CN101874038A - 治疗性抗-hiv肽的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了合成肽的方法。具体而言，本发明提供了合成治疗性抗病毒肽的方法。

Description

治疗性抗-HIV肽的合成方法

与相关申请的交叉引用

本申请主张于2007年9月25日提交的美国临时申请60/995,318的优先权，其全文通过引用并入本文。

技术领域

本发明提供了肽和包含该肽的组合物，以及合成肽的方法。本发明还提供了该治疗剂的施用方法。具体而言，本发明提供了合成SEQ ID NO：9(TRI-1144)和类似肽的方法。这种方法采用固相和液相合成步骤来合成并组合特定肽片段组，从而获得目标肽。本发明还提供了可作为例如合成目标肽(如SEQ ID NO：9)的中间体的单独的肽。本发明进一步提供了可一起用来制备全长SEQ ID NO：9和类似肽的肽组合。

背景技术

肽传递系统

肽产物作为预防和治疗疾病的治疗剂和/或预防剂具有广泛用途。该种肽产物可以是各种种类，例如激素、酶和免疫调节剂(如抗体、血清蛋白和细胞因子)。

为了使肽在患者体内表现出其合适的生物和治疗作用，它们在体内必须以合适的浓度存在于其作用位点。更具体地，任何特定化合物包括任何特定肽的药代动力学取决于该化合物在体内的生物利用度、分布和清除。然而，肽的化学性质和特征例如大小、复杂性、构型需要以及溶解度性质易于使肽具有与其它化合物的药代动力学性质相比次优的药代动力学性质。

因此，本领域已经投入了大量的努力来尝试开发施用治疗剂如肽从而使该治疗剂的生物利用度和半衰期均得到提高的方式。尽管在这个方面已经取得了一些进展，但本领域仍需要可用于以所需的药代动力学性质传递肽治疗剂的组合物。本发明提供的组合物和方法满足了这些需求。

发明概述

本发明提供了组合物，其能够例如用于将生物活性分子给予患者，和合成这些组合物的方法。特别地，本发明提供了包含溶剂、胶凝材料和生物活性分子例如抗病毒肽的组合物。本发明进一步提供了合成方法，其包括线性合成、2片段和3片段方法，以生成包含抗病毒肽组合物。不受理论限制，本发明提供的实施方案至少部分基于以下意想不到的发现：在组合物中可掺入更高重量百分比的生物活性分子，同时在给予对象后表现出所需的药代动力学性质。本发明提供的实施方案还至少部分基于由合成方法所得到的意想不到的结果，例如有关可扩展性和纯度等量度的结果。

在一个实施方案中，当给予患者时，本发明所提供的组合物可获得迅速(例如，在8、12、16、20、24、28、32、36或48小时内)达到C_max的生物分子血浆浓度，并能提供相对恒定的该生物分子的血浆浓度5、7、10、14、17、21或28天或更长时间。在具体实施方案中，本发明所提供的组合物的所需药代动力学性质为更低的C_max，更长的t_max和更长的t_0.01或t_0.1。

本发明所提供的组合物可例如用于给予包含某些抗病毒肽的组合物，这些抗病毒肽是指T20(SEQ ID NO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ IDNO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)，或这些肽的两种或多种的组合，和T20(SEQ ID NO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ ID NO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)肽的衍生物。

在一个实施方案中，这种组合物包含溶剂；胶凝材料，其在溶剂-皮下液体交换后形成基质；和至少一种生物活性分子，例如抗病毒肽如T20(SEQ IDNO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ ID NO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)或其衍生物。

在另一实施方案中，这种组合物还包含至少一种其它成分，例如药学可接受的载体、大分子或其组合。在又一实施方案中，这种组合物还可包含除了上述列举的抗病毒肽以外的抗病毒剂。

本发明进一步提供了使用本发明所提供的组合物的方法。在一个实施方案中，该组合物被用作治疗方案例如抗病毒治疗方案的一部分。在某些实施方案中，这种治疗方案可以例如被用于治疗HIV感染，例如HIV-1感染。

在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明所提供的组合物抑制HIV向靶细胞传递的方法，其包括给予患者一定量的本发明所提供的化合物，从而使所述靶细胞与能够有效抑制所述细胞被所述病毒感染的一定量的活性剂(例如抗病毒肽和/或另一抗病毒剂)接触。

本发明还提供了治疗HIV感染(在一个实施方案中，为HIV-1感染)的方法，其包括给予HIV-感染患者治疗该HIV感染有效量的本发明所提供的组合物。

本发明还提供了在制备用于治疗HIV感染的药物中使用包含有效量的生物活性分子(例如抗病毒肽)的组合物的方法(例如，用于抑制HIV传递的方法，抑制HIV融合的方法，和/或治疗或抑制HIV感染的方法)。

本发明所提供的组合物和方法的上述和其它的目标、特征和优点通过以下的详细描述并结合附图将会变得显而易见。

附图的简要说明

图1是HIV-1gp41的示意图，显示了七肽重复1区(HR1)和七肽重复2区(HR2)，其包含公知的亮氨酸拉链状基序INNYTSLI，以及其它gp41功能区。显示的与HR1和HR2相应的示范性天然氨基酸序列和氨基酸位置编号仅为说明的目的，并与gp160、HIVIIIB链相关。

图2显示了用各种实验室菌株和临床分离物确定的HIV-1gp41的HR2区中所含的天然氨基酸序列的比较，其用于说明目的，而非进行限制，其中显示了氨基酸序列中的部分变体(例如多态性)，该氨基酸序列用单字母氨基酸代码表示。出于举例的目的，与顶部的分离序列中的氨基酸序列INNYTSLI对齐的分离物序列相应于亮氨酸拉链状基序。

图3是具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的肽的合成示意图，该合成采用了包括装配2个肽片段的片段缩合法。

图4是具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的肽的合成示意图，该合成采用了rink-负载CTC2片段缩合装配策略。

图5是具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制剂肽的合成示意图，该合成在2片段缩合法中采用了Sieber树脂。

图6是具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制剂肽的合成示意图，该合成在包括装配2个肽片段的方法中采用了Glu-侧链负载树脂。

图7是具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制剂肽的合成示意图，该合成采用了包括装配3个肽片段的片段缩合法。

图8是具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的HIV融合抑制剂肽的合成示意图，该合成采用了包括装配2个肽片段的片段缩合法。

图9显示了在给予含于如下组合物中的T1144后432小时期间短尾猴中的T1144血浆浓度图：1000μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在74∶11∶15 SAIB∶PLA3L∶NMP中的100mg/g悬浮液(89％肽)(--◆--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(60％肽)(--■--)。

图10显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在74∶11∶15 SAIB∶PLA3L∶NMP中的100mg/g悬浮液(89％肽)(--◆--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60 PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(60％肽)(--■--)。

图11显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在80∶0∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％肽，2％锌)(--◆--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(60％肽，2％锌)(--■--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在65∶15∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％肽，2％锌)(--▲--)。

图12显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在80∶0∶15SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--◆--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在74∶11∶15SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--■--)。

图13显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在70∶10∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--◆--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--■--)。

图14显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在70∶10∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--◆--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在74∶11∶15SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--■--)。

图15显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶三乙酰甘油酯中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--◆--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶苯甲酸苄酯中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--■--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--▲--)。

图16显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--◆--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的75mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--■--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的100mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--▲--)。

图17显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在77∶15∶8SAIB∶NMP∶乙醇中的50mg/g悬浮液(88％肽，2％锌)(--◆--)，200μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在77∶15∶8SAIB∶NMP∶乙醇中的100mg/g悬浮液(88％肽，2％锌)(--■--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在74∶11∶15SAIB∶PLA3M∶NMP中的100mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--◇--)，以及200μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在74∶11∶15SAIB∶PLA3M∶NMP中的100mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--□--)。

图18显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在70∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％肽，2％锌)(--◆--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％肽，2％锌)(--■--)。

图19显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在70∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中发50mg/g悬浮液(73％)(--◆--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％)(--■--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀(73％)并在ZnSO₄溶液中浆化(70％)的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(--▲--)，400μl喷雾干燥(89％)并在ZnSO₄溶液中浆化(66％)的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(--o--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀(88％)并在ZnSO₄溶液中浆化(71％)的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液

以及400μl喷雾干燥(89％)并在ZnSO₄溶液中浆化(65％)的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(--x--)。

图20显示了在给予含于如下组合物中的T1144后432小时期间短尾猴中的T1144血浆浓度图：800μl的3.5mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％)(--◆--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在74∶11∶15SAIB∶PLA3M∶NMP中的100mg/g悬浮液(89％)(--■--)以及1000μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在74∶11∶15SAIB∶PLA3M∶NMP中的100mg/g悬浮液(89％)(--▲--)。

图21显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLGA1A∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％肽，2％锌)(--◆--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在60∶40PLGA1A∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％肽，2％锌)(--■--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(88％肽，2％锌)(--▲--)。

图22显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在50∶50PLGA1A∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--◆--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLGA1A∶三乙酰甘油酯中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--■--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLGA3A∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--▲--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--o--)。

图23显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在50∶50PLGA1A∶NMP中的50mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--◆--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在50∶50PLGA1A∶NMP中的100mg/g悬浮液(73％肽，2％锌)(--■--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLGA3A∶NMP中的50mg/g悬浮液(91％肽，2％锌)(--◇--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的100mg/g悬浮液(91％肽，2％锌)(--□--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的200mg/g悬浮液(90％肽，2％锌)(--△--)。

图24显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl通过喷雾干燥制备的T1144在40∶60PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(--◆--)，以及400μl用MeOH沉淀的T1144在40∶60PLA3M∶NMP中的50mg/g悬浮液(88％肽)(--■--)。

图25显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(60％)(--◆--)，400μl经洗涤的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(94％)(--■--)，400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(88％)(--▲--)，以及400μl从MeOH/H₂O溶液中沉淀出的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(91％)(--o--)。

图26显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl用CaCl₂溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(29％)(--◆--)，400μl用CaCl₂溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(53％)(--■--)，400μl用FeSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(88％)(--▲--)，以及400μl用FeSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(91％)(--o--)。

图27显示了在给予含于如下组合物中的T1144后432小时期间短尾猴中的T1144血浆浓度图：800μl的3.5mg/mL T1144溶液(——)，400μl用锌溶液沉淀的T1144在40∶60PLGA1A∶NMP中的50mg/g悬浮液(89％)(--◆--)，以及400μl用ZnSO₄溶液沉淀的T1144在40∶60PLA3L∶NMP中的50mg/g悬浮液(60％肽)(--■--)。

图28显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间短尾猴中的T1144血浆浓度图：1200μl的3mg/mL T1144溶液(——)，400μl在40∶60PLA3L∶NMP中的沉淀物H的悬浮液(--□--)，400μl在40∶60PLA3L∶NMP中的沉淀物J的悬浮液(--◇--)，400μl在40∶60PLA3L∶NMP中的沉淀物M的悬浮液(--◆--)，以及400μl在40∶60PLA3L∶NMP中的沉淀物N的悬浮液(--■--)。

图29显示了在SAIB∶PLA∶NMP最优大鼠药物(“PK”)研究#526中原位形成凝胶的结果。TRI-144在大鼠血浆中的浓度为：803-003-A，悬浮在SAIB∶PLA3L∶NMP(74∶11∶15)中的用硫酸锌沉淀的100mg/g TRI-1144；803-003-B，悬浮在SAIB∶PLA3L∶NMP(65∶15∶20)中的用硫酸锌沉淀的50mg/g TRI-1144；803-003-C，悬浮在SAIB∶PLA3L∶NMP(70∶15∶15)中的用硫酸锌沉淀的50mg/g TRI-1144；803-003-D，悬浮在SAIB∶PLA3L∶NMP(75∶5∶20)的用硫酸锌沉淀的50mg/g TRI-1144。

图30显示了在SAIB∶PLA∶NMP和PLGA∶NMP比较大鼠PK研究#526中原位形成凝胶的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为：803-010-A，悬浮在SAIB∶PLA3L∶NMP(75∶5∶20)中的用过量硫酸锌沉淀的50mg/g TRI-1144；803-010-E，悬浮在SAIB∶PLA3L∶NMP(75∶5∶20)中的用硫酸锌沉淀的50mg/gTRI-1144；803-010-F，悬浮在PLA3L∶NMP(40∶60)中的用过量硫酸锌沉淀的50mg/g TRI-1144。

图31显示了在PLGA最优猴PK研究#527中原位形成凝胶的结果。TRI-1144在猴血浆中的浓度为：0782-096，通过添加过量硫酸锌从水中沉淀出的、悬浮在(50∶50)PLA3L∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；803-020，通过添加过量硫酸锌从水中沉淀出的、悬浮在SAIB∶PLA3L∶NMP(75∶11∶15)中的50mg/g TRI-1144。

图32显示了在PLGA最优大鼠PK研究#530和531中原位形成凝胶的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为：0782-099，通过添加过量硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在PLA3L∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；0782-102，通过添加过量硫酸锌从水中沉淀出的、悬浮在PLA3L∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144。

图33显示了在PLGA最优大鼠PK研究#552中原位形成凝胶的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为：803-050-1，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在((50∶50)PLGA 2A)∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；803-050-3，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在((50∶50)PLGA2.5A)∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；803-050-4，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在((50∶50)PLGA 3A)∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144。

图34显示了在PLA-PEG 1500和PLGA-PEG 1500共聚物：NMP大鼠PK研究#553中原位形成凝胶的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为：803-051-2，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在((65∶35)PLGA-PEG1500)∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；803-051-3，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在PLA3L-PEGI500∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；803-051-4，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在PLA3L NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144。

图35显示了溶剂比例和PLA/NMP最优PK研究#560的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为：803-072-8，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在PLA3L∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；803-072-9，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在PLA3L∶NMP(30∶70)中的50mg/g TRI-1144；803-072-10，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在(50∶50PLGA3A)∶NMP(40∶60)中的50mg/g TRI-1144。

图36显示了溶剂最优PK研究#561的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为：803-073-3，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在(PLA3L∶((NMP∶PEG400(50∶50)))(30∶70)中的50mg/g TRI-1144；803-073-4，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在(PLA3L∶((NMP∶PEG400(50∶50)))(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；803-073-5：通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在(PLA3L∶((NMP∶丙二醇(70∶30)))(40∶60)中的50mg/g TRI-1144。

图37显示了PLGA位点清除PK研究#585的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为：782-165-1，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在(50∶50PLGA 2.5A∶(((NMP∶PEG400(50∶50)))(40∶60)中的50mg/gTRI-1144；782-165-2，通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在(50∶50PLGA 2A∶((NMP∶PEG400(50∶50)))(40∶60)中的50mg/g TRI-1144；782-165-3：通过添加硫酸锌从50∶50甲醇∶水中沉淀出的、悬浮在(50∶50PLGA1A∶((NMP∶PEG400(50∶50)))(40∶60)中的50mg/g TRI-1144。

发明详述

定义

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“患者”指哺乳动物，例如人。在具体实施方案中，“患者”为需要治疗本发明所公开的疾病或病症(例如HIV或AIDS)的哺乳动物，例如人。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“靶细胞”指能被HIV感染的细胞。在一个实施方案中，该细胞为人类细胞；在另一实施方案中，该细胞为能通过包括膜融合的过程被HIV感染的人类细胞。在另一实施方案中，该细胞存在于患者中，例如人患者中。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“组合物”指包含溶剂、胶凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的制剂。本发明描述了示范性的组合物。本发明所提供的组合物可以例如被用作药剂或被用于制备药剂。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“溶剂”指可与水混溶的液体。在一个实施方案中，该溶剂为可与水混溶的液体，并与共溶剂(例如NMP)联合使用。溶剂可被用于例如充分稀释所述胶凝材料以允许注射至患者。本发明描述了示范性的溶剂，其是本领域技术人员所公知的。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“胶凝材料”指可与溶剂混溶的材料，当存在于包含溶剂和胶凝材料的组合物中时，其在溶剂-皮下液体交换(即，溶剂-皮下患者液体交换)时形成基质。本发明描述了示范性的胶凝材料，其是本领域技术人员所公知的。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“基质”指胶凝材料在溶剂-皮下液体交换后所呈现的可生物降解或可生物蚀解的形式。在一个实施方案中，该基质为粘性(即抗剪切)基质。在另一实施方案中，该基质为凝胶。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“溶媒”指可用于向患者传递生物活性分子(例如，肽例如抗病毒肽)的包含溶剂和胶凝材料的液体材料。溶媒可在液体状态下贮存。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“药学可接受的载体”指不明显改变其所加入的活性成分(例如，HIV融合抑制剂肽)的生物活性的载体介质。药学可接受的载体包括但不限于以下一种或多种：水、缓冲的水、盐水、0.3％甘氨酸、水性醇、等张水溶液；并可进一步包含一种或多种物质，例如甘油，油，盐例如钠、钾、镁和铵盐，膦酸酯或盐，碳酸酯，脂肪酸，糖(例如甘露糖醇)，多糖，聚合物，赋形剂，以及防腐剂和/或稳定剂(用于提高保质期，或者根据需要和便于所述组合物的生产和分配)。在一个实施方案中，该药学可接受的载体适于肌肉内、皮下或肠胃外施用。

除非另行特别指明，本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“包含异亮氨酸或亮氨酸的氨基酸”在用于HIV融合抑制剂肽时分别指异亮氨酸或亮氨酸，或它们相应的天然发生的氨基酸(例如，L-氨基酸)、非天然发生的氨基酸(例如，D-氨基酸)、异构体形式(例如，正亮氨酸、别异亮氨酸等)或衍生物形式(例如，叔亮氨酸)。氨基酸异亮氨酸或亮氨酸的一种形式可用于排除该氨基酸的其它形式。本发明所述的HIV融合抑制肽在其氨基酸序列中，除了本发明所教导氨基酸序列的一个或多个位置处包含具有异亮氨酸或亮氨酸的氨基酸外，还可包含在HIV gp41的HR2区序列中发现的源自HIV gp41的HR2区域序列的一个或多个多态性变体(参见，例如图2)。

术语“HIV”指人类免疫缺陷型病毒，在一个实施方案中指HIV-1。

本发明所用的术语“分离的”在用于生物活性分子，例如抗病毒肽例如HIV融合抑制剂肽或肽片段时表示其基本不含不构成该生物活性分子的整体结构的一部分的成分，例如，在化学合成、生产或采用生物、生化或化学过程修饰时基本不含化学前体或其它化学品。在某些实施方案中，该分离的生物活性分子为按重量超过75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％纯的。

术语“1至3个氨基酸替换”在用于HIV融合抑制剂肽时指HIV融合抑制剂肽除了与SEQ ID NO：9-15中任一序列相比具有不少于一个且不多于三个的氨基酸差异外，具有SEQ ID NO：9-15任一序列的氨基酸序列；同时还具有(a)超过一个的亮氨酸拉链状基序和至少一个不同于形成亮氨酸拉链状基序所需的亮氨酸的额外亮氨酸(即不位于亮氨酸拉链状基序的位置1或8处)，或(b)3至5个亮氨酸拉链状基序；并具有抗HIV的抗病毒活性(在抑制HIV-介导的融合中具有活性)。就此而言，具有替换的HIV融合抑制剂肽的氨基酸差异(与SEQ ID NO：9-15相比)所处的氨基酸序列位置不同于本发明的HIV融合抑制剂肽所示的亮氨酸和/或异亮氨酸残基的位置(参见，例如本发明的图示(I)和(II))。该不少于一个且不超过3个的氨基酸差异包括但不限于保守氨基酸替换(本领域已知包括具有与所替换氨基酸基本相同的电荷、大小、亲水性和/或芳香性的氨基酸的替换，其范例包括但不限于甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸，色氨酸-酪氨酸，天冬氨酸-谷氨酸，精氨酸-赖氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺，以及丝氨酸-苏氨酸)和/或多态性变体(例如，如图2所示，或者在HIV-1的实验室、各种分化体和/或临床分离物中发现的)。例如，对于SEQ ID NO：11、12或13，HIV融合抑制剂肽在SEQ ID NO：11、12或13任一序列的氨基酸残基10、17、24、31和38以外的位置处具有1至3个氨基酸差异。例如，对于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：14，HIV融合抑制剂肽在SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：14的氨基酸残基10、17、21、24和38以外的位置处具有1至3个氨基酸差异。例如，对于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：15，HIV融合抑制剂肽在SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：15的氨基酸残基10、17、21、31和38以外的位置处具有1至3个氨基酸差异。这种实施方案的示范性范例包括但不限于SEQ ID NO：16的氨基酸序列，其中可作为1至3个氨基酸替换的氨基酸差异的位点的位置表示为Xaa(表示任何天然或非天然发生的氨基酸，即在这个氨基酸位置处可以使用一个以上的可能氨基酸)。此外，还可产生一个或多个保守氨基酸替换，例如赖氨酸被精氨酸或组氨酸替换，精氨酸被赖氨酸或组氨酸替换，谷氨酸被天冬氨酸替换，或者天冬氨酸被谷氨酸替换。为了说明的目的，在氨基酸位置10、17、21、24、31和38处加上了下划线。再参考SEQ ID NO：9-15，应注意在SEQ ID NO：16中的“Zaa”用于表示的是可以是亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸；Baa用于表示的是优选为亮氨酸、异亮氨酸，也可以是Xaa的氨基酸，但至少一个Baa为亮氨酸或异亮氨酸。

SEQ ID NO：16：

XaaXaaXaaEAXaaDRAZaaAEXaaAARZaaEAZaaZaaRABaaXaaEXaaXaaEKB

aaEAAZaaREZaa

本发明所述的HIV融合抑制剂肽还可以例如包括衍生自HIV gp41的HR2区的肽，该HIV gp41的HR2区对应于HIV-1的实验室、分化体或临床分离物，例如图2列举的实验室菌株和临床分离物中存在的SEQ ID NO：5(通过序列比对)，只要该HIV融合抑制剂肽满足SEQ ID NO：16的氨基酸要求。在一个实施方案中，这种HIV融合抑制剂肽显示与SEQ ID NO：9-15中任一序列相比具有1至3个氨基酸替换。在一个实施方案中，该HIV融合抑制剂肽还包含N-末端封端基团或C-末端封端基团，或两者，且这些末端基团可包括但不限于：N-末端的氨基基团或乙酰基基团；以及C-末端的羧基基团或酰胺基基团。

