22.30	17.8

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인:

(A) 이름: 아스트라 에이비

(B) 거리: 베스트라 멜라레함넨 9

(C) 도시: 쇠더텔예

(E) 국가: 스웨덴

(F) 우편번호 (ZIP): 에스-151 85

(G) 전화번호: +46-8-553 260 00

(H) 팩스: +46-8-553 288 20

(I) 텔렉스: 19237 아스트라 에스

(ii) 발명의 명칭: 폴리펩티드 발현을 위한 DNA 서열

(iii) 서열수: 4

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 2428 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 이중

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(vi) 공급원:

(A) 생물체: 호모 사피엔스

(B) 조직 형태: 유선

(ix) 특징:

(A) 이름/키: CDS

(B) 위치: 82..2319

(C) 기타 정보: /생성물=담즙산염-자극 리파제

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 엑손

(B) 위치: 985..1173

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 엑손

(B) 위치: 1174..1377

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 엑손

(B) 위치: 1378..1575

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 엑손

(B) 위치: 1576..2415

(ix) 특징:

(A) 이름/키: mat_펩티드

(B) 위치: 151..2316

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 폴리A_신호

(B) 위치: 2397..2402

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_영역

(B) 위치: 1756..2283

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 5'-UTR

(B) 위치: 1..81

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 1756..1788

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 1789..1821

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 1822..1854

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 1855..1887

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 1888..1920

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 1921..1953

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 1954..1986

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 1987..2019

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 2020..2052

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 2053..2085

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 2086..2118

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 2119..2151

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 2152..2184

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 2185..2217

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 2218..2250

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 반복_단위

(B) 위치: 2251..2283

(x) 문헌 정보:

(A) 저자: 닐슨, 쟈네트

블렉베르그, 라르스

카를슨, 페터

에너벡, 스벤

헤르넬, 올레

뷰르셀, 구나르

(B) 제목: 인간-유즙 담즙산염-자극 리파제의 cDNA 클로닝 및 그의 췌장 카르복실산 에스테르 하이드롤라제에 대한 동일성의 입증

(C) 저널: Eur. J. Biochem.

(D) 볼륨: 제192권

(F) 페이지: 543-550

(G) 일자: 1990년 9월

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 746 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 722 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥:

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(iii) 가설: 없음

(vi) 공급원:

(A) 생물체: 호모 사피엔스

(B) 조직 형태: 유선

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 568 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥:

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(iii) 가설: 없음

(vi) 공급원:

(A) 생물체: 호모 사피엔스

(B) 조직 형태: 유선

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 펩티드

(B) 위치: 1..568

(C) 기타 정보: /라벨=변이체_C

(x) 문헌 정보:

(A) 저자: 한슨, 레나르트

블렉베르그, 라르스

에들룬드, 마이클

룬드베르그, 레나르트

스트롬크비스트, 마츠

헤르넬, 올레

(B) 제목: 재조합 인간 유즙 담즙산염-자극 리파제

(C) 저널: J. Biol. chem.

(D) 볼륨: 제268권

(E) 판: 제35쇄

(F) 페이지: 26692-26698

(G) 일자: 1993년 12월 15일

(xi) 서열 설명:

미생물 기탁에 관한 표시

(PCT 규칙 13bis)

A. 하기 표시는 명세서 9페이지 8행에서 언급된 미생물 관한 것이다.
B. 기탁의 확인
기탁 기관의 명칭더 내셔날 콜렉션즈 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 리미티드 (NCIMB)
기탁 기관의 주소 (우편번호 및 국명 포함)영국 에이비2 1알와이 스코틀랜드 애버딘 마차르 드라이브 스트리트 23
기탁일:1995년 5월 2일	수탁번호NCIMB 40721
C. 추가 공시 사항
모든 지정국에 있어서 그 작용이 가능하고 지정국 법률 하에 법적으로 허용되는 정도에서, 기탁된 미생물의 시료는 관련 특허 법률, 예를 들면 EPC 규칙 28(4), 및 기타 지정국에서 필요한 변경을 가한 일반적으로 이와 유사한 규정에 따라 시료의 분양을 신청한 경우에만 독립적인 숙련가에게 분양함으로써만 이용될 수 있다.
D. 공시 사항이 적용되는 지정국

E. 공시 사항의 별도 공급
이 서류는 국제 출원과 함께 접수되었음을 확인함권한있는 관리크리스티나 센프텐

미생물 기탁에 관한 표시

(PCT 규칙 13bis)

