ES2216007T3 - Cepas de levadura y albuminas modificadas. - Google Patents
Cepas de levadura y albuminas modificadas.Info
- Publication number
- ES2216007T3 ES2216007T3 ES95909880T ES95909880T ES2216007T3 ES 2216007 T3 ES2216007 T3 ES 2216007T3 ES 95909880 T ES95909880 T ES 95909880T ES 95909880 T ES95909880 T ES 95909880T ES 2216007 T3 ES2216007 T3 ES 2216007T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- albumin
- yeast
- baselineskip
- modified
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 59
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 17
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 20
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 19
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 16
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 15
- 101100319895 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YAP3 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101100160515 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPS1 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 101150018582 YAP3 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 9
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 claims description 8
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 4
- 101710180313 Protease 3 Proteins 0.000 abstract 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 14
- 241000237955 Nassarius Species 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 9
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 101150109301 lys2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 3
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 3
- 102100029516 Basic salivary proline-rich protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 3
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 3
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 3
- 101001125486 Homo sapiens Basic salivary proline-rich protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 3
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 3
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- YBPUBXQZBUQACE-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;phosphoric acid Chemical compound NCC(O)=O.OP(O)(O)=O YBPUBXQZBUQACE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 2
- 244000286779 Hansenula anomala Species 0.000 description 2
- 101710096444 Killer toxin Proteins 0.000 description 2
- 241000170280 Kluyveromyces sp. Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 2
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 description 2
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 2
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 2
- 101100053618 Yersinia enterocolitica yscE gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101150021974 Adh1 gene Proteins 0.000 description 1
- JPOQZCHGOTWRTM-FQPOAREZSA-N Ala-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPOQZCHGOTWRTM-FQPOAREZSA-N 0.000 description 1
- SOTXLXCVCZAKFI-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SOTXLXCVCZAKFI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZSMEUDYADKZTJ-KJEVXHAQSA-N Arg-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IZSMEUDYADKZTJ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- SLHOOKXYTYAJGQ-XVYDVKMFSA-N Asp-Ala-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 SLHOOKXYTYAJGQ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- 241000612703 Augusta Species 0.000 description 1
- 101150046766 BGL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- -1 CYC1 Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001007681 Candida albicans (strain WO-1) Kexin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001508787 Citeromyces Species 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710104662 Enterotoxin type C-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101150057924 Exoc2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150107049 Exoc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150039877 Exoc6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030844 Exocyst complex component 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030843 Exocyst complex component 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100030860 Exocyst complex component 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100026979 Exocyst complex component 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100026980 Exocyst complex component 5 Human genes 0.000 description 1
- 101150010122 FBP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100036669 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 102100024594 Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Human genes 0.000 description 1
- 241000228402 Histoplasma Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000911699 Homo sapiens Exocyst complex component 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000911703 Homo sapiens Exocyst complex component 5 Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101001072574 Homo sapiens Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101000686942 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Proteins 0.000 description 1
- 101000955035 Homo sapiens Homeobox protein MOX-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001108219 Homo sapiens NADPH oxidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001098352 Homo sapiens OX-2 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000611655 Homo sapiens Prolactin regulatory element-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101000617296 Homo sapiens Protein SEC13 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000652315 Homo sapiens Synaptosomal-associated protein 25 Proteins 0.000 description 1
- 101000931374 Homo sapiens Zinc finger protein ZFPM1 Proteins 0.000 description 1
- 101000931371 Homo sapiens Zinc finger protein ZFPM2 Proteins 0.000 description 1
- YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- VUZMPNMNJBGOKE-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VUZMPNMNJBGOKE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102100021873 NADPH oxidase 1 Human genes 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 241000235652 Pachysolen Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 102100040658 Prolactin regulatory element-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 102100021725 Protein SEC13 homolog Human genes 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150013347 SEC14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150040428 SEC4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150110070 SEC5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150049811 SEC6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100365194 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SEC7 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000206963 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Species 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000235003 Saccharomycopsis Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000228389 Sporidiobolus Species 0.000 description 1
- 101000882406 Staphylococcus aureus Enterotoxin type C-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030552 Synaptosomal-associated protein 25 Human genes 0.000 description 1
- 102000003627 TRPC1 Human genes 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100053617 Yersinia enterocolitica yscD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100053619 Yersinia enterocolitica yscF gene Proteins 0.000 description 1
- 101100053620 Yersinia enterocolitica yscG gene Proteins 0.000 description 1
- 102100020993 Zinc finger protein ZFPM1 Human genes 0.000 description 1
- 102100020996 Zinc finger protein ZFPM2 Human genes 0.000 description 1
- 241000235033 Zygosaccharomyces rouxii Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N diethyl 2-[(dimethoxyphosphorothioyl)thio]succinate Chemical compound CCOC(=O)CC(SP(=S)(OC)OC)C(=O)OCC JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006274 endogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 239000006277 exogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N lufenuron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=CC(Cl)=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 101150079312 pgk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- GGYTXJNZMFRSLX-UHFFFAOYSA-N prosomatostatin Chemical compound C1CCC(C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(=O)NCC(=O)NC2C(NC(CCCCN)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CSSC2)C(O)=O)C(C)O)C(C)O)=O)N1C(=O)C(C)NC(=O)C(CCSC)NC(=O)C(C)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CO GGYTXJNZMFRSLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001670 prosomatostatin Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 101150068026 sec-15 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050201 sec11 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 101150039954 yscA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103409 yscB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150001281 yscH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150004249 yscJ gene Proteins 0.000 description 1
- 101150091222 yscS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150018336 yscY gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
LA ALBUMINA, POR EJEMPLO LA ALBUMINA HUMANA, ES EXPRESADA Y SEGREGADA EN LA LEVADURA, QUE HA SIDO MUTADA PARA CARECER DE LA PROTEASA 3 (YAP3P) DE ASPARTIL DE LA LEVADURA O SU EQUIVALENTE, POR MEDIO DE LO CUAL SE REDUCE LA PRODUCCION DE UN FRAGMENTO DE ALBUMINA 45KD. SE CONSIGUE UNA REDUCCION ADICIONAL ELIMINANDO ADICIONALMENTE LA FUNCION FEX2P. ALTERNATIVAMENTE, SE PREPARA UNA ALBUMINA MODIFICADA QUE NO ES SUCEPTIBLE A LA PARTICION DE LA YAP3P, POR EJEMPLO LA ALBUMINA HUMANA QUE ES R410A, K413Q Y K414Q.
Description
Cepas de levadura y albúminas modificadas.
La presente invención se relaciona con la
producción de albúmina humana recombinante ("rHA") por especies
de levaduras.
La seroalbúmina humana ("HSA") es una
proteína de 585 aminoácidos responsable de una proporción
significativa de la presión osmótica del suero y funciona también
como vehículo para ligandos endógenos y exógenos. Se usa
clínicamente en el tratamiento de pacientes con quemaduras graves,
shock o pérdida de sangre y actualmente es producida comercialmente
por extracción de la sangre humana. La producción de albúmina humana
recombinante (rHA) en microorganismos ha sido descrita en EP 330.451
y EP 361.991.
En los últimos años, se han utilizado ampliamente
especies de levaduras como organismos hospedadores para la
producción de proteínas heterólogas (revisado por Romanos y col.,
1992), incluyendo la rHA (Sleep y col., 1990, 1991; Fleer y col.,
1991). Las levaduras pueden ser fácilmente sometidas a manipulación
genética, pueden crecer hasta una alta densidad celular en medios
simples y, como eucariontes, son adecuadas para la producción de
proteínas segregadas, así como citosólicas.
Cuando se utiliza S. cerevisiae para
producir rHA, la principal proteína segregada es la albúmina madura
de 67 kDa. Sin embargo, también se observa un fragmento
N-terminal de 45 kDa de la rHA (Sleep y col., 1990).
Se obtiene un fragmento similar cuando la rHA se expresa en
Kluyveromyces sp. (Fleer y col., 1991) y Pichia
pastoris (EP 510.693). El fragmento tiene la misma secuencia de
aminoácidos N-terminal que la rHA madura, pero el
extremo carboxi es heterogéneo y aparece entre Phe^{403} y
Val^{409}, siendo los extremos más comunes Leu^{407} y
Val^{409} (Geisow y col., 1991), como se muestra a
continuación.
La cantidad de fragmento producido, como
porcentaje de la rHA total segregada, varía tanto con la cepa como
con la secuencia líder de secreción utilizadas, pero nunca se reduce
a cero (Sleep y col., 1990). Hemos visto también que la cantidad de
fragmento producido en fermentación de alta densidad celular
(75-100 g/l de peso celular seco) es aproximadamente
cinco veces mayor que en cultivos en matraces con agitación.
El fragmento de albúmina de 45 kDa no es
observado en la seroalbúmina humana derivada del suero (HSA) y no es
deseable su presencia como material no idéntico al natural en el
producto recombinante. El problema que aborda la presente invención
es reducir la cantidad del fragmento de 45 kDa en el producto. La
aproximación más simple y más obvia habría sido purificarlo de la
albúmina de longitud completa, según propone
Gist-brocades en EP 524.681 (véase especialmente la
página 4, líneas 17-22). Sin embargo, hemos escogido
una aproximación diferente, a saber, tratar de evitar su producción
en primer lugar.