本发明所述的HIV融合抑制剂肽还可包括显示具有US 2006/0247416(其全部内容在此通过引用并入本文)所公开的任意肽的变体氨基酸序列的肽，只要该HIV融合抑制剂肽满足SEQ ID NO：16的氨基酸要求。在一个实施方案中，这种HIV融合抑制剂肽显示与SEQ ID NO：9-15中任一序列相比具有1至3个氨基酸替换。在优选的实施方案中，该HIV融合抑制剂肽的长度为14至60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制剂肽还包含N-末端封端基团或C-末端封端基团，或两者，且这些末端基团可包括但不限于：N-末端的氨基基团或乙酰基基团；以及C-末端的羧基基团或酰胺基基团。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“反应性官能团”指能够与另一化学基团或化学部分形成键的化学基团或化学部分。对于化学基团，反应性官能团是本领域技术人员公知的，包括但不限于：马来酰亚胺、硫醇、羧酸、氢、磷酰基、酰基、羟基、乙酰基、疏水基、胺、酰胺、丹酰基、磺基、丁二酰亚胺、硫醇反应性基团、胺反应性基团、羧基反应性基团等。一种反应性官能团可用于排除另一反应性官能团。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“接头”指可作为分子桥以可操作地连接两个不同分子的化合物或部分(例如，接头的第一反应性官能团共价偶联至大分子载体的反应性官能团，而该接头的第二反应性官能团共价偶联至HIV融合抑制剂肽的反应性官能团)。该接头可以是氨基酸，例如在生成含有所述HIV融合抑制剂肽的一个或多个拷贝的重组融合蛋白时。可替代性地，所述两个不同的分子可以分步方式连接至接头(例如，通过化学偶联)。总体而言，对于接头没有具体的大小或成分限制，只要其能够满足作为分子桥的目的。接头是本领域技术人员公知的，包括但不限于：化学链、化学化合物(例如，试剂)、氨基酸等。接头可包括但不限于同基双功能接头、异基双功能接头、生物稳定接头、可水解接头和可生物降解接头，以及本领域已知的其它接头。如本领域技术人员公知，异基双功能接头包含具有第一反应性官能团的一端以特异性连接第一分子，和具有第二反应性官能团的相对端以特异性连接至第二分子。本领域技术人员了解，各种单功能、双功能和多功能试剂(例如在Pierce Chemical Co.，Rockford，III.的目录中所描述的那些试剂)可被用作接头。接头的长度和装配可根据需要连接的分子、实施连接的条件以及施用时的理想药代动力学特性等因素改变，以优化特性，例如生物活性和功能的保存、稳定性、某些化学和/或温度参数的耐受性、体内易于裂解性、以及充分的立体选择性或大小。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“大分子载体”指连接、结合或融合(例如，化学地或通过采用遗传表达的重组方式)至一种或多种本发明的肽的分子，因而该分子能够相对于缺乏该分子的所述一种或多种肽赋予如下一种或多种特性：该一种或多种肽的稳定性，该一种或多种肽的生物活性的提高，或者该一种或多种肽的血浆半衰期的提高(例如，延长该一种或多种肽在体内的存在时间)。这种大分子载体是本领域公知的，包括但不限于血清蛋白、聚合物、碳水化合物以及脂质-脂肪酸缀合物。通常用作大分子载体的血清蛋白包括但不限于传递蛋白、白蛋白(优选人白蛋白)、免疫球蛋白(优选人IgG或其一个或多个链)或激素。通常用作大分子载体的聚合物包括但不限于聚赖氨酸或聚(D-L-丙氨酸)-聚(L-赖氨酸)或多元醇。多元醇可包含水溶性聚(烯基氧化物)聚合物，并可具有线性或支链化的链。聚合物可以是支链多元醇(例如PEG，具有多条(例如，3条或更多条)链，其分别直接或通过接头偶联至HIV融合抑制剂肽)；在一个实施方案中，支链多元醇在体内条件下是可生物降解的和/或随时间裂解的。合适的多元醇包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)以及PEG-PPG共聚物。在一个实施方案中，多元醇包括具有约1,000道尔顿至约20,000道尔顿平均分子量的PEG。可使用通常具有大于20,000道尔顿的分子量的其它类型大分子载体，其是本领域公知的。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“化学保护基团”或“CPG”表示用于阻断包含胺基团的反应性官能团与另一反应性官能团发生化学反应的化学部分。化学保护基团是肽合成领域公知的，包括但不限于Dmcp(二甲基环丙基甲基)、Bsmoc(苯并[b]噻吩砜-2-甲氧基羰基)、tBu(叔丁基)、trt(三苯基甲基(三苯甲基))、OtBu(叔丁氧基)、Boc或t-Boc(叔丁氧基羰基)、Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)、Aoc(叔戊烷氧基-羰基)、TEOC(β-三甲基乙基氧羰基)、CLIMOC(2-氯-1-茚满基甲氧基羰基)、BIMOC(苯并-[f]-茚-3-甲氧基羰基)、PBF(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、2-Cl-Z(氯苄基-氧羰基)、Alloc(烯丙氧基羰基)、Cbz(苯甲氧基羰基)、Adoc(金炕氧基-羰基)、Mcb(1-甲基环丁氧基羰基)、Bpoc(2-(对双苯基基)丙基-2-氧羰基)、Azoc(2-(对苯基偶氮苯基)丙基-2-氧羰基)、Ddz(2，2二甲基-3，5-二甲氧基苄基-氧羰基)、MTf(4-甲氧基-2，3，6-三甲氧基苯磺酰基)、PMC(2，2，5，7，8-五甲基色原烷-6-磺酰基)、Tos(甲苯磺酰基)、Hmb(2-羟基-4-甲氧基苄基)、Poc(2-苯基丙基-2-氧羰基)、Dde(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-基亚基)乙基)、ivDde(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-环己-1-基亚基)-3-甲基丁基)、苄基、丹酰基、对硝基苄酯等。一个化学保护基团可用于排除另一化学保护基团。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“脱保护”是本领域公知的，指从含有一个或多个化学保护基团的分子去除一个或多个化学保护基团的过程，其中该分子包含氨基酸、肽片段或HIV融合抑制剂肽。一般而言，该脱保护过程包括将由一个或多个化学保护基团保护的分子与去除该化学保护基团的化学剂反应。例如，由化学保护基团保护的N-末端α氨基基团可与碱反应以去除对碱不稳定的化学保护基团(例如，Fmoc等)。化学保护基团(例如，Boc、TEOC、Aoc、Adoc、Bopc、Ddz、Cbz等)可通过酸去除。其它化学保护基团，特别是由羧酸衍生的基团，可通过酸或碱去除。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“衍生物”指亲代化合物通过用另一原子或原子基团替换一个或多个原子得到的化合物，对于抗病毒化合物而言，优选保留所有或基本所有该亲代化合物的抗病毒活性。

术语“第一”、“第二”、“第三”等可用于：(a)表示顺序；或者(b)区别分子或分子的反应性官能团；或者(c)(a)和(b)的组合。然而，术语“第一”、“第二”、“第三”等不应解释为限制本发明。

本发明在说明书和权利要求书中所用的有关本发明的HIV融合抑制剂肽的术语“肽片段”和“中间体”在此可同义使用，表示包含长度不少于约5个氨基酸且不超过约30个氨基酸的氨基酸序列并且包含HIV融合抑制剂肽的氨基酸序列的至少一部分(作为连续氨基酸)的肽。参见本发明实施例4-7和表4、5、7和8中的可用于制备SEQ ID NO：9和10的肽片段的示范性例子。此外，尽管在优选实施方案中肽片段(单独地或组合成组以形成HIV融合抑制剂肽)被合成为使氨基酸残基之间形成肽键，但本领域技术人员可以容易地了解，可使用本领域技术人员公知的反应形成非肽键(例如，亚氨基、酯、酰肼、偶氮、氨基脲等)。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“药代动力学特性”指组合物中全身可用的生物活性分子(例如抗病毒肽)随时间的总量。药代动力学特性可通过测定生物活性分子(例如，抗病毒肽)在施用后在体内随时间的总全身浓度来确定。例如，药代动力学特性可表示为曲线下面积(AUC)、生物半衰期和/或清除率。AUC是全身生物活性分子浓度随时间的综合量度，单位为质量时间/体积。在施用一定剂量的生物活性分子后，从给药时到体内没有残余活性成分时的AUC是个体暴露于生物活性分子(和/或该生物活性分子的代谢产物)的量度。当组合物所含的生物活性分子与不同于本发明所述的制剂中所含的生物活性分子相比具有：(a)更长的(“提高的”)生物(终末)半衰期(“t1/2)，(b)降低的生物(总体)清除率(Cl)，(c)更长的持续释放属性，(d)更高的掺入该组合物中的重量百分比(例如，约10％或更高)，(e)下降的或更小的C_max，(f)更长的t_max，以及(g)更长的t_0.01或t_0.1时，该组合物具有“改善的”或“提高的”药代动力学特性。在一个实施方案中，改善的药代动力学表示生物活性分子的清除率与比较制剂相比降低，例如通常降低至约二分之一至约十分之一。在另一实施方案中，改善的药代动力学表示与比较制剂相比生物半衰期提高了约10％至约60％。改善的药代动力学还可同时包括清除率降低和生物半衰期提高。在一个实施方案中，理想的药代动力学特性包括迅速达到C_max(例如，在8、12、16、20、24、28、32、36或48小时内)，并随后维持相对恒定的血浆浓度5、7、10、14、17、21或28天或更长时间。在某些实施方案中，本发明所提供的组合物所需的药代动力学特性为更低的C_max、更长的t_max和更长的t_0.01或t_0.1。用于计算血浆浓度相对时间曲线下的面积(AUC)、总体清除率(Cl)以及终末半衰期(t1/2)的等式列于本发明的实施例1中。

本发明在说明书和权利要求书中所用的有关溶解有一种或多种固体的水性液体的本领域标准术语“在溶液中”指在本发明更详细描述的浓度和温度实际使用条件下包含溶解有生物活性分子(例如HIV融合抑制剂肽)且符合本领域可注射用药物制剂标准的水性溶液。本领域中存在各种方式来区分悬浮液形式和溶液形式，例如检查视觉澄清度(溶液的透明度相对悬浮液的浊度)、光传输等。“溶解度”可通过在没有显示出可观察到的溶液沉淀或含有所述生物活性分子的水性液体胶凝的水性液体溶液中存在的生物活性分子(例如HIV融合抑制剂肽)的量(例如，重量百分比)来确定。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“持续释放”指生物活性分子在给予后持续释放指定的时间段。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“有效量”指能够实现特定方法的所需结果的生物活性分子的量。在一个实施方案中，生物分子的有效量是足以(通过其自身和/或与给药方案结合)降低(例如，相对于缺乏该生物活性分子的情况)患者HIV病毒载荷的量。在另一实施方案中，生物分子的有效量是足以抑制(例如，相对于缺乏该生物活性分子的情况)细胞被HIV感染或抑制病毒进入靶细胞的量。该种抑制可通过本领域已知的测定进行测量。在另一实施方案中，生物分子的有效量是足以改善与HIV感染相关的症状的量。生物分子的有效量可由本领域技术人员采用本领域技术人员公知的常规体外和体内研究获得的数据进行确定。

本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“治疗”或“疗法”或其语法上等同的术语在有关HIV感染时可互换使用，表示包含生物活性分子(例如HIV融合抑制剂肽)的组合物可用于影响与HIV感染相关的一个或多个过程或者影响用作测定该种治疗或疗法(例如，“治疗性应用”)的疗效的指标的一个或多个参数或终点。例如，该生物活性分子可用于抑制如下一种或多种过程：HIV向靶细胞的传递；HIV和靶细胞之间的融合(“HIV融合”)；病毒进入(HIV或其遗传物质在感染过程中进入靶细胞的过程)；以及合胞体形成(例如，HIV感染细胞和靶细胞之间的融合)。在评估药物在HIV感染的治疗或疗法中的效力时，病毒抑制(通过本领域已知的测定体液或组织中HIV的病毒载荷的方法测定)常用作主要终点，而血流中的循环CD4⁺细胞数量上升常用作次要终点，两者均是抑制HIV向靶细胞传递的可测量效果。因此，包含生物活性分子(例如HIV融合抑制剂肽)的组合物可用于影响治疗性应用，包括病毒抑制和/或提高循环CD4⁺细胞的相对数量。

组合物

本发明提供了可用于给予患者生物活性分子的组合物。特别地，本发明提供了包含溶剂、胶凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的组合物。不受理论限制，本发明所提供的实施方案至少部分基于以下意想不到的发现：在组合物中可掺入更高重量百分比的生物活性分子，同时在给予患者后表现出所需的持续释放性质。本发明所述的组合物在给予患者并发生溶剂-皮下液体交换时可原位形成包含基质的凝胶组合物。

在一个实施方案中，本发明所提供的组合物在给予患者时可获得迅速(例如，在8、12、16、20、24、28、32、36或48小时内)达到C_max的生物分子血浆浓度，并能提供相对恒定的该生物分子的血浆浓度5、7、10、14、17、21或28天或更长时间。在具体实施方案中，本发明所提供的组合物的所需药代动力学性质为更低的C_max、更长的t_max以及更长的t_0.01或t_0.1。

本发明所提供的组合物可例如用于给予包含某些抗病毒肽的组合物，这些抗病毒肽是指T20(SEQ ID NO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ IDNO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)，或这些肽的两种或多种的组合，和T20(SEQ ID NO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ ID NO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)肽的衍生物。

在一个实施方案中，所述组合物包含溶剂；胶凝材料，其在溶剂-皮下液体交换后形成基质；和至少一种生物活性分子，例如抗病毒肽如T20(SEQ IDNO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ ID NO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)或其衍生物。该组合物可以，例如，在给予前作为溶液或悬浮液存在。该溶液或悬浮液可以是水性的或者包含有机溶剂。在一个实施方案中，该组合物可在室温下贮存达18个月。一旦给予和暴露至患者皮下空间的液体，该胶凝材料可形成可生物降解或至少可生物蚀解的基质。因此，在一个实施方案中，该组合物可以以液体形式给予(例如，通过皮下注射)至有此需要的患者。所得的基质可以，例如，作为该生物活性分子的持续释放基质。

本发明所提供的组合物通常包含至少一种胶凝材料，其量足以在给予至患者时形成基质(例如，约50-1000mg/g、100-900mg/g、150-900mg/g、200-900mg/g、250-900mg/g、500-900mg/g、750-900mg/g或750-1000mg/g)。在一个实施方案中，胶凝材料的合适的量(mg/g)可通过以溶媒比例添加溶媒胶凝材料组合物并乘以10来测定。在一个实施方案中，该胶凝材料为丙交酯或乙交酯聚合物。在具体实施方案中，该胶凝材料为蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB)、聚丙交酯(PLA，例如PLA3L、PLA3M或PLA-PEG)或聚丙交酯-共-乙交酯(PLG，PLGA例如PLGA1、PLGA-葡萄糖或PLGA-PEG)。本发明所提供的组合物还可包含生物活性分子，例如抗病毒肽。在一个实施方案中，本发明所提供的组合物包含足够浓度的所述生物活性分子，从而使有效剂量的该生物活性分子在给予至患者后从形成的基质中释放，例如以持续释放方式释放。

本发明所提供的组合物通常包含至少5％浓度的生物活性分子，并以该浓度的生物活性分子施用。因此，在一个实施方案中，本发明所提供的组合物包含等于或为该组合物重量的约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％或更多量的生物活性分子(例如，抗病毒肽)。在一个实施方案中，本发明所提供的组合物包含约80-90mg/ml、90-100mg/ml、100-105mg/ml、105-110mg/ml、110-125mg/ml、125-130mg/ml、130-140mg/ml、140-150mg/ml、150-200mg/ml、200-250mg/ml、250-300mg/ml的生物活性分子。

在具体实施方案中，本发明所提供的组合物在给予至患者时形成基质，在给予该组合物后，该基质提供该生物活性分子的初始突释，然后持续释放该生物活性分子至少5、7、10或14天。在某些实施方案中，通过给予患者本发明所提供的组合物所产生的生物活性分子的初始突释是C_max，至少或大约为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml或15μg/ml或更高，在该组合物施用后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24小时内达到。在某些实施方案中，通过给予患者本发明所提供的组合物所产生的生物活性分子的持续释放是在给予该组合物后至少5、7、10、14、21、25或28天或更长时间内释放大于或等于0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.25μg/ml、1.5μg/ml或2.0μg/ml或更多。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，该组合物在给予至患者后形成基质(例如，原位)，并且在给予12小时内提供至少10μg/ml的生物活性分子(例如，抗病毒肽)C_max，随后以至少1μg/ml的血浆水平持续释放至少7天。

在一个实施方案中，本发明所提供的包含抗病毒肽的组合物进一步包含至少一种其它成分，例如药学可接受的载体、大分子或其组合。

在另一实施方案中，所述组合物包含一种或多种其它生物活性分子。在一个实施方案中，该组合物可包含T20、T1249、T897、T2635、T999或T1144肽或其衍生物。在另一实施方案中，这种组合物可包含或进一步包含一种或多种其它抗病毒剂。自身或作为组合治疗方案的一部分可用于该组合物的其它抗病毒剂包括但不限于DP107(T21)或任意其它抗病毒多肽，例如美国专利6,541,020B1(全文通过引用并入本文)所述的那些。治疗剂的其它示范性非限制性范例包括抗病毒剂，如细胞因子如rIFNα、rIFNβ、rIFNγ；逆转录酶抑制剂，包括但不限于阿巴卡韦、AZT(齐多夫定)、ddC(扎西他滨)、奈韦拉平、ddl(地达诺新)、FTC(恩曲他滨)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS 840、GW-1592、GW-8248、GW-5634、HBY097、地拉韦定、依法韦仑、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韦、替诺福韦以及阿洛夫定；蛋白酶抑制剂，包括但不限于安泼那韦、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、印地那韦、那非那韦、PNU-140690、利托那韦、沙奎那韦、替利那韦、替拉那韦、阿扎那韦、洛匹那韦、ABT378、ABT538和MK639；病毒mRNA加帽抑制剂，例如三氮唑核苷；作为具有抗-HIV活性的脂质结合分子的两性霉素B；作为糖蛋白加工抑制剂的澳粟精胺；病毒进入抑制剂，如融合抑制剂(恩夫韦肽、T1249、其它融合抑制剂肽以及小分子)、SCH-D(Schering-Plough)、UK-427857(Pfizer)、TNX-355(Tanox Inc.)、AMD-070(AnorMED)、Pro 140、Pro 542(Progenies)、FP-21399(EMD Lexigen)、BMS806、BMS-488043(Bristol-Myers Squibb)、maraviroc(UK-427857)、ONO-4128、GW-873140、AMD-887、CMPD-167以及GSK-873,140(GlaxoSmithKline)；CXCR4拮抗剂，例如AMD-070；脂质和/或胆固醇相互作用调节剂，例如盐酸普鲁卡因(SP-01和SP-01A)；整合酶抑制剂，包括但不限于L-870和810；RNAseH抑制剂；rev或REV的抑制剂；vif的抑制剂(例如，vif-衍生的脯氨酸富集肽、HIV-1蛋白酶N-末端衍生肽)；病毒加工抑制剂，包括但不限于白桦苷和二氢白桦苷衍生物(例如PA-457)；以及免疫调节剂，包括但不限于AS-101、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸以及胸腺喷丁。

在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中生物活性分子(例如，抗病毒肽)被溶解。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中生物活性分子(例如，抗病毒肽)被悬浮。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈喷雾干燥形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含盐(例如，金属盐)的喷雾干燥形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含锌的喷雾干燥形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含钙的喷雾干燥形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含铁的喷雾干燥形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈沉淀形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含盐(例如，金属盐)的沉淀形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含锌的沉淀形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含钙的沉淀形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含铁的沉淀形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含镁的沉淀形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含铜的沉淀形式。

在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如，抗病毒肽)呈包含铝的沉淀形式。

在另一实施方案中，本发明提供了包含约1-15％、1-14％、1-13％、1-12％、1-11％、1-10％、1-9％、1-8％、1-7％、1-6％、1-5％、1-4％、1-3％、1-2％、5-15％、7-15％、5-10％、7-10％或10-15％盐，例如金属盐的组合物。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含盐，例如金属盐的组合物，该盐与生物分子，例如抗病毒肽的摩尔比例为1∶1。可用于本发明所提供的组合物的金属盐的具体范例包括但不限于锌、钙和铁。

改变胶凝材料在本发明所提供的组合物中的比例可以调节，例如提高或优化生物分子从在本发明所提供的组合物给予至患者时形成的基质传递的速率。在具体实施方案中，降低本发明所提供的组合物中的SAIB∶PLA比例可导致患者体内在任意特定时间的生物分子血浆浓度升高，并可增加患者体内维持生物分子特定血浆水平的持续时间。

在具体实施方案中，在本发明所提供的组合物中用NMP替代三乙酰甘油酯或苯甲酸苄酯作为溶剂可导致患者体内在任意特定时间的生物分子血浆浓度升高，并可增加患者体内维持生物分子特定血浆水平的持续时间。在特定实施方案中，用NMP替代三乙酰甘油酯作为溶剂可导致C_max上升。

在另一实施方案中，增加本发明所提供的组合物所给予的注射体积(例如，加倍)可导致患者体内在任意特定时间的生物分子血浆浓度升高，并可增加患者体内维持生物分子特定血浆水平的持续时间。