A. 하기 표시는 명세서 12페이지 19-20행에서 언급된 미생물 관한 것이다.
B. 기탁의 확인
기탁 기관의 명칭더 내셔날 콜렉션즈 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 리미티드 (NCIMB)
기탁 기관의 주소 (우편번호 및 국명 포함)영국 에이비2 1알와이 스코틀랜드 애버딘 마차르 드라이브 스트리트 23
기탁일:1995년 5월 2일	수탁번호NCIMB 40723
C. 추가 공시 사항
모든 지정국에 있어서 그 작용이 가능하고 지정국 법률 하에 법적으로 허용되는 정도에서, 기탁된 미생물의 시료는 관련 특허 법률, 예를 들면 EPC 규칙 28(4), 및 기타 지정국에서 필요한 변경을 가한 일반적으로 이와 유사한 규정에 따라 시료의 분양을 신청한 경우에만 독립적인 숙련가에게 분양함으로써만 이용될 수 있다.
D. 공시 사항이 적용되는 지정국

E. 공시 사항의 별도 공급
이 서류는 국제 출원과 함께 접수되었음을 확인함권한있는 관리크리스티나 센프텐

미생물 기탁에 관한 표시

(PCT 규칙 13bis)

A. 하기 표시는 명세서 17페이지 18-19행에서 언급된 미생물 관한 것이다.
B. 기탁의 확인
기탁 기관의 명칭더 내셔날 콜렉션즈 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 리미티드 (NCIMB)
기탁 기관의 주소 (우편번호 및 국명 포함)영국 에이비2 1알와이 스코틀랜드 애버딘 마차르 드라이브 스트리트 23
기탁일:1995년 5월 2일	수탁번호NCIMB 40722
C. 추가 공시 사항
모든 지정국에 있어서 그 작용이 가능하고 지정국 법률 하에 법적으로 허용되는 정도에서, 기탁된 미생물의 시료는 관련 특허 법률, 예를 들면 EPC 규칙 28(4), 및 기타 지정국에서 필요한 변경을 가한 일반적으로 이와 유사한 규정에 따라 시료의 분양을 신청한 경우에만 독립적인 숙련가에게 분양함으로써만 이용될 수 있다.
D. 공시 사항이 적용되는 지정국

E. 공시 사항의 별도 공급
이 서류는 국제 출원과 함께 접수되었음을 확인함권한있는 관리크리스티나 센프텐

Claims

(a) 인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체인 폴리펩티드 코딩 영역;

(b) 상기 폴리펩티드 코딩 영역의 5'-말단에 연결된, (a), (b) 및 (c)를 포함하는 DNA 분자로 형질전환된 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 세포로부터 상기 폴리펩티드의 분비를 지시할 수 있는 신호 펩티드 코딩 영역; 및

(c) 상기 (a) 및 (b)에서 정의된 상기 코딩 영역에 조작가능하게 연결된, 피키아 파스토리스의 메탄올 옥시다제 프로모터 또는 기능상 균등한 프로모터

를 포함하는 DNA 분자
제1항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 서열 목록의 서열 2의 아미노산 -20 내지 -1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 동일하거나 실질적으로 유사한 것인 DNA 분자.
제1항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 인버타제 신호 펩티드를 포함하는 것인 DNA 분자.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1에 나타낸 11 아미노산의 반복 단위가 하나 이상 결실된 인간 BSSL의 생물학상 활성 변이체를 코딩하는 DNA 분자.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, BSSL 활성을 갖고 아미노산 서열이 서열 3 또는 서열 4에 따른 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 3 또는 서열 4에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자.
제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 벡터.
제7항에 있어서, 피키아 파스토리스 세포에서 인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체의 발현을 조절할 수 있는 복제가능 발현 벡터.
제8항에 있어서, 플라스미드 벡터 pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) 또는 pARC 5797 (NCIMB 40722)인 벡터.
제7항 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환된 피키아 속의 숙주 세포.
제10항에 있어서, 피키아 파스토리스 세포인 숙주 세포.
제11항에 있어서, 균주 GS115의 피키아 파스토리스 세포인 숙주 세포.
제12항에 있어서, PPF-1[pARC 5771] (NCIMB 40721), GS115[pARC 5799] (NCIMB 40723) 또는 GS115[pARC 5797] (NCIMB 40722)인 숙주 세포.
인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체인 폴리펩티드가 배양 배지 내에 분비되는 조건 하에 제10항 내지 13항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 폴리펩티드를 배양 배지로부터 회수하는 단계로 이루어지는, 인간 BSSL 또는 그의 생물학상 활성 변이체인 폴리펩티드의 생성 방법.