Sleep y col. (1990) postularon que el fragmento
de rHA se produce en la célula y no es el resultado de proteolisis
extracelular. Estos autores optimizaron por codones el ADNc de la
HSA de Glu^{382} a Ser^{419}, pero esto no tuvo efecto sobre la
producción del fragmento rHA. Observaron que un sitio potencial de
procesamiento Kex2p en la secuencia de aminoácidos de rHA,
Lys^{413}Lys^{414}, está en estrecha proximidad al extremo
carboxi heterogéneo del fragmento, pero ni el uso de una cepa
huésped kex2 (es decir, una cepa que albergue una mutación en
el gen KEX2 tal que no produzca la proteasa Kex2p) ni la
eliminación del sitio de escisión potencial por mutagénesis dirigida
a sitio del codon para Lys^{414}, dieron lugar a la reducción de
la cantidad de fragmento.
Existe una vasta variedad de proteasas de
levadura que podrían, en principio, degradar un producto proteico
deseado, incluyendo (en S. cerevisiae) yscA, yscB, yscY,
yscS, otras proteinasas vacuolares, yscD, yscE, yscF (equivalente a
kex2p), ysc\alpha, yscIV, yscG, yscH, yscJ, yscE y kexI.
Bourbonnais y col. (1991) describieron una
actividad endoproteasa de S. cerevisiae específica para
sitios monobásicos, un ejemplo de los cuales (Arg^{410}) existe en
esta región de la albúmina. Se vio posteriormente que esta actividad
era atribuible a la aspartil proteasa 3 de levaduras (Yap3)
(Bourbonnais y col., 1993), una enzima que fue originalmente
descrita por Egel-Mitani y col. (1990) como una
endoproteasa similar a Kex2p en cuanto a especificidad, en el
sentido de que escindía en residuos básicos emparejados. Un mayor
trabajo sugirió que Yap3p es capaz de escindir sitios monobásicos y
entre, y en posición C-terminal a, pares de residuos
básicos, pero que la escisión en ambos tipos de sitios es
dependiente del contexto de la secuencia (Azaryan y col., 1993;
Cawley y col., 1993).
Como ya se ha discutido, la región del extremo C
del fragmento de rHA contiene a la vez un sitio monobásico
(Arg^{410}) y uno dibásico (Lys^{413}Lys^{414}). Sin embargo,
incluso si está presente una actividad proteolítica de tipo Kex2p en
las células humanas y es responsable de la escisión de la
prosecuencia de HSA C-terminal a un par de residuos
de arginina, no se sabe que el fragmento antes discutido sea
producido en humanos. Esto indica que los residuos básicos
Arg^{410}, Lys^{413} y Lys^{414} no son reconocidos por esta
proteasa de tipo Kex2p, lo que a la vez sugiere que esta región de
la molécula puede no ser accesible a proteasas en la ruta secretora.
Así, no se podría haber predicho que la proteasa Yap3p es
responsable de la producción del fragmento de 45 kDa. Además,
Egel-Mitani y col. (1990, Yeast 6,
127-137) han mostrado que Yap3p es similar a Kex2p
en la escisión de la proferomona MF\alpha. Como la eliminación de
la función Kex2p sola no reduce la cantidad producida del fragmento,
no había razón para suponer que la eliminación de la función Yap3p
sería beneficiosa. Ciertamente, Bourbonnais y col. (1993) mostraron
que las cepas yap3 tenían una menor capacidad para procesar
la prosomatostatina y, por lo tanto, desaconsejaron la utilización
de cepas yap3 en la producción de proteínas heterólogas.
La solución al problema antes identificado es,
según la invención, evitar o al menos reducir la producción del
fragmento en la fermentación inicial, más que eliminarlo durante la
purificación de la albúmina. Hemos visto ahora que, de las 20 ó más
proteasas de levaduras que se sabe existen hasta la fecha, es
ciertamente la proteasa Yap3p la que es en gran medida responsable
del fragmento de 45 kDa de la rHA producida en levaduras. La
presente invención proporciona un método para reducir
substancialmente la cantidad de un fragmento de 45 kDa producido
cuando se segrega rHA por especies de levaduras. La reducción en la
cantidad de fragmento mejora la recuperación de rHA durante el
proceso de purificación y proporciona también una mayor calidad del
producto final. Otro beneficio, completamente inesperado, de la
utilización de cepas yap3 de levaduras es que pueden producir
un 30-50% más de rHA que las cepas que tienen la
función Yap3p. Este beneficio no puede ser explicado por la mera
reducción del fragmento de rHA de un \sim15% a un
3-5%.
Así, un aspecto de la presente invención
proporciona un procedimiento según se define en la Reivindicación
1.
Adecuadamente, la levadura es S.
cerevisiae que carece de un gen funcional YAP3. Sin
embargo, la invención no se limita al uso de S. cerevisiae,
ya que el problema de la producción del fragmento de 45 kDa aparece
también en otros géneros de levaduras, por ejemplo Pichia y
Kluyveromyces, lo que demuestra que tienen proteasas
equivalentes (es decir, actividad proteolítica Yap3p); véase Clerc y
col. (1994), página 253. Hemos confirmado esto por análisis de
hibridación para localizar homólogos de Yap3p en géneros distintos
de Saccharomyces. Se considera que un gen es un homólogo, en
general, si la secuencia del producto de la traducción tiene más de
un 50% de identidad de secuencia con Yap3p. En géneros distintos de
Saccharomyces, la proteasa de tipo Yap3p y su gen pueden ser
denominados de forma diferente, pero ello no altera, por supuesto,
su naturaleza esencial.
Se puede reducir el nivel de fragmento aún más
si, además de eliminar substancialmente la actividad proteolítica
Yap3p, se elimina también substancialmente la función Kex2p incluso
aunque, como se ha mencionado con anterioridad, la eliminación de la
función Kex2p sola no afecte al nivel del fragmento. Como en el caso
de Yap3p, la función Kex2p no se restringe a Saccharomyces;
véase Gellissen y col. (1992), especialmente la frase que enlaza las
páginas 415 y 416, que muestra que Pichia tiene una función
Kex2p. Los genes codificantes de la actividad equivalente Kex2p en
Kluyveromyces lactis y Yarrowia lipolytica han sido
clonados (Tanguy-Rougeau y col., 1988; Enderlin y
Ogrydziak, 1994).
Un medio adecuado de eliminación de la actividad
de una proteasa es alterar el gen hospedador que codifica la
proteasa, generando así una cepa que no revierte y que carece de
todo o de parte del gen para la proteasa (Rothstein, 1983).
Alternativamente, la actividad puede ser reducida o eliminada por
procedimientos clásicos de mutagénesis o por introducción de
mutaciones puntuales específicas por el procedimiento de
transposición (Winston y col., 1983). Preferiblemente, la actividad
de la enzima se reduce a como mucho el 50% del nivel del tipo
salvaje, más preferiblemente no más de un 25%, de un 10% o de un 5%,
y más preferiblemente es indetectable. El nivel de actividad
proteolítica Yap3p puede ser medido determinando la producción del
fragmento de 45 kDa, o por el ensayo de
^{125}I-\beta_{h}-lipoproteína
de Azaryan y col. (1993), también usado por Cawley y col. (1993). La
actividad proteolítica Kex2p puede ser medida de forma similar por
ensayos conocidos, por ejemplo como exponen Fuller y col.
(1989).
La albúmina puede ser una albúmina humana o una
variante de la misma, o albúmina de cualquier otro animal.
En "variantes", incluimos inserciones,
deleciones y substituciones, ya sean conservadoras o no
conservadoras, donde dichos cambios no alteran substancialmente las
propiedades oncóticas, de unión útil a ligandos o no inmunogénicas
de la albúmina. En particular, incluimos variantes polimórficas
naturales de la albúmina humana; fragmentos de albúmina humana que
incluyen la región escindida por Yap3p, por ejemplo los fragmentos
descritos en EP 322.094 (a saber, HSA (1-n), donde n
es 369 a 419), que son suficientemente largos para incluir la región
escindida por Yap3p (es decir, donde n es 403 a 419), y fusiones de
albúmina (o de porciones escindidas con Yap3p de la misma) con otras
proteínas, por ejemplo el tipo descrito en WO 90/13653.
Por "substituciones conservadoras", se
entienden cambios en grupos tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp,
Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg, y Phe, Tyr.
Dichas variantes pueden ser producidas usando los
métodos de ingeniería de proteínas y mutagénesis dirigida a sitio
que se describen a continuación.
Un segundo aspecto de la invención proporciona
una albúmina modificada que tiene al menos un 90% de identidad de
secuencia con una albúmina natural, cuya albúmina natural es
susceptible de escisión con la aspartil proteasa de la levadura
S. cerevisiae (Yap3p) cuando se expresa en levaduras,
caracterizada por el hecho de que la albúmina modificada carece de
un aminoácido monobásico en la posición equivalente a Arg^{410} en
la albúmina humana.