在另一实施方案中，所用的胶凝材料的类型(例如PLA)可影响本发明所提供的组合物的药代动力学参数。在具体实施方案中，将PLA类型由3L改为3M可导致C_max下降，t_max上升以及t_0.01上升。

在另一实施方案中，改变本发明所提供的组合物中的胶凝材料相对于溶剂的比例可以影响生物分子的传递速率。在具体实施方案中，增加本发明所提供的组合物中的胶凝材料相对于溶剂的比例(例如PLGA1A相对于NMP的比例)可导致C_max下降，t_max上升以及t_0.01上升。

在另一实施方案中，改变聚合物类型和分子量可以提高生物分子的传递速率。在具体实施方案中，提高聚合物分子量和/或提高L∶G(丙交酯∶乙交酯)比例可导致C_max下降，t_max上升以及t_0.01上升。

在另一实施方案中，提高本发明所提供的组合物中的肽浓度(例如，加倍)可导致C_max下降，t_max上升以及t_0.01下降。

在另一实施方案中，提高溶媒中的胶凝材料(例如PLGA)的量可导致C_max下降，t_max上升以及t_0.01下降。

在另一实施方案中，提高溶媒(例如，含SAIB的溶媒)中的胶凝材料(例如PLA)的量会减缓本发明所提供的组合物中的生物分子的释放(例如，降低C_max，增加t_max和/或增加t_0.01)。在具体实施方案中，将溶媒中PLA的量由1％增加至5％会进一步减缓本发明所提供的组合物中的生物分子的释放。在另一实施方案中，将溶媒中的PLA的量由5％增加至10％会进一步减缓本发明所提供的组合物中的生物分子的释放。

溶剂

可用于本发明所提供的组合物和方法中的溶剂包括可充分稀释所述胶凝材料以允许将该组合物注射至患者的任意与水混溶的液体。在一个实施方案中，该溶剂为N-甲基-2-吡咯炕酮(NMP)。其它合适的溶剂包括但不限于水、醇(例如，甲醇、乙醇、异丙醇和苄醇)、二醇(例如，聚乙二醇、丙二醇和四甘醇)、苯酸酯(例如，苯酸乙酯和苯甲酸苄酯)、甘油酯(例如，单、双和三甘油酯)、三乙酰甘油酯以及药学可接受的酯(例如，乳酸乙酯和碳酸丙酯)。

胶凝材料

可用于本发明所提供的组合物和方法的胶凝材料包括在溶剂-皮下液体交换后形成基质的任意与溶剂混溶的材料。在一个实施方案中，该胶凝材料为蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB)或其衍生物，例如，特级的蔗糖醋酸酯或蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB-SG)。在另一实施方案中，该胶凝材料为聚丙交酯(PLA)，例如PLA3L或PLA3M。在另一实施方案中，该胶凝材料为聚丙交酯-共-乙交酯(PLG、PLGA、PLGA-葡萄糖或其衍生物例如PLGA-PEG1500或PLA-PEG1500)。在另一实施方案中，该胶凝材料为聚己内酯或其衍生物或其丙交酯/乙交酯共聚物。PLA和PLGA在丙交酯∶乙交酯比例、分子量及其末端基团方面不同。分子量以名称中的数字分级。该分子量约为该数值的10000倍。该末端基团为羧酸(A)、甲酯(M)或月桂酯基(L)。

在一个实施方案中，本发明所提供的化合物可包含具有相同或不同重量百分比的两种或多种不同胶凝剂。在具体实施方案中，该胶凝材料是两种或多种选自PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖的材料的混合物。

在某些实施方案中，所述胶凝材料以约5-95％(重量)、约5-90％(重量)、约10-90％(重量)、约10-85％(重量)、约15-85％(重量)、约20-85％(重量)、约30-85％(重量)、约30-80％(重量)、约30-70％(重量)、约30-65％(重量)、约30-60％(重量)、约40-85％(重量)、约45-85％(重量)、约50-85％(重量)、约55-85％(重量)、约60-85％(重量)、约65-85％(重量)、约70-85％(重量)、约75-85％(重量)、约80-85％(重量)、约1-15％(重量)、约5-15％(重量)或约10-15％的量存在。

在另一实施方案中，所述胶凝材料以约25-900mg/g、100-900mg/g、200-900mg/g、300-900mg/g、400-900mg/g、500-900mg/g、100-800mg/g、100-700mg/g、100-600mg/g、100-500mg/g、200-800mg/g、300-600mg/g、25-250mg/g、25-200mg/g、25-150mg/g、50-150mg/g、50-100mg/g、50mg/g、75mg/g或100mg/g的量存在。

肽

对于作为抗病毒肽的生物活性分子，本领域已知的任意抗病毒肽均可用于本发明所提供的组合物和方法。在一个实施方案中，该抗病毒肽为T20、T1249、T897、T2635、T999或T1144肽或其衍生物。

可用于本发明所提供的组合物和方法的具体抗病毒肽包括衍生自具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的基础氨基酸序列(“基础序列”)的HIV融合抑制剂肽，但其中每种HIV融合抑制剂肽与基础序列的不同之处在于在其氨基酸序列中具有一个以上的亮氨酸拉链状基序，并且在其氨基酸序列中除形成亮氨酸拉链样基序所必需的亮氨酸以外具有至少一个额外的亮氨酸(即在所述序列中除亮氨酸拉链样基序的氨基酸位点1或8以外的氨基酸；例如在SEQ IDNO：5的氨基酸位点21用亮氨酸替换异亮氨酸)。

可用于本发明所提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括衍生自具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的基础氨基酸序列(“基础序列”)的HIV融合抑制剂肽，但是其中每种HIV融合抑制肽与基本序列的不同在于其氨基酸序列中具有多于两个的亮氨酸拉链样基序。

可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括一系列HIV融合抑制肽，其中每种HIV融合抑制肽：(a)包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列；(b)具有不少于2个且不多于5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列；(c)在其氨基酸序列中除亮氨酸拉链样基序的氨基酸位点1或8以外具有至少一个额外的亮氨酸(例如，与SEQ ID NO：5-7中任何一个或多个序列的基本序列比较)；并且任选地(d)在一种或多种生物学性质方面显示出意想不到的改善。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉链样基序，例如图1或图2显示的HR2亮氨酸拉链样基序。在优选实施方案中，该HIV融合抑制肽长度为14到60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽进一步包含N末端封闭基团或C末端封闭基团或两者；这些末端封闭基团可包括但不限于：位于N末端的氨基或乙酰基；以及位于C末端的羧基或酰胺基。

可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括HIV融合抑制肽，其中每种HIV融合抑制肽：(a)包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列；(b)具有含有多于2个且不多于5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列；并且(c)在其氨基酸序列中除亮氨酸拉链样基序的氨基酸位点1或8以外具有至少一个额外的亮氨酸(例如，与SEQ ID NO：5-7中任何一个或多个序列的基本序列比较)；并且(d)在一种或多种生物学性质方面显示出意想不到的改善。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉链样基序，例如图1或图2显示的HR2亮氨酸拉链样基序。在优选实施方案中，该HIV融合抑制肽长度为14到60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽进一步包含N末端封闭基团或C末端封闭基团或两者；这些末端基团可包括但不限于：位于N末端的氨基或乙酰基；以及位于C末端的羧基或酰胺基。

可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括具有与SEQ IDNO：5相似的氨基酸序列的HIV融合抑制肽，除了该HIV融合抑制肽氨基酸序列：(a)具有多于一个的亮氨酸拉链样基序，并且具有除了形成亮氨酸拉链样基序所需要的亮氨酸以外(即除亮氨酸拉链样基序的1或8位点以外)的至少一个额外的亮氨酸；或(b)具有多于2个亮氨酸拉链样基序；并且其中该HIV融合抑制肽在一种或多种生物学性质方面显示出改善。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽长度为14到60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉链样基序，例如图1或图2显示的HR2亮氨酸拉链样基序。

可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括例如SEQ IDNO：9、10、14、和15所示的肽，或者与SEQ ID NO：9、10、14、和15中任一序列相比包含1到3个氨基酸差异的HIV融合抑制肽。

可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括氨基酸序列与SEQ ID NO：5基本氨基酸序列相似的HIV融合抑制肽，但是与所述基本氨基酸序列相比，该HIV融合抑制肽氨基酸序列在其氨基酸序列中具有多于2个亮氨酸拉链样基序；其中该HIV融合抑制肽在一种或多种生物学性质方面显示出意想不到的改善。可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括例如SEQ ID NO：11-13所示的肽，或者与SEQ ID NO：11-13中任一序列相比包含1到3个氨基酸差异的HIV融合抑制肽。

本发明所述的HIV融合抑制肽可通过公知的方法常规制备，所述方法包括重组表达编码所述肽的核酸。例如，可在适当的条件下培养重组表达HIV融合抑制肽的工程细胞适当的时间来表达并从中获得该肽。本发明所述的HIV融合抑制肽也可通过合成方法制备。在一个实施方案中，该肽通过线性合成方法装配。在其它实施方案中，该肽采用片段缩合法用2个或多个肽片段装配得到。在一个实施方案中，采用2片段缩合法，其中片段AA(1-26)和AA(27-37)被共价偶联并与AA(38)装配得到具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制剂肽。在其它实施方案中，采用3片段方法，其中片段AA(1-12)、AA(13-26)和AA(27-37)被共价偶联并与AA(38)装配得到具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制剂肽。

以下是可用于本发明所述组合物的具体肽片段。每个肽片段都可以作为中间体，该中间体可与一组肽片段中的一个或多个其它肽片段共价结合从而产生具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15氨基酸序列的HIV融合抑制肽。在一个实施方案中，在一组肽片段中，肽片段在溶液相过程中以一定方式结合从而产生所需的具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15氨基酸序列的HIV融合抑制肽。通过如下方式制备的HIV融合抑制肽也可用于本发明提供的组合物：合成所述HIV融合抑制肽的组成肽片段，然后将所述肽片段装配成HIV融合抑制肽，其中该HIV融合抑制肽具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，包含将所述肽喷雾干燥。例如，肽可在pH小于4或大于6时溶解(例如在水中)，其中使用合适的酸或碱例如1NNaOH或1N HCl调节pH，然后将所述肽溶液通过喷雾嘴喷到加热的箱体中。可人工收集干燥的肽颗粒。

在另一个实施方案中，上述喷雾干燥方法进一步包括向所述喷雾干燥溶液加入赋形剂，由此掺入赋形剂与肽。示例性赋形剂的实例包括但不限于填充剂、膨胀剂、稀释剂、湿润剂、溶剂、乳化剂、防腐剂、风味剂、吸收促进剂、持续释放基质、着色剂、和大分子物质例如白蛋白、或例如氨基酸和糖的物质。

在另一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，包括将肽溶液通过喷雾嘴喷到(与喷雾干燥方式相似)另一溶液(例如金属盐溶液，例如锌盐、铁盐或钙盐溶液)中。然后将所得悬浮液离心，弃去上清液，并冷冻沉淀。将该沉淀冻干并过200μm筛。

在另一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，包括盐沉淀或pH沉淀，其中肽可在pH小于4或大于6时溶解(例如在水中)，其中使用合适的酸或碱例如1N NaOH或1N HCl调节pH至约4到6之间或约4.8到5.2之间。在具体实施方案中，该方法包含向肽溶液中加入盐溶液或强酸/碱溶液以导致沉淀。在另一个实施方案中，该方法进一步包含通过离心收集沉淀、通过冻干干燥沉淀、以及任选地将沉淀过200μm筛以控制颗粒大小。

不受理论限制，认为用于制备本发明提供的组合物的肽的方法和试剂可产生有益于某些患者或疾病的理想的或改善的药代动力学参数(例如释放生物活性分子的量或持续时间)。尤其是，金属(例如锌、铁或钙)掺入到肽沉淀中的方式(例如喷雾和/或沉淀)可影响所得组合物的药代动力学参数。

在一个实施方案中，在所述肽沉淀过程中增加所述金属含量(例如锌含量)可降低C_max、增加t_max并增加t_0.01。在另一实施方案中，向低金属(例如低锌)沉淀加入作为冻干盐的金属盐(例如硫酸锌)可降低C_max、增加t_max并增加t_0.01。

在另一实施方案中，沉淀出肽的溶液可影响C_max和t_max。例如，从50∶50甲醇∶水中沉淀出肽相对于从纯水中沉淀出肽可降低C_max并增加t_max。

在另一实施方案中，制备肽的方式可影响C_max和t_max。例如，喷雾沉淀相对于非喷雾沉淀可升高C_max并增加t_max。

使用方法

本发明进一步提供了使用本发明提供的组合物的方法。在一个实施方案中，所述组合物用作治疗方案例如抗病毒治疗方案的一部分。在某些实施方案中，这样的治疗方案可以，例如，被用于治疗HIV感染。

在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明提供的组合物抑制HIV向靶细胞传递的方法，包括给予患者一定量本发明提供的组合物，以使所述靶细胞与抑制细胞被病毒感染有效量的活性试剂(例如抗病毒肽)接触。该方法可以，例如用于治疗HIV感染患者。在一个实施方案中，抑制HIV向靶细胞传递包括抑制gp41介导的HIV-1与靶细胞的融合和/或抑制HIV感染细胞与靶细胞间的合胞体形成。

本发明还提供了治疗HIV感染(在一个实施方案中，HIV-1感染)的方法，包括给予HIV感染患者治疗HIV感染有效量的本发明提供的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含抑制HIV向靶细胞传递有效量的HIV融合抑制肽，和/或抑制gp41介导的HIV与靶细胞融合有效量的HIV融合抑制肽。所述方法可以，例如，用于治疗HIV感染患者。

在具体实施方案中，本发明提供了改善HIV感染相关症状的方法，包括给予HIV感染患者包含溶剂、胶凝材料和肽的组合物，其中该肽选自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或其组合。

本发明进一步提供了将包含HIV融合抑制肽的组合物用于制备用于治疗HIV感染的药物的方法(例如用于抑制HIV传递的方法、抑制HIV融合的方法、和/或治疗HIV感染的方法)。所述药物可为药物组合物形式，该药物组合物包含生物活性分子例如HIV融合抑制肽、溶剂、胶凝材料，并任选地包含一种或多种药学可接受载体。

在一个实施方案中，本发明提供的组合物可通过注射给予，例如皮下注射。

在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可每3、5、7、10、14、17、21、28或60天给予(例如通过皮下注射)一次。

在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可持续一天或多天、一周或多周、一月或多月、或一年或多年每天给予(例如通过皮下注射)1次、2次、3次或更多次。

在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可每周给予(例如通过皮下注射)1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次。在特定实施方案中，本发明提供的组合物可每周给予(例如通过皮下注射)1次或2次。在另一特定实施方案中，本发明提供的组合物每2周给予(例如通过皮下注射)2次。每次给予可包含1次、2次、3次或更多次注射。

在一个实施方案中，本发明提供的组合物以100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl、1000μl或更多体积给予。

在一个实施方案中，本发明提供的组合物通过注射器注射递送，例如，通过100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl、1000μl或更大的体积的注射器注射递送。在一个实施方案中，可使用自动注射器或笔式装置进行递送。在另一实施方案中，该传递装置可被预填充。在一个具体实施方案中，可使用Owen Mumford的AutoJect作为具有300μl、500μl或1000μl体积的递送注射器，并可采用规格30、0.5英寸的固定针头。在另一具体实施方案中，可使用具有300μl、500μl或1000μl体积和规格30、0.5英寸固定针头的Becton Dickinson UltraFine注射器。在一个实施方案中，可以控制药物递送的注射深度。

在一个具体实施方案中，本发明提供的组合物以50mg/ml活性药物成分(例如SEQ ID NO：9)的剂量与的药学可接受的载体，例如甘露糖醇一起在注射用水(pH 7.4)中每天施用一次。在另一具体实施方案中，本发明提供的组合物以125mg/ml活性药物成分(例如SEQ ID NO：9)的剂量在pH 7.4的水中每天施用一次。

实施例

实施例1

在以下实施例中，评估了多种生物物理学参数和生物学参数。确定所述参数的方法如下所述。

使用标准固相合成技术并使用标准FMOC肽化学法，或如本发明实施例3详述的固相合成与液相合成的组合在肽合成仪上合成肽，包括HIV融合抑制肽和基本序列。在本实施例中，所述HIV融合抑制肽可进一步包含反应性官能团，即大部分所述反应性官能团在N末端被乙酰基保护和/或在C末端被酰胺基保护。从树脂上脱离后，沉淀所述肽，并将该沉淀冻干。然后使用反相高效液相色谱纯化该肽；用电喷雾质谱法确认肽的身份。

生物物理参数的评估包括测定螺旋度和热稳定性。使用圆二色谱(“CD”)如下测定螺旋度。简单地说，使用配有热电温控器的分光计获得CD光谱。光谱获得条件为：25℃，从200到260nm步进0.5纳米(nm)，带宽1.5nm，典型平均时间4秒/步。扣除细胞/缓冲液空白后，使用保守窗口大小通过三阶最小二乘多项式拟合平滑光谱以给出随机残差。原始椭圆率数值使用标准方法转换为平均残基椭圆率，并用波长(200到260nm)对[θ]×10^-3(度cm²/dmol)作图。然后使用标准方法计算百分比螺旋度值(通常表示为10μM、25℃的百分比螺旋度)。热稳定性评估如下进行：当以2℃步进升高温度时监测CD信号在222nm处的变化，平衡时间为1分钟。每个样品(例如HIV融合抑制肽)的热稳定性(以Tm值表示)是对应于热转变一阶导数最大值的温度。

生物学性质的评估包括测定对HIV-1毒株的抗病毒活性。在确定HIV融合抑制肽抗病毒活性(例如，一种测量是抑制HIV向靶细胞传递的能力)时，通过源于HIV gp41的HR区域的肽产生的数据使用体外分析，该体外分析已经显示对体内观察到的抗病毒活性具有预测性。更具体地，对于相同的HIVgp41衍生肽，使用体外感染性分析(“Magi-CCR5感染性分析”，参见例如美国专利号6,258,782)观察到的抗病毒活性已显示出与体内抗病毒活性合理相关(参见，例如Kilby等人，1998，Nature Med.4：1302-1307)。这些分析使用指示细胞系MAGI或表达衍生cMAGI的CCR5对感染性病毒滴度降低进行记分。上述两种细胞系都利用HIV-1tat的能力以反式激活HIV-LTR驱动的β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因的表达。该β-gal报告基因已被修饰以定位在细胞核内，并可在感染后几天内用X-gal底物强烈核染色检测。如果染色前只有一轮感染，被染色的核数量就可解释为等于激发接种物(challenge inoculum)中的感染性病毒粒子数量。感染的细胞用CCD-成像器计数，原代细胞和实验室改变的分离株都显示出病毒输入和成像器显示的感染细胞数量之间的线性关系。在MAGI和cMAGI分析中，感染性滴度降低50％(Vn/Vo＝0.5)是显著的，并提供了评估抗病毒活性的主要截断值(“IC50定义为导致感染性病毒滴度降低50％的活性成分浓度)。用于测试抗病毒活性的肽被稀释成多种浓度，并针对HIV接种进行2次或3次重复测试，所述HIV接种物经调整在48孔微量滴定板中产生约1500到2000个感染细胞/孔。将所述肽(在相应稀释中)加入到cMAGI或MAGI细胞中，然后加入病毒接种物；24小时后，加入感染和细胞-细胞融合抑制剂(例如SEQ ID NO：2(恩夫韦地))以防止第二轮HIV感染和细胞-细胞病毒传播。将细胞再培养2天，然后固定并用X-gal底物染色以检测HIV感染细胞。每个对照和肽稀释物的感染细胞数量用CCD成像器确定，然后计算IC50(以μg/ml表示)。

对由基本序列组成的肽的抗病毒活性具有抗性的病毒可使用标准的实验室方法制备。基本而言，在计算IC50和IC90后，将细胞与病毒和肽(例如浓度接近IC90)在培养物中混合(包括当所述细胞此后分瓶时)。维持并监测所述培养物直至合胞体出现。从第一轮培养收获的病毒用于在第二轮培养中感染细胞，肽的浓度高于(2到4倍)第一轮培养使用的浓度。维持并监测第二轮培养物中对所述肽的抗病毒活性具有抗性的病毒的存在。可能需要随后几轮培养以最终产生对所述肽的抗病毒活性具有抗性的病毒分离株(在抗此类分离株的肽的IC50预定水平)。

为确定药代动力学性质，将HIV融合抑制肽或衍生出HIV融合抑制肽的基本序列静脉内给予猕猴(Macaca fasicularis)(如本领域已知，其它动物模型也可用于确定药代动力学性质)。在给药后多个时间点抽取血样并离心分离血浆。冷冻保存血浆样品直至在电喷雾阳离子模式下进行LC-MS(液相色谱/质谱)分析。使用pH 6.8的10mM乙酸铵缓冲液中的乙腈梯度将HIV融合抑制剂或基本序列从C18或C8HPLC柱上洗脱。分析时，使用2倍或3倍体积的包含0.5％甲酸的乙腈将血浆样品去蛋白。猕猴血浆样品的双份校准标准与所述样品同时制备，并在所述包含HIV融合抑制肽或基本序列的样品之前或之后分析。使用单指数或双指数数学模型从血浆浓度-时间数据计算出药代动力学性质。通过非线性最小二乘优化获得模型。使用了浓度1/C²权重。使用以下方程计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)、全身清除率(Cl)、和终末半衰期(t¹/₂)。

AUC＝A/-a+B/-b

其中A和B为截距，a和b为指数方程的速率常数，分别描述分布期和消除期。当使用单指数模型时，消除参数“A”和“a”。

Cl＝剂量/AUC(以L/K/hr表示)

t¹/₂＝-0.6903/b(以小时(hr)表示)

