ES2843679T3 - Células hospedadoras y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Una célula hospedadora que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteasa de expresión de eliminación (Kex2p), al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una oxidorreductina del retículo endoplasmático (Ero1) y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína disulfuro isomerasa (Pdi1), en donde dicha célula hospedadora es una célula de levadura que es Saccharomyces cerevisiae BXP10.

Description

DESCRIPCIÓN

Células hospedadoras y métodos de uso

Campo de la invención

La presente invención pertenece al cambio de la ingeniería bioquímica. Más particularmente, la presente invención se refiere a células hospedadoras genéticamente modificadas y a métodos para producir polipéptidos en ellas.

Antecedentes de la invención

Los polipéptidos y proteínas terapéuticos pueden expresarse en diversas células hospedadoras, incluyendo células bacterianas, células de E. coli, células fúngicas o de levadura, células de un microorganismo, células de insecto y células de mamífero. Los hospedadores fúngicos, tales como la levadura metilotrópica Pichia pastoris tiene distintas ventajas para la expresión de proteínas terapéuticas, p. ej., no secreta grandes cantidades de proteínas endógenas, tiene un fuerte promotor inducible, puede cultivarse en medio químico definido y puede producir títulos elevados de proteínas recombinantes (Cregg et al., Mol. Biotech. 16:23-52 (2000)). Las levaduras y los hongos filamentosos se han usado con éxito para la producción de proteínas recombinantes, tanto intracelulares como secretadas (Cereghino, J. L. y J. M. Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1): 45 66; Harkki, A., et al. 1989 Bio-Technology 7(6): 596; Berka, R. M., et al. 1992 Abstr. Papers Amer. Chem. Soc.203: 121-BIOT; Svetina, M., et al. 2000 J. Biotechnol. 76(23): 245-251. S. cerevisiae es una célula hospedadora importante para la expresión de seroalbúmina humana (HSA) recombinante. Sin embargo, la expresión de otros polipéptidos terapéuticos, entre los que se incluyen polipéptidos genéticamente fusionados con HSA, encara las barreras técnicas de bajos títulos de proteínas recombinantes.

Por lo tanto, existe la necesidad de células hospedadoras, en particular, cepas de S. cerevisiae, que tienen la capacidad de producir péptidos, polipéptidos y/o proteínas heterólogos con altos títulos de una proteína recombinante.

Compendio de la invención

En un aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteasa de expresión de eliminación (Kex2p), al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una oxidorreductina del retículo endoplasmático (Ero1) y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína disulfuro isomerasa (Pdi 1), en donde dicha célula hospedadora es una célula de levadura que es Saccharomyces cerevisiae BXP10.

En esta memoria se describen y proporcionan células hospedadoras genéticamente modificadas que comprenden al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteasa de expresión de eliminación (Kex2p) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Kex2p y al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteína disulfuro isomerasa (Pdi 1) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Pdi. En esta memoria también se proporcionan células hospedadoras genéticamente modificadas que comprenden al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteasa de expresión de eliminación (Kex2p) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Kex2p, al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteína disulfuro isomerasa (Pdi1) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Pdi1 y al menos un polinucleótido aislado que codifica una oxidorreductina del retículo endoplasmático (Ero1) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Ero1.

En esta memoria se describen células hospedadoras genéticamente modificadas que expresan o sobreexpresan al menos un producto génico de al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteína o fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de dicha proteína seleccionada entre: Kex2p, Pdi1 o Ero1 cuando se cultiva en un cultivo celular dicha célula hospedadora genéticamente modificada. También se describen células hospedadoras genéticamente modificadas que sobreexpresan al menos dos proteínas o fragmentos y/o variantes de las mismas que tienen al menos una actividad funcional de dichas al menos dos proteínas seleccionadas entre: Kex2p, Pdi1 o Ero1 cuando se cultiva en un cultivo celular dicha célula hospedadora modificada, en comparación con la célula hospedadora de tipo silvestre, en donde dicha célula hospedadora de tipo silvestre es de la misma especie y se cultiva en las mismas condiciones de cultivo pero no sobreexpresa al menos dos productos génicos seleccionados entre Kex2p, Pdi1 y Ero1. Las células hospedadoras pueden se procariotas o eucariotas. Los ejemplos de células hospedadoras pueden incluir, pero sin limitación: HeLa, CHO, COS, HEK293, THPI, células de levadura y de insecto.

En esta memoria también se proporcionan métodos para producir un polipéptido recombinante que comprenden cultivar una célula hospedadora de la presente invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos recombinantes producidos mediante los métodos de la presente invención. En esta memoria también se describen composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos recombinantes producidos mediante métodos de la presente invención. En esta memoria también se describen métodos para tratar a un paciente que lo necesite, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la presente descripción.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Creación del banco celular maestro preliminar de la cepa productora de albiglutida. Las etapas desde el producto de la PCR de casete de expresión de KEX2-KanMX hasta el hospedador de producción BXP10KEX2PDIERO1 son las integraciones secuenciales de casetes de expresión para construir la cepa hospedadora del proceso IV, BXP10_KEX2_PDI_EPO1. Después de la transformación del plásmido pCID3610, se seleccionó el clon de producción final y se usó en la producción de un banco celular maestro preliminar (PCB).

Figura 2: Análisis de transferencia de Southern de PDII y KEX2 en las cepas hospedadoras. Los genes KEX2 y PDI1 están ubicados en los cromosomas XIV y III, respectivamente, como una sola copia (tipo silvestre). Se demostró que el sitio diana de integración está debajo del tipo silvestre en el cromosoma XII. Las sondas de detección para cada gen se muestran como un rectángulo sólido.

Figura 3: Análisis de transferencia de Western de Pdi1 y Kex2p de las cepas hospedadoras. Muestras en el carril, Carriles 1-5: 5 clones de la cepa BXP10-KEX2-PDI1; PDI: BXP10 que sobreexpresa Pdi1; KEX2: BXP10 que sobreexpresa Kex2p; y BXP10: cepa hospedadora como control. Se cargaron cantidades equivalentes de proteínas.

Figura 4. SDS-PAGE de 12 muestras de sobrenadante de la prueba de placa de agitación. Carriles en el gel; L: Escala de proteína preteñida con SeeBlue2 (Invitrogen); RS. Patrón de referencia de la proteína pCID3610; 1-12: 12 subclones que expresan pCID3610.

Figura 5: Análisis del título (A) y la calidad (B) de la proteína pCID3610 producida en el ciclo de fermentación DasGip. Se comparó el rendimiento del título de sobrenadante y los niveles de 6-AA (%) de la proteína pCID3610 con BXP10-KEX2-PDI1, como control, que es BXP10 que sobreexpresa Kex2p y Pdi1.

Figura 6: Curvas de crecimiento generadas a partir de células del vial de banco celular de investigación.

Figura 7: Curvas de crecimiento generadas a partir de células del banco celular de premaestro.

Descripción detallada de la invención

"Células hospedadoras", como se emplea en esta memoria, se refiere a una célula que se ha introducido (p. ej., transformado, infectado o transfectado) en la que puede introducirse (p. ej., transformación, infección o transfección) una secuencia de polinucleótido aislada. Las células hospedadoras descritas en esta memoria son células bacterianas, células fúngicas, células de levadura, una célula de un microorganismo, células de insecto y células de mamífero. Las células hospedadoras de la presente descripción procedentes de levaduras y/u hongos filamentosos incluyen, pero sin limitación, las siguientes familias, géneros y especies: Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichi salictaria, Pichia guercum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia sp., Saccharomyces castelii, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces cryophilus, Schizosaccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Candida sp., Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans, Schwanniomyces occidentalis y Neurospora crassa.

"Transformado", como es sabido en la técnica, es la modificación dirigida del genoma de un organismo o episoma mediante la introducción de ADN o ARN externo o cualquier otra introducción estable de ARN o ARN externo.

"Transfectado", como es sabido en la técnica, es la introducción de ADN o ARN externo en un microorganismo, incluyendo, pero sin limitación, ADN o ARN.

"Identidad", como es sabido en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, según sea el caso, determinada comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, determinada por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero sin limitación, los descritos en ComputationalMolecularBiology, Lesk, A M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, Von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la mejor coincidencia entre las secuencias evaluadas. Por otra parte, se han codificado en programas informáticos disponibles para el público métodos para determinar la identidad. Los métodos informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete informático GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLa St P, BLASTN y FASTA (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol.215: 403-410 (1990). El programa BlAs T X se encuentra disponible al público en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol.215: 403-410 (1990). También puede usarse el conocido algoritmo de Smith-Waterman para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptido incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de comparación:

BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

Penalización por hueco: 12

Penalización por longitud de hueco: 4

Se encuentra disponible públicamente un programa útil con estos parámetros como el programa "GAP" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para las comparaciones de péptidos (junto con la ausencia de penalización para los huecos terminales).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: coincidencias = 10, emparejamiento erróneo = 0

Penalización por hueco: 50

Penalización por longitud de hueco: 3

Disponible como: El programa "GAP" del Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de ácidos nucleicos.

En los puntos (1) y (2) a continuación se proporciona un significado de "identidad" para los polinucleótidos y polipéptidos, según sea el caso.

(1) Las realizaciones de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100 % de identidad respecto de una secuencia de referencia, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3, en donde dicha secuencia de polinucleótido puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 3 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia, en donde dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo que consiste en al menos una eliminación, sustitución, lo que incluye transición y transversión o inserción de nucleótidos y en donde dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótido de referencia o en cualquier punto entre estas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia y en donde dicho número de alteraciones se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEQ ID NO: 3 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y después restando dicho producto de dicho número total de nucleótidos en la SEQ ID NO: 3 o:

n^{n < Xn} -(^Xn • y),

en donde nⁿ es el número de alteraciones de nucleótidos, Xⁿ es el número total de nucleótidos en la SEQ ID NO:3, y es 0,95 para el 95 %, 0,97 para el 97 % o 1,00 para el 100 % y • es el símbolo para el operador de multiplicación y en donde cualquier producto no entero de Xⁿ e y se redondea hasta el entero más próximo antes de restarlo de Xⁿ. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido puede crear mutaciones sin sentido, de sentido perdido o de desplazamiento de marco en esta secuencia codificante y de este modo, alteran el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones.

(2) Las realizaciones de polipéptidos incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100 % de identidad respecto de una secuencia de polipéptido de referencia, tal como la SEQ ID NO: 1, en donde dicha secuencia de polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de referencia o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de referencia, en donde dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo que consiste en al menos una eliminación, sustitución, lo que incluye una sustitución conservativa y no conservativa o inserción de aminoácidos y en donde dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxiterminales de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier punto entre estas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia y en donde dicho número de alteraciones se determina multiplicando el número total de aminoácidos por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y después restando dicho producto de dicho número total de aminoácidos o:

n^a < X^a -(X^a • y),

en donde na es el número de alteraciones de aminoácidos, Xa es el número total de aminoácidos en la secuencia, y es 0,95 para el 95 %, 0,97 para el 97 % o 1,00 para el 100 % y • es el símbolo para el operador de multiplicación y en donde cualquier producto no entero de Xa e y se redondea hasta el entero más próximo antes de restarlo de Xa.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" respecto de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su ambiente natural o ambas cosas a la vez. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", lo que incluye, pero sin limitación, cuando dicho polinucleótido o polipéptido se vuelve a introducir en una célula.

Un ácido nucleico o polinucleótido "aislado" o "sustancialmente puro" (p. ej., un ARN, ADN o un polímero mixto) es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan de manera natural al polinucleótido nativo en su célula hospedadora natural, p. ej., ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que se asocia naturalmente. El término abarca un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha retirado de su ambiente de origen natural, (2) no está asociado con la totalidad o una parte de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza o (4) no se produce en la naturaleza. El término "aislado" o la expresión "sustancialmente puro" también puede usarse en referencia a aislados de ADN recombinantes o clonados, análogos de polinucleótido sintetizados químicamente o análogos de polinucleótido que se sintetizan biológicamente por sistemas heterólogos.

Sin embargo, "aislado" no implica necesariamente que el ácido nucleico o el polinucleótido descrito de este modo se haya retirado en sí físicamente de su ambiente natural. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico endógena en el genoma de un organismo se considera en esta memoria "aislada" en caso de que se coloque una secuencia heteróloga adyacente a la secuencia de ácido nucleico endógena, de tal forma que se altera la expresión de esta secuencia de ácido nucleico endógena, por ejemplo, se aumenta, reduce o elimina. En este contexto, una secuencia heteróloga es una secuencia que no se encuentra adyacente de manera natural a la secuencia de ácido nucleico endógena, independientemente de que la secuencia heteróloga sea o no endógena por sí misma (procedente de la misma célula hospedadora o la descendencia de la misma) o exógena (procedente de una célula hospedadora diferente o la descendencia de la misma). A modo de ejemplo, el promotor nativo de un gen en el genoma de una célula hospedadora puede sustituirse por una secuencia promotora (p. ej., mediante recombinación de homólogos), de tal forma que este gen tiene un patrón de expresión alterado. Este gen quedaría en este caso "aislado" ya que está separado de al menos algunas de las secuencias que lo flanquean de manera natural.

Un ácido nucleico también se considera "aislado" si contiene cualquier modificación que no se produce de manera natural en el ácido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endógena se considera "aislada" si contiene una inserción, eliminación o una mutación puntual introducida artificialmente, p. ej., mediante intervención humana. Un "ácido nucleico aislado" también incluye un ácido nucleico integrado en el cromosoma de una célula hospedadora en un sitio heterólogo y una construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Por otra parte, un "ácido nucleico aislado" puede estar sustancialmente libre de otro material celular o sustancialmente libre de medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.

Como se emplea en esta memoria, una "secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico funcional" se refiere a cualquier porción de una parte codificante de un gen. La secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico funcional puede ser una porción de una enzima que es capaz de efectuar al menos una actividad de la enzima entera o una enzima completa.

Como se emplea en esta memoria, el "ácido nucleico necesario para la expresión de al menos un producto génico" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquier porción de un gen y/o está unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un producto génico pero no comprende necesariamente secuencia codificante. A modo de ejemplo, una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión de al menos un producto génico incluye, pero sin limitación, potenciadores, promotores, secuencias reguladoras, codones de inicio, codones de parada, secuencias de poliadenilación y/o secuencias codificantes.