Convenientemente, la albúmina modificada carece
adicionalmente de un par de aminoácidos básicos presentes en la
albúmina natural, especialmente cualquiera de Lys, Lys; Lys, Arg;
Arg, Lys; o Arg, Arg. Así, en una realización particular, la
albúmina natural es albúmina humana y la proteína modificada carece
de Arg^{410} y, eventualmente, de una o ambas lisinas
Lys^{413}Lys^{414}. Por ejemplo, la albúmina modificada puede
ser albúmina humana que tenga los cambios de aminoácidos R410A,
K413Q, K414Q. Como modificaciones equivalentes en la seroalbúmina
bovina se incluyen la substitución de la Arg^{408} y/o de una o
ambas de Arg^{411}Lys^{412}. El experto en la técnica podrá
identificar sitios monobásicos y pares de residuos básicos en otras
albúminas sin dificultad.
La numeración de los residuos corresponde a la
secuencia de la albúmina humana madura normal. Si la albúmina es una
variante (por ejemplo, una forma polimórfica) que tiene una deleción
o adición neta de residuos N-terminales a la
posición identificada, entonces la numeración se refiere a los
residuos de la albúmina variante que están alineados con las
posiciones numeradas de la albúmina normal cuando las dos secuencias
están así alineadas para maximizar la homología aparente.
Un tercer aspecto de la invención proporciona un
polinucleótido codificante de dicha albúmina modificada.
El ADN se expresa en una levadura adecuada (ya
sea el ADN para una albúmina modificada o carezca la levadura de la
función Yap3p) para producir una albúmina. Así, el ADN codificante
de la albúmina puede ser usado según técnicas conocidas,
apropiadamente modificadas a la vista de las enseñanzas aquí
contenidas, para construir un vector de expresión, el cual es luego
usado para transformar una célula de levadura apropiada para la
expresión y producción de la albúmina.
El ADN codificante de la albúmina puede unirse a
una amplia variedad de otras secuencias de ADN para introducción en
un hospedador apropiado. El ADN compañero dependerá de la naturaleza
del hospedador, de la forma de introducción del ADN en el hospedador
y de si se desea mantenimiento o integración de episomas.
En general, el ADN es insertado en un vector de
expresión, tal como un plásmido, en una orientación apropiada y un
marco de lectura correcto para la expresión. Se introduce entonces
el vector en el hospedador a través de técnicas estándar y, en
general, será necesario seleccionar células huésped
transformadas.
Las células huésped que han sido transformadas
por el ADN recombinante de la invención son entonces cultivadas
durante un tiempo suficiente y en condiciones apropiadas conocidas
para los expertos en la técnica a la vista de las enseñanzas aquí
descritas para permitir la expresión y la secreción de la albúmina,
que puede ser luego recuperada, como es sabido.
Son vectores plasmídicos de levaduras útiles
pRS403-406 y pRS413-416 y se pueden
adquirir, en general, de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA
92037, EE.UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son
plásmidos de Integración de Levaduras ("YIp") e incorporan los
marcadores seleccionables de levaduras HIS3, TRP1, LEU2 y
URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos
de Centrómeros de Levaduras ("YCp"). Se describen otros
plásmidos de expresión en levaduras en
EP-A-258.067,
EP-A-286.424 y
EP-A-424.117.
Las secuencias codificantes polinucleotídicas que
codifican para la albúmina modificada de la invención pueden tener
diferencias adicionales a las requeridas para producir la albúmina
modificada. Por ejemplo, se pueden substituir diferentes codones que
codifican para el(los) mismo(s) aminoácido(s)
que los codones originales. Alternativamente, los codones
substitutos pueden codificar para un aminoácido diferente que no
afectará a la actividad o inmunogenicidad de la albúmina o que puede
mejorar su actividad o inmunogenicidad, así como reducir su
susceptibilidad a una actividad de proteasa Yap3p. Por ejemplo, se
puede emplear la mutagénesis dirigida a sitio u otras técnicas para
crear mutaciones únicas o múltiples, tales como substituciones,
inserciones, deleciones y transposiciones, según describen Botstein
y Shortle (1985). Dado que dichas secuencias codificantes
modificadas pueden ser obtenidas por aplicación de técnicas
conocidas a las enseñanzas aquí contenidas, dichas secuencias
codificantes modificadas quedan dentro del alcance de la invención
reivindicada.
Son ejemplos de géneros de levaduras contemplados
como útiles en la práctica de la presente invención Pichia,
Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Hansenula
(ahora reclasificada como Pichia), Histoplasma,
Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces,
Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus,
Sporidiobolus, Endomycopsis y similares. Son géneros preferidos
los seleccionados entre el grupo consistente en Pichia,
Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia y Hansenula. Son
ejemplos de Saccharomyces sp. S. cerevisiae, S. italicus y
S. rouxii. Son ejemplos de Kluyveromyces sp. K.
fragilis y K. lactis. Son ejemplos de Hansenula
(Pichia) sp. H. polymorpha (ahora Pichia
augusta), H. anomala (ahora P. anomala) y P.
pastoris. Y. lipolytica es un ejemplo de una especie de
Yarrowia adecuada.
Se enseñan métodos para la transformación de
S. cerevisiae, en general, en EP 251.744, EP 258.067 y WO
90/01063. Como promotores adecuados para S. cerevisiae se
incluyen los asociados al gen PGK1, a los genes GAL1 o
GAL10, a CYC1, PHO5, TRP1, ADH1, ADH2, los genes para la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, la hexokinasa, la piruvato descarboxilasa, la
fosfofructokinasa, la triosa fosfato isomerasa, la fosfoglucosa
isomerasa, la glucokinasa, la feromona de factor de acoplamiento
\alpha, la feromona de factor de acoplamiento a, el promotor
PRB1, el promotor GPD1 y promotores híbridos que
incluyen híbridos de partes de regiones reguladoras 5' con partes de
regiones reguladoras 50 de otros promotores o con sitios de
activación contracorriente (por ejemplo, el promotor de
EP-A-258.067).
Son promotores regulables convenientes para uso
en Schizosaccharomyces pombe el promotor represible por
tiamina del gen nmt descrito por Maundrell (1990) y el
promotor del gen fbp1 represible por glucosa descrito por
Hoffman y Winston (1990).
Se enseñan métodos de transformación de
Pichia para la expresión de genes extraños en, por ejemplo,
Cregg y col. (1993) y varias patentes de Phillips (por ejemplo,
EE.UU. 4.857.467) y se puede disponer de kits comerciales para la
expresión de Pichia de BV, Leek, Países Bajos, e Invitrogen
Corp., San Diego, California. Como promotores adecuados se incluyen
AOX1 y AOX2.
El artículo de Gellissen y col. (1992) antes
citado y Gleeson y col. (1986), J. Gen. Microbiol.
132, 3459-3465, incluyen información sobre
vectores y transformación de Hansenula, siendo promotores
adecuados MOX1 y FMD1, mientras que EP 361.991, Fleer
y col. (1991) y otras publicaciones de Rhône-Poulenc
Rorer muestran cómo expresar proteínas extrañas en
Kluyveromyces spp., siendo un promotor adecuado
PGK1.
La señal de finalización de la transcripción es
preferiblemente la secuencia flanqueante 3' de un gen eucariótico
que contiene señales apropiadas para la finalización de la
transcripción y la poliadenilación. Pueden ser secuencias
flanqueantes 3' adecuadas, por ejemplo, las del gen unido de forma
natural a la secuencia usada de control de la expresión, es decir,
que pueden corresponder al promotor. Alternativamente, pueden ser
diferentes, en cuyo caso se prefiere la señal de finalización del
gen ADH1 de S. cerevisiae.
La albúmina se expresa inicialmente con una
secuencia líder de secreción, que puede ser cualquier líder efectivo
en la levadura escogida. Como líderes útiles en S. cerevisiae
se incluyen el del polipéptido \alpha del factor de acoplamiento
(MF\alpha-1) y los líderes híbridos de
EP-A-387.319. Dichos líderes (o
señales) son escindidos por la levadura antes de liberarse la
albúmina madura al medio circundante. Cuando la cepa de levadura
carece de actividad Kex2P (o equivalente), y siendo yap3,
puede ser ventajoso seleccionar un líder de secreción que no
necesite ser escindido de la albúmina por Kex2p. Dichos líderes
incluyen los de la invertasa (SUC2) descritos en JP
62-096086 (concedida como 91/036516), la fosfatasa
ácida (PHO5), la presecuencia de
MF\alpha-1, la \beta-glucanasa
(BGL2) y la toxina asesina de S. cerevisiae; la
glucoamilasa II de S. diastaticus; la
\alpha-galactosidasa de s. carlsbergensis
(MEL1); la toxina asesina de K. lactis, y la
glucoamilasa de Candida.
Se describirán ahora diversas realizaciones no
limitantes de la invención a modo de ejemplos y en relación a los
dibujos adjuntos, en donde:
La Figura 1 es un esquema general para la
construcción de plásmidos de expresión de rHA mutada, en donde HA es
una secuencia codificante de la albúmina humana, L es una secuencia
codificante de un líder de secreción, P es el promotor PRB1, T es el
finalizador ADH1, amp es un gen de resistencia a ampicilina y LEU2
es el marcador seleccionable de leucina.
La Figura 2 es un dibujo que representa un
análisis de Western blot de rHA mutante segregada por S.
cerevisiae, en donde Banda A representa el sobrenadante de
cultivo de DB1 cirº pAYE316 (rHA normal), Banda B representa el
sobrenadante de cultivo de DB1 cir^{+} pAYE464 (alteración 1) y
Banda C representa el sobrenadante de cultivo de DB1 cir^{+}
pAYE468 (alteración 3).