实施例2

为说明本发明提供的实施方案，基本序列具有如下氨基酸序列(SEQ IDNO：5)。

TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL

在一个实施方案中，HIV融合抑制肽与其来源的基本序列相比，包含多于2个亮氨酸拉链样基序。这些HIV融合抑制肽的例子包括但不限于SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13；或与SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、或SEQ ID NO：13中任一序列相比具有1到3个氨基酸差异(例如，至少92％一致性)的氨基酸序列；每个HIV融合抑制肽具有3到5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列。以下图示(I)显示了HIV融合抑制肽的氨基酸序列，在所述基本序列的氨基酸位点下方(用“|”对齐)用单字母氨基酸代码(“L”表示亮氨酸，“I”表示异亮氨酸)表示氨基酸差异(与基本序列相比)，且参与亮氨酸拉链样基序的异亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉链样基序的位点1或8，或一个亮氨酸拉链样基序的位点8和相邻亮氨酸拉链样基序的位点1)用下划线标示。一个亮氨酸拉链的位点1或8也可作为序列中另一亮氨酸拉链样基序的相对末端位点，即作为一个基序的位点8和另一相邻基序的位点1。

(I)

TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL SEQ ID NO：5

                       |      |

                       L      L        SEQ ID NO：11

                       I      L        SEQ ID NO：12

                       L      I        SEQ ID NO：13

在另一个实施方案中，HIV融合抑制肽与其来源的基本序列相比，包含多于1个亮氨酸拉链样基序，以及不参与形成亮氨酸拉链样基序的额外的亮氨酸。这种HIV融合抑制肽的例子包括但不限于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、和SEQ ID NO：15；或与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15中任一序列相比具有1到3个氨基酸差异(例如，至少92％一致性)的氨基酸序列；并且每种HIV融合抑制肽氨基酸序列与SEQ ID NO：5基本序列的不同在于包含多于1个亮氨酸拉链样基序，和不参与形成亮氨酸拉链样基序的额外的亮氨酸(即，除亮氨酸拉链样基序位点1或8以外的亮氨酸)。在一个实施方案中，非亮氨酸拉链样基序亮氨酸替换在SEQ ID NO：5基本序列的氨基酸位点21替换了异亮氨酸，该替换提供了促进这些肽的有利生物学性质的因素。以下图示(II)显示了HIV融合抑制肽的氨基酸序列，在所述基本序列的氨基酸位点下方(用“|”对齐)用单字母氨基酸编码(“L”表示亮氨酸，“I”表示异亮氨酸)表示氨基酸差异(与基本序列相比)，且参与亮氨酸拉链样基序的异亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉链样基序的位点1或8，或一个亮氨酸拉链样基序的位点8和相邻亮氨酸拉链样基序的位点1)用下划线标示。不参与形成亮氨酸拉链样基序的亮氨酸为斜体。

(II)

TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL SEQ ID NO：5

                    |  |      |

                    L  L               SEQ ID NO：9

                    L  L               SEQ ID NO：10

                    L  I               SEQ ID NO：14

                    L         I        SEQ ID NO：15

以下图示(III)显示了“基本序列”SEQ ID NO：5与本发明公开的SEQ IDNO：9-15肽的比较总结，SEQ ID NO：9-15肽相对于SEQ ID NO：5显示出改善的生物学性质。SEQ ID NO：9-15中各序列相对于SEQ ID NO：5基本序列的氨基酸替换用下划线和粗体标示。

(III)

SEQ ID NO：5

T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L I R A A Q E Q Q E K N E A A L R E L

SEQ ID NO：9

T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L L R A L Q E Q Q E K N E A A L R E L

SEQ ID NO：10

T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L L R A A Q E Q Q E K L E A A L R E L

SEQ ID NO：11

T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L I R A L Q E Q Q E K L E A A L R E L

SEQ ID NO：12

T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L I R A I Q E Q Q E K L E A A L R E L

SEQ ID NO：13

T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L I R A L Q E Q Q E K I E A A L R E L

SEQ ID NO：14

T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L L R A I Q E Q Q E K N E A A L R E L

SEQ ID NO：15

T T W E A W D R A I A E Y A A R I E A L L R A A Q E Q Q E K I E A A L R E L

参考表1，将根据本发明的HIV融合抑制肽与合成肽比较该合成肽具有相同的基本序列，但氨基酸序列有所不同(与SEQ ID NO：9-15比较)，并具有抗HIV活性。所述比较包括用本发明实施例1所述的方法确定的生物物理参数和生物活性参数。在确定生物活性时，由于通过抗病毒活性进行评估，因而使用了病毒分离株，该病毒分离株对已知抑制HIV介导的融合的某些肽的抗病毒活性具有抗性(所述抗性病毒分离株在表1中命名为“Res”)。

表1：生物物理学和生物学(抗病毒活性)参数

SEQ IDNO：	螺旋度(％)	Tm(℃)	抗病毒活性(μg/ml)HIV-IIIB IC50	抗病毒活性(μg/ml)HIV-Res IC50
					5	71	42	＜0.10	＜0.10
6	97	65	＜0.10	＞0.10
					7	84	75	＜0.10	＞0.10
8	99	46	＜0.10	未测试
					9	61	62	＜0.10	＜0.10
10	77	75	＜0.10	＜0.10

SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7与基本序列SEQ ID NO：5的不同在于单个亮氨酸替换(分别位于位点24和位点31)；如以上表1所示，该替换没有显著地影响抗病毒活性，但导致了半衰期的改善(参见以下表2)。SEQ ID NO：6与根据本发明具有SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽相似，但是SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有另一个氨基酸差异，即氨基酸位点21的亮氨酸(而SEQ IDNO：6在氨基酸位点21是异亮氨酸)。参考表1，与SEQ ID NO：6的肽比较，SEQ ID NO：9中亮氨酸替换异亮氨酸导致螺旋度降低(从97％到61％)，同时保持良好的抗性性质(对抗性病毒分离株“Res”的活性)。类似地，SEQ ID NO：7的氨基酸序列与根据本发明具有SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽相似，但是SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有一个氨基酸差异，即氨基酸位点21的亮氨酸(而SEQ ID NO：7在氨基酸位点21是异亮氨酸)。参考表1，与SEQID NO：7的肽比较，SEQ ID NO：10中亮氨酸替换异亮氨酸导致螺旋度降低(从84％到77％)，同时保持良好的抗性性质(对抗性病毒分离株“Res”的活性)。因此，表1显示了SEQ ID NO：9和10相对于SEQ ID NO：6-7的改善性质。

本实施方案说明了根据本发明的HIV融合抑制肽与基本氨基酸序列相比的药代动力学性质。使用实施例1此前详述的评估药代动力学性质的方法，

表2说明了与基本序列SEQ ID NO：5的药代动力学性质相比，根据本发明的HIV融合抑制肽的药代动力学性质。

表2

SEQ ID NO：	清除率(L/kg/hr)	半衰期(t1/2：hr)
			5	＞0.04	6
6	＜0.02	15
			7	＜0.02	17
8	＞0.04	7
			9	＜0.02	12
10	＜0.02	21

如表2所示，SEQ ID NO：6、7、9和10都显示出延长的生物半衰期(“t¹/₂”)。SEQ ID NO：8在氨基酸位点21为亮氨酸，而在氨基酸位点24或31不是，其没有显示出SEQ ID NO：6、7、9和10肽所显示的显著延长的半衰期。

为了在生产药物制剂时将HIV融合抑制肽配制到药学可接受载体中，在水溶液中的稳定性可能是重要的参数，尤其是当药物制剂被肠胃外给予时。应注意到，根据本发明的HIV融合抑制肽在生理pH下显示出在水溶液中改善的稳定性。例如，如下分别测试具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5氨基酸序列的合成肽，和具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的溶解度：向磷酸缓冲液(PBS)中加入浓度为10mg/ml的所述肽，在1周(168小时)时间中的不同时间点，测定(例如用HPLC)在37℃下约pH 7.3到约pH 7.5范围内的溶液中残留的肽的量。包含SEQ ID NO：2的溶液在仅仅数小时后变得不稳定(溶液中检测到最少量的肽)。相反，在1周的时间点仍可在溶液中检测到90％或更多具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽，但是在1周的时间点只可在溶液中检测到少于80％具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的肽。

实施例3

将本发明提供的HIV融合抑制肽的生物学性质与其它公认的有效抗病毒剂(包括SEQ ID NO：2(恩夫韦地))进行了比较。尤其是，将感兴趣的新化合物SEQ ID NO：9与公认的抗病毒剂SEQ ID NO：2进行了体外抗性比较研究，详述如下：MT2细胞用病毒分离株(IIIB、030、060和098)感染，并在浓度逐渐升高的SEQ ID NO：2(恩夫韦地)或SEQ ID NO：9中培养以选择抗性。初始肽浓度约为各个肽对相应野生型分离株的IC₅₀的2倍。通过每1-3天添加新鲜肽保持肽浓度。使用标准技术监测培养物的细胞病理效应(CPE)，当达到最大CPE时，将一小等份病毒用于随后轮次的感染。与野生型病毒生长速率比较，根据培养时间，肽浓度升高2到4倍。在选择期间，也收集不含肽的病毒储液。不含肽的病毒储液用双脱氧测序化学法鉴定gp41的基因型改变，并使用cMAGI感染性分析确定表型易感性。

使用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9进行体外选择的比较结果如表3所示。这些数据显示SEQ ID NO：9选择的培养时间比SEQ ID NO：2选择平均长3倍，导致IC₅₀更低的倍数改变(SEQ ID NO：2的42倍与SEQ ID NO：9的24倍相比)。SEQ ID NO：9选择需要的突变(几何平均数3.6)比SEQ ID NO：2(几何平均数1.7)更多以达到所述更低的倍数改变。更长的培养时间、更低的倍数改变、以及实现所述更低的倍数改变所需的更高的突变数量，都表明与SEQ ID NO：2相比，SEQ ID NO：9显示出更不易发展体外抗性。也就是说，所述结果说明HIV出现对SEQ ID NO：9的抗性比出现对SEQ ID NO：2的抗性需要更长的时间。基于以前对其它肽例如SEQ ID NO：2和T1249的HIV抗性发展研究，人们可预期本发明提供的体外结果可与体内结果合理地关联。

表3：SEQ ID NO：2(恩夫韦肽)和SEQ ID NO：9体外选择的比较

起始病毒分离株	肽(SEQ ID NO)	培养天数	起始IC50(ng/mL)	终末IC50(ng/mL)	IC50倍数变化	获得突变的数目
							IIIB	2	62	6	163	27	2
584.000030	2	46	42	798	19	2
							584.000060	2	46	10	68	7	2
584.000098	2	45	50	45575	912	1
							几何平均值	2	49	19	797	42	1.7

起始病毒分离株	肽(SEQ ID NO)	培养天数	起始IC50(ng/mL)	终末IC50(ng/mL)	IC50倍数变化	获得突变的数目
							IIIB	9	168	12	2768	231	4
584.000030	9	77	28	113	4	2

起始病毒分离株	肽(SEQ ID NO)	培养天数	起始IC50(ng/mL)	终末IC50(ng/mL)	IC50倍数变化	获得突变的数目
							584.000060	9	173	8	208	26	4
584.000098	9	173	37	521	14	5
							几何平均值	9	140	18	429	24	3.6

基于以前对其它肽例如SEQ ID NO：2和T1249的HIV抗性发展研究，人们可预期本发明提供的体外结果应与体内结果合理相关联(参见，例如Melby等人，2006，AIDS Research and Human Retroviruses 22(5)：375-385；Greenberg & Cammack，2004，J.Antimicrobial Chemotherapy 54：333-340；Sista等人，2004，AIDS 18：1787-1794)。

实施例4

一般而言，本发明提供的HIV融合抑制肽可通过两种方法中的一种合成。第一种方法为使用标准固相合成技术和使用标准Fmoc肽化学法或其它标准肽化学法(使用化学保护基团或CPG)的线性合成。合成本发明提供的HIV融合抑制肽的第二种方法为通过片段缩合法。简单地说，合成2个或多个片段，每个片段包含所要制备的HIV融合抑制肽完整氨基酸序列的相应部分。在片段合成中，如果需要，加入的氨基酸可具有被化学保护剂化学保护的游离胺(例如侧链胺)。然后组装(以一定方式和顺序共价结合)所述片段，由此制备(以正确的氨基酸序列)所述HIV融合抑制肽。

关于肽合成，可使用肽序列合成领域技术人员熟知的技术制备各个肽片段自身，以及由一组肽片段组合生产的本发明提供的HIV融合抑制肽。例如，在一种方法中，肽片段可在固相中合成，然后在装配过程中在液相中组合以制备产物HIV融合抑制肽。在另一种方法中，可使用液相合成制备肽片段，然后所述肽片段在装配过程中在固相中组合以制备HIV融合抑制肽。在另一种方法中，各种肽片段可使用固相合成，然后在装配过程中在固相中组合以制备HIV融合抑制肽的完整氨基酸序列。在一个实施方案中，使用本领域技术人员熟知的固相合成法制备各个肽片段。在另一个实施方案中，使用一组肽片段并使用固相和液相技术组合的装配过程制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽。例如，一组肽片段包含2到4个肽片段，合成该片段，然后装配，以完成本发明提供的HIV融合抑制肽的合成。基于本发明的教导，对本领域技术人员显而易见的是，所述的片段装配方法可用于、且已经被用于具有SEQ ID NO：9-16中任一序列的氨基酸序列的一些HIV融合抑制肽。

为说明通过片段缩合法制备本发明提供的HIV融合抑制肽，在合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中，一组肽片段中的肽片段在肽片段装配过程中共价结合。本发明提供的肽片段可包括但不限于具有如下表4所示氨基酸序列的肽片段。本发明提供的某些肽片段可用于排除其它肽片段。还标示了各种肽片段在SEQ ID NO：9中的对应氨基酸；因此，显示出各种肽片段由SEQ ID NO：9氨基酸序列中的多个相邻氨基酸组成。

表4

SEQ IDNO：	氨基酸序列	在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
17	TTWEAWDRAIAE	1-12
			18	YAARIEALLRALQE	13-26
19	QQEKNEAALRE	27-37
			20	QQEKNEAALREL	27-38
21	TTWEAWDRAIA	1-11
			22	EYAARIEALLRALQE	12-26
23	TTWEAWDRAI	1-10
			24	AEYAARIEALRALQE	11-26
25	TTWEAWDRA	1-9
			26	IAEYAARIEALLRALQE	10-26
27	TTWEAWDR	1-8
			28	AIAEYAARIEALLRALQE	9-26
29	TTWEAWDRAIAEYAARIEAL	1-20
			30	LRALQEQQEKNEAALRE	21-37
31	LRALQEQQEKNEAALREL	21-38
			32	TTWEAWDRAIAEYAARIE	1-18
33	ALLRALQEQQEKNEAALRE	19-37
			34	ALLRALQEQQEKNEAALREL	19-38
35	YAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL	13-38

SEQ IDNO：	氨基酸序列	在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
			36	EYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL	12-38
37	AEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL	11-38
			38	IAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL	10-38
39	AIAEYAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL	9-38
			40	TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE	1-26
57	TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALRE	1-37
			58	AARIEALLRALQEQQEKNEAALRE	14-37
59	RIEALLRALQEQQEKNEAALRE	16-37
			60	QEQQEKNEAALREL	25-38
61	LQEQQEKNEAALREL	24-37
			62	EQQEKNEAALREL	26-38
63	TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQ	1-25
			64	TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRAL	1-24
65	TTWEAWDRAIAEYAARIEALLR	1-22
			66	TTWEAWDRAIAEYAARIEALL	1-21
67	TTWEAWDRAIAEYAARIEA	1-19

68	TTWEAWDRAIAEYAARI	1-17
			69	TTWEAWDRAIAEYAAR	1-16
70	TTWEAWDRAIAEYAA	1-15
			71	TTWEAWDRAIAEYA	1-14

68	TTWEAWDRAIAEYAARI	1-17
			72	TTWEAWDRAIAEY	1-13
73	EL	37-38
			74	AARIEALLRALQE	14-26
75	ARIEALLRALQE	15-26
			76	RIEALLRALQE	16-26
77	EALLRALQE	18-26

本发明还提供了特定的肽片段组，所述肽片段组在合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中作为中间体。本发明提供的肽片段组包括1-16组，如表5所示(组的编号仅为描述方便)。某些肽片段组可用于排除其它肽片段组。

表5

组编号	肽片段	在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
			1	TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：18)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)	1-1213-2627-37
2	TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：18)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)	1-1213-2627-38
			3	TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRALQEQQEKNEAALRE(SEQ ID NO：30)	1-2021-37
4	TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRALQEQQEKNEAALREL(SEQ ID NO：31)	1-2021-38
			5	TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：22)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)	1-1112-2627-37

组编号	肽片段	在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
			6	TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：24)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)	1-1011-2627-37
7	TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：26)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)	1-910-2627-37
			8	TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：28)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)	1-89-2627-37
9	TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALL-RALQE(SEQ ID NO：22)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)	1-1112-2627-38

10	TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：24)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)	1-1011-2627-38
			11	TTWEAEDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：26)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)	1-910-2627-38
12	TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：28)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)	1-89-2627-38
			13	TTWEAWDRAIAEYAARIE (SEQ ID NO：32)ALLRALQEQQEKNEAALRE(SEQ ID NO：33)	1-1819-37
14	TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRALQEQQEKNEAALREL(SEQ ID NO：34)	1-1819-38
			15	TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：40)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)	1-2627-37

10	TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：24)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)	1-1011-2627-38
			16	TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：40)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)	1-2627-38

因此，在一个实施方案中，本发明提供了可用于合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法、肽片段、和肽片段组。从本发明描述中还显而易见的是，所述方法、肽片段、和肽片段组可用于合成具有SEQ IDNO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽，其中所述HIV融合抑制肽包含一个或多个化学基团：

B-TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL-Z

                               |

                               U

其中一个或多个氨基末端、羧基末端、或侧链游离反应性官能团(例如内部赖氨酸的ε胺)用化学基团(B、U、Z；其中B、U、Z可为相同的化学基团或不同的化学基团)修饰，所述化学基团可包括但不限于一种或多种以下基团：反应性官能团、化学保护基团(CPG)、和接头。本领域还已知可用于在肽片段N末端、或肽片段C末端、在内部氨基酸的游离胺、或其组合处引入化学基团的技术。与制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽有关，被保护的肽片段(具有一个或多个化学基团的肽片段)的示例性实例包括但不限于，表6中所列的肽片段。

表6

SEQID NO：	氨基酸序列	在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
			17	Ac-TTWEAWDRAIAE	1-12
18	CPG-YAARIEALLRALQE	13-26
			19	CPG-QQEKNEAALRE	27-37
19	CPG-QQEKNEAALRE|U	27-37
			20	QQEKNEAALREL-NH2	27-38
29	Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIEAL	1-20
			30	CPG-LRALQEQQEKNEAALRE	21-37
31	LRALQEQQEKNEAALREL-NH2	21-38

SEQID NO：	氨基酸序列	在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
			21	Ac-TTWEAWDRAIA	1-11
22	CPG-EYAARIEALLRALQE	12-26
			23	Ac-TTWEAWDRAI	1-10
24	CPG-AEYAARIEALLRALQE	11-26
			25	Ac-TTWEAWDRA	1-9
26	CPG-IAEYAARIEALLRALQE	10-26
			27	Ac-TTWEAWDR	1-8
28	CPG-AIAEYAARIEALLRALQE	9-26
			32	Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIE	1-18
33	CPG-ALLRALQEQQEKNEAALRE	19-37
			34	ALLRALQEQQEKNEAALREL-NH2	19-38

Ac-乙酰基，NH₂-氨基(但可为其它化学基团，如本发明“定义”部分详述)；CPG为化学保护基团(例如，Fmoc或其它N末端化学保护基团，如本文“定义”部分详述)；U如上定义。

SEQ ID NO：9首先被线性合成以得到初始研究量。首先用两片段合成以生成大量SEQ ID NO：9，基于在该过程中通过两片段方法导入的效率，该途径(图3)被用于毒理学物质和临床物质的第一GMP合成。也可采用三片段方法(参见，例如图7)。合成的主要途径包括例如采用氨基酸位点1-26片段和氨基酸位点27-37片段的2片段方法，和采用氨基酸位点1-12片段、氨基酸位点13-26片段以及氨基酸位点27-37片段的3片段方法。已经检查了SEQ IDNO：9初始线性合成的各种改进(实施例12)。SEQ ID NO：9在例如Sieber酰胺树脂、rink-负载CTC树脂和Glu37侧链负载树脂上线性装配。用于装配SEQ ID NO：9的线性合成方法的其它范例包括例如采用rink-负载CTC(图4)、Sieber树脂(图5)和Glu-负载的CTC(图6)的合成。

实施例5

参考表5(组1和组2)和图7，示出了使用3个特定肽片段(例如SEQ ID NO：17-19+Leu；或SEQ ID NO：17、18和20)并使用片段缩合法合成具有SEQID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，该片段缩合法包括将3个肽片段组合以制备HIV融合抑制肽。每个所述肽片段显示出的物理性质和溶解度特性使该肽片段成为优选肽片段(相对于二片段法)，以用于以高产量和高纯度合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，且进一步只需一种加样树脂作为起始材料(简化合成方法)。通过标准固相合成法(使用超酸敏感树脂，例如4-羟甲基-3-甲氧苯氧基丁酸树脂、或2-氯三苯甲基氯树脂-“CTC”，图7)合成具有SEQ ID NO：17氨基酸序列且包含SEQ ID NO：9前12位氨基酸(参见图3，“AA(1-12)”)的肽片段，该肽片段的N末端被乙酰化(“Ac”，作为化学基团)并具有C末端羧基(-COOH)(参见图7，“Ac-AA(1-12)-OH”)。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：18氨基酸序列并包含SEQ ID NO：9中第13-26位氨基酸(参见图3，“AA(13-26)”)的肽片段，该肽片段的N末端具有Fmoc(作为化学保护基团)且在C末端具有-OH(参见图7，“Fmoc-AA(13-26)-OH”)。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：19氨基酸序列并包含SEQ ID NO：9中第27-37位氨基酸(参见图7，“AA(27-37)”)的肽片段，该肽片段的N末端具有Fmoc(作为化学保护基团)且在C末端具有-OH(参见图7，“Fmoc-AA(27-37)-OH”)。使用本领域技术人员熟知的裂解剂、溶剂和技术将各个肽片段从所用的固相合成树脂上裂解。然后如下分离各个肽片段：通过蒸馏去除大部分上述溶剂，并通过加入水(含有或不含有含醇助溶剂)沉淀所述肽片段。所得固体通过过滤分离、洗涤、在水或乙醇/水中重新制浆、再过滤、并在真空炉中干燥。