Como se emplea en esta memoria, "proteólisis" o "producto génico responsable de la proteólisis en una célula" se refiere a cualquier péptido, polipéptido, proteína y/o enzima o porción de los mismos capaz de provocar la escisión de al menos un péptido, polipéptido y/o proteína. El producto génico responsable de la proteólisis puede ser directamente responsable de la escisión (es decir, una peptidasa) o puede ser responsable indirectamente como parte de una vía de síntesis de peptidasa. Los ejemplos de productos génicos que son responsables de la proteólisis en una célula incluyen, pero sin limitación, aspartil proteasas, serina proteasas, aspartil proteasas secretadas, serina proteasas secretadas, proteasas metiltróficas de levadura, endopeptidasas similares a DPP IV, metaloendopeptidasas, serina proteasas similares a Prb1, serina proteasas Prb1 y carboxipeptidasas similares a CPY. Asimismo, en esta definición se incluyen proteasas que pueden secretarse por una célula, pero que siguen manteniendo parte o la totalidad de su actividad de proteólisis, tal como una serina proteasa secretada. Una proteasa secretada puede ser responsable de la proteólisis dentro de la célula y/o fuera de la célula.

Como se emplea en esta memoria, "glucosilación" o "producto génico responsable de la glucosilación en una célula" se refiere a cualquier péptido, polipéptido, proteína y/o enzima o una porción de la misma implicada en la adición de al menos un resto de sacárido a un polipéptido o la prolongación de al menos una cadena de sacárido en la célula. El producto génico responsable de la glucosilación en una célula puede ser responsable directamente de la adición de un sacárido a un polipéptido en una célula, por ejemplo, pero sin limitación, manosiltransferasas. Las manosiltransferasas pueden transferir un resto de Dol-P-Man a un resto de serina y/o treonina en un péptido, polipéptido y/o proteína o puede actuar transfiriendo un resto de manosa de GPD-Man a un sacárido, de este modo, alargando la cadena de sacárido. Como alternativa, el producto génico responsable de la glucosilación puede formar parte de una vía de glucosilación y puede ser responsable indirectamente de la adición de polisacárido a un polipéptido en una célula. Los ejemplos de productos génicos que son responsables de la glucosilación en una célula incluyen, Pero sin limitación, manosiltransferasas.

"Polinucleótidos" se refiere normalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que pueden ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias o regiones mono, bi y tricatenarias, ARN mono y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, regiones bicatenarias o tricatenarias o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, "polinucleótido", como se emplea en esta memoria, se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las hebras en dichas regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir la totalidad de una o más de las moléculas, pero más típicamente implican únicamente una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región triple helicoidal es normalmente un oligonucleótido. Como se emplea en esta memoria, el término "polinucleótidos" también incluye ADN o ARN, como se describen anteriormente, que comprenden una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para mejorar la estabilidad o por otros motivos son "polinucleótidos" en el sentido en que se aplica el término en esta memoria. Por otra parte, los ADN o ARN que comprenden bases infrecuentes, tales como inosina o bases modificadas, tales como bases tritiadas, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos en el sentido en que se usa este término en esta memoria. Se apreciará que se han efectuado una gran variedad de modificaciones en el ADN o ARN que tienen varios fines útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término "polinucleótido", en el sentido en que se emplea en esta memoria, abarca dichas formas modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente de los polinucleótidos, así como las formas químicas del ADN y el ARN características de los virus y células, entre los que se incluyen, por ejemplo, células sencillas y complejas. Los "polinucleótidos" también abarcan polinucleótidos cortos normalmente denominados oligonucleótidos.

Los "polipéptidos" se refieren a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. "Polipéptidos" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos y oligómeros y a cadenas más largas generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden comprender aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los "polipéptidos" incluyen los modificados o bien mediante procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, pero también mediante técnicas de modificación química. Dichas modificaciones se han descrito extensamente en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación y se conocen bien por los expertos en la técnica. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o diferente en varios sitios en un polipéptido determinado. Asimismo, un polipéptido determinado puede comprender diversos tipos de modificaciones. Las modificaciones pueden producirse en cualquier parte en un polipéptido, incluyendo la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, acoplamiento covalente de flavina, acoplamiento covalente de un resto hemo, acoplamiento covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, acoplamiento covalente de un lípido o derivado de lípido, acoplamiento covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, glucosilación, acoplamiento de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tales como arginilación y ubiquitinación. Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2.a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993) y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, págs. 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Los polipéptidos pueden ser ramificados o cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y circulares ramificados pueden ser el resultado de procesos postraduccionales naturales y también pueden producirse completamente mediante métodos sintéticos.

"Variante", en el sentido que se usa el término en esta memoria, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente, pero conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia nucleotídica de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se explica a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en su secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de tal forma que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son en general estrechamente similares y, en muchas regiones, idénticas. Un polipéptido variante y de referencia puede diferir en cuanto a su secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede ser o no uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural, tal como una variante alélica o puede ser una variante que no se sabe que se produzca en la naturaleza. La presente invención también incluye variantes de cada uno de los polipéptidos de la invención, es decir, polipéptidos que varían respecto de la secuencia de referencia por sustituciones de aminoácidos conservativas, mediante las que se sustituye un resto por otro con características similares. Las sustituciones típicas son entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los restos básicos Lys y Arg; o los restos aromáticos Phe y Tyr. En particular, hay variantes en las que se sustituyen, eliminan o añaden 5-10, 1 -5, 1-3, 1-2 o 1 aminoácidos en cualquier combinación. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos de origen no natural pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa. Las variantes también pueden incluir, pero sin limitación, polipéptidos o fragmentos de los mismos que tienen una modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácido. Una modificación química incluye, pero sin limitación, añadir restos químicos, crear nuevos enlaces y retirar restos químicos. Las modificaciones en los grupos laterales de aminoácidos incluyen, sin limitación, acilación de los grupos lisina-£-amino, N-alquilación de arginina, histidina o lisina, alquilación de grupos ácido carboxílico glutámico o aspártico y desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones de los grupos amino terminales incluyen, sin limitación, las modificaciones des-amino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo. Las modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de amida, amida de alquilo inferior, dialquil amida y éster de alquilo inferior. Además, se pueden proteger uno o más grupos laterales o grupos terminales mediante grupos protectores conocidos por el bioquímico normalmente versado en la materia.

Como se emplea en esta memoria, "fragmento", cuando se usa en referencia a un polipéptido, es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es igual a una parte pero no a la totalidad de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de origen natural completo. Como se emplea en esta memoria, "fragmento", cuando se usa en referencia a una secuencia de polinucleótido o ácido nucleico es un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que es igual que una parte pero no la totalidad de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de origen natural completo. Los fragmentos pueden ser "libres" o estar comprendidos en un polipéptido de mayor tamaño del que forman una parte o región, tal como una región continua individual en un polipéptido individual de mayor tamaño. A modo de ejemplo, un fragmento de GLP-1 de origen natural incluirá los aminoácidos 7 a 36 de los aminoácidos de origen natural 1 a 36. Además, los fragmentos de un polipéptido también pueden ser variantes de la secuencia parcial de origen natural. Por ejemplo, un fragmento de GLP-1 que comprende los aminoácidos 7-36 de GLP-1 de origen natural también puede ser una variante que tiene sustituciones de aminoácidos en su secuencia parcial. Como otro ejemplo, "fragmento" puede referirse a cualquier polipéptido heterólogo o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido descrito en esta memoria, lo que incluye, pero sin limitación, Kex2P, Pdi1 y Ero1, en donde dicho fragmento conserva al menos una actividad funcional de dicho polipéptido o enzima de tipo silvestre.

Como se emplea en esta memoria, "conjugado" se refiere a dos moléculas que están unidas entre sí. Por ejemplo, un primer polipéptido puede estar unido de manera covalente o no covalente a un segundo polipéptido. El primer polipéptido puede estar unido covalentemente por medio de un enlazador químico o puede estar fusionado genéticamente al segundo polipéptido, en donde los polipéptidos primero y segundo comparten una cadena principal de polipéptido común. Los polipéptidos recombinantes expresados en las células hospedadoras de la presente invención pueden comprender al menos un polipéptido terapéutico conjugado a seroalbúmina humana. Otros conjugados también incluyen, pero sin limitación, al menos un polipéptido terapéutico conjugado a transferrina, un dominio variable monocatenario y/o al menos una región Fc de un anticuerpo. Los conjugados pueden comprender o no un enlazador.

Como se emplea en esta memoria, "orientado en tándem" se refiere a dos o más polipéptidos que se encuentran adyacentes entre sí como parte de la misma molécula. Pueden unirse de manera covalente o no covalente. Dos o más polipéptidos orientados en tándem pueden formar parte de la misma cadena principal de polipéptido. Los polipéptidos orientados en tándem pueden tener una orientación directa o invertida y/o pueden estar separados mediante otras secuencias de aminoácidos.

Como se emplea en esta memoria, "albiglutida" se refiere a una proteína de fusión recombinante que consta de 2 copias de una secuencia de 30 aminoácidos de péptido 1 similar a glucagón humano modificado (GLP-1, fragmento 7-36(A8G)) fusionado genéticamente en serie a seroalbúmina humana recombinante. La secuencia de aminoácidos de la albiglutida se muestra a continuación como la SEQ ID NO: 1.

HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR 60

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLWEVTEFAKTCVADESAE 120

NCDKSLHTL FGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPE 180

VDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLL 240

PKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLT 300

KVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMP 360

ADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEK 420

CCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVS 480

TPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTE 540

SLWRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKA 600

TKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL 674

(SEQID NO:l)

"Sistemas de expresión recombinante" se refiere a sistemas de expresión o a porciones de los mismos o a polinucleótidos de la invención introducidos, transfectados o transformados en una célula hospedadora o un lisado de células hospedadoras para la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención.

Como se emplea en esta memoria, una "proteína de fusión a albúmina" comprende al menos un fragmento o variante de un polipéptido terapéutico y al menos un fragmento o variante de seroalbúmina humana, que se asocian entre sí, preferiblemente mediante fusión genética.

Los polipéptidos que tienen actividad GLP-1 pueden comprender al menos un fragmento y/o variante de GLP-1 humano. Los dos fragmentos de origen natural de GLP-1 humano se representan en la SEQ ID NO: 2.

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-

29 30 31 32 33 34 35 36 37

Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa (SEQ ID N O: 2 )

en donde: Xaa en la posición 37 es Gly (en lo sucesivo denominado "GLP-l(7-37)") o -NH2 (en lo sucesivo denominado "GLP-1 (7-36)"). Los fragmentos de GLP-1 pueden incluir, pero sin limitación, moléculas de GLP-1 que comprenden o que como alternativa consisten en, los aminoácidos 7 a 36 de GLP-1 humano (GLP-1 (7-36)). Las variantes de GLP-1 o los fragmentos del mismo pueden incluir, pero sin limitación, una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos en GLP-1 de tipo silvestre o en los fragmentos de origen natural de GLP-1 mostrados en la SEQ ID NO: 2. Las variantes de GLP-1 o los fragmentos de GLP-1 pueden incluir, pero sin limitación, sustituciones de un resto de alanina análogas a la alanina 8 de GLP-1 de tipo silvestre, estando dicha alanina mutada a glicina (en lo sucesivo denominado "A8G") (véanse, por ejemplo, los mutantes descritos en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.545.618).

Como se emplea en esta memoria, "KEX2' se refiere a un gen que codifica la proteína denominada "proteasa de expresión de eliminación" o "Kex2p", también denominada en el esta memoria "kexp". Kex2p es una serina proteasa dependiente de calcio implicada en el procesamiento de proproteínas. Esta proteasa escinde los polipéptidos en el extremo carboxilo de las secuencias de reconocimiento: Arg-Arg/X y Lys-Arg/X. Otras actividades de Kex2p incluyen, pero sin limitación, actividad hidrolasa, actividad de unión a iones metálicos, actividad endopeptidasa de tipo serina, actividad peptidasa y actividad peptidasa de tipo serina. Los seudónimos para KEX incluyen: Pcsk2, Pcsk4, kpc-1. El gen de endopeptidasa (KEX2) de Saccharomyces cerevisiaetiene la ID de GenBank n.° 855483 y codifica la secuencia de proteína del NCBI Ref Seq NP:014161.1. El gen KEX2está conservado en la mosca de la fruta, S. cerevisiae, K. lactis, E. gossypii, S. pombe, M. oryzae y N. crassa. Una variante de KEX2 puede ser un polinucleótido que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia respecto del gen (KEX2) de Saccharomyces cerevisiae o codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia respecto de Kex2p de Saccharomyces cerevisiae. Un fragmento y/o variante funcional de Kex2p puede conservar al menos una función de Kex2p, lo que incluye, pero sin limitación, la capacidad para escindir polipéptidos en el extremo carboxilo de las secuencias de reconocimiento: Arg-Arg/X y Lys-Arg/X. La secuencia génica de XEX2 (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos correspondiente de Kex2p (SEQ ID NO: 4) de S. cerevisiae se muestran a continuación:

ORIGEN S. cerevisiae

1 atgaaagtga ggaaatatat tactttatgc ttttggtggg ccttttcaac atccgctctt 61 gtatcatcac aacaaattcc attgaaggac catacgtcac gacagtattt tgctgtagaa 121 agcaatgaaa cattatcccg cttggaggaa atgcatccaa attggaaata tgaacatgat 181 gttcgagggc taccaaacca ttatgttttt tcaaaagagt tgctaaaatt gggcaaaaga 241 tcatcattag aagagttaca gggggataac aacgaccaca tattatctgt ccatgattta 301 ttcccgcgta acgacctatt taagagacta ccggtgcctg ctccaccaat ggactcaagc 361 ttgttaccgg taaaagaagc tgaggataaa ctcagcataa atgatccgct ttttgagagg 421 cagtggcact tggtcaatcc aagttttcct ggcagtgata taaatgttct tgatctgtgg 481 tacaataata ttacaggcgc aggggtcgtg gctgccattg ttgatgatgg ccttgactac 541 gaaaatgaag acttgaagga taatttttgc gctgaaggtt cttgggattt caacgacaat 601 accaatttac ctaaaccaag attatctgat gactaccatg gtacgagatg tgcaggtgaa 661 atagctgcca aaaaaggtaa caatttttgc ggtgtcgggg taggttacaa cgctaaaatc 721 tcaggcataa gaatcttatc cggtgatatc actacggaag atgaagctgc gtccttgatt 781 tatggtctag acgtaaacga tatatattca tgctcatggg gtcccgctga tgacggaaga 841 catttacaag gccctagtga cctggtgaaa aaggctttag taaaaggtgt tactgaggga 901 agagattcca aaggagcgat ttacgttttt gccagtggaa atggtggaac tcgtggtgat 961 aattgcaatt acgacggcta tactaattcc atatattcta ttactattgg ggctattgat 1021 cacaaagatc tacatcctcc ttattccgaa ggttgttccg ccgtcatggc agtcacgtat 1081 tcttcaggtt caggcgaata tattcattcg agtgatatca acggcagatg cagtaatagc 1141 cacggtggaa cgtctgcggc tgctccatta gctgccggtg tttacacttt gttactagaa 1201 gccaacccaa acctaacttg gagagacgta cagtatttat caatcttgtc tgcggtaggg 1261 ttagaaaaga acgctgacgg agattggaga gatagcgcca tggggaagaa atactctcat 1321 cgctatggct ttggtaaaat cgatgcccat aagttaattg aaatgtccaa gacctgggag 1381 aatgttaacg cacaaacctg gttttacctg ccaacattgt atgtttccca gtccacaaac 1441 tccacggaag agacattaga atccgtcata accatatcag aaaaaagtct tcaagatgct 1501 aacttcaaga gaattgagca cgtcacggta actgtagata ttgatacaga aattagggga 1561 actacgactg tcgatttaat atcaccagcg gggataattt caaaccttgg cgttgtaaga 1621 ccaagagatg tttcatcaga gggattcaaa gactggacat tcatgtctgt agcacattgg 1681 ggtgagaacg gcgtaggtga ttggaaaatc aaggttaaga caacagaaaa tggacacagg