La Figura 3 es un esquema de la construcción de
pAYE515.
La Figura 4 es una comparación de la producción
del fragmento rHA por cepas de tipo salvaje y alteradas en las
proteasas, presentada como dibujo de un Western blot
anti-HSA del sobrenadante de cultivo de cultivos en
matraces con agitación separados por SDS 10%/PAGE, en donde Banda A
corresponde a DB1 cirº pAYE316, Banda B corresponde a DXY10cirº
pAYE316 (cepa yap3) y Banda C corresponde a ABB50 cirº
pAYE316 (cepa yap3, kex2).
La Figura 5 es similar a la Figura 4, pero
muestra el Phastgel de SDS al 12,5% teñido con Coomassie Azul
Brillante (Pharmacia) de sobrenadantes de cultivo de fermentaciones
de alimentación intermitente, a saber, Banda D para el patrón de
HSA, Banda E para DB1 cirº pAYE316, Banda F para DB1
\Deltakex2 cirº pAYE522 y Banda G para DXY10 cirº
pAYE522.
La Figura 6 es un esquema para la construcción de
pAYE519.
Todos los procedimientos estándar de ADN
recombinante son como se describe en Sambrook y col. (1989) a menos
que se indique en contrario. Las secuencias de ADN codificantes de
HSA derivan del ADNc descrito en EP 201.239.
Con objeto de investigar el papel de las
endoproteasas en la generación del fragmento de rHA, se modificó el
ADNc HSA (SEC1 (que incluye una secuencia codificante de la
secuencia líder de secreción artificial de WO 90/01063)) por
mutagénesis dirigida a sitio. Se hicieron tres cambios por separado
en la secuencia de la HSA (SEC2). El primero, usando el cebador
mutagénico FOG1, cambió sólo el codon Arg^{410}, substituyéndolo
con un codon de Ala, dejando intacto el sitio dibásico
Lys^{413}Lys^{414}. El segundo cambio, usando el cebador FOG2,
cambió los residuos 407-409, incluyendo los residuos
C-terminales del fragmento, de LeuLeuVal a
AlaValAla. El tercer cambio, usando el cebador FOG3, alteró los
residuos 410-414 de ArgTyrThrLysLys (SEC3) a
AlaTyrThrGlnGln (SEC4). Los oligonucleótidos codificaban no sólo
para los cambios de aminoácidos, sino también para cambios de bases
conservadores que crean un sitio de restricción PvuII o
SpeI en los mutantes para facilitar la detección de las
secuencias alteradas.
Se usó ADN de una sola hebra de un clon M13mp19,
mp19.7 (EP 201.239; Figura 2), que contenía el ADNc HSA como
plantilla para las reacciones de mutagénesis usando el Sistema de
Mutagénesis In Vitro, Versión 2 (Amersham International plc)
según las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron placas
individuales y se secuenciaron para confirmar la presencia de las
mutaciones. Se preparó entonces ADN RF de doble hebra a partir de
clones con los cambios esperados y se cortó el ADN portador de la
mutación en un fragmento XbaI/SacI (Figura 1). Se usó
éste para substituir el fragmento de tipo salvaje correspondiente de
pAYE309 (EP 431.880; Figura 2). Se comprobó la presencia del
fragmento XbaI/SacI mutado en el plásmido por
digestión con PvuII o SpeI según resultara apropiado.
Estos fragmentos HindIII fueron cortados e insertados en el
vector de expresión pAYE219 (Figura 1) para generar los plásmidos
pAYE464 (alteración 1, R410A), pAYE470 (alteración 2, L407A, L408V,
V409A) y pAYE468 (alteración 3, R410A, K413Q, K414Q). Estos
plásmidos de expresión contienen el promotor PRB1 de S.
cerevisiae (WO 91/02057), que dirige la expresión de la
secuencia líder HSA/MF\alpha1 (WO 90/01063) fusionada en marco con
la secuencia codificante de HA mutada, que va seguida del
finalizador de la transcripción ADH1. Los plásmidos también
contienen parte del plásmido de 2 \mum para disponer de funciones
de replicación y el gen LEU2 para la selección de
transformantes.
Se introdujeron pAYE464, pAYE470 y pAYE468 en
S. cerevisiae DB1 cir^{+} (a.leu2; Sleep y col.,
1990) por transformación y se cultivaron los transformantes
individuales durante 3 días a 30ºC en 10 ml de YEPS (1% p/v de
extracto de levadura, 2% p/v de peptona, 2% p/v de sacarosa) y se
examinaron luego los sobrenadantes por Western blot
anti-HSA en cuanto a la presencia del fragmento de
rHA. Los Western blots mostraron claramente que el fragmento aún era
producido por las cepas que albergaban pAYE464, aunque el nivel se
redujo ligeramente en comparación con el control que expresaba rHA
de tipo salvaje. Las mutaciones en el plásmido pAYE470 parecían no
tener ningún efecto sobre la generación del fragmento. Sin embargo,
DB1 cir^{+} pAYE468 mostró un nuevo patrón de bandas relacionadas
con la HSA, con pocos o ningún fragmento.
Se cultivó un ejemplo de cada de DB1 cir^{+}
pAYE464 y DB1 cir^{+} pAYE468 a alta densidad celular por cultivo
intermitente alimentado en medio mínimo en un fermentador (Collins,
1990). Resumiendo, se llenó un fermentador de 10 l de volumen
operativo hasta 5 l con un medio intermitente inicial que contenía
50 ml/l de una mezcla de sales concentrada (Tabla 1), 10 ml/l de una
solución de elementos traza (Tabla 2), 50 ml/l de una mezcla de
vitaminas (Tabla 3) y 20 g/l de sacarosa. Se mantuvo igual volumen
de medio de alimentación que contenía 100 ml/l de la mezcla de
sales, 20 ml/l de la mezcla de elementos traza, 100 ml/l de solución
de vitaminas y 500 g/l de sacarosa en un recipiente aparte conectado
al fermentador por una bomba dosificadora. Se mantuvo el pH a 5,7
\pm 0,2 por adición automática de hidróxido de amonio o de ácido
sulfúrico y se mantuvo la temperatura a 30ºC. Se ajustó la velocidad
del agitador para dar una tensión de oxígeno disuelto de >20% de
saturación del aire a una velocidad de flujo del aire de 1
v/v/min.
| Compuesto químico | Concentración (g/l) |
| KH_{2}PO_{4} | 114,0 |
| MgSO_{4} | 12,0 |
| CaCl_{2}\cdot6H_{2}O | 3,0 |
| Na_{2}EDTA | 2,0 |
| Compuesto químico | Concentración (g/l) |
| ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O | 3,0 |
| FeSO_{4}\cdot7H_{2}O | 10,0 |
| MnSO_{4}\cdot4H_{2}O | 3,2 |
| CuSO_{4}\cdot5H_{2}O | 0,079 |
| H_{3}BO_{3} | 1,5 |
| KI | 0,2 |
| Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O | 0,5 |
| CoCl_{2}\cdot6H_{2}O | 0,56 |
| H_{3}PO_{4} | 75 ml/l |
| Compuesto químico | Concentración (g/l) |
| Ca pantotenato | 1,6 |
| Ácido nicotínico | 1,2 |
| m-inositol | 12,8 |
| Tiamina HCl | 0,32 |
| Piridoxina HCl | 0,8 |
| Biotina | 0,008 |
Se inoculó el fermentador con 100 ml de un
cultivo de una noche de S. cerevisiae crecido en medio mínimo
tamponado (base nitrogenada de Levadura [sin aminoácidos, sin
sulfato de amonio, Difco] 1,7 g/l, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5
g/l, ácido cítrico monohidrato 6,09 g/l, Na_{2}HPO_{4} 20,16
g/l, sacarosa 20 g/l, pH 6,5). La fermentación intermitente inicial
procedió hasta que se hubo consumido la fuente de carbono, en cuyo
punto se conectó una bomba dosificadora y se controló por ordenador
la adición de la alimentación (microsistema MFCS, B. Braun,
Melsungen, Alemania) usando un algoritmo basado en el desarrollado
por Wang y col. (1979). Se usó un espectrómetro de masas junto con
el sistema de control por ordenador para monitorizar los gases
desprendidos de la fermentación y para controlar la adición de
alimentación con objeto de mantener una velocidad de crecimiento
establecida (por ejemplo, 0,1 h^{-1}). Se consigue una conversión
máxima de substrato carbonado en biomasa manteniendo el coeficiente
respiratorio por debajo de 1,2 (Collins, 1990) y, gracias a esto, se
pueden conseguir densidades celulares de aproximadamente 100 g/l de
peso celular seco. Se compararon los sobrenadantes de cultivo con
los de un productor de rHA de tipo salvaje por SDS/PAGE teñida con
Coomassie y por Western blot. Éstos indicaron (Figura 2) que,
mientras que la eliminación de la Arg^{410} monobásica (pAYE464)
sí reducía el nivel del fragmento en un cantidad útil, la
eliminación de ambos sitios de proteasas potenciales (pAYE468) casi
abolió el fragmento de 45 kDa.