如图7所示，通过液相合成制备肽片段，其中将具有SEQ ID NO：19氨基酸序列的肽片段(参见图7，“FmocAA(27-37)-OH”)与SEQ ID NO：9第38位氨基酸亮氨酸(已在液相中被酰胺化)化学结合，从而生成具有SEQ ID NO：20氨基酸序列的肽片段(包含SEQ ID NO：9中第27-38位氨基酸)，该肽片段C末端被酰胺化(作为化学基团)(参见图7，“Fmoc-AA(27-38)-NH₂”)。在一种合成方法中，本发明提供的酰胺化肽片段(包括但不限于肽片段H-AA(27-38)-NH₂)可使用酰胺树脂直接合成。总结所述液相反应，在DIEA(二异丙基乙胺)和亮氨酰胺(例如，偶联剂和消旋抑制剂的组合)的存在下分别使用HBTU(O-苯并三氮唑1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)或TBTU(O-苯并三氮唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯)、以及HOBT、6-Cl HOBT、或HOAT，分离的肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH的羧基末端被转换成HOBT(1-羟基苯并三唑水合物)、6-Cl HOBT*H₂O、或HOAT(1-羟基-7-偶氮苯并三唑)的活性酯。所述反应在0到30℃在极性非质子溶剂例如DMF(二甲基甲酰胺)、DMAc(二甲基乙酰胺)或NMP(N-甲基吡咯烷酮)中进行。所述偶联反应完成时，将哌啶、碳酸钾、DBU或本领域技术人员熟知的其它碱加入到所述反应中(加或不加另外的助溶剂)以有效去除末端Fmoc保护基团。所述反应完成时，加入醇或可与水混溶的溶剂和/或水以沉淀肽片段，该肽片段具有SEQ ID NO：20氨基酸序列，并在C末端被酰胺化(H-AA(27-38)-NH₂)。

如图7示例所示，为在液相过程中使用肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH与亮氨酰胺(参见图3，“H-Leu-NH₂”)组合制备肽片段H-AA(27-38)-NH₂，将肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH(571g，205mmol，1当量)、H-Leu-NH₂(32.0g，246mmol，1.2当量)和6-Cl HOBT(41.7g，246mmol，1.2当量)加入到DMF(4568ml，8体积)中，用DIEA(53.6ml，307.5mmol，1.5当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约20分钟)。将所述溶液冷却，并加入TBTU(79.0g，246mmol，1.2当量)。将所述反应在0℃搅拌，然后在25℃搅拌。当HPLC分析显示所述反应完成时，加入哌啶(81ml，820mmol，4当量)以去除所述肽片段Fmoc-AA(27-38)-NH₂的Fmoc保护基团(也可使用其它碱，例如碳酸钾、DBU等)。将反应在30℃搅拌，直至HPLC显示反应完成。然后将所述反应混合物冷却至5℃以下，并缓慢加入预冷水(8体积，4568mL)保持所得浆体温度低于10℃。将悬浮液搅拌30分钟，然后过滤并用25％乙醇/水洗涤2次(每次2284mL，4体积)。通过在乙醇/水(加或不加稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它类似溶剂混合物中重新制浆以去除残留哌啶和哌啶二苄基富烯。如图7所示，产物为分离的肽片段H-AA(27-38)-NH₂的制备物。

如图7所示，然后进行液相反应，其中肽片段H-AA(27-38)-NH₂(SEQ IDNO：20)与肽片段Fmoc-AA(13-26)-OH(SEQ ID NO：18)组合，并去保护从而产生肽片段H-AA(13-38)-NH₂(SEQ ID NO：35，在N末端和C末端都具有化学基团)。

将肽片段Fmoc-AA(13-26)-OH(460g，167mmol，1当量)、肽片段H-AA(27-38)-NH₂(460g，172mmol，1.03当量)和6-Cl HOBT(34g，200mmol，1.2当量)加入到DMF(6900ml，15体积)中，用DIEA(47ml，267mmol，.1.6当量)处理，并搅拌以溶解所有固体。将所得溶液冷却至5℃以下。向反应中加入TBTU(64g，200mmol，1.2当量)，并将反应在0℃搅拌，然后在25℃搅拌。一旦HPLC分析显示所述反应完成，加入哌啶(58ml，668mmol，4当量)以去除Fmoc，然后搅拌所述反应直至HPLC显示反应完成。将溶液冷却至5℃以下，并以一定速率缓慢加入水(6900mL，15体积)使得温度不会升到10℃以上。将所得悬浮液搅拌30分钟后，通过过滤收集固体并用水洗涤(2次，每次2300mL，5体积)并干燥。通过在乙醇/水(加或不加稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它类似溶剂混合物中重新制浆去除残留哌啶和哌啶二苄基富烯。通过过滤收集固体、洗涤、并干燥以产生基本纯的白色固体H-AA(13-38)-NH₂(SEQ IDNO：35)，纯度用高效液相色谱(HPLC)分析确定。

如图7所示，肽片段H-AA(13-38)-NH₂(SEQ ID NO：35)在液相反应中与肽片段Ac-(1-12)-OH(SEQ ID NO：17)装配而产生具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如图7，Ac-(1-38)-NH₂)。将肽片段Ac-AA(1-12)-OH(130g，58.5mmol，1当量)研磨成细粉并与肽片段H-AA(13-38)-NH₂(303g，58.5mmol，1当量)混合。将所述混合物缓慢加入到2∶1 DCM/DMF(20体积，2600mL)和DIEA(25.5mL，146mmol，2.5当量)温热溶液中。加入HOAT(15.9g，117mmol，2.0当量)且搅拌所述混合物以溶解所有固体。将所得溶液冷却至5℃以下，并加入TBTU(28.2g，87.8mmol，1.5当量)。将溶液在0℃搅拌30分钟，然后在25℃搅拌，直至HPLC显示反应完成。将所述溶液加热到30-35℃，并加入额外的DCM(13体积，1740mL)，接着加入水(1820mL，14体积)。将所述混合物搅拌5分钟，然后允许分层。去除水层并替换为新鲜水(1820ml，14体积)。分层重复总计5次。将有机层蒸馏至原体积的1/3，并加入异丙醇(IPA；1820ml，14体积)。继续蒸馏以去除残留DCM。将所得浆体冷却至5℃以下，并缓慢加入水(1820ml，14体积)。形成的固形通过过滤收集，用水洗涤2次(每次520mL，4体积)，并干燥以产生分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH₂(SEQ ID NO：9)的制备物，纯度用HPLC分析确定。

如图7所示，可通过酸解或本领域技术人员熟知的其它通过去除侧链化学保护基团将肽去保护的方法去除HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH₂的侧链化学保护基团。在本实施例中，HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH₂(60g，8.1mmol)用TFA(三氟乙酸)∶DDT(二硫苏糖醇)∶水(90∶10∶5；570ml)处理，并在室温搅拌6小时。将该溶液冷却至10℃以下，并以一定速率缓慢加入预冷MTBE(25体积，1500ml)使得温度保持低于10℃。生成的固体通过过滤收集，用MTBE洗涤，并干燥。然后将所得粉末在乙腈(ACN；10体积，600mL)中制浆，用DIEA和乙酸调节pH至4到5之间，以使所述肽脱羧基。一旦HPLC显示所述反应完成，通过过滤收集固体，用ACN洗涤，并干燥以产生去保护且脱羧基的肽制备物，然后所述肽制备物通过HPLC或其它合适的色谱技术纯化，以产生具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的分离的HIV融合抑制肽的制备物。

实施例6

参考表5(组3和组4)和图8，显示了使用2个特定肽片段(例如SEQ ID NO：29和30+Leu；或SEQ ID NO：29和31)并使用片段装配法合成具有SEQ IDNO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，该片段装配法包括将2个肽片段通过化学结合(“装配”)进行组合以生成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽。每种所述肽片段显示出的物理性质和溶解度特性使它们在使用2个肽片段以高产量和高纯度合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中是可用的或优选的。在选择用于二片段装配方法的肽片段时，发现被装配在一起的2个片段之间的接合点(例如，具有SEQ ID NO：29氨基酸序列的肽片段C末端，和具有SEQ ID NO：31氨基酸序列的肽片段末N端)处具有亮氨酸和/或谷氨酸有利于以高产量装配和获得的纯度水平。

通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：29氨基酸序列并包含SEQ IDNO：9前20位氨基酸(“AA(1-20)”)的肽片段，该肽片段N末端被乙酰化(“Ac”，作为化学基团)且C末端具有羟基(-OH)(参见表6；本发明也被称为“Ac-AA(1-20)-OH”)。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：30氨基酸序列并包含SEQ ID NO：9中第21-37位氨基酸(“AA(21-37)”)的肽片段，该肽片段的N末端具有Fmoc(作为化学保护基团)其C末端具有-OH(参见表6；本发明也被称为“Fmoc-AA(21-37)-OH”)。

如表5组3和组4以及图8所示，通过液相合成制备肽片段，其中肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH化学结合到已在液相中酰胺化的SEQ ID NO：9的第38位氨基酸亮氨酸上以生成具有SEQ ID NO：31氨基酸序列的肽片段(包含SEQ ID NO：9中第21-38位氨基酸)，该肽片段的C末端被酰胺化(作为化学基团)(“Fmoc-AA(21-38)-NH₂”)。为了在液相过程中使用肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH与亮氨酸(“H-Leu-NH₂”)组合制备肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH₂，将肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH(30g，7.43mmol，1.0当量)、H-Leu-NH₂*HCl(1.36g，8.16mmol，1.2当量)和HOAT(1.52g，11.2mmol，1.5当量)溶解于DMF(450ml，15体积)中，用DIEA(6.5ml，37.3mmol，5当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约30分钟)。将该溶液冷却至0±5℃，并加入TBTU(2.86g，8.91mmol，1.2当量)，在0±5℃搅拌5分钟，然后在25±5℃反应2小时或直至HPLC显示反应完成。

在分离片段H-AA(21-38)-NH₂之前去除肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH₂的Fmoc化学保护基团。加入哌啶(7.3mL，73.8mmol，10当量)，且将所述溶液在25±5℃搅拌1小时或直至HPLC分析显示基本所有Fmoc已从所述肽片段去除。冷却反应器，加入水(1000ml，30体积)，在10℃以下搅拌自由流动的浆体30分钟，然后通过过滤分离。用1∶1乙醇/水洗涤收集的固体，并在真空炉中在35±5℃干燥。然后将肽片段在1∶1乙醇/水(450mL，15体积)中重新制浆3小时。收集并干燥固体。然后所述肽片段在3∶1正己烷∶MTBE(450mL，15体积)中制浆过夜，然后通过过滤分离并重新干燥。如需要，所述MTBE重新制浆可重复以去除多余的哌啶。所得产物是分离的肽片段H-AA(21-38)-NH₂制备物(参见图8)。

然后进行了液相反应，其中将肽片段H-AA(21-38)-NH₂(SEQ ID NO：31)与肽片段Ac-AA(1-20)-OH(SEQ ID NO：29)组合，以生成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见图8，Ac-(1-38)-NH₂)。将肽片段H-AA(21-38)-NH₂(3.40g，0.86mmol，1当量)、肽片段Ac-AA(1-20)-OH(3.00g，0.86mmol，1.0当量)以及HOAT(0.177g，1.3mmol，1.5当量)和DIEA(0.599ml，3.44mmol，4当量)溶解于DMAc(二甲基乙酰胺；100ml，33体积)，冷却至0±5℃。向反应中加入TBTU(0.331g，1.03mmol，1.2当量)。将所述反应在0±5℃搅拌5分钟，并在25±5℃搅拌3小时或直至HPLC显示所述反应完成。冷却反应器，缓慢加入水(200ml，66体积)。形成浆体并在10℃以下搅拌至少30分钟。固体通过过滤分离并用另外的水洗涤。在真空炉中在35±5℃干燥收集的固体。所得产物是完全保护的、分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH₂(SEQ ID NO：9)制备物，纯度用HPLC分析确定。然后使用本发明实施例5所述的方法或本领域技术人员熟知的其它去保护和脱羧基方法对所述HIV融合抑制肽去保护(通过去除侧链化学保护基团)并脱羧基(在色氨酸残基)，然后纯化(例如通过HPLC)。所得产物是具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(在本说明中，N末端被乙酰化，C末端被酰胺化)制备物(去保护且脱羟基的)。

使用相似的技术和条件，使用其它涉及2片段装配或3片段装配的片段装配法制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如表4和5)。从本文描述应理解，用于通过本发明的方法制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的优选肽片段可用于排除优选肽片段以外的肽片段。同样地，用于通过本发明的方法制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的优选肽片段组可用于排除优选肽片段组以外的肽片段组。

实施例7

本发明的另一实施方案涉及可用于合成具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法、肽片段、和肽片段组。从本文描述中还显而易见的是，所述方法、肽片段、和肽片段组可用于合成具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽，其中所述HIV融合抑制肽包含一个或多个化学基团：

B-TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL-Z

                                |

                                U

其中氨基末端或羧基末端之一或两者用化学基团(B、U、Z；其中B、U、Z可为相同的化学基团或不同的化学基团)修饰，所述化学基团可包括但不限于一种或多种以下基团：反应性官能团、化学保护基团(CPG)、和接头。涉及到制备具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽时，肽片段、肽片段组、和被保护的肽片段(具有一个或多个化学基团的肽片段)的示例性实例包括但不限于表7、8、和9中分别所列的肽片段。

表7

SEQIDNO：	氨基酸序列	在SEQ IDNO：10中的氨基酸位点
			17	TTWEAWDRAIAE	1-12
41	YAARIEALLRAAQE	13-26

SEQIDNO：	氨基酸序列	在SEQ IDNO：10中的氨基酸位点
			42	QQEKLEAALRE	27-37
43	QQEKLEAALREL	27-38
			21	TTWEAWDRAIA	1-11
44	EYAARIEALLRAAQE	12-26
			23	TTWEAWDRAI	1-10
45	AEYAARIEALLRAAQE	11-26
			25	TTWEAWDRA	1-9
46	IAEYAARIEALLRAAQE	10-26
			27	TTWEAWDR	1-8
47	AIAEYAARIEALLRAAQE	9-26
			29	TTWEAWDRAIAEYAARIEAL	1-20
48	LRAAQEQQEKLEAALRE	21-37
			49	LRAAQEQQEKLEAALREL	21-38
32	TTWEAWDRAIAEYAARIE	1-18
			50	ALLRAAQEQQEKLEAALRE	19-37
51	ALLRAAQEQQEKLEAALREL	19-38
			52	YAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL	13-38
53	EYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL	12-38
			54	AEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL	11-38
55	IAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL	10-38
			56	AIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL	9-38

SEQIDNO：	氨基酸序列	在SEQ IDNO：10中的氨基酸位点
			78	WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF
79	YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNIT
			80	YQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL

本发明进一步提供了特定的肽片段组，该肽片段组在合成具有SEQ IDNO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中作为中间体。本发明提供的肽片段组包括表8所示的组1-14(组的编号只为描述方便)。某些肽片段组可用于排除其它肽片段组。

表8

表9

SEQ ID NO：	氨基酸序列	在SEQ ID NO：10中的氨基酸位点
			17	Ac-TTWEAWDRAIAE	1-12
41	CPG-YAARIEALLRAAQE	13-26
			42	CPG-QQEKLEAALRE	27-37

SEQ ID NO：	氨基酸序列	在SEQ ID NO：10中的氨基酸位点
			42	CPG-QQEKLEAALRE|IvDde	27-37
43	QQEKLEAALREL-NH2	27-38
			29	Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIEAL	1-20
48	CPG-LRAAQEQQEKLEAALRE	21-37
			49	LRAAQEQQEKLEAALREL-NH2	21-38
21	Ac-TTWEAWDRAIA	1-11
			44	CPG-EYAARIEALLRAAQE	12-26
23	Ac-TTWEAWDRAI	1-10
			45	CPG-AEYAARIEALLRAAQE	11-26
25	Ac-TTWEAWDRA	1-9
			46	CPG-IAEYAARIEALLRAAQE	10-26
27	Ac-TTWEAWDR	1-8
			47	CPG-AIAEYAARIEALLRAAQE	9-26
32	Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIE	1-18
			50	CPG-ALLRAAQEQQEKLEAALRE	19-37
51	ALLRAAQEQQEKLEAALREL-NH2	19-38

参考表8(组3和组4)，显示了使用2个特定肽片段(例如SEQ ID NO：29和48+Leu；或SEQ ID NO：29和49)并使用片段装配法合成具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，该片段装配法包括通过化学结合(“装配”)组合2个肽片段以制备具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽。为了在液相过程中使用具有SEQ ID NO：48的肽片段(“Fmoc-AA(21-37)-OH”)与亮氨酸(“H-Leu-NH₂”)组合制备具有SEQ ID NO：-49的肽片段(“Fmoc-AA(21-38)-NH₂”)，将肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH(30.01g，7.98mmol，1.0当量)、H-Leu-NH₂*HCl(1.48g，8.78mmol，1.1当量)和HOAT(1.63g，11.97mmol，1.5当量)溶于DMF(450ml，15体积)中，用DIEA(7.0ml，39.91mmol，5当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约30分钟)。将所述溶液冷却至0±5℃，并加入TBTU(3.09g，9.58mmol，1.2当量)，在0±5℃搅拌5分钟，然后在25±5℃反应2小时或直至HPLC显示所述反应完成。

在分离片段H-AA(21-38)-NH₂之前去除肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH₂的Fmoc化学保护基团。加入哌啶(8.0ml，79.8mmol，10当量)，并将所述溶液在25±5℃搅拌1.5小时或直至HPLC分析显示基本所有Fmoc都被从所述肽片段去除。将反应器冷却，加入水(1000ml，30体积)，在10℃以下搅拌自由流动的悬浮液30分钟，然后通过过滤分离。收集的固体用1∶3乙醇/水洗涤，并在真空炉中于35±5℃干燥。然后将肽片段在1∶3乙醇/水(400mL，13体积)中重新制浆3小时。收集并干燥固体，然后将所述肽片段在3∶1正己烷∶MTBE(400mL，13体积)中制浆过夜，通过过滤分离并重新干燥。如需要，所述MTBE重新制浆可重复以去除多余的哌啶。所得产物是分离的肽片段H-AA(21-38)-NH₂制备物(参见表9，SEQ ID NO：49)。

然后进行液相反应，其中肽片段H-AA(21-38)-NH₂(SEQ ID NO：49)与肽片段Ac-AA(1-20)-OH(SEQ ID NO：29，表9)结合，以生成具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如Ac-(1-38)-NH₂)。将肽片段H-AA(21-38)-NH₂(3.14g，0.86mmol，1当量)、肽片段Ac-AA(1-20)-OH(3.00g，0.86mmol，1.0当量)以及HOAT(0.18g，1.3mmol，1.5当量)和DIEA(0.599ml，3.44mmol，4当量)溶解于DMAc(100ml，33体积)，冷却至0±5℃。向反应中加入TBTU(0.331g，1.03mmol，1.2当量)。将所述反应在0±5℃搅拌5分钟，并在25±5℃搅拌3小时或直至HPLC显示所述反应完成。冷却反应器，缓慢加入水(250ml，83体积)。浆体形成并在10℃以下搅拌至少30分钟。固体通过过滤分离并用额外的水洗涤。收集的固体在真空炉中于35±5℃干燥。所得产物是完全保护的、分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH₂(SEQ IDNO：10)制备物，纯度用HPLC分析确定。然后使用本发明实施例4所述的方法或本领域技术人员熟知的其它去保护和脱羧基方法对所述HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH₂去保护(通过去除侧链化学保护基团)并脱羧基(在色氨酸残基)。纯化后，所得产物是分离的具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽(N末端被乙酰化，C末端被酰胺化)制备物(去保护且脱羟基的)，这通过HPLC确定。

使用相似的技术和条件，使用其它涉及2片段装配或3片段装配的片段装配法制备具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如表8和9)。从本文描述应理解，用于通过本发明提供的方法制备具有SEQ IDNO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的肽片段可用于排除其它肽片段。同样地，用于通过本发明提供的方法制备具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的肽片段组可用于排除其它肽片段组。

实施例8

已开发了采用Ac-AA(1-26)-OH和Fmoc-AA(27-38)-OH合成SEQ ID NO：9肽的两片段方法。SEQ ID NO：9的片段Ac-AA(1-26)-OH和Fmoc-AA(27-37)-OH首先通过标准固相合成技术合成。

为了合成Fmoc-AA(27-37)-OH，将树脂(2-CTC，2kg，3.1mol活性Cl)在DCM(10体积，20L)中25±5℃下溶胀15-30分钟，然后排干，同时制备Fmoc-Glu(Otbu)-OH*H₂O(0.45当量，619g，1.40mol)和DIEA(相对于Glu为3当量，4.19mmol，729mL)的DCM(5体积，10L)溶液。将树脂在DCM(5体积，10L)中重新浆化，向树脂中添加氨基酸溶液，并将浆液在25±5℃下搅拌2小时。排干容器，将树脂在NMP(4体积，8L)中浆化。添加封端溶液9∶1(v/v)MeOH/DIEA(6体积，12L)，并将浆液在25±5℃下搅拌40-50分钟。排干容器，并用DCM(2×6体积，各900mL)洗涤树脂。然后用NMP(4体积，600mL)洗涤树脂，并在10℃下贮存。