1741 attgacttcc acagttggag gctgaagctc tttggggaat ccattgattc atctaaaaca 1801 gaaactttcg tctttggaaa cgataaagag gaggttgaac cagctgctac agaaagtacc 1861 gtatcacaat attctgccag ttcaacttct atttccatca gcgctacttc tacatcttct 1921 atctcaattg gtgtggaaac gtcggccatt ccccaaacga ctactgcgag taccgatcct 1981 gattctgatc caaacactcc taaaaaactt tcctctccta ggcaagccat gcattatttt 2041 ttaacaatat ttttgattgg cgccacattt ttggtgttat acttcatgtt ttttatgaaa 2101 tcaaggagaa ggatcagaag gtcaagagcg gaaacgtatg aattcgatat cattgataca 2161 gactctgagt acgattctac tttggacaat ggaacttccg gaattactga gcccgaagag 2221 gttgaggact tcgattttga tttgtccgat gaagaccatc ttgcaagttt gtcttcatca 2281 gaaaacggtg atgctgaaca tacaattgat agtgtactaa caaacgaaaa tccatttagt 2341 gaccctataa agcaaaagtt cccaaatgac gccaacgcag aatctgcttc caataaatta 2401 caagaattac agcctgatgt tcctccatct tccggacgat cgtga (SEQ ID NO:3) ORIGEN S. cerevisiae

1 mkvrkyitlc fwwafstsal vssqqiplkd htsrqyfave snetlsrlee mhpnwkyehd 61 vrglpnhyvf skellklgkr ssleelqgdn ndhilsvhdl fprndlfkrl pvpappmdss 121 llpvkeaedk lsindplfer qwhlvnps fp gsdinvldlw ynnitgagvv aaivddgldy 181 enedlkdnfc aegswdfndn tnlpkprlsd dyhgtrcage iaakkgnnfc gvgvgynaki 241 sgirilsgdi ttedeaasli ygldvndiys cswgpaddgr hlqgpsdlvk kalvkgvteg 301 rdskgaiyvf asgnggtrgd ncnydgytns iysitigaid hkdlhppyse gcsavmavty 361 ssgsgeyihs sdingrcsns hggtsaaapl aagvytllle anpnltwrdv qylsilsavg 421 leknadgdwr dsamgkkysh rygfgkidah kliemsktwe nvnaqtwfyl ptlyvsqstn 481 steetlesvi tisekslqda nfkriehvtv tvdidteirg tttvdlispa giisnlgvvr 541 prdvssegfk dwtfmsvahw gengvgdwki kvkttenghr idfhswrlkl fgesidsskt 601 etfvfgndke evepaatest vsqysassts isisatstss isigvetsai pqtttastdp 661 dsdpntpkkl ssprqamhyf ltifligatf lvlyfmffmk srrrirrsra etyefdiidt 721 dseydstldn gtsgitepee vedfdfdlsd edhlaslsss engdaehtid svltnenpfs 781 dpikqkfpnd anaesasnkl qelqpdvpps sgrs (SEQ ID NO:4)

Como se emplea en esta memoria, "PDI" o "PDI1" se refiere a un gen que codifica "pdi" o "Pdilp", también conocida como "proteína disulfuro isomerasa", que es una enzima en el retículo endoplasmático en eucariotas que cataliza la formación y ruptura de enlaces disulfuro entre restos de cisteína en las proteínas a medida que se pliegan. (Wilkinson B, Gilbert Hf (junio de 2004). "Protein disulfide isomerase". Biochimica et Biophysica Acta 1699 (1-2): 35-44 y Gruber CW, Cemazar M, Heras B, Martin JL, Craik DJ (agosto de 2006). "Protein disulfide isomerase: the structure of oxidative folding”. Trends in Biochemical Sciences 31 (8): 455-64)) y puede actuar como una proteína chaperona (Wang, CC y Tsou, CL FASEB J. diciembre de 1993;7(15):1515-7). La proteína disulfuro isomerasa es una proteína multifuncional que reside en el lumen del retículo endoplasmático, esencial para la formación de enlaces disulfuro en las proteínas secretadas y de la superficie celular, destrama los enlaces disulfuro no nativos; forma un complejo con Mnl1p que tiene actividad exomanosidasa, procesando los oligosacáridos de Man8GlcNAc2 unidos a proteína no plegada en Man7GlcNAc2, lo que promueve la degradación en la respuesta de proteína no plegada. Pdi1 también tiene actividad reductasa oxidativa. Pdi1p de S. cerevisiae está codificada por el n.° de ID de GenBank 850314. Un fragmento y/o variante funcional de pdi puede ser un polipéptido que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos del Ref Seq del NCBI NP_009887 codificada por un polinucleótido que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia respecto del n.° de ID de GenBank 850314 y conservará al menos una función de Pdi, lo que incluye, pero sin limitación, actividad isomerasa. La actividad funcional de Pdi1 incluye, pero sin limitación, formación y/o ruptura catalizante de enlaces disulfuro, lo que ayuda al plegamiento adecuado de proteínas mal plegadas. Los seudónimos para PDI incluyen: PDI1, PDIA2, Pdia3, P4HB, PADI1, Padi2, EUG1, NCU09223, SOAC1F5.02 y AGOS_AFR718W. El gen PDI1 está conservado en seres humanos, macaco cangrejero, perro, vaca, ratón, rata, pollo, pez cebra, mosca de la fruta, mosquito, C. elegans, S. cerevisiae, K. lactis, E. gossypii, S. pombe, M. oryzae, N. crassa, A. thaliana, y arroz. (PDI1) puede efectuar. La secuencia génica de PDI (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de aminoácidos correspondiente de Pdi1 (SEQ ID NO: 6) de S. cerevisiae se muestran a continuación:

ORIGEN S. cerevisiae

1 atgaagtttt ctgctggtgc cgtcctgtca tggtcctccc tgctgctcgc ctcctctgtt 61 ttcgcccaac aagaggctgt ggcccctgaa gactccgctg tcgttaagtt ggccaccgac 121 tccttcaatg agtacattca gtcgcacgac ttggtgcttg cggagttttt tgctccatgg 181 tgtggccact gtaagaacat ggctcctgaa tacgttaaag ccgccgagac tttagttgag 241 aaaaacatta ccttggccca gatcgactgt actgaaaacc aggatctgtg tatggaacac 301 aacattccag ggttcccaag cttgaagatt ttcaaaaaca gcgatgttaa caactcgatc 361 gattacgagg gacctagaac tgccgaggcc attgtccaat tcatgatcaa gcaaagccaa 421 ccggctgtcg ccgttgttgc tgatctacca gcttaccttg ctaacgagac ttttgtcact 481 ccagttatcg tccaatccgg taagattgac gccgacttca acgccacctt ttactccatg 541 gccaacaaac acttcaacga ctacgacttt gtctccgctg aaaacgcaga cgatgatttc 601 aagctttcta tttacttgcc ctccgccatg gacgagcctg tagtatacaa cggtaagaaa 661 gccgatatcg ctgacgctga tgtttttgaa aaatggttgc aagtggaagc cttgccctac 721 tttggtgaaa tcgacggttc cgttttcgcc caatacgtcg aaagcggttt gcctttgggt 781 tacttattct acaatgacga ggaagaattg gaagaataca agcctctctt taccgagttg 841 gccaaaaaga acagaggtct aatgaacttt gttagcatcg atgccagaaa attcggcaga 901 cacgccggca acttgaacat gaaggaacaa ttccctctat ttgccatcca cgacatgact 961 gaagacttga agtacggttt gcctcaactc tctgaagagg cgtttgacga attgagcgac 1021 aagatcgtgt tggagtctaa ggctattgaa tctttggtta aggacttctt gaaaggtgat 1081 gcctccccaa tcgtgaagtc ccaagagatc ttcgagaacc aagattcctc tgtcttccaa 1141 ttggtcggta agaaccatga cgaaatcgtc aacgacccaa agaaggacgt tcttgttttg 1201 tactatgccc catggtgtgg tcactgtaag agattggccc caacttacca agaactagct 1261 gatacctacg ccaacgccac atccgacgtt ttgattgcta aactagacca cactgaaaac 1321 gatgtcagag gcgtcgtaat tgaaggttac ccaacaatcg tcttataccc aggtggtaag 1381 aagtccgaat ctgttgtgta ccaaggttca agatccttgg actctttatt cgacttcatc 1441 aaggaaaacg gtcacttcga cgtcgacggt aaggccttgt acgaagaagc ccaggaaaaa 1501 gctgctgagg aagccgatgc tgacgctgaa ttggctgacg aagaagatgc cattcacgat 1561 gaattgtaa (SEQ ID NO:5)

ORIGEN S. cerevisiae

MKFSAGAVLSWSSLLLASSVFAQQEAVAPEDSAWKLATDSFNE

YIQSHDLVLAEFFAPWCGHCKNMAPEYVKAAETLVEKNITLAQIDCTENQDLCMEHNI

PG FPSLKIFKN SDVNNSIDYE GPRTAEAIVQ FMIKQ SQPAVAWAD LPAYLAN ETFVT

PVTVQSGKIDADFNATFYSMANKHFNDYDFVSAENADDDFKLSIYLPSAMDEPWYNG

KKADIADADVFEKWLQVEALPYFGEIDGSVFAQYVESGLPLGYLFYNDEEELEEYKPL

FTELAKKNRGLMNFVSIDARKFGRHAGNLNMKEQFPLFAIHDMTEDLKYGLPQLSEEA

FDELSDKIVLESKAIESLVKDFLKGDASPIVKSQEIFENQDSSVFQLVGKNHDEIVND

PKKDVLVLYYAPWCGHCKRLAPTYQELADTYANATSDVLIAKLDHTENDVRGVVIEGY

PTIVLYPGGKKSESWYQGSRSLDSLFDFIKENGHFDVDGKALYEEAQEKAAEEADAD

AELADEEDAIHDEL(SEQ ID NO:6)

PDI es una proteína residente en el lumen del R.E. de las células. Una gran cantidad de pruebas acerca de la distribución celular de la enzima, su ubicación subcelular y sus propiedades de desarrollo sugiere que desempeña un papel en la biosíntesis de proteínas y la vía de secreción (Freedman, 1984, Trends Biochem. Sci. 9, pp.438-41) y esto está respaldado por estudios de entrecruzamiento directo in situ (Roth y Pierce, 1987, Biochemistry, 26, págs. 4179­ 82). La observación de que las membranas microsomales deficientes para PDI muestran un defecto específico en la formación de disulfuros en las proteínas (Bulleid y Freedman, 1988, Nature, 335, págs. 649-51) implica que la enzima funciona como catalizador de la formación de enlaces disulfuro naturales durante la biosíntesis de proteínas secretorias y de la superficie celular. Este papel es coherente con lo que se conoce acerca de las propiedades catalíticas de la enzima in vitro; cataliza las reacciones de intercambio de tiol:disulfuro que dan lugar a la formación, ruptura o isomerización neta de disulfuro de proteínas y puede catalizar el plegamiento de proteínas y la formación de enlaces disulfuro nativos en una gran variedad de sustratos de proteína reducidos no plegados (Freedman et al., 1989, Biochem. Soc. Symp., 55, págs. 167-192). Se conoce la secuencia de ADN y de aminoácidos de la enzima de varias especies (Scherens, B. et al., 1991, Yeast, 7, págs. 185-193; Farquhar, R., et al., 1991, Gene, 108, págs. 81-89) y cada vez se dispone de más información acerca del mecanismo de acción de la enzima purificada hasta homogeneidad de hígado de mamífero (Creighton et al., 1980, J. Mol. Biol., 142, págs. 43-62; Freedman et al., 1988, Biochem. Soc. Trans., 16, págs. 96-9; Gilbert, 1989, Biochemistry28, págs. 7298-7305; Fundstrom y Holmgren, 1990, J. Biol. Chem, 265, págs. 9114-9120; Hawkins y Freedman, 1990, Biochem. J., 275, págs. 335-339). De los diversos factores de proteína actualmente implicados como mediadores del plegamiento de proteínas, su ensamblaje y su traslocación en la célula (Rothman, 1989, Cell 59, págs. 591 -601), PDI es inusual, ya que tiene una actividad catalítica bien definida.

PDI se aísla fácilmente de tejidos de mamífero y la enzima homogénea es un homodímero (2 x 57 kD) con un pI característicamente ácido (4,0-4,5) (Hillson et al., 1984, Methods Enzymol., 107, págs. 281-292). También se ha purificado la enzima a partir de trigo y del alga Chlamydomonas reinhardii (Kaska et al., 1990 Biochem. J. 268, págs.