Los datos anteriores sugerían que la generación
del fragmento de rHA podría ser debida a ataque endoproteolítico,
aunque la ausencia de un efecto de eliminación del sitio potencial
Kex2p Lys^{413}Lys^{414} (Sleep y col., 1990, y confirmado por
otros estudios no indicados aquí), a menos que se combine con la
eliminación de Arg^{410}, había sugerido una etiología compleja.
La reducción de la cantidad de fragmento con la rHA mutada podría,
en principio, ser debida a un efecto de los cambios sobre la
cinética de plegamiento de la molécula y no a la eliminación de los
sitios de escisión de las proteasas.
Se mutó el gen YAP3 codificante de la
aspartil proteasa 3 de levaduras mediante el proceso de disrupción
génica (Rothstein 1983), que eliminaba de forma efectiva parte de la
secuencia codificante de YAP3, evitando así la producción de
Yap3p activo.
Se sintetizaron cuatro oligonucleótidos adecuados
para la amplificación por PCR de los extremos 5' y 3' del gen
YAP3 (Egel-Mitani y col., 1990) usando un
Sintetizador de Oligonucleótidos Applied Biosystems 380B. Para
ayudar al lector, incluimos como SEC15 la secuencia del gen
YAP3, de la cual la secuencia codificante es
541-2250.
extremo
5'
YAP3A:
5'-CGTCAGACCTTGCATGCAGCCAAGACACCCTCACATAGC-3'
(SEC5)
YAP3B:
5'-CCGTTACGTTCTGTGGTGGCATGCCCACTTCCAAGTCCACCG-3'
(SEC6)
extremo
3'
YAP3C:
5'-GCGTCTCATAGTGGAAAAGCTTCTAAATACGACAACTTCCCC-3'
(SEC7)
YAP3D:
5'-CCCAAAATGGTACCTGTGTCATCACTCGTTGGGATAATACC-3'
(SEC8)
Se llevaron a cabo reacciones de PCR para
amplificar individualmente los extremos 5' y 3' del gen YAP3
del ADN genómico de S. cerevisiae (Clontech Laboratories,
Inc.). Las condiciones eran las siguientes: 2,5 \mug/ml de ADN
genómico, 5 \mug/ml de cada cebador, desnaturalizar a 94ºC durante
61 segundos, hibridar a 37ºC durante 121 segundos, prolongar a 72ºC
durante 181 segundos durante 40 ciclos, seguido de un mantenimiento
a 4ºC, usando un ciclador térmico
Perkin-Elmer-Cetus y un kit de PCR
Perkin-Elmer-Cetus según las
recomendaciones del fabricante. Se analizaron los productos por
electroforesis en gel y se vio que eran del tamaño esperado. Se
digirió el fragmento 5' con SphI y se clonó en el sitio
sphI de pUC19HX (pUC19 que carecía de un sitio
HindIII), para dar pAYE511 (Figura 3), en donde la
orientación es tal que YAP3 se transcribirá hacia el sitio
KpnI del policonector pUC19HX. Se digirió el fragmento
YAP3 3' con HindIII y Asp718 (un isoesquizómero
de KphI) y se ligó en pUC19 digerido con
HindIII/Asp718 para dar pAYE512. Se realizó la
secuenciación del ADN plasmídico sobre los insertos para confirmar
que se habían clonado las secuencias deseadas. Se subclonó entonces
el fragmento HindIII/Asp718 de pAYE512 en los sitios
correspondientes de pAYE511 para obtener pAYE513 (Fig. 3), en donde
las regiones 5' y 3' de YAP3 están correctamente orientadas
con un sitio HindIII único entre ellas. Se aisló el gen
URA3 de YEp24 (Botstein y col., 1979) como un fragmento
HindIII y se insertó después en este sitio para obtener
pAYE515 (Fig. 3), con URA3 flanqueado por las regiones 5' y
3' de YAP3, y se transcribió en la dirección opuesta a
YAP3.
Se obtuvo un derivado ura3 de la cepa DB1
cirº pAYE316 (Sleep y col., 1991) por mutagénesis química aleatoria
y selección en cuanto a resistencia al ácido
5-fluoroorótico (Boeke y col., 1987). Se cultivó la
cepa durante la noche en 100 ml de medio mínimo tamponado y se
recogieron las células por centrifugación y se lavaron después una
vez con agua estéril. Se resuspendieron entonces las células en 10
ml de agua estéril y se pusieron alícuotas de 2 ml en tubos Falcon
de 15 ml por separado. Se añadió entonces una solución de 5 mg/ml de
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) a los tubos como sigue: 0 \mul, 20 \mul, 40 \mul, 80
\mul ó 160 \mul. Se incubaron entonces las células a 30ºC
durante 30 minutos y se centrifugaron después y se lavaron tres
veces con agua estéril. Finalmente, se resuspendieron las células en
1 ml de YEP (1% p/v de extracto de levadura, 2% p/v de Bacto
pectona) y se guardaron a 4ºC. Se determinó el porcentaje de células
que sobrevivieron al tratamiento mutagénico extendiendo diluciones
de las muestras en placas de YEP que contenían un 2% p/v de sacarosa
e incubando a 30ºC durante 3 días. Se cultivaron las células del
tratamiento que dieron aproximadamente un 50% de supervivencia en
placas de YEP que contenían un 2% p/v de sacarosa y se plaquearon
luego en réplicas en medio mínimo YNB que contenía un 2% p/v de
sacarosa y suplementado con ácido 5-fluoroorótico (1
mg/ml) y uracilo (50 \mug/ml). Se purificaron las colonias capaces
de crecer en este medio, se estudiaron para verificar que eran
incapaces de crecer en ausencia de suplementación de uracilo y que
este defecto podía ser corregido por introducción del gen
URA3 por transformación. Se transformó una de tales cepas,
DBU3 cirº pAYE316, con el fragmento SphI/Asp718
YAP3-URA3-YAP3 de pAYE515 con
selección de las colonias Ura^{+}. Se sondó un Southern blot del
ADN genómico digerido de una serie de transformantes con los
extremos 5' y 3' del gen YAP3 y se confirmó la disrupción del
gen YAP3. Un Western blot anti-HSA de
sobrenadantes de matraces en agitación con YEPS de dos
transformantes indicó que la disrupción de YAP3 redujo
marcadamente los niveles de fragmento de rHA.
Se cultivó varias veces un derivado yap3
de DBU3 cirº pAYE316, designado como DXY10 cirº pAYE316, por
fermentación de alimentación intermitente en medio mínimo hasta
obtener un peso seco celular elevado. Cuando se examinaron los
sobrenadantes por PAGE teñida con Coomassie y Western blot
anti-HSA (Figs. 4 y 5), la reducción en el nivel del
fragmento de 45 kDa de rHA era claramente aparente; los cálculos de
la cantidad de producto de degradación varían entre 1/3 y 1/5 de los
niveles observados con el YAP3 parental. La cantidad de rHA
producida no resultó afectada de forma adversa por la mutación
yap3; ciertamente, se vio que DXY10 cirº pAYE316 producía un
30-50% más de rHA que el equivalente YAP3,
DB1 cirº pAYE316. A pesar del hecho de que la escisión de la
secuencia líder de la secuencia HA es C-terminal a
un par de residuos básicos, se vio que la rHA tenía el extremo N
correcto.
Se centrifugó el caldo de fermentación para
eliminar las células y someter luego a purificación cromatográfica
de afinidad como sigue. Se pasó el sobrenadante de cultivo a través
de una columna Cibacron Blue F3GA Sepharose (Pharmacia), que fue
entonces lavada con tampón de glicina fosfato 0,1 M, pH 8,0. Se
eluyó entonces la rHA de la columna con NaCl 2 M, glicina fosfato
0,1 M, pH 8,0, en cuyo punto era >95% pura. Se puede purificar
aún más por técnicas conocidas en este campo.
La albúmina puede ser alternativamente purificada
del medio de cultivo por cualquiera de la variedad de técnicas
conocidas para purificar albúmina del suero o del medio del cultivo
de fermentación, por ejemplo las descritas en WO 92/04367, Maurel y
col. (1989), Curling (1980) y EP 524.681.
Para construir una cepa carente de actividad
tanto Yap3p como Kex2p, se obtuvo un derivado lys2 de la cepa
de levadura DXY10 cirº (pAYE316) por mutagénesis química aleatoria y
selección en cuanto a resistencia a
\alpha-aminoadipato (Barnes y Thorner, 1985). Se
mutagenizaron las células como en el Ejemplo 2 y se plaquearon
después sobre medio mínimo YNB que contenía un 2% p/v de sacarosa y
suplementado con 2 mg/ml de
DL-\alpha-aminoadipato como única
fuente de nitrógeno y 30 \mug/ml de lisina. Se purificaron las
colonias capaces de crecer en este medio y se estudiaron para
verificar que eran incapaces de crecer en ausencia de suplementación
con lisina y que este defecto podía ser corregido por introducción
del gen LYS2 por transformación. Se mutó entonces esta cepa
por el proceso de disrupción génica, que desorganizó de forma
efectiva parte de la secuencia codificante KEX2, evitando así
la producción de Kex2p activo. Para ayudar al lector, se reproduce
aquí la secuencia del gen KEX2 como SEC14, de la cual la
secuencia codificante es 1329-3773.