将树脂在25±5℃下在NMP(10体积，20L)中溶胀30-60分钟，然后排干。在30±5℃下用NMP中的2×20-40min×5体积10％PIP脱保护进行所述片段的装配。然后用NMP洗涤树脂，直至得到阴性四氯苯醌测试。0-5℃下在DMF(6体积)中用1.5当量受保护的氨基酸、1.5当量6-Cl HOBt、1.7当量DIEA和1.5当量TBTU预活化15分钟后启动结合。添加结合溶液后，进行DMF(2体积)洗涤，然后使反应在30±5℃下进行长达4小时，直至用Kaiser测试显示反应完全。如果在3小时后未完全，则进行重结合。一旦结合完全，在用NMP(3×6体积，12L)分别洗涤树脂5分钟。

将所述完成树脂结合的片段用8体积NMP(16L)洗涤两次，并用8体积DCM(16L)洗涤4次。将树脂在2体积(4L)DCM中浆化，并添加预冷至＜5℃的含于DCM(5体积，10L)的1％TFA。将浆液搅拌5分钟，然后过滤至含吡啶的大玻璃瓶中(相对于TFA为1.26体积，126mL)。添加另一份预冷至＜5℃的含于DCM(5体积，10L)的1％TFA，搅拌，如前排干(不发生2体积预溶胀)。进行额外的3次TFA/DCM处理(总计5次)。将树脂在DCM(5体积，10L)中浆化5分钟，排干，并通过HPLC检测滤出液中的产物。继续DCM洗涤，直至洗液中的产物量最小。通过蒸馏从预冷的DCM滤出液中去除DCM，直至剩余的溶液少于4体积水平(8L)。加入异丙醇(8体积，16L)，继续蒸馏，直至IPA浆液中的残余DCM含量＜1％。将浓缩物冷却至＜10℃，添加预冷的水(8体积，16L)并快速搅拌以沉淀产物，搅拌的速率使温度保持在10℃以下。将浆液温热至10-15℃，并熟化。过滤分离产物并用水(2×4体积)洗涤。将固体空气干燥，然后在20％IPA/水(10体积)中重新浆化。过滤分离产物，用水(2体积)洗涤，并在真空炉中30-40℃干燥至恒重。回收到2618g(72.6％)白色粉末。

为了合成片段Ac-AA(1-26)-OH，如上所述使树脂(2-CTC，1.5kg，2.3mol活性Cl)负载片段Fmoc-AA(27-37)-OH。如上所述装配片段Ac-AA(1-26)-树脂，并以类似的方式裂解。回收到2841g(61.6％)白色粉末。

通过溶液相合成生成片段H-AA(27-38)-NH₂，其中在溶液相中将肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH化学结合至H-Leu-NH₂(氨基酸38)，以得到Fmoc-AA(27-38)-NH₂，然后去除N末端Fmoc保护基团，从而得到H-AA(27-38)-NH₂。可使用替代性的碱(K₂CO₃、DBU、N-甲基哌啶和DEA(二乙胺))。

为了生成肽片段Fmoc-AA(27-38)-NH₂，将肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH(2618g，940mmol，1.0当量)、H-Leu-NH₂(153g，1.18mol，1.25当量)(H-Leu-NH₂HCl盐也曾被使用)和6-Cl-HOBT(183g，1.08mol，1.15当量)溶解于DMF(18.3L，7体积)，用DIEA(287ml，1.65mol，1.75当量)处理并搅拌至溶解，同时冷却至＜2.5℃。将TBTU(347g，1.08mol，1.15当量)在DMF(1体积，2.6L)中浆化后添加，将溶液在0±5℃下搅拌15分钟，然后在35±5℃下反应至HPLC显示反应完全。

在分离片段H-AA(27-38)-NH₂前去除肽片段Fmoc-AA(27-38)-NH₂的Fmoc化学保护基团。添加哌啶(372mL，3.76mol，4当量)，并将溶液在35±5℃下搅拌至HPLC分析显示基本所有的Fmoc均从所述肽片段中去除。将溶液冷却至＜10℃，并缓慢添加预冷却的水(20.8L，8体积)以沉淀产物。将该自由流动的浆液在10-15℃下熟化，然后通过过滤分离。用25％EtOH/水洗涤收集的固体并空气干燥。将肽片段在25％EtOH//水(20.8L，8体积)中重新浆化＞2小时。收集固体，洗涤并空气干燥。然后将该湿润的固体在MTBE/庚烷(1∶1，8体积，20.8L)中重新浆化，过滤收集，用MTBE/庚烷(2×4体积，各自10.4L)洗涤，并空气干燥。再进行一次MTBE/庚烷重新浆化，然后将固体在真空炉中35±5℃干燥。得到2475g(98.4％)分离肽片段H-AA(27-38)-NH₂的制备物。

为了制备Ac-AA(1-38)-NH₂片段，进行溶液相反应，其中肽片段H-AA(27-38)-NH₂与肽片段Ac-AA(1-26)-OH组合以生成Ac-(1-38)-NH₂。将肽片段Ac-AA(1-26)-OH(1.18kg，0.25mol，1.0当量)、肽片段H-AA(27-38)-NH₂(836g，0.31mol，1.25当量)、6-Cl-HOBT(57g，338mmol，1.35当量)和DIEA(78mL，0.45mol，1.8当量)溶解于DMF(8.9L，7.5体积)，并冷却至＜2.5℃。向反应中添加在DMF(0.5体积，0.6L)中浆化的TBTU(108g，338mmol，1.35当量)。将反应物在0±5℃下搅拌5分钟，并在30±5℃下搅拌至HPLC显示反应完全。冷却反应器，在迅速搅拌下添加预冷却的水(9.4L，8体积)。过滤分离所得的固体并用额外的水洗涤。将该固体在20％乙醇/水(7.1L，6体积)中重新浆化，通过过滤重新收集并用水洗涤。收集的固体在真空炉中35±5℃下干燥。所得的是2005g(108％)全保护的、分离的HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1-38)-NH₂的制备物。

作为粗制SEQ ID NO：9肽的合成方法的一方面，HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1-38)-NH₂的侧链化学保护基团可通过酸解或本领域技术人员已知的用于通过去除侧链化学保护基团而使肽脱保护的任意其它方法去除。例如，用TFA(三氟乙酸)∶DTT(二硫苏糖醇)∶水(90∶15∶5；10体积)处理HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1-38)-NH₂(678g，92mmol)，并在20+/-2℃下搅拌5小时。在优选的实施方案中，使用10-15当量而非5当量的DTT来优化结果。将溶液冷却至10℃以下，优选5℃以下，缓慢添加预冷却的MTBE(25体积，17L，＜0℃，优选＜-15℃)，添加的速率使得温度保持在10℃以下，优选在7至8℃。使浆液在10-15℃下熟化，过滤收集所得的固体，用MTBE洗涤，并空气干燥。然后在乙腈(CAN；10体积，6.8L)中浆化所得的粉末，并用DIEA和乙酸将pH调节至4-5之间，优选接近5，并在25±5℃下搅拌该浆液以使该肽脱羧。一旦HPLC显示反应完全，过滤收集固体，用ACN洗涤，并干燥得到脱保护和脱羧肽的制备物(414g，100％)。

在一个实施方案中，纯化所述1144肽SEQ ID NO：9，浓缩并直接从浓缩柱沉淀。在水性/乙腈缓冲液中通过RP-HPLC三次注射纯化SEQ ID NO：9(270g)。汇集可接受的组分，用水稀释，直至缓冲液中乙腈的总含量约为28％。将溶液重新加载至HPLC柱，用1∶1NaOAc水溶液/乙腈缓冲液洗脱肽。将汇集组分的pH调节至5-6，然后通过向溶液添加乙腈将乙腈的总含量调节至85％以上。通过真空过滤收集沉淀的固体，用90％乙腈/水洗涤，真空炉干燥得到78g纯SEQ ID NO：9肽。

实施例9

在使用2片段Rink-负载CTC策略的方法中，通过标准固相合成H-AA(27-38)-Rink-OH(表1，序列27)，其N末端是H且在C末端用Rink接头-OH(p-[(R，S)-α-氨基-2，4-二甲氧基苄基]-苯氧基乙酸)作为化学保护基团。

然后进行溶液相反应，其中将肽片段H-AA(27-38)-Rink-OH(SEQ ID NO：18)与肽片段Ac-AA(1-26)-OH(SEQ ID NO：10)组合得到具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HIV融合抑制剂肽。将肽片段Ac-AA(1-26)-OH(1.0g，0.21mmol，1.0当量)、6-Cl-HOBT(39mg，0.23mmol，1.1当量)和DIEA(55μl，0.32mmol，1.5当量)溶解于DMF(10ml，10体积)，并冷却至0-5℃。将TBTU(71mg，0.22mmol，1.05当量)添加至反应。将反应在0-5℃下搅拌15分钟，加入单独溶解在DMF(2mL)中的肽片段H-AA(27-38)-Rink-OH(628mg，0.21mmol，1.0当量)和DIEA(37μl，0.21mmol，1.0当量)，冷却至0-5℃。将反应物在0-5℃下搅拌15分钟，在25±5℃下搅拌3小时或直至HPLC显示反应完全。冷却反应器，在迅速搅拌下添加水(10体积)。过滤分离所得的固体并用额外的水洗涤。将固体在水/异丙醇中重新浆化，通过过滤重新收集，用水洗涤。收集的固体在真空炉中35±5℃下干燥。所得的是1.55g(95.7％)全保护的、分离的HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1-38)-Rink-OH的制备物。然后采用上述方法或通过本领域技术人员已知的用于脱保护和脱羧的任意其它方法对该HIV融合抑制剂肽脱保护(去除侧链化学保护基团和C末端Rink基团)和脱羧(在色氨酸残基处)；然后纯化(例如，通过HPLC)。所得的是具有SEQ ID NO：9序列的(脱保护、脱羧并纯化的)HIV融合抑制剂肽的制备物(在该图示中，N末端被乙酰化，且C末端被酰胺化)。

实施例10

在进一步的实施方案中，使用酸超敏树脂通过2片段方法生成SEQ IDNO：9肽，通过Sieber酰胺树脂以标准固相合成法合成包含SEQ ID NO：9的氨基酸27-38的肽片段(″H-AA(27-38)-NH₂″)，其N末端为H，C末端为-NH₂。

然后进行溶液相反应，其中将肽片段H-AA(27-38)-NH₂与肽片段Ac-AA(1-26)-OH(SEQ ID NO：40)组合得到具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HIV融合抑制剂肽。将肽片段Ac-AA(1-26)-OH(1g，0.21mmol，1.0当量)、肽片段H-AA(27-8)-NH₂(677mg，0.25mmol，1.2当量)、6-Cl-HOBT(39mg，0.23mmol，1.1当量)和DIEA(92μl，0.053mmol，2.5当量)溶解于DMF(10ml，10体积)中，并冷却至0-5℃。将TBTU(75mg，0.23mmol，1.1当量)添加至反应。将反应物在0-5℃下搅拌15分钟，然后在25±5℃下搅拌3小时或直至HPLC显示反应完全。冷却反应器，在迅速搅拌下添加水(10体积)。过滤分离所得的固体并用额外的水洗涤。将固体在水/异丙醇中重新浆化，通过过滤重新收集，用水洗涤。收集的固体在真空炉中35±5℃下干燥。所得的是1.58g(101％)全保护的、分离的HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1-38)-NH₂的制备物。然后采用上述方法或通过本领域技术人员已知的用于脱保护和脱羧的任意其它方法对该HIV融合抑制剂肽脱保护(去除侧链化学保护基团和C末端Rink基团)和脱羧(在色氨酸残基处)；然后纯化(例如，通过HPLC)。所得的是具有SEQID NO：9序列的(脱保护、脱羧并纯化的)HIV融合抑制剂肽的制备物(在该图示中，N末端被乙酰化，且C末端被酰胺化)。

实施例11

在进一步优选的用于合成SEQ ID NO：9的2片段方法中，从N末端为H、C末端为-NH₂且具有与CTC树脂结合的侧链Glu₃₇的H-Glu-(CTC树脂)-Leu-NH₂(其合成见下文)起始，通过标准固相合成法合成包含SEQ ID NO：9的氨基酸27-38(″AA(27-38)-NH₂″)的片段(参见表7，也称为“H-AA(27-38)-NH₂游离Glu₃₇”)。

然后进行溶液相反应，其中将肽片段H-AA(27-38)-NH₂游离Glu₃₇侧链(SEQ ID NO：9)与肽片段Ac-AA(1-26)-OH(SEQ ID NO：40)组合得到具有291144的氨基酸序列的HIV融合抑制剂肽。将肽片段Ac-AA(1-26)-OH(1.0g，0.21mmol，1.0当量)、6-Cl-HOBT(39mg，0.23mmol，1.1当量)和DIEA(55μL，0.32mmol，1.5当量)溶解于DMF(10ml，10体积)，并冷却至0±5℃。将TBTU(71mg，0.22mmol，1.05当量)添加至反应。将反应在0±5℃下搅拌15分钟，加入单独溶解在DMF(2mL)中的肽片段H-AA(27-38)-NH₂，游离Glu₃₇(556mg，0.21mmol，1当量)和DIEA(37μl，0.21mmol，1.0当量)，并冷却至0-5℃。将反应物在0±5℃下搅拌15分钟，并在25±5℃下搅拌3小时或直至HPLC显示反应完全。冷却反应器，在迅速搅拌下添加水(10体积)。过滤分离所得的固体并用额外的水洗涤。将收集的固体在水/异丙醇中重新浆化，通过过滤重新分离，用水洗涤，并在真空炉中35±5℃干燥。得到1.43g(92％)全保护的、分离的HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1-38)-NH₂游离Glu₃₇(SEQ ID NO：9)的制备物，纯度通过HPLC分析测定。然后采用实施例8中所述的方法或通过本领域技术人员已知的用于脱保护和脱羧的任意其它方法对该HIV融合抑制剂肽脱保护(去除侧链化学保护基团和C末端Rink基团)和脱羧(在色氨酸残基处)；然后纯化(例如，通过HPLC)。所得的是具有SEQ ID NO：9序列的(脱保护、脱羧并纯化的)HIV融合抑制剂肽的制备物(在该图示中，N末端被乙酰化，且C末端被酰胺化)。

实施例12

在此说明了采用线性固相合成步骤来合成具有1144氨基酸序列(SEQ IDNO：9)的HIV融合抑制剂肽的方法。具有SEQ ID NO：9的HIV融合抑制剂肽可在固相支持物上以线性方式高产率和高纯度地合成，其仅需要一种负载树脂作为起始原料，且不涉及片段的溶液缩合和相应片段在溶液相中的脱保护，从而简化了合成方法。

SEQ ID NO：9肽可通过标准固相合成法合成得到(采用酰胺树脂，例如Sieber树脂或Rink树脂(也可用其它树脂，例如Ramage)；或者修饰的树脂，例如rink-接头-负载的CTC树脂，或者γ-谷氨酰基(Leu-酰胺)-负载的CTC树脂)，其在N末端被乙酰化(“Ac”，作为化学基团)，同时在C末端具有酰胺基团(-NH₂)。该肽从用于其固相合成的树脂裂解，且HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1-38)-NH₂的侧链化学保护基团可通过酸解或本领域技术人员已知的通过去除侧链化学保护基团为肽脱保护的任意其它方法去除。然后通过HPLC或其它合适的层析技术纯化该脱保护和脱羧的肽，以得到分离HIV融合抑制剂SEQ ID NO：9肽的制备物。

rink-接头-负载的CTC树脂可通过以本领域技术人员已知的方法将Fmoc-rink接头加载至CTC树脂获得。在该实施例中，显示了Fmoc-γ-谷氨酰基(Leu-酰胺)及其向CTC树脂的加载。将Fmoc-Glu(OtBu)-OH(22.175g，50mmol)、6-Cl-HOBt(10.176g，60mmol)、DIEA(21.78ml，125mmol)和H-Leu-NH₂(9.764g，75mmol)溶解于DMF(220L，10体积)，并冷却至5℃以下，然后将添加TBTU(19.266g，60mol)至该反应烧瓶中。将反应混合物在5℃以下搅拌30分钟，并在室温下搅拌1小时或直至HPLC显示反应完全。用水沉淀Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-NH₂，用0.2％N HCl洗涤，并在20％IPA和4％NaHCO₃中重新浆化。通过用95％TFA/水处理去除t-Bu保护基团后，通过本领域已知的方法将Fmoc-Glu-Leu-NH₂加载至CTC树脂以提供γ-谷氨酰基(Leu-酰胺)-负载的CTC树脂。

Fmoc-Rink-CTC树脂        Fmoc-γ-谷氨酰基(Leu-NH2)-CTC树脂

(rink-负载的CTC树脂)     (γ-谷氨酰基(Leu-酰胺)-负载的CTC树脂)

实施例13

在分离和纯化SEQ ID NO：9肽的方法中，将纯冻干的Ac-AA(1-38)-NH₂(908mg)在8∶2乙腈∶水(18ml，20体积)(10-30体积可接受)中20±5℃下浆化3小时(1-5小时可接受)。通过过滤重新分离该产物，用8∶2乙腈∶水洗涤，并在35±5℃下真空干燥得到854mg(94％)纯的、脱盐Ac-AA(1-38)-NH₂。

还可通过将纯SEQ ID NO：9加载至Sephadex柱并以9∶1水/ACN洗脱，或者通过重新加载回RP-HPLC柱并用5mM NH₄OAc/ACN 1∶1洗脱，来明显减少SEQ ID NO：9的盐含量(使得其适于制剂)。在这两种情况下，该肽可通过冻干重新分离。

冻干的SEQ ID NO：9肽的沉淀1.将1144(SEQ ID NO：9)固体(186.2g，已通过冻干分离)溶解于9312mL含于水中的20％ACN，用TFA(46mL)将pH降低至～1.6。然后用1N NaOH(583mL)将pH提高至最终pH 4.76。将烧瓶在冰浴中冷却2小时，然后过滤固体，并在真空炉中35±5℃干燥，得到179.5g(96％)纯的脱盐的Ac-AA(1-38)-NH₂。

冻干的SEQ ID NO：9肽的沉淀2.将1144(SEQ ID NO：9)固体(已通过冻干分离)以50mg/ml的浓度溶解于50％乙腈-水中，并将pH调节至8-9。然后在添加更多的乙腈以将乙腈总浓度上升至85％以上之前，将溶液的pH调回5-6。通过真空过滤收集沉淀的固体，用90％乙腈/水洗涤，并在真空炉中干燥。

在另一实施方案中，将1144(SEQ ID NO：9)固体(已通过冻干分离)以70mg/ml的浓度溶解于50％乙腈-水(14体积)中，并用NH₄OH将pH调节至6-9。精过滤后，将溶液添加至乙腈(48体积)中，再用2体积50％乙腈/水洗涤该溶解罐和管道。在真空过滤前将所得的浆液搅拌10分钟。使用10体积90％乙腈/水和直接的乙腈(各10体积)洗涤该固体。在真空炉中将收集的肽干燥至恒重。

在另一实施方案中，将含于50％ACN、50％10mM NaOAC的纯1144(SEQIDNO：9)溶液酸化至pH 5-6，并用乙腈稀释以沉淀该产物。通过分离所得的固体，并用90％乙腈/水洗涤，然后用直接的乙腈洗涤(各10体积)。在真空炉中将收集的肽干燥至恒重。

实施例14

本发明进一步提供了在HIV感染和/或AIDS的治疗、疗法或作为治疗方案的一部分中施用抗病毒肽(例如，HIV融合抑制剂肽，其自身或作为本发明所提供的组合物的活性药物成分)的方法。HIV融合抑制剂肽的抗病毒活性可被用于抑制HIV向靶细胞传递的方法中，该方法包括将病毒和/或细胞与一定量的能有效抑制HIV感染细胞(更优选地，抑制病毒和靶细胞之间发生HIV-介导的融合)的HIV融合抑制剂肽接触。该方法可用于治疗HIV感染患者(治疗性)或治疗新近暴露于HIV或具有暴露于HIV的高风险(例如，通过使用毒品或高风险性行为)的患者(预防性)。因此，例如，对于HIV-1感染的患者，HIV融合抑制剂肽的有效量应该是(其自身和/或与给药方案结合)足以降低被治疗患者的HIV病毒载量的剂量。如本领域技术人员已知，存在多种测量HIV病毒载量的标准方法，其包括但不限于通过外周血单核细胞的定量培养和通过血浆HIV RNA测量。该HIV融合抑制剂肽可以以单次施用、间歇性、周期性或连续性的方式施用，这可由医疗人员通过例如病毒载量的监测进行确定。取决于本发明所提供的含HIV融合抑制剂肽的具体组合物，以及本发明所提供的该具体组合物是否进一步包含药学可接受的载体和/或大分子载体等因素，该HIV融合抑制剂肽可在数天至数周或可能更长的范围内周期性施用。此外，HIV融合抑制剂肽可用于抗病毒疗法，以与其它用于治疗HIV的抗病毒药物或预防剂联用或用于使用其它用于治疗HIV的抗病毒药物或预防剂的治疗方案(例如，同时使用，或在循环开始时与一种药物而在循环结束时与另一种药物一起使用)。

一种常用的涉及抗病毒剂组合的治疗称为HAART(高效抗逆转录病毒疗法)。HAART通常将三种或更多种具有HIV抗病毒活性的药物组合，并通常包括一个类别以上的药物(“类别”指作用机制或者该药物靶向的病毒蛋白或过程)。因此，本发明所提供的包含HIV融合抑制剂肽的组合物可单独施用(例如，作为单一疗法)，或可在治疗方案中施用，或与用于治疗HIV感染和/或AIDS的额外治疗剂组合以共施用，这在本发明有更具体的描述。