63-68). La actividad se ha detectado en una gran variedad de fuentes y en un informe preliminar, se afirmó que la actividad de PDI es detectable en S. cerevisiae (Williams et al., 1968, FEBS Letts., 2, págs. 133-135). Recientemente, se han publicado las secuencias de aminoácidos completas de diversas PDI, en su mayoría procedentes de secuencias de ADNc clonadas; estas incluyen PDI de rata (Edman et al., 1985, Nature, 317, págs. 267-270), bovina (Yamauchi et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm., 146, págs. 1485-1492), humana (Pihlajaniemi et al., 1987, EMBO J., 6, págs. 643-9), levadura (Scherens, B., et al., citado anteriormente; Farquhar, R. et al., citado anteriormente) y pollo (Parkkonen et al., 1988, Biochem. J., 256, págs. 1005-1011). Las proteínas de estas especies de vertebrado muestran un alto grado de conservación de secuencia entre todas ellas y muestran varias características generales observadas inicialmente en la secuencia de PDI de rata (Edman et al., 1985, citado anteriormente).

Se han identificado secuencias correspondientes a o estrechamente relacionadas con PDI en estudios dirigidos a analizar funciones distintas de la formación de enlaces disulfuro. Por ejemplo, hay pruebas sólidas de que PDI actúa como subunidades p de la enzima ap tetramérica prolil-4-hidroxilasa, que cataliza una modificación postraduccional importante de los polipéptidos de procolágeno nacientes o recién sintetizados en el R.E. (Pihlajaniemi et al., 1987, citado anteriormente; Koivu et al., 1987, J. Biol. Chem, 262, págs. 6447-49)). También hay pruebas que sugieren que PDI participa en el sistema para la N-glucosilación cotraduccional (Geetha-Habib et al., 1988, Cell, 4, págs. 63-68) y recientemente se ha propuesto que la enzima participa en el complejo que transfiere triglicéridos a lipoproteínas secretadas nacientes (Wetterau et a l, 1990, J. Biol. Chem., 265, págs. 9800-7). Por lo tanto, PDI puede ser multifuncional en la modificación cotraduccional y postraduccional de proteínas secretoras (Freedman, 1989, Cell, 57, págs. 1069-72).

El aumento de la actividad de Pdi1 en sistemas de expresión bacterianos, de levadura y de células de insecto puede dar lugar a un aumento de la secreción de proteínas recombinantes que contienen enlaces disulfuro. Albiglutida (ALB), cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1, consiste en un dímero de GLP-1 resistente a DPP-4 fusionado a albúmina humana. La proteína contiene 8 enlaces disulfuro diferentes. Es posible que la sobreexpresión de Pdi1 pueda mejorar el plegamiento adecuado y la secreción de la SEQ ID NO: 1 en y/o a partir de células hospedadoras.

ERO1 es un gen que codifica la oxirreductina del RE 1 (Ero1), que es una enzima oxidorreductasa que cataliza la formación e isomerización de los enlaces disulfuro de proteínas en el retículo endoplasmático (RE) de los eucariotas (Frand AD, Cuozzo JW, Kaiser CA (2000). ""Pathways for protein disulphide bond formation". Trends Cell Biol. 10 (5): 203-10 y Frand AR, Kaiser CA (2000). "Two pairs of conservedcysteines are required forthe oxidative activity of Ero1p in protein disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum". Mol. Biol. Cell 11 (9): 2833-43). ERO1 de S. cerevisiae tiene el n.° de ID de gen del NCBI 854909 y el Ref Seq de proteína del NP_013576. Los seudónimos para ERO1 incluyen, pero sin limitación: ERO1L, ERO1LB, Ero1a, Ero1b, ero-1, NCU02074. El gen ERO1 está conservado en seres humanos, chimpancé, macaco cangrejero, perro, vaca, ratón, rata, pollo, pez cebra, C. elegans, S. cerevisiae, K. lactis, E. gossypii, S. pombe, M. oryzae, N. crassa, A. thaliana, y arroz. Las actividades de ERO1 incluyen, pero sin limitación, unión a dinucleótidos de flavina adenina, actividad oxidorreductasa, actividad proteína disulfuro isomerasa y actividad tiol oxidasa. Un fragmento y/o variante funcional de Ero1 puede ser un polipéptido que conserva al menos una actividad funcional de una Ero1 de tipo silvestre.

"Oxidorreductina del retículo endoplasmático" o "ERO" es una enzima oxidorreductasa que cataliza la formación e isomerización de enlaces disulfuro de proteínas en el retículo endoplasmático de células eucariotas. La formación del enlace disulfuro es un proceso oxidativo. Después de que la proteína disulfuro isomerasa (PDI) catalice la formación del enlace disulfuro en un polipéptido naciente, PDI se reduce durante la reacción de intercambio de tiol-disulfuro. ERO es necesaria para la introducción de equivalentes oxidantes en PDI. En S. cerevisiae, la oxirreductina del retículo endoplasmático está codificada por ERO1.

La secuencia génica de ERO1 (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos correspondiente de Ero1 (SEQ ID NO: 8) de S. cerevisiae se muestran a continuación:

ORIGEN S. cerevisiae

1 atgagattaa gaaccgccat tgccacactg tgcctcacgg cttttacatc tgcaacttca 61 aacaatagct acatcgccac cgaccaaaca caaaatgcct ttaatgacac tcacttttgt 121 aaggtcgaca ggaatgatca cgttagtccc agttgtaacg taacattcaa tgaattaaat 181 gccataaatg aaaacattag agatgatctt tcggcgttat taaaatctga tttcttcaaa 241 tactttcggc tggatttata caagcaatgt tcattttggg acgccaacga tggtctgtgc 301 ttaaaccgcg cttgctctgt tgatgtcgta gaggactggg atacactgcc tgagtactgg 361 cagcctgaga tcttgggtag tttcaataat gatacaatga aggaagcgga tgatagcgat 421 gacgaatgta agttcttaga tcaactatgt caaaccagta aaaaacctgt agatatcgaa 481 gacaccatca actactgtga tgtaaatgac tttaacggta aaaacgccgt tctgattgat 541 ttaacagcaa atccggaacg atttacaggt tatggtggta agcaagctgg tcaaatttgg 601 tctactatct accaagacaa ctgttttaca attggcgaaa ctggtgaatc attggccaaa 661 gatgcatttt atagacttgt atccggtttc catgcctcta tcggtactca cttatcaaag 721 gaatatttga acacgaaaac tggtaaatgg gagcccaatc tggatttgtt tatggcaaga 781 atcgggaact ttcctgatag agtgacaaac atgtatttca attatgctgt tgtagctaag 841 gctctctgga aaattcaacc atatttacca gaattttcat tctgtgatct agtcaataaa 901 gaaatcaaaa acaaaatgga taacgttatt tcccagctgg acacaaaaat ttttaacgaa 961 gacttagttt ttgccaacga cctaagtttg actttgaagg acgaattcag atctcgcttc 1021 aagaatgtca cgaagattat ggattgtgtg caatgtgata gatgtagatt gtggggcaaa 1081 attcaaacta ccggttacgc aactgccttg aaaattttgt ttgaaatcaa cgacgctgat 1141 gaattcacca aacaacatat tgttggtaag ttaaccaaat atgagttgat tgcactatta 1201 cagactttcg gtagattatc tgaatctatt gaatctgtta acatgttcga aaaaatgtac 1261 gggaaaaggt taaacggttc tgaaaacagg ttaagctcat tcttccaaaa taacttcttc 1321 aacattttga aggaggcagg caaatcgatt cgttacacca tagagaacat caattccact 1381 aaagaaggaa agaaaaagac taacaattct caatcacatg tatttgatga tttaaaaatg 1441 cccaaagcag aaatagttcc aaggccctct aacggtacag taaataaatg gaagaaagct 1501 tggaatactg aagttaacaa cgttttagaa gcattcagat ttatttatag aagctatttg 1561 gatttaccca ggaacatctg ggaattatct ttgatgaagg tatacaaatt ttggaataaa 1621 ttcatcggtg ttgctgatta cgttagtgag gagacacgag agcctatttc ctataagcta 1681 gatatacaat aa (SEQ ID NO: 7)

ORIGEN S. cerevisiae

MRLRTAIATLCLTAFTSATSNNSYIATDQTQNAFNDTHFCKVDR

NDHVSPSCNVTFNELNAINENIRDDLSALLKSDFFKYFRLDLYKQCSFWDANDGLCLN

RACSVDWEDWDTLPEYWQPEILGSFNNDTMKEADDSDDECKFLDQLCQTSKKPVDIE

DTINYCDWDFNGKNAVLIDLTANPERFTGYGGKQAGQIWSTIYQDNCFTIGETGESL

AKDAFYRLVSGFHASIGTHLSKEYLNTKTGKWEPNLDLFMARIGNFPDRVTNMYFNYA

WAKALWKIQPYLPEFSFCDLWKEIKNKMDNVISQLDTKIFNEDLVFANDLSLTLKD

EFRSRFKNVTKIMDCVQCDRCRLWGKIQTTGYATALKILFEINDADEFTKQHIVGKLT

KYELIALLQTFGRLSESIESVNMFEKMYGKRLNGSENRLSSFFQNNFFNILKEAGKSI

RYTIENINSTKEGKKKTNNSQSHVFDDLKMPKAEIVPRPSNGTWKWKKAWNTEVNNV

LEAFRFIYRSYLDLPRNIWELSLMKVYKFWNKFIGVADYVSEETREPISYKLDIQ" (SEQ ID NO:8)

"Microorganismos" significa (i) un procariota, lo que incluye, pero sin limitación, un miembro del género Streptococcus, Staphylococcus, Bórdetela, Corynebacterium, Mycobacterium, Neisseria, Haemophilus, Actinomycetes, Streptomycetes, Nocardia, Enterobacter, Yersinia, Fancisella, Pasturella, Moraxella, Acinetobacter, Erysipelothrix, Branhamella, Actinobacillus, Streptobacillus, Listeria, Calymmatobacterium, Brucella, Bacillus, Clostridium, Treponema, Escherichia, Salmonella, Kleibsiella, Vibrio, Proteus, Erwinia, Borrelia, Leptospira, Spirillum, Campylobacter, Shigella, Legionella, Pseudomonas, Aeromonas, Rickettsia, Chlamydia, Borrelia y Mycoplasma, e incluye adicionalmente, pero sin limitación, un miembro de la especie o grupo, Streptococcus del grupo A, Streptococcus del grupo B, Streptococcus del grupo C, Streptococcus del grupo D, Streptococcus del grupo G, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diptheriae, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Actinomyctes israelii, Listeria monocytogenes, Bordetella pertusis, Bordetella parapertusis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus influenzae, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus ducreyi, Bordetella, Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pestis, Kleibsiella pneumoniae, Serratia marcessens, Serratia liquefaciens, Vibrio cholera, Shigella dysenterii, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Franscisella tularensis, Brucella abortis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Treponema pallidum, Rickettsia rickettsii y Chlamydia trachomitis, (ii) una arqueobacteria, lo que incluye, pero sin limitación, Archaebacter y (iii) un eucariota unicelular o filamentoso, lo que incluye, pero sin limitación, un protozoo, un hongo, un miembro del género Saccharomyces, Kluveromyces, o Candida y un miembro de la especie Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis o Candida albicans.

"Bacteria" significa (i) un procariota, lo que incluye, pero sin limitación, un miembro del género Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella, Corynebacterium, Mycobacterium, Neisseria, Haemophilus, Actinomycetes, Streptomycetes, Nocardia, Enterobacter, Yersinia, Fancisella, Pasturella, Moraxella, Acinetobacter, Erysipelothrix, Branhamella, Actinobacillus, Streptobacillus, Listeria, Calymmatobacterium, Brucella, Bacillus, Clostridium, Treponema, Escherichia, Salmonella, Kleibsiella, Vibrio, Proteus, Erwinia, Borrelia, Leptospira, Spirillum, Campylobacter, Shigella, Legionella, Pseudomonas, Aeromonas, Rickettsia, Chlamydia, Borrelia y Mycoplasma, e incluye adicionalmente, pero sin limitación, un miembro de la especie o grupo, Streptococcus del grupo A, Streptococcus del grupo B, Streptococcus del grupo C, Streptococcus del grupo D, Streptococcus del grupo G, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diptheriae, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Actinomyctes israelii, Listeria monocytogenes, Bordetella pertusis, Bordetella parapertusis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus influenzae, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus ducreyi, Bordetella, Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pestis, Kleibsiella pneumoniae, Serratia marcessens, Serratia liquefaciens, Vibrio cholera, Shigella dysenterii, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Franscisella tularensis, Brucella abortis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Treponema pallidum, Rickettsia rickettsii y Chlamydia trachomitis y (ii) una arqueobacteria, lo que incluye, pero sin limitación, Archaebacter.

Como se emplea en esta memoria, "secuencia de ácido nucleico heteróloga" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se inserta, transforma o transfecta en una célula hospedadora o un microorganismo de interés. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede ser una secuencia codificante para la totalidad o parte de un polipéptido y/o puede comprender elementos reguladores no codificantes, tales como un promotor, potenciador, elemento de unión a ribosomas o región de poliadenilación. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede ser una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra de manera natural en la célula hospedadora, tal como una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de un organismo, género o especie diferente a la de la célula hospedadora. Como alternativa, una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede ser nativa para el genoma de una célula hospedadora pero se inserta, transforma o transfecta en la célula hospedadora para aumentar la función de la secuencia de ácido nucleico nativa o la expresión del polipéptido codificado por dicha secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, S. cerevisiae de tipo silvestre puede contener secuencias de ácido nucleico que codifican Kex2p de tipo silvestre, pero puede transformarse un ácido nucleico heterólogo que codifica Kex2p de tipo silvestre en dicha S. cerevisiae para aumentar la producción de Kex2p por dicha célula hospedadora. De manera similar, S. cerevisiae de tipo silvestre puede contener secuencias de ácido nucleico que codifican Kex2p de tipo silvestre, pero puede insertarse un ácido nucleico heterólogo que codifica Kex2p de un organismo diferente en dicha S. cerevisiae para aumentar la producción de Kex2p por dicha célula hospedadora. En la presente invención también se contemplan células hospedadoras que contienen secuencias de ácido nucleico heterólogas que son variantes y/o fragmentos de ácidos nucleicos silvestres de la misma especie de célula hospedadora.

Como se emplea en esta memoria, "polipéptidos recombinantes" y las variaciones gramaticales del mismo se refiere a un polipéptido no sintetizado de manera natural por una célula o microorganismo hospedador transformado de interés e introducido en la célula o microorganismo hospedador mediante ADN recombinante. Por ejemplo, S. cerevisiae puede actuar como célula hospedadora para la expresión de seroalbúmina humana, lo que no se produce en S. cerevisiae no transformada o no transfectada. Los polipéptidos recombinantes pueden incluir polipéptidos que se han modificado para facilitar su aislamiento.