Se sintetizaron cuatro oligonucleótidos adecuados
para la amplificación por PCR de los extremos 5' y 3' del gen
KEX2 (Fuller y col., 1989) usando un Sintetizador de
Oligonucleótidos Applied Biosystems 380B.
extremo
5'
KEX2A:
5'-CCATCTGGATCCAATGGTGCTTTGGCCAAATAAATAGTTTCAGC-3'
(SEC9)
KEX2B:
5'-GCTTCTTTTACCGGTAACAAGCTTGAGTCCATTGG-3'
(SEC10)
extremo
3'
KEX2C:
5'-GGTAAGGTTTAGTCGACCTATTTTTTGTTTTGTCTGC-3'
(SEC11)
KEX2D:
5'-GGAAACGTATGAATTCGATATCATTGATACAGACTCTGAGTACG-3'
(SEC12)
Se llevaron a cabo reacciones de PCR para
amplificar individualmente los extremos 5' y 3' del gen KEX2
del ADN genómico de S. cerevisiae (Clontech Laboratories
Inc.). Las condiciones eran las siguientes: 2,5 \mug/ml de ADN
genómico, 5 \mug/ml de cada cebador, desnaturalizar a 94ºC durante
61 segundos, hibridar a 37ºC durante 121 segundos, prolongar a 72ºC
durante 181 segundos durante 40 ciclos, seguido de un mantenimiento
a 4ºC, usando un Ciclador Térmico
Perkin-Elmer-Cetus y un kit de PCR
Perkin-Elmer-Cetus según las
recomendaciones del fabricante. Se analizaron los productos por
electroforesis en gel y se vio que eran del tamaño esperado (0,9 kb
para el producto 5' y 0,62 kb para el producto 3'). Se digirió el
producto 5' con BamHI y HindIII y se digirió el
producto 3' con HindIII y SalI y se clonaron luego los
dos fragmentos conjuntamente en pUC19HX digerido con BamHI y
SalI. Se insertó entonces un fragmento HindIII de 4,8
kb que contenía el gen LYS2 de S. cerevisiae (Barnes y
Thorner, 1985) en el plásmido resultante en HindIII (es
decir, entre los dos fragmentos KEX2) para formar pAYE519
(Fig. 6).
Se transformó el derivado lys2 de DXY10
cirº (pAYE316), lys2-16, con el fragmento
KEX2-LYS2-KEX2 de 6,0 kb de
pAYE519, seleccionando las colonias Lys^{+}. Se sondó un Southern
blot de ADN genómico digerido de una serie de transformantes con los
extremos 5' y 3' del gen KEX2 y se confirmó la disrupción del
gen KEX2. Un Western blot anti-HSA de
sobrenadantes de cultivo en matraces en agitación con YEPS de estos
transformantes indicó que la disrupción de KEX2 en una cepa
yap3 reducía el nivel del fragmento de rHA aún más a pesar de
la falta de un efecto de disrupción de KEX2 solo en el
siguiente Ejemplo 4. El análisis de la rHA producida por una cepa de
este tipo, ABB50, indicó que la secuencia líder era procesada
incorrectamente, dando lugar a un extremo N anormal.
Se curó la cepa ABB50 (pAYE316) de este plásmido
(Sleep y col., 1991) y se transformó con un plásmido similar,
pAYE522, en donde se substituyó la secuencia líder híbrida por la
secuencia líder de la invertasa de S. cerevisiae
(SUC2), de tal forma que el líder codificado y la unión con
la secuencia de HSA eran como sigue:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ MLLQAFLFLLAGFAAKISA \downarrow DAHKS \+ (SEC13)\cr \+ Líder de
invertasa \hskip2cm
HSA\+\cr}
En esta construcción, la escisión de la secuencia
líder de HSA no se basa en la actividad de la proteasa Kex2. Se vio
que la cepa ABB50 (pAYE522) producía rHA con un nivel similarmente
muy bajo de fragmento de rHA, pero en este caso el extremo N
correspondía al de la HSA derivada del suero, es decir, que había
una eliminación eficiente y precisa de la secuencia líder.
Mediante un método similar al descrito en el
Ejemplo 3, se desorganizó el gen KEX2 en S.
cerevisiae. Esta cepa tenía la actividad proteolítica Yap3p y no
quedaba, por lo tanto, dentro del alcance de la invención. Cuando se
cultivó esta cepa en fermentación de alimentación intermitente, la
rHA producida contenía cantidades similares de fragmento a las
producidas por cepas con un gen KEX2 intacto. Además, el
nivel global de rHA se redujo y la secuencia líder no era
correctamente procesada, dando lugar a un extremo N anormal.
Tal como se ha indicado anteriormente, las
levaduras distintas de Saccharomyces producen de forma
similar el fragmento no deseado de rHA y, por lo tanto, tienen la
actividad proteolítica Yap3p. Lo hemos confirmado realizando
hibridaciones Southern del ADN de Pichia angusta usando el
gen YAP3 de S. cerevisiae como sonda. Se identificó un
fragmento de ADN específico, mostrando que no sólo está presente la
actividad proteolítica Yap3p en P. angusta, sino que también
está presente un homólogo específico del gen YAP3.
Se puede adaptar el método de hibridación
Southern usado para la detección del homólogo de YAP3 para
clonar la secuencia génica de una librería de ADN genómico de ADN de
Pichia usando procedimientos estándar (Sambrook y col.,
1989). Se puede conseguir la disrupción del homólogo de YAP3
en Pichia sp. usando técnicas similares a las usadas
anteriormente para Saccharomyces (Cregg y Madden, 1987).
Azaryan, A.V. y col. (1993). J.
Biol. Chem. 268, 11968-11975.
Barnes, D.A. y Thorner, J.
(1985). En Gene Manipulations in Fungi (Bennett, J.W.
y Lasure, L.L., eds.), pp. 197-226, Academic
Press.
Boeke, J.D. y col. (1987).
Methods Enzymol. 154, 164-175.
Botstein, D. y col. (1979).
Gene 8, 17-24.
Botstein y Shortle (1985)
Science 229, 193-210.
Bourbonnais, Y. y col. (1991).
J. Biol. Chem. 266, 13203-13209.
Bourbonnais, Y. y col. (1993).
EMBO J. 12, 285-294.
Cawley, N.X. y col. (1993). FEBS
Lett. 332, 273-276.
Clerc y col. (1994). J. Chromat.
B. 662, 245-259.
Collins, S.H. (1990). En
Protein Production by Biotechnology (Harris, T.J.R., ed.), pp.
61-77, Elsevier Science Publishers, Barking,
Essex.
Cregg, J.M. y Madden, K.R.
(1987). En Biological Research on Industrial Yeasts.
Vol. II. Stewart, G.G., Russell, I., Klein, R.D. y Hiebsch, R.R.
(Eds.), CRC Press, Boca Ratón, FL.
Cregg y col. (1993).
Bio/Technology 11, 905-910.
Curling (1980). "Albumin
Purification by Ion Exchange Chromatography", en "Methods of
Plasma Protein Purification", Ed. Curling, J.M., Academic Press,
Londres.
Enderlin, C.S. y Ogrydziak, D.M.
(1994). Yeast 10, 67-79.
Fleer, R. y col. (1991).
Bio/Technology 9, 968-975.
Fuller, R.S. y col. (1989).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,
1434-1438.
Geisow, M.J. y col. (1991). .
En Techniques in Protein Chemistry II, pp.
567-572, Academic Press, Inc.
Gellissen y col. (1992).
Tibtech 10, 413-417.
Hoffmann y Winston (1990).
Genetics 124, 807-816.
Maundrell (1990). J. Biol.
Chem. 265, 10857-10864.
Maurel y col. (1989).
"Biotechnology of Plasma Proteins", Colloque INSERM
175, 19-24.
Romanos, M.A. (1992). Yeast 8, 423-488.
Rothstein, R.J. (1983). Methods
Enzymol. 101, 203-211.
Sambrook, J. y col. (1989).
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Sleep, D. y col. (1990).
Bio/Technology 8, 42-46.
Sleep, D. y col. (1991).
Bio/Technology 9, 183-187.
Tanguy-Rougeau, C. y col.
(1988). FEBS Lett. 234,
464-470.
Wang, H.Y. y col. (1979).
Biotech. & Bioeng. 21, 975.
Winston, F. y col. (1983).