例如，在一个实施方案中，一种或多种治疗剂在治疗中可与本发明所提供的组合物中的HIV融合抑制剂肽组合。该组合除了该HIV融合抑制剂肽之外还包含至少一种抗病毒剂。该种组合可例如由有效量的已被批准或将被批准的抗病毒剂(用于治疗HIV感染)制备得到，该抗病毒剂包括但不限于选自如下的一种或多种额外的治疗剂：抗病毒剂，如细胞因子，例如rIFNα、rIFNβ、rIFNγ；逆转录酶抑制剂，包括但不限于阿巴卡韦、AZT(齐多夫定)、ddC(扎西他滨)、奈韦拉平、ddl(地达诺新)、FTC(恩曲他滨)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS 840、GW-1592、GW-8248、GW-5634、HBY097、地拉韦定、依法韦仑、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韦、替诺福韦以及阿洛夫定；蛋白酶抑制剂，包括但不限于安泼那韦、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、印地那韦、那非那韦、PNU-140690、利托那韦、沙奎那韦、替利那韦、替拉那韦、阿扎那韦、洛匹那韦、ABT378、ABT538和MK639；病毒mRNA加帽抑制剂，例如三氮唑核苷；作为具有抗-HIV活性的脂质结合分子的两性霉素B；作为糖蛋白加工抑制剂的澳粟精胺；病毒进入抑制剂，如融合抑制剂(恩夫韦肽、T1249、其它融合抑制剂肽以及小分子)、SCH-D、UK-427857(Pfizer)、TNX-355(Tanox Inc.)、AMD-070(AnorMED)、Pro 140、Pro 542(Progenies)、FP-21399(EMD Lexigen)、BMS806、BMS-488043(Bristol-Myers Squibb)、maraviroc(UK-427857)、ONO-4128、GW-873140、AMD-887、CMPD-167以及GSK-873,140(GlaxoSmithKline)；CXCR4拮抗剂，例如AMD-070)；脂质和/或胆固醇相互作用调节剂，例如盐酸普鲁卡因(SP-01和SP-01A)；整合酶抑制剂，包括但不限于L-870和810；RNAseH抑制剂；rev或REV的抑制剂；vif的抑制剂(例如，vif-衍生的脯氨酸富集肽、HIV-1蛋白酶N-末端衍生肽)；病毒加工抑制剂，包括但不限于白桦苷和二氢白桦苷衍生物(例如PA-457)；以及免疫调节剂，包括但不限于AS-101、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸以及胸腺喷丁。如HIV感染和/或AIDS治疗领域技术人员所能理解，组合药物治疗可包括两种或多种具有相同作用机制的治疗剂，或者可包括两种或多种具有不同作用机制的治疗剂。

这些可与HIV融合抑制剂肽组合的示范性的额外治疗剂和/或本发明所提供的组合物的有效剂量为本领域所公知。此外，待施用的本发明所提供的HIV融合抑制剂肽或药物组合物的有效剂量可通过本领域技术人员公知的步骤确定，例如通过测定效力、生物半衰期、生物利用度和毒性进行确定。在一个实施方案中，有效量的HIV融合抑制剂肽及其剂量范围可由本领域技术人员采用通过本领域技术人员公知的常规体外和体内研究所得的数据确定。例如，如本发明所述的抗病毒活性体外传染性测定使得本领域技术人员能够确定所述化合物作为唯一活性成分或与其他活性成分组合时抑制预定的病毒传染性范围(例如，50％抑制IC₅₀；或90％抑制，IC₉₀)或病毒复制所需的平均抑制浓度(IC)。然后，本领域技术人员可采用由一个或多个标准模型得到的药代动力学数据选择合适的剂量，从而使得到的该活性成分的最小血浆浓度(C[min])等于或大于抑制病毒感染或病毒复制的预定值。尽管剂量范围通常取决于所选的施用途径和给用的剂型(施用途径包括但不限于皮下、肠胃外、皮内或口服施用)，但作为活性成分的化合物的示范性剂量范围可以是约1mg/kg体重至约100mg/kg体重；更优选地不少于1mg/kg体重至不超过10mg/kg体重。在一个实施方案中，可通过注射施用(例如，皮下注射)，在一个实施方案中，HIV融合抑制剂肽。

因此，提供了一种抑制HIV向细胞传递的方法，其包括给予抑制所述细胞被HIV感染有效量的包含HIV融合抑制剂肽的本发明所述的组合物。该方法可进一步包括通过向所述个体给予(同时或先后，或作为治疗方案的一部分)包含有效量的本发明所提供的HIV融合抑制剂肽或药物组合物的治疗剂的组合，以向患者给予本发明所述的组合物与用于治疗HIV感染和/或AIDS的其它治疗剂的组合。还提供了抑制HIV进入的方法，其包括向有此需要的患者给予抑制病毒进入靶细胞有效量的包含HIV融合抑制剂肽的本发明所述的组合物。该方法可进一步包括给予本发明所提供的组合物与有效量的一种或多种可用于治疗HIV感染的额外抑制剂(例如，病毒进入抑制剂)的组合。

实施例15

下文阐述了制备本发明所提供的组合物的方法。此外还描述了示范性的组合物。

材料：蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB)由Eastman Chemicals获得。聚丙交酯(PLA)和聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)由Lakeshore Biomateials.获得。PLA和PLGA的丙交酯∶乙交酯比例、分子量及其末端基团不同。本研究中所用的所有PLGA为50∶50丙交酯∶乙交酯。分子量以名称中的数字分级。分子量约为该数值的10000倍。末端基团为羧酸(A)、甲酯(M)或月桂酯基(L)。N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)由Spectrum获得。苯甲酸苄酯和三乙酰甘油酯由Sigma获得。盐酸胍由Amresco获得。Tris-HCl由Sigma获得。4-(2-吡啶偶氮)雷琐酚由Sigma获得。甲醇由VWR获得。七水合硫酸锌由Sigma获得。氯化锌由Sigma获得。

T1144肽物质的制备：T1144肽物质可参照如下方案制备。

喷雾干燥：将T1144肽在小于4或大于6的pH下溶解，通常溶于水。采用1N NaOH或1N HCl调节pH。通过雾化喷嘴将肽溶液喷入加热室中。人工收集干燥的肽颗粒。

可进一步通过上述喷雾干燥法制备肽，但向该喷雾干燥溶液添加赋形剂，从而将该赋形剂和该肽混合。

盐或pH沉淀：将肽在小于4或大于6的pH下溶解，通常溶于水中。采用1N NaOH或1N HCl调节pH。添加盐溶液或强酸/碱以引起沉淀。过滤收集沉淀物，冻干并过200μm筛网以控制颗粒大小。

溶媒沉淀：参照如下方案制备溶媒。

SAIB溶媒沉淀：将能得到所需最终浓度的适当量的SAIB加热并添加至NMP，混合至均匀。

SAIB/PLA溶媒制备：将能得到所需最终浓度的适当量的PLA溶解于NMP、苯甲酸苄酯或三乙酰甘油酯。将能得到所需最终浓度的适当量的SAIB加热并添加至该PLA溶液，混合至均匀。

PLA、PLG和PLGA溶媒制备：将能得到所需最终PLA、PLG和PLGA浓度的适当量的PLA、PLG和PLGA溶解于NMP。

组合物可通过本领域技术人员已知的任意方法制备。在本实施例中，肽物质(沉淀或喷雾干燥形式的)被添加至管瓶中。将溶媒添加至该管瓶，将内含物混合至均匀。在某些情况下，需要温热至～40℃以确保适当混合。配方以肽重量/配方重量为mg/g进行定量。

以类似于Edelhoch法的方式基于色氨酸和酪氨酸吸收测定肽含量。简言之，将～1mg肽物质溶解于1mL 8M盐酸胍。在276、280和288nm下测定该溶液的UV吸收。使用测得的吸收值，以及已知的样本重量、样本体积、肽中色氨酸和酪氨酸残基数量以及肽分子量，测得固体中的肽含量(％w/w)。

金属阳离子含量通过采用4-(2-吡啶偶氮)雷琐酚(PAR)(已知与M²⁺形成2∶1络合物的金属显色指示剂)的UV/vis吸收测定进行检测。简言之，将～1mg固体溶解于含6M盐酸胍的1mL Tris-HCl缓冲液中(pH 8)。(使用相同的缓冲液)稀释该溶液，使得最终的金属阳离子浓度为1-10μM。将50μL 0.1M PAR添加至950μL稀释的溶液。平衡后，在500nm下检测该测试溶液的UV/vis吸收。金属阳离子浓度基于同日获得的标准曲线的最小二乘分析计算得到，从而确定该样本的金属阳离子含量(wt％)。

通过LC-MS测定血浆中的肽浓度。用3体积含0.5％(v/v)甲酸的乙腈稀释该血浆样本，离心，直接测定上清液。采用梯度洗脱(10mM醋酸铵，pH 6.8∶乙腈，0.6mL/min)进行层析，总运行时间为6分钟。在采用4×2mm PhenomenexSecurityGuard C8保护柱保护的Phenomenex Luna C8(2)50×2mm柱上进行分离。在Sciex API4000或API4000 Qtrap仪器上运行质谱(ESI+)，该质谱通常为single-quad模式，检测[M+3H]³⁺或[M+4H]⁴⁺离子。由30ng/mL至30ng/mL构建T1144校正曲线。结果表示为随时间的血浆肽浓度。采用了如下缩写：C_max＝最大血浆肽浓度；t_max＝C_max的时间；t_0.1＝血浆肽浓度降至低于0.1μg/ml的时间；以及t_0.01＝归一化血浆浓度降至0.01μg/mL以下的时间。在一些情况下，血浆浓度归一化至3mg/公斤动物体重，以便于比较。

动物按如下方式给药。将过量的含T1144组合物通过16G针头抽入1cc注射器。将针头换为18G或21G针头，将注射器排空至正确剂量。在肩胛骨的皮下空间向动物给药。向大鼠(400g)给用400μL，每剂量组三只动物。向短尾猴(2.5kg)给用400μL或1000μL，每组三只动物

采用大鼠或猴采集所有的药代动力学数据。在一些情况下，血浆浓度归一化至3mg/公斤动物，以便于比较。

制备如下含肽组合物。

T1144/锌沉淀物A.将T1144溶解于水中，pH调节至～6.2，并添加水至浓度为25mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。将2mL 0.1M ZnSO₄添加至80mL T1144溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物B.将T1144溶解于水中，pH调节至～6.2，并添加水至浓度为25mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。将60mL 0.1M ZnSO₄添加至120mL T1144溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物C.将T1144溶解于水中，pH调节至～5.7，并添加水至浓度为40mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。将＜100mg ZnCl₂添加至20mLT1144溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并用1mL水洗涤沉淀物。该沉淀物被冷冻、冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物D.用5mL水洗涤沉淀物B，离心并倾析上清液。将该步骤重复两次。将所得沉淀物冷冻、冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物E.将445mg ZnSO₄*7H₂O溶解于2mL水中。将1.0g沉淀物D在该锌溶液中浆化。该浆液被冷冻、冻干并通过200μm筛。

T1144/沉淀物F.将T1144溶解于水中，pH调节至～6.2，并添加水至浓度为25mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。添加5mL 1N醋酸，将pH降至～5。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物G.将230mg ZnSO₄*7H₂O溶解于2mL水中。将500mg沉淀物F在该锌溶液中浆化。该浆液被冷冻、冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物H.将T1144溶解于水中，pH调节至～8.4，并添加水至浓度为50mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。添加甲醇至浓度为25mg/mL(50∶50甲醇∶水)。将～1ml 0.1M ZnSO₄添加至该20mL TRI-1144溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200μm筛。

T1144/沉淀物I.将T1144溶解于水中，pH调节至～8.4，并添加水至浓度为50mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。添加甲醇至浓度为25mg/mL(50∶50甲醇∶水)，将pH调节为～5。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物J.将T1144溶解于水中，pH调节至～6.2，并添加水至浓度为25mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。将60mL 0.1M ZnSO₄添加至120mL T1144溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过150μm筛。

T1144/锌沉淀物K.将T1144溶解于水中，pH调节至～6.2，并添加水至浓度为25mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。将1mL 0.1M ZnSO₄添加至40mL T1144溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过150μm筛。

T1144/锌沉淀物L.用30mL水洗涤1.0g沉淀物J，离心并倾析上清液。重复该步骤。将所得沉淀物冷冻、冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物M.将T1144溶解于水中，pH调节至～-6.3，并添加水至浓度为25mg/ml。将溶液通过0.22μm过滤器。通过雾化喷嘴(以类似于喷雾干燥的方式)将25mL T1144溶液喷入50mL剧烈搅拌的0.3M ZnSO₄溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200μm筛。

T1144/锌沉淀物N.将T1144溶解于水中，pH调节至～6.3，并添加水至浓度为50mg/ml。添加甲醇至最终T1144溶液浓度为25mg/mL。将溶液通过0.22μm过滤器。通过雾化喷嘴(以类似于喷雾干燥的方式)将25mL T1144溶液喷入50mL剧烈搅拌的0.1M ZnSO₄溶液。将所得的悬浮液离心并倾析。用10mL水洗涤沉淀物三次。离心该悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200μm筛。

表10：肽物质组合物

肽物质	肽含量(％)	锌含量(％)
			PRECIPITATED A	90.6	1.6
PRECIPITATED B	72.5	7.8
			PRECIPITATED C	87.7	1.5
PRECIPITATED D	89.3，87.9	2.9，2.4
			PRECIPITATED E	70.1	10.0
PRECIPITATED F	88.3	N/A
			PRECIPITATED G	71.7	7.7
PRECIPITATED H	90.6，89.7	1.7，1.9
			PRECIPITATED I	87.7	N/A
PRECIPITATED J	60.2	11.5
			PRECIPITATED K	88.2	1.7
PRECIPITATED L	93.7	1.9
			PRECIPITATED M	60.9	12.4
PRECIPITATED N	92.5	2.1

按照如下所述将上述组合物施用至大鼠或猴。预期在大鼠和猴中所得的结果与人类的结果合理关联。

沉淀物D以100mg/g在74∶11∶15SAIB∶PLA3L∶NMP中配制，并以1000μL施用至短尾猴。如图9所示(--◆--)，血浆浓度超过目标值1μg/mL达12天，超过了目标时间7天。沉淀物J以50mg/g在40∶60PLA3L∶NMP中配制，并以400μL施用至短尾猴。如图9所示(--■--)，血浆浓度超过目标值1μg/mL达7天；更大的剂量，例如1000μL的100mg/g的沉淀物J，可潜在地得到目标血浆浓度达10-12天。这表明了T1144可在SAIB/PLA或PLA溶媒中被皮下传递，并提供超过目标值(即，1μg/mL)的血浆浓度达一周以上。

沉淀物D以100mg/g在74∶11∶15SAIB∶PLA3L∶NMP中配制，并以400μL施用至大鼠。如图10所示(--◆--)，血浆浓度超过目标值1μg/mL达6天，接近达到目标时间7天。沉淀物J以50mg/g在40∶60PLA3L∶NMP中配制，并以400μL施用至大鼠。如图10所示(--■--)，血浆浓度超过目标值1μg/mL达7天。这表明了该配方在啮齿动物和灵长动物模型中提供了类似的T1144持续传递。

SAIB：PLA比例对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A以50mg/g在SAIB∶PLA3M∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图11所示，SAIB∶PLA比例的下降(即更多的PLA)降低了C_max，升高了t_max并升高了t_0.01。沉淀物B同样以50mg/g在SAIB∶PLA3M∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图12和13所示，结果从性质上类似于沉淀物A的结果。然而，SAIB∶PLA比例对沉淀物B的传递的影响程度小于其对沉淀物A的传递的影响。这表明了降低SAIB∶PLA比例促进了TRI-1144的持续传递，且沉淀物特性(特别是锌在沉淀物中的量)可影响传递速率。

基质：溶剂比例对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B以50mg/g在SAIB∶PLA3M∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图14所示，约10％的PLA水平可相对于更低的PLA水平减缓肽传递。

溶剂类型对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B以50mg/g在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶溶剂(即三乙酰甘油酯、苯甲酸苄酯或NMP)中配制，并以400μL施用至大鼠。如图15所示，随着溶剂类型变化，C_max下降，t_max上升，且t_0.01上升。NMP比三乙酰甘油酯提供了更理想的药代动力学特性，而后者的表现优于苯甲酸苄酯。这表明溶剂类型影响肽传递。

肽浓度对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。结果显示于图16，其表明，在该溶媒中，可增加肽浓度而不对肽传递产生不利影响。

注射体积对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B以100mg/g在74∶11∶15SAIB∶PLA3M∶NMP溶媒中配制，并以施用至大鼠。如图17所示，给药体积对持续传递参数没有明显影响；然而，400μL给药在一定程度上优于200μL给药(均被归一化)。沉淀物C在77∶15∶8SAIB∶NMP∶乙醇溶媒中配制，并向大鼠给药。如图17所示，在控制肽剂量时的前三天内给药体积对持续传递参数没有明显影响；然而，三天后400μL给药在一定程度上优于200μL给药。这表明了增加注射体积可以促进持续传递。

SAIB溶媒中的PLA类型对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A以50mg/g在75∶5∶20SAIB∶PLA∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图18所示，将PLA类型由3L变为3M可降低C_max，增加t_max，并增加t_0.01。这表明PLA类型影响持续传递。

肽沉淀物形式对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A、B、E和G分别以50mg/g在75∶5∶20SAIB∶PLA3M∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图19所示，在初始沉淀过程中锌含量的增加可降低C_max，提高t_max，并提高t_0.01(A和B)。向低锌沉淀物添加硫酸锌作为冻干盐可降低C_max，提高t_max，并提高t_0.01(A和E)。当最终的沉淀物含硫酸锌作为冻干盐时，用锌取代pH沉淀不影响持续传递参数(E和G)。即使总锌浓度相近，沉淀物E和G在该溶媒中的表现均不如沉淀物B。这表明了锌结合进入沉淀物的方式(例如，如何沉淀或喷雾)明显影响肽的持续传递。

聚合物类型和给药体积对猴的药代动力学特性的影响。沉淀物D在SAIB∶PLA∶NMP溶媒中配制并施用至短尾猴。如图20所示，将溶媒由75∶5∶20变为74∶11∶15(400μL剂量)不明显影响持续传递参数；然而，两者的表现均优于水性溶液。在74∶11∶15中将给药体积增加至1000μL将降低C_max，降低t_max，并提高t_0.01。这表明改变给药体积将影响持续传递。

PLA和PLGA凝胶系统

基质：溶剂比例对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A和D分别以50mg/g在PLGA1A∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图21所示，提高基质：溶剂比例(更多的PLGA)将降低C_max，提高t_max，并提高t_0.01。这表明溶媒中聚合物的量影响持续传递。

聚合物类型对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A和D分别以50mg/g在聚合物：NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图21所示，增加聚合物MW和L∶G比例可同时降低C_max，提高t_max，并提高t_0.01。沉淀物B以50mg/g在聚合物：NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图22所示，提高L∶G比例可降低C_max，提高t_max，并提高t_0.01。提高聚合物MW可降低C_max，提高t_max，并提高t_0.01。这表明溶媒中的聚合物类型影响持续传递。

溶剂类型对大鼠中药代动力学特征的影响。沉淀物B以50mg/g在PLGA1A：溶剂溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图22所示，将溶剂由NMP改变为三乙酰甘油酯，仅提高t_0.01。这表明溶媒中的溶剂类型影响持续传递。

肽浓度对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B在50∶50PLGA1A∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图23所示，提高剂量将降低C_max，提高t_max，并降低t_0.01(均被归一化)。沉淀物H在40∶60PLA3L∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图23所示，提高剂量将降低C_max，提高t_max，并降低t_0.01(均被归一化)。这表明PLA和PLGA溶媒可提供高剂量肽的持续传递。

肽形式(无锌)对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物I和喷雾干燥物质以50mg/g在40∶60PLA3L∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图24所示，改变为不含锌肽形式不改变持续传递参数。这表明不含锌的肽的物理形式不明显影响持续传递。

肽形式对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物H、J、K和L以50mg/g在40∶60PLA3L∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图25所示，洗涤该沉淀物以降低锌含量不改变持续传递参数(J和L)。洗涤后的沉淀物的表现明显不同于未洗涤的低锌沉淀物(K和L)。从50∶50甲醇∶水溶液沉淀可降低C_max并提高t_max。这表明在该溶媒中，与肽沉淀的锌的量并不影响持续传递；然而，沉淀肽的溶液不明显影响传递。

阳离子类型对大鼠中药代动力学特性的影响。数种钙和铁沉淀物在40∶60PLA3L∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图26所示，所有的制剂均显示了一定的持续传递，铁制剂的表现优于钙制剂。这表明除了锌以外的其它阳离子沉淀物可提供肽的持续传递。

聚合物类型和肽形式对猴的药代动力学特性的影响。沉淀物在聚合物：NMP溶媒中配制，并施用至短尾猴。如图27所示，同时将40∶60PLGA1A∶NMP溶媒和沉淀A改为40∶60PLA3L∶NMP溶媒和沉淀物J可降低C_max，降低t_max，并提高t_0.01。这表明聚合物特性(例如，类型和分子量)以及制备肽的方式对于持续传递非常重要。

沉淀方法对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物H、J、M和N分别在40∶60PLA3L∶NMP溶媒中配制，并以400μL施用至大鼠。如图28所示，标准沉淀物J和H分别类似于(即具有类似的肽和锌含量)喷雾沉淀物M和N。在每种情况下，该喷雾的沉淀物显示了提高的C_max和t_max。喷雾沉淀物在该周末尾的血浆浓度大于或等于标准沉淀物。这表明喷雾沉淀物可相对标准沉淀物提供更高的持续传递潜力。

原位形成凝胶

以下实施例阐述了包含本发明的肽的原位形成凝胶制剂的制备。在以下的实施例中，该原位形成凝胶制剂基于来自Atrix制药的Atrigel技术和来自DURECT制药的SABER^TM技术。

在一个实施例中，将所述药物物质悬浮于热塑性系统中，其中固体、线性链、可生物降解的聚合物或共聚物(例如，聚-丙交酯-共-乙交酯酸(PLGA))被溶解于溶剂(N-甲基吡咯烷酮(NMP))中以形成液体溶液。一旦该聚合物溶液被置于具有充足的水的体内，该溶剂从该聚合物中扩散，使得聚合物固化为固体结构。随着PLGA降解，该药物物质缓慢释放。商用产品的范例为