Como se emplea en esta memoria, "marcador de afinidad" se refiere a cualquier resto asociado con una molécula que pueda proporcionar a dicha molécula afinidad selectiva por otra sustancia o molécula. Por ejemplo, puede usarse un marcador de afinidad para facilitar la purificación de una molécula dotando a la molécula de afinidad selectiva para un material de empaquetado de una columna. Un ejemplo no limitante de un marcador de afinidad es un marcador de his.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder de secreción se une operativamente a ADN para un polipéptido en caso de que se exprese como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se une operativamente a una secuencia codificante en caso de que afecte a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas se une operativamente a una secuencia codificante si está posicionado de tal forma que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no son necesariamente contiguos. La unión se logra mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. En caso de que no existan dichos sitios, se usan los adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Como se emplea en esta memoria, "cosechar" células se refiere a la recolección de las células del cultivo celular. Las células pueden concentrarse durante la cosecha para separarlas del caldo de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración. La recogida de células puede comprender además la etapa de lisar las células para obtener material intracelular, tal como, pero sin limitación, polipéptidos y polinucleótidos. Los expertos en la materia entenderán que ciertos materiales celulares, lo que incluye, pero sin limitación, polipéptidos expresados de manera heteróloga, pueden liberarse de las células durante el cultivo. Por lo tanto, un producto de interés (p. ej., un polipéptido expresado de manera recombinante) puede permanecer en el caldo de cultivo después de que se hayan cosechado las células.

Asimismo, se proporcionan métodos en donde la construcción de ADN recombinante codifica un marcador de selección. Dicho marcador de selección posibilita la selección positiva o negativa. También se proporcionan métodos que comprenden expresar dicho marcador de selección y comparar la cantidad de marcador de selección producida por al menos una primera célula transformada de la etapa de selección, con la cantidad de marcador de selección producida por al menos una segunda célula transformada de la etapa de selección, en donde las células transformadas primera y segunda producen el mismo marcador de selección. Como se entiende en la técnica, los marcadores de selección incluyen, pero sin limitación, dihidrofolato reductasa (dhfr), p-galactosidasa, proteína fluorescente, forma secretada de la fosfatasa alcalina placentaria humana, beta glucuronidasa, los marcadores de selección de levadura LEU2 y URA3, genes de resistencia a la apoptosis y oligonucleótidos antisentido, así como genes de resistencia a antibióticos que confieren la capacidad para crecer en presencia de antibióticos que incluyen, neomicina (neo), kanamicina, geneticina, higromicina B, puromicina, zeocina, blasticidina, nourseotricina, bialafós, fleomicina y ampicilina. Como también se entiende en la técnica, las células pueden clasificarse mediante diversos medios, lo que incluye, pero sin limitación, inspección visual o un clasificador celular, tal como un instrumento BD FACS Aria, que puede detectar la expresión de un marcador de selección.

Como se entiende en la técnica, la expresión "tipo silvestre" se refiere a una célula hospedadora o a una secuencia de polipéptido o polinucleótido que se produce en una población nativa sin modificación genética. Por ejemplo, una "célula hospedadora de tipo silvestre" se refiere a una cepa no modificada de una célula hospedadora antes de efectuarse o de que se produzca cualquier modificación genética en el genoma de la célula hospedadora.

Como se emplea en esta memoria, "título" o "título de rendimiento" se refiere a la concentración de un producto (p. ej., polipéptido expresado de manera recombinante) en solución (p. ej., caldo de cultivo o mezcla o tampón de lisis celular) y normalmente se expresa como mg/l o g/l. Un aumento en el título de rendimiento puede referirse a un aumento absoluto o relativo en la concentración de un producto producido en dos conjuntos de condiciones definidos.

"Hormona incretina", como se emplea en esta memoria, significa cualquier hormona que potencie la secreción de insulina o de otro modo aumente el nivel de insulina. Un ejemplo de una hormona incretina es GLP-1. GLP-1 es una incretina secretada por las células L intestinales en respuesta a la ingesta de alimento. En un individuo sano, GLP-1 desempeña un papel importante a la hora de regular los niveles de glucosa en sangre post-prandiales estimulando la secreción de insulina dependiente de glucosa por el páncreas, dando como resultado una absorción aumentada de glucosa en la periferia. GLP-1 también suprime la secreción de glucagón, lo que da lugar a una menor producción de glucosa hepática. Además, GLP-1 retrasa el tiempo de vaciado gástrico y frena la movilidad del intestino delgado, lo que retrasa la absorción del alimento. GLP-1 promueve la competencia continuada de células beta estimulando la transcripción de genes implicados en la secreción de insulina dependiente de glucosa y promoviendo la neogénesis de células beta (Meier, et al. Biodrugs 2003; 17 (2): 93-102).

"Actividad de GLP-1", como se emplea en esta memoria, significa una o más de las actividades de GLP-1 humano de origen natural, lo que incluye, pero sin limitación, reducir la glucosa en sangre y/o plasma, estimular la secreción de insulina dependiente de glucosa o de otro modo elevar el nivel de insulina, suprimir la secreción de glucagón, reducir la fructosamina, aumentar el aporte de glucosa y su metabolismo en el cerebro, retrasar el vaciado gástrico y promover la competencia y/o la neogénesis de células beta. Cualquiera de estas actividades y otras actividades asociadas con la actividad de GLP-1 pueden estar causadas directa o indirectamente por una composición que tiene actividad GLP-1 o un agonista de GLP-1. A modo de ejemplo, una composición que tiene actividad GLP-1 puede estimular directa o indirectamente la dependiente de glucosa, mientras que la estimulación de la producción de insulina puede reducir indirectamente los niveles plasmáticos de glucosa en un mamífero.

Un "mimético de incretina", como se emplea en esta memoria, es un compuesto capaz de potenciar la secreción de insulina o de otro modo elevar el nivel de insulina. Un mimético de incretina puede ser capaz de estimular la secreción de insulina, aumentar la neogénesis de células beta, inhibir la apoptosis de células beta, inhibir la secreción de glucagón, retrasar el vaciado gástrico e inducir la saciedad en un mamífero. Un mimético de incretina puede incluir, pero sin limitación, cualquier polipéptido que tenga actividad GLP-1, lo que incluye, pero sin limitación, exendina 3 y exendina 4, lo que incluye cualquier fragmento y/o variante y/o conjugado de los mismos.

Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" puede considerarse lo mismo que un "dominio variable individual", que es capaz de unirse a un antígeno. Un dominio variable individual puede ser un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables de anticuerpos individuales de otras especies, tales como roedor (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/29004), tiburón nodriza y dAb de Vhh de camélidos. Los Vhh de camélido son polipéptidos de dominio variable individual de inmunoglobulina que proceden de especies que incluyen camellos, llamas, alpacas, dromedarios y guanacos, que producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de manera natural de cadenas ligeras. Dichos dominios Vhh pueden humanizarse de acuerdo con técnicas convencionales disponibles en la técnica y dichos dominios se consideran "anticuerpos de dominio". Como se emplea en esta memoria, Vh incluye dominios Vhh de camélido.

La expresión "dominio variable individual" se refiere a un dominio variable de proteína de unión a antígeno (por ejemplo, Vh, Vhh, VI) que se une específicamente a un antígeno o epítopo de manera independiente de una región variable o dominio diferente.

La expresión "proteína de unión a antígeno", como se emplea en esta memoria, se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otras construcciones de proteína, tales como dominios, pero sin limitación, dominios variables y anticuerpos de dominio, que son capaces de unirse a un antígeno.

Como se emplea en esta memoria, "cantidad reducida" y las variaciones gramaticales de la misma de una enzima o un fragmento de la misma o de una actividad enzimática, comparada en una célula hospedadora genéticamente modificada se refiere a una célula hospedadora genéticamente modificad que produce menos cantidad de al menos una enzima o muestra menos de al menos un tipo de actividad enzimática cuando se compara con una célula hospedadora no genéticamente modificada. Normalmente, la comparación de la actividad enzimática producida por una célula hospedadora genéticamente modificada es con la cepa de tipo silvestre de la misma especie antes de la modificación genética. Sin embargo, la comparación también puede efectuarse entre un hospedador genéticamente modificado y un hospedador de tipo silvestre del mismo género pero una especie o cepa diferente o con otra cepa genéticamente modificada. Una reducción en al menos una enzima o actividad enzimática también incluye la supresión completa de al menos una enzima o actividad enzimática en la que no se produce ninguna de al menos una enzima en un hospedador genéticamente modificado y/o ninguna de al menos una enzima es funcional o muestra actividad. También se incluye en esta definición una cantidad reducida de al menos una actividad enzimática. Es decir, las enzimas que tienen más de una actividad pueden mantener la cantidad de una primera actividad, mientras que se reduce una segunda actividad de la misma enzima.

Como se emplea en esta memoria, "cantidad aumentada" y variaciones gramaticales de la misma de una enzima o un fragmento de la misma o de una actividad enzimática, en una célula hospedadora genéticamente modificada se refiere a una célula hospedadora genéticamente modificad que produce más cantidad de al menos una enzima o muestra más de al menos un tipo de actividad enzimática cuando se compara con una célula hospedadora no genéticamente modificada. Normalmente, la comparación de la actividad enzimática producida por una célula hospedadora genéticamente modificada es con la cepa de tipo silvestre de la misma especie antes de la modificación genética. Sin embargo, la comparación también puede efectuarse entre un hospedador genéticamente modificado y un hospedador de tipo silvestre del mismo género pero una especie o cepa diferente o con otra cepa genéticamente modificada. También se incluye en esta definición una cantidad aumentada de al menos una actividad enzimática. Es decir, las enzimas que tienen más de una actividad pueden mantener la cantidad de una primera actividad, mientras que se aumenta una segunda actividad de la misma enzima. Adicionalmente, este término incluye aumentos en la actividad enzimática aparte de la cantidad de enzima producida por una célula hospedadora. Por ejemplo, puede producirse una célula hospedadora genéticamente modificada en una cantidad igual o similar a la de una enzima o fragmento y/o variante de la misma que se produce por una célula hospedadora de tipo silvestre, medida en masa o cantidad, pero puede haber un aumento medible en la cantidad de al menos una actividad funcional de dicha enzima, en comparación con el tipo silvestre.

Como se emplea en esta memoria, las expresiones "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" significan que la hibridación se producirá únicamente si hay al menos un 70 % y al menos un 80 %, pero al menos un 95 % de identidad entre las secuencias. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es incubación durante una noche a 42 °C en una solución que comprende: formamida al 50 %, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10 % y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en SSC 0,1x a aproximadamente 65 °C. Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se ilustran en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), en particular, en el capítulo 11 del mismo.

Como se emplea en esta memoria, "modificación genética" o "genéticamente modificado" se refiere a cualquier supresión, sustitución, eliminación y/o inserción de una o más bases o de un fragmento de una o más secuencias de ADN celulares. Dicha modificación genética puede obtenerse in vitro (directamente en ADN aislado) o in situ, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética o exponiendo las células a un agente mutagénico. Los agentes mutagénicos incluyen, por ejemplo, agentes físicos, tales como rayos de energía (rayos X, rayos y, UV, etc.) o agentes químicos capaces de reaccionar con diferentes grupos funcionales del ADN, tales como agentes alquilantes (EMS, NQO, etc.), agentes bialquilantes, agentes intercalantes, etc. También pueden obtenerse modificaciones genéticas mediante ruptura genética, por ejemplo, según el método descrito por Rothstein et al. (Meth. Enzymol. 194:281-301(1991)). Según este método, se reemplaza la totalidad o parte de un gen mediante recombinación de homólogos por una versión modificada in vitro. Las modificaciones genéticas también pueden obtenerse mediante cualquier inserción de una mutación en las secuencias de ADN, tales como transposones, fagos, etc. Asimismo, como se emplea en esta memoria, "genéticamente modificado" puede hacer referencia a un gen que codifica un polipéptido o a un polipéptido que tiene al menos una eliminación, sustitución o eliminación de un ácido nucleico o un aminoácido, respectivamente. Por ejemplo, puede considerarse genéticamente modificado un polipéptido en el que se sustituye al menos un aminoácido con respecto a la forma de tipo silvestre.

La modificación genética puede revertirse o atenuarse mediante un mecanismo celular. Como alternativa, las mutaciones pueden ser no reversivas y/o no filtrantes. Las "mutaciones filtrantes" incluyen mutaciones que dan como resultado una inactivación parcial en lugar de completa de la función de tipo silvestre.

Las modificaciones genéticas portadas por las células hospedadoras de la invención pueden estar ubicadas en una región codificante de la secuencia de ADN de la célula y/o en una región que afecta a la expresión de un gen. Por lo tanto, las modificaciones de la invención afectarán por lo general a un producto génico o a la regulación o promoción del producto génico de proteínas y/o enzimas implicadas en la proteólisis y/o la glucosilación. La capacidad reducida de las células de la invención para escindir y/o glucosilar proteolíticamente un polipéptido expresado de manera heteróloga puede deberse a cambios estructurales y/o conformacionales, a la producción de una o más enzimas que tienen propiedades biológicas alteradas, a la ausencia de producción de dichas una o más enzimas o a la producción de una o más enzimas a bajos niveles.

Las modificaciones genéticas de la invención también afectan al producto génico o a la regulación o la promoción del producto génico de proteínas y/o enzimas implicadas en cualquiera de las actividades funcionales de Kex2p, Pdi1 y ero1 descritas en esta memoria. La capacidad aumentada de las células de la invención para plegarse de manera adecuada y secretar polipéptidos expresados de manera recombinante puede deberse a que las enzimas implicadas en estos procesos tienen propiedades biológicas alteradas o se producen a altos niveles.

En esta memoria se describen y proporcionan células hospedadoras genéticamente modificadas que comprenden al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteasa de expresión de eliminación (KEX) (Kex2p) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de proteasa Kex2p y al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteína disulfuro isomerasa (PDI) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Pdi1. La célula hospedadora genéticamente modificada de la presente descripción incluye células hospedadoras genéticamente modificadas que comprenden al menos un polinucleótido aislado que codifica oxidorreductina del retículo endoplasmático (erol) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de ERO.