Methods Enzymol. 101, 211-228.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Delta Biotechnology Limited
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Castle Court, Castle Boulevard
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nottingham
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nottinghamshire
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): NG7 1FD
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cepas de levaduras y albúminas modificadas
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE DE ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flotante
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.830 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73..1827
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 585 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Tyr Thr Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Tyr Thr Gln Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCAGACCT TGCATGCAGC CAAGACACCC TCACATAGC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGTTACGTT CTGTGGTGGC ATGCCCACTT CCAAGTCCAC CG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGTCTCATA GTGGAAAAGC TTCTAAATAC GACAACTTCC CC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCAAAATGG TACCTGTGTC ATCACTCGTT GGGATAATAC C
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATCTGGAT CCAATGGTGC TTTGGCCAAA TAAATAGTTT CAGC
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTCTTTTA CCGGTAACAA GCTTGAGTCC ATTGG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTAAGGTTT AGTCGACCTA TTTTTTGTTT TGTCTGC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAAACGTAT GAATTCGATA TCATTGATAC AGACTCTGAG TACG
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala
Gly Phe Ala Ala Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Ile Ser Ala Asp Ala His Lys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4.106 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.526 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
Claims (21)
1. Un procedimiento para preparar albúmina,
consistente en cultivar una levadura en un medio de cultivo tal que
se segregue la albúmina al medio, cuya levadura ha sido
genéticamente modificada para producir y segregar la albúmina,
caracterizado por el hecho de que la levadura ha sido también
modificada para reducir la actividad de la aspartil proteasa 3 de la
levadura por disrupción del gen codificante de la proteasa, o por
procedimientos de mutagénesis clásicos o introduciendo una mutación
puntual específica.
2. Un procedimiento para preparar albúmina por
secreción por parte de una levadura genéticamente modificada para
producir y segregar la albúmina, consistente en cultivar la levadura
en un medio de cultivo tal que la albúmina se segregue al medio,
caracterizado por carecer la levadura de un gen YAP3
funcional o de un homólogo del mismo codificante de una proteína que
tiene la actividad proteolítica de la aspartil proteasa 3 de
levaduras.
3. Un procedimiento según la Reivindicación 1 ó
2, donde la levadura es S. cerevisiae.
4. Un procedimiento según la Reivindicación 1 ó
2, donde la levadura es Pichia.
5. Un procedimiento según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, donde las células de levadura tienen
adicionalmente un nivel reducido de actividad proteolítica Kex2p de
S. cerevisiae.
6. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la albúmina es una albúmina
humana.
7. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la albúmina es purificada a
partir del medio de cultivo para obtener albúmina purificada.
8. Un cultivo de células de levadura que
contienen una secuencia polinucleotídica codificante de una albúmina
y una segunda secuencia polinucleotídica codificante de una señal de
secreción que hace que la albúmina expresada por la primera
secuencia polinucleotídica sea segregada por la levadura,
caracterizado por haber sido modificada la levadura para
reducir la actividad aspartil proteasa 3 de la levadura por
disrupción del gen codificante de la proteasa, o por procedimientos
clásicos de mutagénesis o por introducción de una mutación puntual
específica.
9. Un cultivo según la Reivindicación 8, donde la
levadura carece de un gen YAP3 funcional o de un homólogo del
mismo codificante de una proteína que tiene la actividad
proteolítica de la aspartil proteasa 3 de levaduras.
10. Un cultivo según la Reivindicación 8 ó 9,
donde la albúmina es una albúmina humana.
11. Un cultivo según cualquiera de las
Reivindicaciones 8 a 10, donde la levadura es S.
cerevisiae.
12. Un cultivo según cualquiera de las
Reivindicaciones 8 a 11, donde dicha señal es escindida por la
levadura antes de la liberación de la albúmina por la levadura.
13. Un cultivo según cualquiera de las
Reivindicaciones 8 a 12, donde las células de levadura tienen
adicionalmente un nivel reducido de actividad proteolítica
Kex2p.
14. Un cultivo según la reivindicación 13, donde
dicha señal de secreción es escindida de la albúmina por una
proteasa distinta de Kex2p.
15. Una albúmina modificada que tiene al menos
una identidad de secuencia del 90% con una albúmina natural, cuya
albúmina natural es susceptible de escisión con aspartil proteasa 3
de levadura (Yap3p) cuando se expresa y segrega en levaduras,
caracterizada por el hecho de que la albúmina modificada
carece de un aminoácido monobásico en la posición equivalente a
Arg^{410} en la albúmina humana.
16. Una albúmina modificada según la
Reivindicación 15, donde la albúmina modificada carece
adicionalmente de un par de aminoácidos básicos presentes en la
albúmina natural.
17. Una albúmina modificada según la
Reivindicación 16, donde dicho par de aminoácidos es Lys,Lys,
Lys,Arg, Arg,Lys o Arg,Arg.
18. Una albúmina modificada según la
Reivindicación 15, donde la albúmina natural es una albúmina humana
y, eventualmente, los residuos 413 y 414 no consisten cada uno en
lisina o arginina.
19. Una albúmina modificada según la
Reivindicación 18, que es una albúmina humana que tiene los cambios
de aminoácidos R410A, K413Q, K414Q.
20. Un polinucleótido codificante de una albúmina
modificada según cualquiera de las Reivindicaciones 15 a 19.
21. Una levadura que contiene un polinucleótido
según la Reivindicación 20, señales de transcripción tales que la
albúmina modificada se exprese en la levadura y un polinucleótido
más adyacente a dicho polinucleótido, de tal forma que la albúmina
modificada sea segregada por la levadura.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9404270A GB9404270D0 (en) | 1994-03-05 | 1994-03-05 | Yeast strains and modified albumins |
| GB9404270 | 1994-03-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2216007T3 true ES2216007T3 (es) | 2004-10-16 |
Family
ID=10751353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95909880T Expired - Lifetime ES2216007T3 (es) | 1994-03-05 | 1995-03-01 | Cepas de levadura y albuminas modificadas. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5965386A (es) |
| EP (1) | EP0749478B1 (es) |
| JP (1) | JP3795073B2 (es) |
| KR (1) | KR100372514B1 (es) |
| AT (1) | ATE260338T1 (es) |
| AU (1) | AU683728B2 (es) |
| CA (1) | CA2183241C (es) |
| DE (1) | DE69532603T2 (es) |
| DK (1) | DK0749478T3 (es) |
| ES (1) | ES2216007T3 (es) |
| GB (2) | GB9404270D0 (es) |
| PT (1) | PT749478E (es) |
| WO (1) | WO1995023857A1 (es) |
Families Citing this family (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| US6110703A (en) * | 1996-07-05 | 2000-08-29 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of polypeptides |
| CN1150313C (zh) * | 1996-07-05 | 2004-05-19 | 诺沃挪第克公司 | 多肽的生产方法 |
| WO1998001473A1 (en) * | 1996-07-05 | 1998-01-15 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of precursors of insulin, precursors of insulin analogues, and insulin like peptides |
| US6274305B1 (en) | 1996-12-19 | 2001-08-14 | Tufts University | Inhibiting proliferation of cancer cells |
| US6265186B1 (en) | 1997-04-11 | 2001-07-24 | Dsm N.V. | Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces |
| AU2241699A (en) * | 1998-01-27 | 1999-08-09 | Board Of Regents Of The University And Community College System Of Nevada, The | Expression of proteolytically-sensitive peptides |
| GB9902000D0 (en) | 1999-01-30 | 1999-03-17 | Delta Biotechnology Ltd | Process |
| US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| AU2001264563A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| WO2002022685A2 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-21 | Kufe Donald W | Muc1 extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom |
| EP1531842A4 (en) * | 2000-12-22 | 2007-03-07 | Dana Farber Cancer Inst Inc | REGULATION OF CELL GROWTH BY MUC1 |
| US7507413B2 (en) | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20050054051A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| JP2003047471A (ja) * | 2001-08-01 | 2003-02-18 | Kirin Brewery Co Ltd | 異種タンパク質の分泌生産に優れた改変酵母およびその酵母を用いた異種タンパク質の製造法 |
| US7176278B2 (en) | 2001-08-30 | 2007-02-13 | Biorexis Technology, Inc. | Modified transferrin fusion proteins |
| WO2005003296A2 (en) | 2003-01-22 | 2005-01-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20080194481A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-08-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
| CA2484556A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| ES2500918T3 (es) | 2001-12-21 | 2014-10-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta |
| US7879365B2 (en) * | 2002-02-07 | 2011-02-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Zinc salt compositions for the prevention of dermal and mucosal irritation |
| WO2003066085A1 (en) | 2002-02-07 | 2003-08-14 | Delta Biotechnology Limited | Albumin-fused anti-angiogenesis peptides |
| WO2003091431A1 (fr) | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Methylotrophe produisant une chaine de sucre de type mammifere |
| AU2003237061A1 (en) * | 2002-06-29 | 2004-01-19 | Bioholdings Co., Ltd | Hansenula polymorpha yapsin deficient mutant strain and process for the preparation of recombinant proteins using the same |
| WO2004092339A2 (en) * | 2003-04-11 | 2004-10-28 | Ilex Products, Inc. | Modulation of muc1 mediated signal transduction |
| WO2005042573A1 (en) * | 2003-10-24 | 2005-05-12 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Modulation of the interaction of muc1 with muc1 ligands |
| US9057061B2 (en) | 2003-12-23 | 2015-06-16 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Gene expression technique |
| GB0329722D0 (en) | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Modified plasmid and use thereof |
| GB0329681D0 (en) | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene expression technique |
| CN1901931A (zh) * | 2004-01-07 | 2007-01-24 | 特里梅里斯公司 | HIV gp41 HR2－来源的合成肽,及其在抑制人类免疫缺陷性病毒传递的治疗中的用途 |
| CA2556729A1 (en) * | 2004-02-23 | 2005-09-09 | Genzyme Corporation | Muc1 antagonist enhancement of death receptor ligand-induced apoptosis |
| CA2581423A1 (en) | 2004-09-23 | 2006-03-30 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Polipeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
| KR20080074120A (ko) | 2005-10-13 | 2008-08-12 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 자가항체 양성 질환 환자의 치료에 유용한 방법 및 조성물 |
| AR059300A1 (es) | 2006-02-02 | 2008-03-26 | Trimeris Inc | Peptidos inhibidores de la fusion de vih con propiedades biologicas mejoradas |
| KR101193722B1 (ko) | 2006-07-24 | 2013-01-11 | 바이오렉시스 파마슈티칼 코포레이션 | 엑센딘 융합 단백질 |
| WO2008019368A2 (en) * | 2006-08-07 | 2008-02-14 | Teva Biopharmaceuticals Usa, Inc. | Albumin-insulin fusion proteins |
| KR20090060294A (ko) | 2006-09-08 | 2009-06-11 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 인간 혈장 폴리펩티드 또는 Ｆｃ 스캐폴드 및 그의 용도 |
| WO2008097840A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions relating to the regulation of muc1 by hsf1 and stat3 |
| WO2008097844A2 (en) * | 2007-02-02 | 2008-08-14 | Dana -Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by muc1 and bh3- containing proapoptotic proteins |
| EP2139526A4 (en) * | 2007-04-03 | 2010-07-14 | Trimeris Inc | NEW FORMULATIONS TO RELEASE ANTIVIRAL PEPTIDE THERAPEUTICS |
| US20110124576A1 (en) | 2007-08-08 | 2011-05-26 | Novozymes A/S | Transferrin Variants and Conjugates |
| CN101874038A (zh) * | 2007-09-25 | 2010-10-27 | 特里梅里斯公司 | 治疗性抗-hiv肽的合成方法 |
| JP2012516878A (ja) | 2009-02-06 | 2012-07-26 | ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ | 精製プロセス |
| DK2396347T3 (en) | 2009-02-11 | 2017-07-24 | Albumedix As | ALBUMIN VARIANTS AND CONJUGATES |
| JP2013509170A (ja) * | 2009-10-30 | 2013-03-14 | ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ | アルブミン変異体 |
| ES2550761T3 (es) | 2009-11-25 | 2015-11-12 | Novo Nordisk A/S | Método para producción de polipéptidos |
| CN102781960B (zh) | 2010-02-16 | 2014-12-10 | 米迪缪尼有限公司 | Hsa相关组合物及使用方法 |
| JP5883780B2 (ja) * | 2010-03-26 | 2016-03-15 | アサヒグループホールディングス株式会社 | 酵母の培養方法 |
| EP2556087A1 (en) | 2010-04-09 | 2013-02-13 | Novozymes Biopharma DK A/S | Albumin derivatives and variants |
| KR20140012094A (ko) * | 2011-02-15 | 2014-01-29 | 메디뮨 엘엘씨 | Hsa 관련 조성물 및 사용 방법 |
| US9045564B2 (en) | 2011-02-15 | 2015-06-02 | Medimmune, Llc | HSA-related compositions and methods of use |
| AU2012222833B2 (en) | 2011-03-03 | 2017-03-16 | Zymeworks Inc. | Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs |
| KR20140027307A (ko) | 2011-05-05 | 2014-03-06 | 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 | 알부민 변이체 |
| HK1200842A1 (en) | 2011-11-18 | 2015-08-14 | Albumedix Ltd | Proteins with improved half-life and other properties |
| KR20140136934A (ko) | 2012-03-16 | 2014-12-01 | 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 | 알부민 변이체 |
| IN2015DN01115A (es) | 2012-07-13 | 2015-06-26 | Zymeworks Inc | |
| US20140128326A1 (en) | 2012-11-08 | 2014-05-08 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Albumin variants |
| ES2843679T3 (es) | 2013-03-06 | 2021-07-20 | Glaxosmithkline Llc | Células hospedadoras y métodos de uso |
| US20160152686A1 (en) | 2013-03-13 | 2016-06-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or moiety binding thereto |
| US20160168198A1 (en) * | 2013-07-01 | 2016-06-16 | Biocon Limited | Signal sequence for protein expression in pichia pastoris |
| CA2989966C (en) | 2015-08-20 | 2024-04-30 | Albumedix A/S | Albumin variants and conjugates |
| CA3117961A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | Spin Therapeutics, Llc | Compositions and methods for alpha-1-antitrypsin disorders |
| US11739166B2 (en) | 2020-07-02 | 2023-08-29 | Davol Inc. | Reactive polysaccharide-based hemostatic agent |
| US12161777B2 (en) | 2020-07-02 | 2024-12-10 | Davol Inc. | Flowable hemostatic suspension |
| JP2024500994A (ja) | 2020-12-28 | 2024-01-10 | デボル，インコーポレイテッド | タンパク質及び多官能化変性ポリエチレングリコール系架橋剤を含む反応性乾燥粉末状止血用材料 |
| CN114957448B (zh) * | 2022-06-08 | 2023-08-25 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种高效表达α-乳白蛋白的酵母菌株和α-乳白蛋白及其应用 |
| CN118580980B (zh) * | 2024-08-07 | 2024-10-15 | 通化安睿特生物制药股份有限公司 | 一种用于制备重组人白蛋白的重组工程菌及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01240191A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-09-25 | Green Cross Corp:The | 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現 |
| ATE157703T1 (de) * | 1991-12-16 | 1997-09-15 | Ciba Geigy Ag | Endoplasmatisches retikulum-ständige rekombinante dibasische endoprotease und deren verwendungen |
| US5440018A (en) * | 1992-05-20 | 1995-08-08 | The Green Cross Corporation | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
-
1994
- 1994-03-05 GB GB9404270A patent/GB9404270D0/en active Pending
-
1995
- 1995-03-01 GB GB9616724A patent/GB2301365B/en not_active Revoked
- 1995-03-01 EP EP95909880A patent/EP0749478B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 ES ES95909880T patent/ES2216007T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 DE DE69532603T patent/DE69532603T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 JP JP52276295A patent/JP3795073B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 DK DK95909880T patent/DK0749478T3/da active
- 1995-03-01 AT AT95909880T patent/ATE260338T1/de active
- 1995-03-01 WO PCT/GB1995/000434 patent/WO1995023857A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-01 US US08/702,572 patent/US5965386A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 CA CA002183241A patent/CA2183241C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 PT PT95909880T patent/PT749478E/pt unknown
- 1995-03-01 KR KR1019960704819A patent/KR100372514B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-01 AU AU18183/95A patent/AU683728B2/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100372514B1 (ko) | 2004-04-30 |
| GB9616724D0 (en) | 1996-09-25 |
| DK0749478T3 (da) | 2004-06-28 |
| EP0749478B1 (en) | 2004-02-25 |
| GB9404270D0 (en) | 1994-04-20 |
| GB2301365A (en) | 1996-12-04 |
| US5965386A (en) | 1999-10-12 |
| DE69532603D1 (de) | 2004-04-01 |
| ATE260338T1 (de) | 2004-03-15 |
| JP3795073B2 (ja) | 2006-07-12 |
| JPH09509581A (ja) | 1997-09-30 |
| CA2183241C (en) | 2002-05-21 |
| AU1818395A (en) | 1995-09-18 |
| WO1995023857A1 (en) | 1995-09-08 |
| DE69532603T2 (de) | 2005-01-05 |
| EP0749478A1 (en) | 1996-12-27 |
| PT749478E (pt) | 2004-07-30 |
| CA2183241A1 (en) | 1995-09-08 |
| GB2301365B (en) | 1997-07-30 |
| AU683728B2 (en) | 1997-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2216007T3 (es) | Cepas de levadura y albuminas modificadas. | |
| KR100380532B1 (ko) | 효모균주 | |
| RU2194758C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО ПОЛИПЕПТИДА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae | |
| CA1340547C (en) | Novel secretory leader sequences for yeasts | |
| US5612196A (en) | Human serun albumin, preparation and use | |
| EP0430645B1 (en) | Vaccines | |
| US9056921B2 (en) | Method for making mature insulin polypeptides | |
| Zurek et al. | Production of two aprotinin variants in Hansenula polymorpha | |
| HU218731B (hu) | Élesztőtörzs és eljárás az élesztőre heterológ fehérjék előállítására | |
| KR100490190B1 (ko) | 개량된 단백질 발현균주 | |
| US5218093A (en) | EGF variants and pharmaceutical use thereof | |
| RU2091490C1 (ru) | Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов | |
| US5585257A (en) | Process for the production of human lysozyme | |
| EP0208706A1 (en) | Dna sequence useful for the production and secretion from yeast of peptides and proteins | |
| JPH1042873A (ja) | フィターゼ生産酵母 | |
| KR970005584B1 (ko) | 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법 | |
| CA2002480C (en) | Process for the production of human lysozyme | |
| CA2164221A1 (en) | Tryptase inhibitor | |
| JPH08256770A (ja) | ピキア属酵母由来のプロテアーゼ | |
| JPH0538287A (ja) | ウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドｄｎａ、該組換えプラスミドｄｎａで形質転換された微生物及び該微生物を用いたウサギ血清アルブミンの製造方法 | |
| JPH03219875A (ja) | Ｃｐｂ―ｉの製造方法並びにこれに用いる組換えプラスミドおよび形質転換酵母 |