或悬浮于

的醋酸亮丙瑞林。

在另一实施例中，采用SABER技术，将所述药物物质悬浮于蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB)中，其与乙醇混合以降低该溶液的粘度。SAIB是非聚合的、非水溶性的高粘度液体材料，其不在环境或生理条件下结晶。一旦该肽-SAIB溶液被置于具有充足的水的体内，该溶剂从该SAIB中扩散，使得SAIB固化为固体结构。随着SAIB降解，该药物物质缓慢释放进入血流。可用的商用产品的范例为Posidur^TM或悬浮于SAIB中的丁哌卡因。

实施例16

在此说明了包含本发明的肽的原位凝胶制剂的制备的其它实施例。初始时将TRI-1144喷雾干燥或通过添加冰醋酸沉淀。然后从硫酸锌水溶液沉淀TRI-1144，以形成Zn:TRI-1144络合物。在分析锌和肽含量时，该Zn∶TR-1144比例为1.1∶1。在其它实施例中，TR-1144被溶解于50∶50水∶甲醇溶液中，然后添加硫酸锌沉淀。

SAIB购自Mallinckrodt。将TRI-1144沉淀物悬浮于不同的SAIB∶PLGA∶乙醇(表11)溶液中，然后施用至大鼠/猴。将PLGA溶解于乙醇中，然后添加至SAIB以实现所需的％wt/wt。基于动物PK研究的结果，优化沉淀物类型和溶剂。

表11.SAIB∶PLGA∶乙醇溶剂系统研究(％Wt/Wt)

SAIB	PLGA	乙醇
			74	11	15
65	15	20
			70	15	15

SAIB	PLGA	乙醇
			75	5	20

所有的PLA/PLGA聚合物来自Lakeshore Biomaterials，Mobile，Alabama。将锌沉淀物悬浮于不同的PLA∶NMP和PLGA∶NMP溶液中(表12)，然后施用至大鼠/猴。总体而言，可通过将PLA/PLGA溶解于NMP中制备该溶剂，然后根据需要添加其它的亲水溶剂。基于动物PK研究的结果，优化沉淀物类型和溶剂。

表12.PLA∶NMP和PLGA∶NMP溶剂系统研究

PLA/PLGA类型(％Wt-Wt)	NMP(％Wt-Wt)	其它亲水溶剂(％Wt-Wt)
			PLA3L     40	60	-
PLGA2A    40	60	-
			PLGA2M    40	60	-
PLGA3A    40	60	-
			PLGA3E    40	60	-
PLGA-PEG 1500   40	60	-
			PLA-PEG 1500    40	60	-
PLGA3A          40	-	苄醇              60
			PLGA3A          40	-	乙氧基化四氢糠醇  60
PLGA3A          40	12	乳酸乙酯          48
			PLGA3A          40	-	碳酸丙酯          60
PLGA3A          40	12	苯甲酸乙酯        48
			PLGA3A          40	30	PEG400            30
PLGA3A          40	42	丙二醇            18

PLA/PLGA类型(％Wt-Wt)	NMP(％Wt-Wt)	其它亲水溶剂(％Wt-Wt)
			PLGA3A          40	48	乙醇              12
PLGA3A          40	54	水                6
			PLGA3L          40	-	苄醇              60
PLGA3L          30	-	苯甲酸苄酯        70
			PLGA3L          30	-	三乙酰甘油酯      70
PLGA3L          30	-	乙氧基化四氢糠醇  70
			PLGA3L          40	-	乳酸乙酯          60
PLGA3L          40	-	碳酸丙酯          60
			PLGA3L          40	36	乙醇              24
PLGA3L          30	35	PEG400            35
			PLGA3L          40	42	丙二醇            18
PLGA3L          40	51	Miglyol           9
			PLGA-PEG 1500   30	70	-
PLGA-PEG 1500   20	80	-
			PLA-PEG 1500    20	80	-
PLGA2.5A        40	30	PEG400            30
			PLGA2A          40	30	PEG400            30
PLGA1A          40	30	PEG400            30
			PLGA-PEG 1500   20	40	PEG400            40

PLA/PLGA类型(％Wt-Wt)	NMP(％Wt-Wt)	其它亲水溶剂(％Wt-Wt)
			PLGA-PEG 1500   10	45	PEG400            45

表13.动物药代动力学研究索引

动物PK研究#	动物	目的
			385	猴	TRI-1144PLGA微球体
386	猴	TRI-1144不溶性盐-油悬浮液
			392	大鼠	TRI-1144不溶性盐-油悬浮液
393	猴	TRI-1144不溶性盐-油悬浮液
			400	大鼠	TRI-1144不溶性盐-油悬浮液
401	大鼠	TRI-1144不溶性盐-油悬浮液TRI-1144微球体
			409	大鼠	TRI-1144微球体喷出评估
427	大鼠	具有相转移阳离子的TRI-1144
			433	猴	TRI-1144不溶性盐-油悬浮液
446	大鼠	TRI-1144不溶性盐-油悬浮液
			462	大鼠	TRI-1144不溶性盐-油悬浮液
464	大鼠	具有相转移阳离子的TRI-1144
			482	大鼠	具有相转移阳离子的TRI-1144
490	大鼠	具有SAIB的原位形成凝胶
			494	大鼠	具有相转移阳离子的TRI-1144

动物PK研究#	动物	目的
			507	大鼠	具有SAIB的原位形成凝胶具有PLGA:NMP的原位形成凝胶
520	大鼠	具有SAIB的原位形成凝胶具有PLGA:NMP的原位形成凝胶
			525	大鼠	具有优化SAIB溶剂的原位形成凝胶
526	大鼠	具有PLA:NMP的原位形成凝胶，最初1周由Zn:TRI-1144沉淀物释放，“高Zn”
			527	猴	具有PLA:NMP的原位形成凝胶，最初1周由Zn:TRI-1144沉淀物释放，“高Zn”
530	大鼠	具有PLA:NMP的原位形成凝胶，1周由Zn:TRI-1144沉淀物释放，“低Zn”
			531	大鼠	具有PLA:NMP的原位形成凝胶，最初1周由从甲醇∶水中沉淀的Zn:TRI-1144沉淀物释放，“低Zn”
540	大鼠	具有PLA:NMP的原位形成凝胶Zn:TRI-1144沉淀物水性悬浮液，“低Zn”
			552	大鼠	具有优化PLGA溶剂的原位形成凝胶
553	大鼠	具有PLA-PEG 1500和PLGA-PEG共聚物:NMP的原位形成凝胶
			560	大鼠	原位形成凝胶亲水溶剂优化
561	大鼠	原位形成凝胶亲水溶剂优化
			585	大鼠	原位形成凝胶亲水溶剂/PLGA优化

结果/讨论

用SAIB形成的TRI-1144的原位形成凝胶显示了第一周的持续释放。图29显示了TRI-1144 SAIB凝胶在大鼠中的TRI-1144释放。随着SIAB浓度升高，TRI-1144释放时间更长。然而，在与PLA/PLGA∶NMP中的TRI-1144原位形成凝胶比较时，TRI-1144的释放时间没有那么长。图30显示了Atrigel系统和SABER形成的原位形成凝胶的比较。SABER凝胶具有相对较高的喷出(burst)，且在100小时内基本上释放了所有的TRI-1144。然而，用Atrigel系统形成的TRI-1144凝胶在一周后仍释放TRI-1144。此外，采用Atrigel技术的TRI-1144制剂的粘度小于采用SABER技术的制剂。这可在如图31所示的猴PK研究#527的结果中得到证明。这两种制剂中TRI-1144释放的持续时间相同。然而，由于具有相对更低的粘度，悬浮于PLGA的TRI-1144给药更为容易。

Zn-TRM 144沉淀物优化

TRI-1144的持续释放可通过用硫酸锌沉淀TRI-1144来进一步提高。分析锌含量时，锌与TRI-1144以1.1∶1比例络合。初始制剂包含最大100倍的可及锌。在图31中所示的猴PK研究#结果以及由图8中大鼠PK研究#530的制剂782-102的结果表明Zn-TRI-1144络合物增强了持续释放。然而，该结果类似于图32中大鼠PK研究#531的制剂782-099的结果所示的最小量的锌与TRI-1144络合的情况。Zn-TRI-1144沉淀物可通过在用硫酸锌沉淀前将TRI-1144溶解于50∶50水∶甲醇溶液中被进一步优化。TRI-1144溶解于水的沉淀的沉淀物是精细的白色、流动性粉末，而TRI-1144溶解于有机溶液时形成的Zn-TRI-1144沉淀物是团块固体，其需要在悬浮于给药溶剂之前进行研磨。在通过x射线粉末衍射分析时，来自水溶液的Zn-TRI-1144沉淀物是无定形的，而来自有机溶液的沉淀物具有约10％的结晶。

PLA/PLGA优化

聚合物链长和类型也被优化。总体而言，PLA比PLGA具有更长时间的持续释放，而具有更长的链长度的聚合物具有更长时间的持续释放。这与聚合物降解和所述给药溶液的溶液粘度成正比。在图33中，与采用PLGA2.5A和PLGA3A的制剂相比，PLGA2A溶解于NMP时的制剂具有更高的喷出，以及更少的持续释放时间。

采用PLA-PEG 1500和PLGA-PEG 1500的原位形成凝胶

还采用具有PEG 1500的PLA共聚物和具有PEG 1500的PLGA共聚物制备Zn-TRI-1144的原位形成凝胶制剂。该理论为PEG 1500将使得聚合物变得更为亲水。这将允许NMP的更快耗散，从而辅助凝胶的凝结(setting)。图34中所示的大鼠PK研究#的结果显示了由采用PLA-PEG和PLGA-PEG 1500共聚物的原位形成凝胶一周内TRI-1144的零级释放。这些制剂首次证明了TRI-1144的一次/周给药制剂的可行性。

亲水性溶剂优化

尽管NMP是可被接受的皮下注射溶剂，目前在制剂研究中的NMP量高于一次/天给药和潜在的一次/周给药的药学可接受的限度。因此，基于使用PLA-PEG 1500和PLGA-PEG 1500共聚物形成该原位形成凝胶的大鼠PK研究#553的结果，已设计了一系列研究来优化其它具有能溶解PLA/PLGA聚合物的MP的亲水溶剂。大鼠PK研究#560和#561的结果分别显示于图35和36，其显示了向PLA/PLGA稀释剂添加亲水溶剂可使该原位形成凝胶更快凝结，从而维持TRI-1144的释放。对于所研究的溶剂，PEG400显示为所研究的最佳溶剂(图36，803-073-3和803-073-4)。

PLGA优化

PLA 3L和PLGA 3A最初在研究中被用于优化所述溶剂系统，因为PLA3L和PLGA 3A具有更好的持续释放。任何由于不同溶剂系统造成的TRI-1144的释放的差异将更易于分辨。然而，PLA 3L在6个月内降解，而PLGA 3A在一个月内降解，两者均不适于TRI-1144的一次/周给药。在大鼠PK研究#560和#561中优化的溶剂系统为包含以40∶60％wt/wt的比例溶解于NMP∶PEG400(50∶50)的PLA 3L/PLGA 3A的系统。能更快降解的聚合物是必要的。图37显示了大鼠PK研究#585的结果。在该研究中，所述制剂含有溶解于NMP∶PEG 1500的PLGA 1A、PLGA 2A和PLGA 2.5A。用PLGA 1A和PLGA 2A的原位形成凝胶具有类似的结果，不适于TRI-1144的一次/周给药。用PLGA2.5A的原位形成凝胶在一周内具有假一级释放，其适于TRI-1144的一次/周给药。

用单和双乳液的TRI-1144的持续释放制剂需要进行研究，以进一步确定其是否适于TRI-1144的一次/周给药。肽的加载妨碍了微球体的正确形成。在进行体内分析时，这些制剂导致了TRI-1144的喷出，然后是TRI-1144的缓慢释放。这些制剂的体内释放特征与TRI-1144立即释放的液体制剂相当。TRI-1144的一次/周给药的原型制剂可采用悬浮在溶解于50∶50NMP∶PEG400的50∶50PLGA 2.5A中的锌-TRI-1144沉淀物的原位形成凝胶实现。该50∶50PLGA 2.5A将在注射位点保留两周。该NMP∶PEG 400溶剂系统在NMP的药学可接受的限度内。

本发明所提供的特定实施方案为说明的目的进行了详细描述。结合该描述和说明，本领域其它技术人员可采用现有技术容易地修改和/或调整所述实施方案以用于各种应用，而不偏离所述基本概念，因此该修改和/或调整倾向于包含在附加权利要求的含义和范围内。

此处引用的各种参考文献，其公开在此全文通过引用并入本文。

序列表

<110>特里梅里斯公司

 

<120>治疗性抗-HIV肽的合成方法

 

<130>7872-139-228

 

<140>

<141>

 

<150>60/995,318

<151>2007-09-25

 

<160>80

 

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

 

<210>1

<211>64

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>1

Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn

1               5                   10                  15

Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu

            20                  25                  30

Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu

        35                  40                  45

Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe

    50                  55                  60

 

<210>2

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>2

Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln

1               5                   10                  15

Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu

            20                  25                  30

Trp Asn Trp Phe

        35

 

<210>3

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>3

Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu

1               5                   10                  15

Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu

            20                  25                  30

Gln Glu Leu Leu

        35

 

<210>4

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>4

Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His

1               5                   10                  15

Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu

            20                  25                  30

Leu Leu Glu Leu

        35

 

<210>5

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>5

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>6

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>6

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>7

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>7

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>8

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>8

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>9

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>9

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>10

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>10

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>11

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>11

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>12

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>12

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>13

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>13

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Ile Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>14

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>14

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ile Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>15

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>15

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Ile Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu

        35

 

<210>16

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>Xaa＝任意氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa＝任意氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>Xaa＝任意氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>Xaa＝任意氨基酸，优选亮氨酸或异亮氨酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)..(25)

<223>Xaa＝任意氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(28)

<223>Xaa＝任意氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(31)

<223>Xaa＝任意氨基酸，优选亮氨酸或异亮氨酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)..(35)

<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)..(38)

<223>Xaa＝亮氨酸或异亮氨酸

 

<400>16

Xaa Xaa Xaa Glu Ala Xaa Asp Arg Ala Xaa Ala Glu Xaa Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Xaa Glu Ala Xaa Xaa Arg Ala Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu Lys Xaa Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Xaa Arg Glu Xaa

        35

 

<210>17

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

 

<400>17

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu

1               5                   10

 

<210>18

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>18

Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

1               5                   10

 

<210>19

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>19

Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu

1               5                   10

 

<210>20

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>20

Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

1               5                   10

 

<210>21

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>21

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala

1               5                   10

 

<210>22

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>22

Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

1               5                   10                  15

 

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>23

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile

1               5                   10

 

<210>24

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>24

Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

1               5                   10                  15

 

<210>25

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>25

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala

1               5

 

<210>26

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>26

Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln

1               5                   10                  15

Glu

 

<210>27

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>27

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg

1               5

 

<210>28

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>28

Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Gln Glu

<210>29

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>29

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu

            20

 

<210>30

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>30

Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg

1               5                   10                  15

Glu

 

<210>31

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>31

Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg

1               5                   10                  15

Glu Leu

 

<210>32

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>32

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu

 

<210>33

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>33

Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala

1               5                   10                  15

Leu Arg Glu

 

<210>34

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>34

Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala

1               5                   10                  15

Leu Arg Glu Leu

            20

 

<210>35

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>35

Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln

1               5                   10                  15

Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25

 

<210>36

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>36

Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln

1               5                   10                  15

Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25

 

<210>37

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>37

Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

1               5                   10                  15

Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25

 

<210>38

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>38

Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln

1               5                   10                  15

Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25

<210>39

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>39

Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25                  30

 

<210>40

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>40

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1               5                   10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

            20                  25

 

<210>41

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>41

Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu

1               5                   10

 

<210>42

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

<400>42

Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu

1               5                   10

 

<210>43

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>43

Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

1               5                   10

 

<210>44

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>44

Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu

1               5                   10                  15

 

<210>45

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>45

Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu

1               5                   10                  15

 

<210>46

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

<400>46

Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln

1               5                   10                  15

Glu

 

<210>47

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>47

Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala

1               5                   10                  15

Gln Glu

 

<210>48

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>48

Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg

1               5                   10                  15

Glu

 

<210>49

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>49

Leu Arg Ala Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu

1               5                   10                  15

Arg Glu Leu

<210>50

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>50

Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala

1               5                   10                  15

Leu Arg Glu

 

<210>51

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>51

Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala

1               5                   10                  15

Leu Arg Glu Leu

            20

 

<210>52

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>52

Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln

1               5                   10                  15

Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25

 

<210>53

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

 

<400>53

Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln

1               5                   10                  15

Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25

 

<210>54

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>54

Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu

1               5                   10                  15

Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25

 

<210>55

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>55

Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln

1               5                   10                  15

Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25

 

<210>56

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>56

Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala

1               5                   10                  15

Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

            20                  25                  30

 

<210>57

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>57

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu

            20                  25                  30

Ala Ala Leu Arg Glu

        35

 

<210>58

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>58

Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu

 1               5                  10                  15

Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu

            20

 

<210>59

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>59

Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn

 1               5                  10                  15

Glu Ala Ala Leu Arg Glu

            20

<210>60

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>60

Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

 1               5                  10

 

<210>61

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>61

Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

 1               5                  10                  15

 

<210>62

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>62

Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

 1               5                  10

 

<210>63

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>63

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln

            20                  25

 

<210>64

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>64

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu

            20

 

<210>65

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>65

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg

            20

 

<210>66

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>66

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ile Glu Ala Leu Leu

            20

 

<210>67

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>67

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ile Glu Ala

 

<210>68

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>68

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ile

 

<210>69

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>69

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

 1               5                  10                  15

 

<210>70

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>70

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala

 1               5                  10                  15

<210>71

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>71

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala

 1               5                  10

 

<210>72

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>72

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr

 1               5                  10

 

<210>73

<211>2

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>73

Glu Leu

 1

 

<210>74

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>74

Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

 1               5                  10

 

<210>75

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>75

Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

 1               5                  10

 

<210>76

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>76

Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

 1               5                  10

 

<210>77

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>77

Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu

 1               5

 

<210>78

<211>39

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>78

Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln

 1               5                  10                  15

Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp

            20                  25                  30

Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe  

        35

 

<210>79

<211>39

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>79

Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln

 1               5                  10                  15

Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu

            20                  25                  30

Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr

        35

 

<210>80

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>80

Tyr Gln Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr

 1               5                  10                  15

Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu

            20                  25                  30

Leu Gln Lys Leu

        35

Claims (19)

1.合成包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的肽的方法，所述方法包括缩合肽片段，所述肽片段包含选自SEQ ID NO：58-77的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括缩合两个肽片段。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述肽片段包含氨基酸序列SEQ IDNO：72和58；SEQ ID NO：70和59；SEQ ID NO：64和60；或者SEQ ID NO：63和62。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述合成采用rink-负载CTC树脂、Sieber树脂、Ramage树脂、Glu-负载CTC树脂或Glu37侧链负载树脂实施。

5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括脱保护以在所述肽的N末端形成乙酰基基团的步骤。

6.如权利要求1所述的方法，其进一步包括脱羧基以在所述肽的C末端形成酰胺基基团的步骤。

7.如权利要求1所述的方法，其进一步包括脱保护以在所述肽的N末端形成乙酰基基团的步骤；和脱羧基以在所述肽的C末端形成酰胺基基团的步骤。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括缩合三个肽片段。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述肽片段包含氨基酸序列SEQ IDNO：72、74和20；SEQ ID NO：71、75和20；SEQ ID NO：70、76和20；或者SEQ ID NO：68、77和20。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述合成采用rink-负载CTC树脂、Sieber树脂、Ramage树脂、Glu-负载CTC树脂或Glu37侧链负载树脂实施。

11.如权利要求8所述的方法，其进一步包括脱保护以在所述肽的N末端形成乙酰基基团的步骤。

12.如权利要求8所述的方法，其进一步包括脱羧基以在所述肽的C末端形成酰胺基基团的步骤。

13.如权利要求8所述的方法，其进一步包括脱保护以在所述肽的N末端形成乙酰基基团的步骤；以及脱羧基以在所述肽的C末端形成酰胺基基团的步骤。

14.合成包含SEQ ID NO：9的肽的方法，所述方法包括缩合肽片段，其中所述肽片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：72、74和19；SEQ ID NO：71、75和19；SEQ ID NO：70、76和19；或者SEQ ID NO：68、77和19。

15.如权利要求14所述的方法，其进一步包括在所述肽片段缩合前将包含氨基酸序列SEQ ID NO：19的肽片段与亮氨酸氨基酸残基共价偶联的步骤。

16.合成包含SEQ ID NO：9的肽的方法，所述方法包括缩合两个肽片段，其中所述肽片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：20，所述合成采用rink-负载CTC树脂、Sieber树脂或Glu-负载CTC树脂实施。

17.合成包含SEQ ID NO：9的肽的方法，所述方法包括采用rink树脂、修饰酸树脂、rink-连接-负载CTC树脂或γ-谷氨酰基(Leu-酰胺基)-负载CTC树脂的线性固相合成。

18.用于合成SEQ ID NO：9的肽片段组，包括选自如下的组：

(a)Ac-AA(1-26)-OH和AA(27-37)-Rink-OH；

(b)Ac-AA(1-26)-OH和AA(27-38)-Rink-OH；

(c)Ac-AA(1-12)-OH，Fmoc-AA(13-26)-OH和AA(27-37)-Rink-OH；

(d)Ac-AA(1-12)-OH，Fmoc-AA(13-26)-OH和AA(27-38)-Rink-OH；或

(e)Ac-AA(1-26)-OH和H-AA(27-38)-NH₂游离Glu37。

19.由氨基酸序列SEQ ID NO：58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76或77组成的肽。

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