Las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente descripción también incluyen células hospedadoras genéticamente modificadas que expresan o sobreexpresan al menos un producto génico de al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteína y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de dicha proteína seleccionada entre: Kex2p, Pdi1 o Ero1 cuando dicha célula hospedadora genéticamente modificada se cultiva en un cultivo celular,, en comparación con una segunda célula hospedadora, en donde dicha segunda célula hospedadora no expresa o sobreexpresa al menos un producto génico seleccionado entre KEX, PDI y ERO. En la presente descripción también se incluyen células hospedadoras genéticamente modificadas que sobreexpresan al menos dos proteínas o fragmentos y/o variantes de las mismas que tienen al menos una actividad funcional de dicha proteína seleccionada entre: Kex2p, Pdi1 o Ero1 cuando dicha célula hospedadora genéticamente modificada se cultiva en cultivo celular, en comparación con una segunda célula hospedadora en donde dicha segunda célula hospedadora es de la misma especie y se cultiva en las mismas condiciones de cultivo celular, pero no sobreexpresa al menos dos productos génicos seleccionados entre KEX, PDI y ERO. En algunos casos, la segunda célula hospedadora puede tener una modificación genética, pero no tiene modificaciones genéticas que permitan que exprese o sobreexprese al menos un producto génico de al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteína y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de dicha proteína seleccionada entre: Kex2p, Pdi1 o Ero1. En algunos casos, la segunda célula hospedadora puede ser una célula de tipo silvestre (es decir, sin modificaciones genéticas) de la misma especie que la célula hospedadora modificada. En algunos casos, el segundo hospedador puede contener todas las mismas modificaciones genéticas que la célula hospedadora genéticamente modificada, excepto por que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína y/o una variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de dicha proteína seleccionada entre: Kex2p, Pdi1 o Ero1. En la presente descripción también se contemplan células hospedadoras que se modifican genéticamente para aumentar la expresión de polipéptidos endógenos, lo que incluye, pero sin limitación: Kex2p, Pdi1 y Ero1 a partir de genes ya contenidos en la célula hospedadora.

En otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan células hospedadoras genéticamente modificadas que comprenden además al menos una de las siguientes modificaciones genéticas: supresión génica de la proteasa pep4, menor actividad de ubc4 y/o ubc5 en comparación con la célula hospedadora de tipo silvestre, supresión génica de yps1, supresión génica de hsp150 y supresión génica de pmt1. Se ha observado que estas modificaciones genéticas aumentan las capacidades de secreción de seroalbúmina humana recombinante y reducen las modificaciones postraduccionales.

Las cepas de levadura usadas en la producción de proteínas de fusión a albúmina incluyen, pero sin limitación, D88, DXY1 y BXP10. D88 [leu2-3, leu2-122, can1, pra1, ubc4] es un derivado de la cepa precursora AH22his.sup.+ (también conocida como DB1; véase, p. ej., Sleep et al. Biotechnology 8:42-46 (1990)). La cepa contiene una mutación de leu2 que permite la selección auxotrófica de plásmidos de 2 micrómetros que contienen el gen LEU2. D88 también muestra una depresión de PRB1 en presencia de un exceso de glucosa. El promotor PRB1 está normalmente controlado por dos puntos de control que controlan los niveles de glucosa y la etapa de crecimiento. El promotor se activa en la levadura de tipo silvestre tras el agotamiento de la glucosa y la entrada en fase estacionaria. La cepa D88 muestra la represión por glucosa, pero mantiene la inducción tras la entrada en la fase estacionaria. El gen PRA1 codifica una proteasa vacuolar de levadura, YscA endoproteasa A, que está localizada en el RE. El gen UBC4 se encuentra en la vía de ubiquitinación y está implicado en el direccionamiento a proteínas de corta vida y anormales para la degradación dependiente de ubiquitina. Se observó que el aislamiento de esta mutación ubc4 aumenta el número de copias de un plásmido de expresión en la célula y provoca un nivel aumentado de expresión de una proteína deseada expresada a partir del plásmido (véase, p. ej., la Publicación Internacional n.° W099/00504, que se incorpora a la presente memoria por referencia en su totalidad).

DXY1, un derivado de D88, tiene el siguiente genotipo: [leu2-3, leu2-122, can1, pra1, ubc4, ura3:yap3]. Además de las mutaciones aisladas en D88, esta cepa también tiene una supresión génica de la proteasa YAP3. Esta proteasa provoca la escisión de restos mayoritariamente dibásicos (RR, RK, KR, KK) pero también puede promover la escisión en restos básicos individuales en las proteínas. El aislamiento de esta mutación de yap3 dio como resultado mayores niveles de producción de HSA de longitud completa (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos n.° 5.965.386 y Kerry-Williams et al., Yeast 14:161-169 (1998), incorporado a esta memoria por referencia en su totalidad).

BXP10 tiene el siguiente genotipo: leu2-3, leu2-122, canl, pral, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp150::LYS2, pmtl::URA3. Además de las mutaciones aisladas en DXY1, esta cepa también tiene una supresión génica del gen PMT1 y del gen HSP150. El gen PMT1 es un miembro de la familia evolutivamente conservada de las dolichil-fosfato-D-manosa proteína O-manosiltransferasas (Pmt). La topología transmembrana de Pmt1 p sugiere que es una proteína integral de membrana del retículo endoplasmático con un papel en la glucosilación unida a O. Esta mutación tiene la función de reducir/eliminar la glucosilación unida a O de las fusiones con HSA (véase, p. ej., la Publicación Internacional n.° WO00/44772, que se incorpora a la presente memoria por referencia en su totalidad). Diversos estudios han revelado que la proteína Hsp150 se separa de manera no eficiente de rHA mediante cromatografía de intercambio iónico. La mutación en el gen HSP150 elimina un potencial contaminante que resulta difícil de eliminar mediante técnicas de purificación convencionales. Véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos n.° 5.783.423, que se incorpora a la presente memoria por referencia en su totalidad.

Las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente descripción incluyen, pero sin limitación, células fúngicas, células de levadura y células de mamífero. Las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente descripción incluyen, pero sin limitación: Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia. Las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente descripción también incluyen, pero sin limitación, S. cerevisiae.

Las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente invención pueden comprender además al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido recombinante. Los polinucleótidos capaces de expresar al menos un polipéptido heterólogo incluyen, pero sin limitación, vectores, ADN transformado en el genoma de la célula hospedadora, virus o parte de un virus y/o plásmidos. Los polinucleótidos capaces de expresar un polipéptido heterólogo pueden transformarse en el genoma de la célula hospedadora y/o pueden formar parte de un vector de expresión y/o un sistema de expresión episómico.

En algunos aspectos de la presente invención, el ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante está contenido en un plásmido. En otros aspectos, el ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante se transforma en el genoma de la célula hospedadora de la presente invención.

Como se entiende en la técnica, el ADN puede transformarse en una célula hospedadora mediante varios métodos diferentes. En levaduras, puede usarse cualquier método conveniente de transferencia de ADN, tal como electroporación, el método de cloruro de litio, el método de acetato de litio o el método de esferoplastos. Para producir una cepa estable adecuada para la fermentación de alta densidad, es deseable integrar el ADN en el cromosoma hospedador. La integración se produce mediante recombinación de homólogos, usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el ADN capaz de expresar al menos una proteína heteróloga puede proporcionarse con secuencias flanqueantes homólogas a secuencias del organismo hospedador. De esta manera, la integración se produce en un sitio definido en el genoma hospedador, sin la alteración de genes deseables o esenciales. Además y como alternativa, el ADN capaz de expresar al menos una proteína heteróloga se integra en el sitio de un gen no deseado en un cromosoma hospedador, efectuando la alteración o eliminación del gen o la expresión de dicho producto génico.

La expresión aumentada o sobreexpresión de un producto génico puede lograrse integrando copias adicionales de ADN capaces de expresar el producto génico en el cromosoma hospedador. Además y como alternativa, el ADN que codifica el producto génico puede unirse operativamente a un promotor fuerte y el casete de expresión completo puede integrarse en el cromosoma hospedador en un sitio definido. Por ejemplo, la integración del ADN que codifica Kex2p, Pdi1 o Ero1 unido operativamente a un promotor fuerte (p. ej., el promotor PGK1) en el sitio de NTS2-2 permite la sobreexpresión del producto génico respectivo. En otras realizaciones, puede introducirse ADN en el hospedador por medio de un cromosoma, plásmido, vector retrovírico o integración aleatoria en el genoma hospedador.

Las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente invención incluyen células hospedadoras genéticamente modificadas, en donde se une operativamente un polinucleótido aislado que codifica la proteasa kex o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Kex2p a al menos un promotor seleccionado entre el grupo de: TEF1, PRB1 ADH1, ADH2, PYK1, PGK1, ENO, GAL1.10.7, GALS, MET25, CUP1, PHO5, tetO-CYCl, CaMV, HXT6, HXT7 y ARE. De manera adecuada, el promotor es PGK1. Las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente invención también incluyen células hospedadoras genéticamente modificadas, en donde se une operativamente un polinucleótido aislado que codifica PDI o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Pdi1 a al menos un promotor seleccionado entre el grupo de: TEF1, PRB1 ADH1, ADH2, PYK1, PGK1, ENO, GAL1.10.7, GALS, MET25, CUP1, PHO5, tetO-CYC1, CaMV, HXT6, HXT7 y ARE. De manera adecuada, el promotor es PGK1. Adicionalmente, las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente invención incluyen células hospedadoras genéticamente modificadas, en donde se une operativamente un polinucleótido aislado que codifica ERO o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de ERO a al menos un promotor seleccionado entre el grupo de TEF1, PRB1 ADH1, ADH2, PYK1, PGK1, ENO, GAL1.10.7, GALS, MET25, CUP1, PHO5, tetO-CYCl, CaMV, HXT6, HXT7 y ARE. De manera adecuada, el promotor es PGK1.

En otro aspecto, el polipéptido recombinante expresado en las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente invención tiene al menos un enlace disulfuro. En algunos aspectos, el polipéptido recombinante es una proteína de fusión a albúmina. En algunos aspectos, el polipéptido recombinante comprende al menos un polipéptido terapéutico que tiene actividad GLP-1 conjugado a albúmina.

En algunos aspectos, al menos un fragmento y variante de GLP-1 comprende GLP-1(7-36(A8G)) y está fusionado genéticamente a seroalbúmina humana. En una realización adicional, los polipéptidos de la invención comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o más moléculas orientadas en tándem de GLP-1 y/o fragmentos y/o variantes de las mismas fusionadas al extremo N o C-terminal de seroalbúmina humana o una variante de la misma. Otras realizaciones tienen dichos polipéptidos de A8G fusionados al extremo N o C-terminal de albúmina o una variante de la misma. Un ejemplo de dos fragmentos y/o variantes de GLP-1(7-36)(A8G) orientados en tándem fusionados al extremo N-terminal de la seroalbúmina humana comprende la SEQ ID NO: 1, que se presenta en la figura 3. En otro aspecto, al menos un fragmento y variante de GLP-1 comprende al menos dos GLP-1(7-36(A8G)) en tándem y fusionados genéticamente a la seroalbúmina humana. Al menos dos GLP-1 (7-36(A8G)) pueden estar fusionados genéticamente al extremo N-terminal de la seroalbúmina humana. Al menos un polipéptido que tiene actividad GLP-1 puede comprender la SEQ ID NO: 1.

Las variantes de GLP-1 (7-37) pueden anotarse, por ejemplo, como Glu22-GLP-1 (7-37)OH, que indica una variante de GLP-1 en la que se ha reemplazado la glicina normalmente encontrada en la posición 22 de GLP-1 (7-37)OH por ácido glutámico; Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH indica un compuesto de GLP-1 en el que se han reemplazado la alanina normalmente encontrada en la posición 8 y la glicina normalmente encontrada en la posición 22 de GLP-1(7-37)OH por valina y ácido glutámico, respectivamente. Los ejemplos de variantes de GLP-1 incluyen, pero sin limitación, Val8-GLP-l(7-37)OH Gly8-GLP-l(7-37)OH Glu22-GLP-1(7-37)0- H

Asp22-GLP-1(7-37)OH Arg22-GLP-l(7-37)OH Lys22-GLP-1(7-37)OH

Cys22-GLP-1(7-37)OH Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH Val8-Asp22-GLP-1 (7-37)0H

Val8-Arg22-GLP-l(7-37)OH Val8-Ly s22-GLP-1(7-37)OH Val8-Cys22-GLP-1 (7-37)OH Gly8-Glu22-GLP-l(7-37)OH Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH Gly8-Arg22-GLP-1 (7-37)0H Gly8-Lys22-GLP-l(7-37)OH Gly8-Cy s22-GLP-1(7-37)OH Glu22-GLP-1(7-36)0H

Asp22-GLP-1(7-36)OH Arg22-GLP-l(7-36)OH Lys22-GLP-1(7-36)OH

Cys22-GLP-1(7-36)OH Val8-Glu22-GLP-1(7-36)OH Val8-Asp22-GLP-1 (7-36)0H Val8-Arg22-GLP-l(7-36)OH Val8-Ly s22-GLP-1(7-36)OH Val8-Cys22-GLP-1 (7-36)OH Gly8-Glu22-GLP-l(7-36)OH Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)OH Gly8-Arg22-GLP-1 (7-36)0H Gly8-Lys22-GLP-l(7-36)OH Gly8-Cys22-GLP-l(7-36)OH Lys23 -GLP-1(7-37)0H

Val8-Lys23-GLP-l(7-37)OH Gly8-Lys23-GLP-l(7-37)OH His24-GLP-1(7-37)OH

Val8-His24-GLP-1(7-37)OH Gly8-His24-GLP-1(7-37)OH Lys24-GLP-1(7-37)OH

Val8-Lys24-GLP-l(7-37)OH Gly8-Lys23-GLP-l(7-37)OH Glu30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH Asp30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Asp30-GLP-1(7-37)OH Gln30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Gln30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Gln30-GLP-1(7-37)OH Tyr30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH Ser30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Ser30-GLP-1(7-37)OH His30-GLP-1(7-37)OH

Val8-His30-GLP-1(7-37)OH Gly8-His30-GLP-1(7-37)OH Glu34-GLP-1(7-37)0H

Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH Gly8-Glu34-GLP-l(7-37)OH Ala34-GLP-1(7-37)OH

Val8-Ala34-GLP-l(7-37)OH Gly8-Ala34-GLP-l(7-37)OH Gly34-GLP-l(7-37)OH

Val8-Gly34-GLP-l(7-37)OH Gly8-Gly34-GLP-l(7-37)OH Ala35-GLP-1(7-37)OH

Val8-Ala35-GLP-l(7-37)OH Gly8-Ala35-GLP-l(7-37)OH Lys35-GLP-1 (7-37)OH

Val8-Lys35-GLP-l(7-37)OH Gly8-Lys35-GLP-l(7-37)OH His35-GLP-1 (7-37)OH

Val8-His35-GLP-1(7-37)OH Gly8-His35-GLP-l(7-37)OH Pro35-GLP-1(7-37)OH

Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH Gly8-Pro35-GLP-l(7-37)OH Glu35-GLP-1(7-37)OH

Gly8-Glu35-GLP-l(7-37)OH Val8-Ala27-GLP-1 (7-37)OH Val8-His37-GLP-1(7-37)0H

Val8-Glu22-Lys23-GLP-l(7-37)OH Val8-Glu22-Glu23-GLP-l(7-37)OH Val8-Glu22-Ala27-GLP-l(7-37)OH Val8-Gly34-Lys35-GLP-l(7-37)OH Val8-His37-GLP-1 -(7-37)OH Gly8-His37-GLP-1 (7-37)OH

Val8-Glu22-Ala27-GLP-1 (7-37)OH Gly8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH Val8-Lys22-Glu23-GLP-l(7-37)OH Gly8-Lys22-Glu23-GLP-l(7-37)OH. Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH

Las variantes de GLP-1 también pueden incluir, pero sin limitación, GLP-1 o fragmentos de GLP-1 que tienen modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácidos. Una modificación química incluye, pero sin limitación, añadir restos químicos, crear nuevos enlaces y retirar restos químicos. Las modificaciones en los grupos laterales de aminoácidos incluyen, sin limitación, acilación de los grupos lisina-s-amino, N-alquilación de arginina, histidina o lisina, alquilación de grupos ácido carboxílico glutámico o aspártico y desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones de los grupos amino terminales incluyen, sin limitación, las modificaciones des-amino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo. Las modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de amida, amida de alquilo inferior, dialquil amida y éster de alquilo inferior. Además, se pueden proteger uno o más grupos laterales o grupos terminales mediante grupos protectores conocidos por el bioquímico normalmente versado en la materia.

Los fragmentos o variantes de GLP-1 también pueden incluir polipéptidos en los que se han añadido uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o al extremo C-terminal de GLP-1(7-37)OH de dicho fragmento o variante. Los aminoácidos en GLP-1 en los que se han añadido aminoácidos al extremo N-terminal o al extremo C-terminal se anotan mediante el mismo número que el aminoácido correspondiente en GLP-1 (7-37)OH. Por ejemplo, el aminoácido N-terminal de un compuesto de GLP-1 obtenido añadiendo dos aminoácidos al extremo N-terminal de GLP-1 (7-37)OH se encuentra en la posición 5; y el aminoácido C-terminal de un compuesto de GLP-1 obtenido añadiendo un aminoácido al extremo C-terminal de GLP-1 (7-37)OH se encuentra en la posición 38. Por lo tanto, la posición 12 está ocupada por fenilalanina y la posición 22 está ocupada por glicina en estos dos compuestos de GLP-1, así como en GLP-1 (7-37)OH. Los aminoácidos 1-6 de un GLP-1 con aminoácidos añadidos al extremo N-terminal pueden ser iguales que o una sustitución conservativa del aminoácido en la posición correspondiente de GLP-1 (1-37)OH. Los aminoácidos 38-45 de un GLP-1 con aminoácidos añadidos al extremo C-terminal pueden ser iguales que o una sustitución conservativa del aminoácido en la posición correspondiente del glucagón o de exendina-4.

En otro aspecto, el al menos un polipéptido que tiene actividad GLP-1 comprende al menos un fragmento y/o variante de GLP-1 humano fusionado con seroalbúmina humana. En otro aspecto, al menos un fragmento y variante de GLP-1 comprende GLP-1(7-36(A8G)).

El al menos un fragmento y variante de GLP-1 se fusiona genéticamente a seroalbúmina humana. En otro aspecto, el polipéptido recombinante de la presente invención comprende al menos dos GLP-1 (7-36(A8G)) en tándem y fusionados genéticamente a la seroalbúmina humana. Los dos GLP-1 (7-36(A8G)) están genéticamente fusionados al extremo N-terminal de la seroalbúmina humana. En algunos casos, el polipéptido recombinante comprende la SEQ ID NO: 1.

En una realización de la presente invención, el polipéptido recombinante comprende un polipéptido que tiene un 99 % de identidad de secuencia respecto del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 1 o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que está truncado en el extremo C-terminal y/o en el extremo N-terminal. En un aspecto, el polipéptido recombinante tiene actividad GLP-1. En un aspecto, el polipéptido está truncado en el extremo N-terminal por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1 o un polipéptido que tiene un 99 % de identidad de secuencia respecto de la SEQ ID NO: 1 a lo largo de la secuencia completa. En un aspecto, el polipéptido recombinante está truncado en el extremo N-terminal por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1 o un polipéptido que tiene un 99 % de identidad de secuencia respecto de la SEQ ID NO: 1 a lo largo de la secuencia completa.

En otra realización más, al menos un polipéptido recombinante expresado en las células hospedadoras de la invención comprende uno o más de los siguientes: al menos una proteína de unión a antígeno, al menos un dominio variable individual y/o al menos un anticuerpo de dominio. Los polipéptidos que comprenden al menos un dominio de unión a antígeno también pueden comprender al menos un polipéptido y/o agonista y/o antagonista de receptor peptídico. En algunos casos, el agonista polipeptídico puede ser un agonista de receptor de GLP-1. Como se entiende en la técnica, puede expresarse más de un polipéptido recombinante en la misma célula. A modo de ejemplo, puede expresarse un polipéptido recombinante que tiene actividad GLP-1 en la misma célula que una proteína de unión a antígeno. El polipéptido que tiene actividad GLP-1 puede expresarse a partir del mismo polinucleótido que la proteína de unión a antígeno, unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión. Como alternativa y a modo de ejemplo, puede expresarse un polipéptido que tiene actividad GLP-1 de manera independiente de un segundo polipéptido recombinante, tal como una proteína de unión a antígeno, ya sea a partir del mismo ADN episómico o genoma pero unido operativamente a diferentes secuencias de polinucleótido necesarias para la expresión o a partir de secuencias de ADN ubicadas en vectores separados.

También se describen células hospedadoras genéticamente modificadas que comprenden al menos un polipéptido aislado que codifica una proteasa de expresión de eliminación (KEX) (Kex2p) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Kex2p, al menos un polipéptido aislado que codifica una proteína disulfuro isomerasa (Pdi1) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de PDI y al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una oxidorreductina del retículo endoplasmático (Ero1) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de ERO. La célula hospedadora genéticamente modificada de la presente descripción comprende al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante. En otro aspecto de la presente descripción, la célula hospedadora genéticamente modificada aumenta la expresión de dicho polipéptido recombinante cuando se cultiva en un cultivo celular, en comparación con una célula hospedadora de la misma especie y con las mismas modificaciones genéticas, pero que no comprende al menos una secuencia de polinucleótido aislada que codifica una proteasa de expresión de eliminación (KEX) Kex2p o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de KEX, al menos un polinucleótido aislado que codifica una proteína disulfuro isomerasa (Pdi 1) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Pdi1 y al menos un polinucleótido aislado que codifica una oxidorreductina del retículo endoplasmático (Ero1) o un fragmento y/o variante de la misma que tiene al menos una actividad funcional de Ero1. En algunos casos, la célula hospedadora genéticamente modificada es S. cerevisiae.

En otro aspecto, el polipéptido recombinante expresado en la célula hospedadora genéticamente modificada de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia respecto de la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para producir un polipéptido recombinante que comprenden cultivar una célula hospedadora genéticamente modificada de la presente invención, comprendiendo además los métodos recuperar dicho polipéptido recombinante del medio de cultivo. En otros aspectos, se proporciona un polipéptido recombinante producido mediante dichos métodos. En otro aspecto, el polipéptido recombinante producido mediante métodos de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 99 % de identidad de secuencia respecto de la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, el polipéptido recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, el polipéptido recombinante comprende una secuencia líder. En un aspecto, la secuencia líder es una secuencia líder de KEX modificada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. Como se entiende en la técnica, la célula hospedadora y las condiciones de cultivo celular pueden afectar al producto final de la proteína recombinante producida por una célula hospedadora. Por ejemplo, las modificaciones postraduccionales pueden efectuarse según el tipo de célula hospedadora y las condiciones de cultivo celular. Estas modificaciones postraduccionales que incluye, pero sin limitación, glucosilación y metilación de una proteína recombinante pueden afectar a aspectos tales como, pero sin limitación, el plegamiento de la proteína y la actividad de la proteína o a la potencia de la proteína recombinante producida por dicha célula hospedadora.

En otro aspecto más de la presente descripción, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido preparado mediante los métodos de la presente invención. También se describen métodos para tratar a un paciente que lo necesite, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición farmacéutica. En algunos casos, el paciente tiene una enfermedad o afección seleccionada entre: diabetes de tipo I, diabetes de tipo II, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, enfermedad de Alzheimer, obesidad, trastorno cardiovascular, insuficiencia cardíaca congestiva y retinopatía.

Como se emplea en esta memoria, "polipéptido terapéutico" se refiere a proteínas, polipéptidos, anticuerpos, péptidos o fragmentos o variantes de los mismos, que tienen una o más actividades terapéuticas y/o biológicas y en particular, al menos una actividad biológica que es útil para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad. Los polipéptidos terapéuticos abarcados por la invención incluyen, pero sin limitación, proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos y agentes biológicos. (Los términos péptidos, proteínas y polipéptidos se emplean indistintamente en esta memoria). Una lista no exclusiva de actividades biológicas que puede poseer un polipéptido terapéutico incluye, cualquiera de las actividades de GLP-1 descritas en el presente documento, potenciación de la respuesta inmunitaria, promoción de la angiogénesis, inhibición de la angiogénesis, regulación de la función endocrina, regulación de las funciones hematopoyéticas, estimulación del crecimiento nervioso, potenciación de la respuesta inmunitaria o inhibición de una respuesta inmunitaria.

Como se emplea en esta memoria, un "paciente" es un animal, preferiblemente un mamífero y lo más preferiblemente un ser humano, con una enfermedad, trastorno o afección.

Como se emplea en esta memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección. La cantidad de la composición farmacéutica de la invención que será eficaz en el tratamiento, la inhibición y la prevención de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión aberrante y/o la actividad de un polipéptido terapéutico puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, opcionalmente, para ayudar a identificar intervalos de dosis óptimos, pueden emplearse ensayos in vitro. La dosis exacta que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o del trastorno y según las circunstancias de cada paciente, será el médico a cargo del tratamiento quien decida la dosis. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosis obtenidas de sistemas de ensayo in vitro o en modelos animales.

Como se emplea en esta memoria, una "composición farmacéutica" comprende un polipéptido terapéutico y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o indicado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y más particularmente, en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los procedentes de petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, en particular para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponadores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores convencionales, tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o el polipéptido terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador a fin de proporcionar la forma para la administración adecuada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

Como se entiende en la técnica, "cultivar en cultivo celular" y las variaciones gramaticales de este se refiere a inocular un medio nutriente con células hospedadoras e incubar el cultivo celular, normalmente en condiciones óptimas o convencionales para el crecimiento de la célula hospedadora particular, para permitir que las células crezcan y/o se dividan. Como se entiende en la técnica, la actividad enzimática de una o más enzimas producidas por las células hospedadoras en cultivo puede verse afectada por las condiciones de crecimiento del cultivo. Por ejemplo, puede reducirse la actividad proteolítica de una proteasa producida por una célula hospedadora en cultivo, alterando una o más de las siguientes condiciones: pH, oxígeno disuelto, temperatura, osmolaridad, uno o más componentes del medio, inhibidores de proteasas específicos, tiempo y/o tasa de cultivo, concentración celular, duración del cultivo y/o velocidad de alimentación de glucosa (p. ej., cultivo discontinuo alimentado). La adición de complejos hidrolizados de proteínas al cultivo puede ser especialmente eficaz para inhibir la proteólisis. Por otra parte, pueden alterarse las condiciones en uno o más puntos específicos durante el cultivo, de tal forma que se maximiza el efecto. De manera similar, la glucosilación de proteínas producidas en cultivo puede verse afectada por factores similares. Por lo tanto, las condiciones de cultivo celular para reducir o aumentar la actividad enzimática de una célula hospedadora, tal como la actividad proteolítica o de glucosilación, en cultivo pueden optimizarse ajustando uno o más de los factores no limitantes nombrados anteriormente.

Asimismo, como se entiende en la técnica, la producción de proteína heteróloga y/o proteína recombinante en una célula hospedadora puede aumentarse controlando muchos de los mismos factores indicados anteriormente. Además, la adición de factores que aumentan el número de copias del vector, lo que incluye, pero sin limitación, la adición de rapamicina al medio de crecimiento, también pueden aumentar la producción. Otros factores que pueden aumentar la producción incluyen, pero sin limitación, la coexpresión de una o más proteínas chaperonas, tales como proteína disulfuro isomerasa (PDI). Adicionalmente, puede coexpresarse hemoglobina (HB) con al menos un polipéptido heterólogo en una célula hospedadora para potenciar la disponibilidad de oxígeno para el metabolismo oxidativo, de este modo, aumentando la producción de polipéptido.

En otro aspecto, el polipéptido recombinante expresado a partir de las células hospedadoras genéticamente modificadas de la presente invención comprende una secuencia líder. En algunos aspectos, la secuencia líder es una secuencia líder de KEX2 o una secuencia líder de KEX2 modificada.

La secuencia líder de KEX de tipo silvestre se muestra a continuación como la SEQ ID NO: 9.

Met Lys Trp Val Ser Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr

Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg (SEQ ID NO:9)

En algunos casos, se usa una secuencia líder de KEX modificada mostrada como la SEQ ID NO: 10.

Met Lys Trp Val Ser Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Gly

Ser Leu Asp Lys Arg (SEQ ID NO:10)

En algunos casos, la secuencia líder de KEX puede tener un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia respecto de la SEQ ID NO: 9 a lo largo de la secuencia completa.

Las proteínas heterólogas o las proteínas recombinantes que se secretan por una célula hospedadora durante la producción pueden comprender una secuencia líder que facilita la secreción. Las secuencias líder pueden modificarse para mejorar la secreción y por tanto la producción general y la recuperación de la proteína expresada de manera heteróloga; por ejemplo, pueden unirse operativamente diferentes secuencias líder de diversas proteínas secretadas a la proteína heteróloga y se evalúa su expresión potenciada. Como alternativa, una secuencia líder determinada puede modificarse mediante mutagénesis de sitio dirigido o mediante una estrategia de biblioteca combinatoria para identificar una variante de secuencia líder mejorada. Puede observarse que las secuencias líder quiméricas procedentes de dos o más péptidos líder mejoran el nivel de expresión de proteína heteróloga.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran varios aspectos no limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1 - Cepa de S. cerevisiae que sobreexpresa KEX2, PDI1 y EROI

Se construyó una cepa de S. cerevisiae que sobreexpresa KEX2, PDI1 y ERO1 usando un sistema de expresión de hospedador de levadura (S. cerevisiae BXP10) desarrollado en Delta Biotechnology Ltd. (Delta) en Nottingham, Reino Unido. BXP10 procedía de la cepa AH22 de S. cerevisiae, obtenida de la ATCC, que procedía de s288c. La construcción de BXP10 implicó una serie de mutagénesis aleatorias y de alteraciones génicas específicas dirigidas para aumentar las capacidades de secreción de seroalbúmina humana recombinante (rHSA) y reducir las modificaciones postraduccionales no deseadas.

La figura 1 muestra la creación de BXP10-KEX2-PDI1-ERO1, una cepa que sobreexpresa KEX2, PDI1 y ERO1. Se integraron secuencialmente casetes de expresión que contienen KEX2-KanMX unido operativamente al promotor de PGK1, PDI-HphMX unido operativamente al promotor de PGK1 o ERO-BsdMX unido operativamente al promotor de PGK1 en los loci de NTS2-2 (región espaciadora no transcrita en las repeticiones de ADNr) de BXP10, de tal forma que se crearon las siguientes cepas: BXP10-KEX2 (cepa que sobreexpresa KEX2), BXP10-KEX2-PDI1 (cepa que sobreexpresa KEX2 y PDI1) y BXP10-KEX2-PDI1-ERO1 (cepa que sobreexpresa k Ex 2, PDI1 y EROI).

Para construir el casete de expresión de KEX2, se amplificaron individualmente mediante la PCR el ORF de KEX2, el promotor del gen PGK1 (Ppgki) y la secuencia de terminación de la transcripción del gen ADH1 (Tadhi) a partir de ADN genómico de BXP10 y se ensamblaron posteriormente usando otra reacción PCR (una reacción PCR de "costura" o "fusión"). El fragmento de PpGK1-KEX2-Tadhi ensamblado se clonó en pRS314KanMX para generar pRS314KanMXpPGK1 -KEX2. Este plásmido se usó como el molde en una ronda final de PCR para añadir secuencias flanqueantes 5' y 3' (105 pb y 101 pb, respectivamente) que son homólogas a los sitios de integración de NTS2-2. El fragmento de a Dn resultante se transformó en la cepa hospedadora BXP10 mediante electroporación y se sembró en placas que contenían G418. Se confirmó adicionalmente que los clones resistentes a G418 eran positivos para el sitio de integración específico mediante PCR para colonias.

El plásmido pRS314HphMXpPGK1-PDI1 que porta el casete de expresión de PDI1 se construyó reemplazando el ORF de KEX2 y las regiones de KanMX en pRS314KanMXpPGK1-KEX2 con el ORF de PDI1 y el marcador de resistencia a higromicina B, HphMX amplificados mediante la PCR. Este plásmido se usó como el molde en una ronda final de PCR para añadir secuencias flanqueantes 5' y 3' (105 pb y 101 pb, respectivamente) que son homólogas a los sitios de integración de NTS2-2. El fragmento de ADN resultante se transformó en las cepas hospedadoras BXP10-KEX2 mediante electroporación y se sembraron en placas que contenían higromicina B. Se confirmó adicionalmente que los clones resistentes a la higromicina B eran positivos para la integración de sitio específico mediante PCR para colonias.

El ORF de ERO1 se amplificó a partir del ADN genómico de BXP10 mediante la PCR y después se clonó adicionalmente en pRS314pPGKlBsdMX para producir pRS314BsdMXpPGK1-ERO1. Este plásmido se usó como el molde en una ronda final de PCR para añadir secuencias flanqueantes 5' y 3' (105 pb y 101 pb, respectivamente) que son homólogas a los sitios de integración de NTS2-2. El fragmento de ADN resultante se transformó en la cepa hospedadora BXP10-KEX2-PDI1 mediante electroporación y se sembró en placas que contenían blasticidina S. Se confirmó adicionalmente que los clones resistentes a la blasticidina eran positivos para la integración de sitio específico mediante PCR para colonias.

La figura 2 muestra el análisis mediante transferencia de Southern que confirma la integración de KEX2 y PDI1 en los loci de NTS2-2 de BXP10, para crear las cepas BXP10-KEX2 y BXP10-KEX2-PDI1. Para KEX2, la banda de 2,6 kb corresponde a la copia de KEX2 endógena y la banda de 1,6 kb corresponde a la copia integrada con éxito. Para PDI1, la banda de 1,3 kb corresponde a la copia de PDI1 endógena y la banda de 1,7 kb corresponde a la copia integrada con éxito.

La figura 3 muestra el análisis por transferencia de Western de PDI1 y KEX2 que muestra la sobreexpresión de PDI1 y KEX2 en los clones de BXP10-KEX2-PDI1. Entre los cinco clones de BXP10-KEX2-PDI1, el clon n.° 2 mostró la máxima expresión tanto de PDI1 como de KEX2 y por tanto, se seleccionó como la cepa hospedadora para construir BXP10 -KEX2-PD11 -EROP.

Después, las cepas hospedadoras se transformaron con el plásmido pCID3610, que contiene una proteína de fusión recombinante ("proteína pCID3610") que consiste en dos copias del péptido 1 similar a glucagón humano (GLP-1, fragmento 7-36(A8G)) y albúmina humana recombinante (rHA). Cada secuencia de GLP-1 se ha modificado con una alanina de origen natural sustituida por una glicina en la posición 8 para conferir resistencia a la proteólisis. La segunda secuencia de GLP-1 funciona como espaciador peptídico entre la primera secuencia de GLP-1 y rHA. La proteína pCID3610 es una proteína no glucosilada que consiste en 645 aminoácidos y tiene un peso molecular de 72.970,4 Da. pCID3610 se describe en detalle en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.569.384, que se incorpora en la presente memoria en su totalidad.

El plásmido pCID3610 se construyó en Human Genome Sciences en Rockville, MD, usando el vector de expresión basado en pSAC35. pSAC35 contiene el gen LEU2 de S. cerevisiae como un marcador de selección que complementa la auxotrofia de leucina en BXP10. pSAC35 también contiene un promotor fuerte de levadura (PRB1), un sitio de clonación único (Notl) y secuencia del plásmido pUC9 de E. coli para permitir la clonación y la propagación en E. coli. Además, pSAC35 es un vector desintegrante y una vez que se transforma en levadura, las secuencias procedentes de pUC9 se cortan mediante recombinación de sitio específico. Esta escisión se logra mediante dianas de reconocimiento de FLP (FRT) y la expresión de la recombinasa FLP ("flip") a partir del plásmido de 2 micrómetros. Otros segmentos en pSAC35 incluyen las regiones REP1 y REP2 del gen D. Los genes REP1 y REP2 codifican productos que ayudan a regular el número de copias de plásmidos y también desempeñan un papel en la segregación del plásmido durante la división celular. El producto del gen D aumenta la expresión de FLP aliviando la represión causada por REP1 y REP2. pCID3610 se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.569.384.

El ADNc de longitud completa de albúmina humana (HA) se aisló a partir de una biblioteca de ADNc humano y se clonó en un plásmido, pAT153ALB, en el laboratorio del Dr. F.E. Baralle en la Universidad de Oxford, Reino Unido. Posteriormente, se modificó pAT 153ALB por Delta introduciendo nuevos sitios de restricción para facilitar la clonación en pSAC35.

El plásmido del vector de expresión, pCID3610, se construyó a partir de pSAC35 mediante la introducción del gen de fusión GLP-1-rHSA ensamblado como se indica a continuación. En primer lugar, se prepararon genes sintéticos que codifican el péptido líder y una variante de GLP-1 madura que tiene una sola sustitución de A a G en la posición 2 del péptido maduro. El péptido de GLP-1 variante se retrotradujo usando codones óptimos para levadura y se sintetizaron copias en tándem mediante la PCR usando oligonucleótidos solapantes. Este gen sintético se usó como molde en una segunda ronda de PCR para añadir sitios de restricción 5' y 3' para permitir su clonación en el extremo 5' del gen de rHSA. Finalmente, se logó una secuencia codificante de péptido de señal en el extremo 5' de la construcción de GLP-1. El fragmento resultante se ligó en pSAC35 en el sitio único de NotI y se transformó en DH5a, dando como resultado el vector de expresión pCID3610. Se confirmó la secuencia de nucleótidos de pCID3610. A continuación, se transformó pCID3610 nuevamente en DH5a para su amplificación adicional y el aislamiento del ADN plasmídico.

Para construir la cepa BXP10-KEX2-PDI1-ERO1 que expresa pCID3610, se transformó pCID3610 en BXP10-KEX2-PDI-ERO1 mediante electroporación y después se sembraron las células en placas de ESFM2 agarosa y las colonias Leu+ se seleccionaron después de 4 días de incubación de las placas a 30C. Se sembraron en hileras doce (12) colonias de transformantes en placas de ESFM2 agarosa para obtener colonias individuales. Se inoculó una colonia de cada hilera en medio ESFM2 para la exploración sistemática usando placas de cultivo de 24 pocillos profundos.

Después de 3 días de incubación con agitación, se analizó el sobrenadante de cada uno de los 12 cultivos clonales en SDS-PAGE. La figura 4 muestra la SDS-PAGE de las 12 muestras de sobrenadante. A continuación, se seleccionaron 4 clones de los 12 clones (clon n.° 2, clon n.° 8, clon n.° 10 y clon n.° 12) para pruebas de fermentación adicionales (los clones seleccionados marcados con flechas en la figura 4). Debido a la evaporación variable del medio de cada pocillo en la placa de cultivo, los cuatro clones se seleccionaron tomando en consideración el volumen final de cada cultivo al final del cultivo celular, la medición de la DO del cultivo celular y la intensidad de bandas en el gel de SDS-PAGE.

Posteriormente, se evaluaron los cuatro clones seleccionados en minibiorreactores DASGIP usando un programa de fermentación y se compararon los rendimientos de título y la calidad de la proteína resultantes con los de BXP10 que expresa pCID3610, una cepa hospedadora que no sobreexpresa KEX2, PDI1 y ERO1. La figura 5 muestra el análisis del rendimiento de título y la calidad de proteína de la proteína producida en el ciclo de fermentación. La calidad de la proteína se mide mediante el porcentaje de producto de proteína que tiene 6 aminoácidos adicionales (6-AA) en el extremo N-terminal debido a la escisión ineficiente de la secuencia líder. El clon n.° 2 y el clon n.° 8 mostraron un aumento significativo en la concentración de proteína pCID3610, en comparación con BXP10 que expresa pCID3610, que tan solo generó hasta 1,6 g/l de proteína pCID3610 en las mismas condiciones de fermentación (los datos para BXP10 que expresa pCID3610 no se muestran en la figura 5). Además, se redujeron significativamente los niveles de 6-AA en todos los clones (<1 % del producto de proteína tiene los 6-AA adicionales) en comparación con los niveles de 6-AA en BXP10 que expresa la proteína pCID3610, que tenía un 4-7 % del producto de proteína con 6-AA adicionales (los datos para BXP10 que expresa pCID3610 no se muestran en la figura 5). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de KEX2, PDI1 y ERO1 había mejorado enormemente la cepa hospedadora (BXP10) para producir más cantidad de proteína pCID3610 de mejor calidad.

Aunque el rendimiento de título y los niveles de 6-AA en el clon n.° 2 y el clon n.° 8 eran comparables, el clon n.° 8 se seleccionó como el clon principal debido a que mostró resultados ligeramente mejores en el ciclo de fermentación. Para confirmar el rendimiento de título mejorado y la calidad de proteína de pCID3610, el clon n.° 8 se empleó en un fermentador de 15 l. El rendimiento de título medio de cuatro (4) lotes de ciclos fue de 2,5 g/l, que representa un aumento del 40-50 % con respecto al rendimiento de título usando BXP10 que expresa pCID3610.

Después se prepararon dos soluciones madre congeladas de BXP10-KEX2-PDI1-ERO1 clon n.° 8. La primera solución madre congelada ("vial de banco celular de investigación") se preparó cultivando el clon n.° 8 en 200 ml de medio ESFM2 que contenía los 3 antibióticos (G418, higromicina y blasticidina). Cuando el cultivo celular alcanzó una DO600 ~3,0, se cosecharon las células, se lavaron, se resuspendieron y se separaron en alícuotas para producir soluciones madre congeladas en trehalosa al 20 %.

Posteriormente, se descongelaron las células del vial del banco celular de investigación y se cultivaron en medio ESFM2 a 30 °C y 250 rpm. La densidad del cultivo se controló midiendo la DO600 del cultivo. La figura 6 muestra la curva de crecimiento de las células. Aproximadamente a DO600 = 2,54, se cosecharon las células, se lavaron y se resuspendieron para producir una segunda solución madre congelada ("banco celular pre-maestro"). La figura 7 muestra la curva de crecimiento de células del banco celular pre-maestro.

Después se evaluó la estabilidad de BXP10-KEX2-PDI1-ERO1 clon n.° 8 mediante estudios de edad celular in vitro y

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una célula hospedadora que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteasa de expresión de eliminación (Kex2p), al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una oxidorreductina del retículo endoplasmático (Ero1) y al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína disulfuro isomerasa (Pdi1), en donde dicha célula hospedadora es una célula de levadura que es Saccharomyces cerevisiae BXP10.

2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicha célula hospedadora sobreexpresa una proteína seleccionada entre: Kex2p, Pdi1 y Ero1 cuando dicha célula hospedadora se cultiva en un cultivo celular.

3. La célula hospedadora de la reivindicación 1 o 2, que comprende al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante.

4. La célula hospedadora de la reivindicación 3, en donde dicho polipéptido recombinante tiene al menos un enlace disulfuro.

5. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en donde dicho polipéptido recombinante es una proteína de fusión a albúmina.

6. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde dicho polipéptido recombinante comprende al menos un polipéptido terapéutico que tiene actividad GLP-1 fusionado genéticamente a albúmina.

7. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde dicho polipéptido recombinante tiene un polipéptido que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1.

8. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en donde dicho polipéptido recombinante comprende una secuencia líder.

9. Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende cultivar una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 y recuperar dicho polipéptido recombinante del medio de cultivo.

10. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha Kex2p tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.

11. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha Pdi1 tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.

12. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha Ero1 tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8.