JPH09509581A - 酵母株および修飾アルブミン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アルブミン、例えばヒトアルブミンが、酵母アスパルチルプロテアーゼ３（Ｙａｐ３ｐ）またはその等価物を欠き、それによって４５ｋＤアルブミン断片の産生を減少させるように変異された酵母で発現および分泌される。それ以上の減少はＫｅｘ２ｐ機能を更に欠失させることで達成される。一方、Ｙａｐ３ｐ開裂をうけにくい修飾アルブミン、例えば、Ｒ４１０Ａ、Ｋ４１３ＱおよびＫ４１４Ｑであるヒトアルブミン、が製造される。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母株および修飾アルブミン 発明の分野 本発明は酵母種による組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）の産生に関する。背景および先行技術 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は血清の浸透圧のかなりの割合に関与する５８ ５アミノ酸のタンパク質であって、内在および外来リガンドのキャリアとしても 機能する。それは臨床的に重度熱傷、ショックまたは血液喪失の患者の治療に用 いられ、現在ヒト血液からの抽出により商業上産生されている。微生物での組換 えヒトアルブミン（ｒＨＡ）の産生は、ＥＰ ３３０ ４５１およびＥＰ ３６ １ ９９１に開示されている。 近年、酵母種はｒＨＡ（Sleep et al,1990,1991 ；Fleer et al,1991）を含め た異種タンパク質（Romanos et al,1992で総説されている）の産生用の宿主生物 として広く用いられている。酵母は容易に遺伝子操作しやすく、単純培地で高細 胞密度まで増殖させることができ、しかも真核細胞として分泌および細胞質ゾル タンパク質の産生に適している。 S.CerevisiaeがｒＨＡを産生するために利用される場合、主要分泌タンパク質 は成熟６７ｋＤａアルブミンである。しかしながら、ｒＨＡの４５ｋＤａ Ｎ末 端断片も観察される（Sleep et al,1990）。類似断片はｒＨＡがKluyveromyces sp.(Sleep et al,1990)およびPichia pastoris（ＥＰ ５１０ ６９３）で発現 されるときに得られる。その断片は成熟ｒＨＡと同様のＮ末端アミノ酸配列を有 するが、カルボキシ末端は異なり、下記のようにｐｈｅ⁴⁰³とＶａｌ⁴⁰⁹との間に あり、最も共通した末端はＬｅｕ⁴⁰⁷およびＶａｌ⁴⁰⁹である（Geisow et al,1991）。 産生される断片の量は、分泌される全ｒＨＡのパーセンテージとして、利用さ れる株および分泌リーダー配列の双方に応じて変わるが、ゼロまで減少されない （Sleep et al,1990）。我々は、高細胞密度発酵（７５〜１００ｇ／ｌ細胞乾燥 重量）で産生される断片の量が振盪フラスコ培養の場合より約５倍高いことも発 見した。 ４５ｋＤａアルブミン断片は血清由来ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で観察さ れず、組換え産物中では非天然同一物質としてその存在は望ましくない。本発明 で扱われる問題は、産物中における４５ｋＤａ断片の量を減少させることである 。最も簡単で明らかなアプローチでは、ＥＰ ５２４ ６８１（特に、第４頁１ ７〜２２行目参照）でGist-brocades により提案されたように、全鎖長アルブミ ンからそれを精製しなければならなかった。しかしながら、我々は異なるアプロ ーチ、即ち初めてその産生を回避する試みを選択した。 Sleep et al(1990)では、ｒＨＡ断片が細胞内で産生されて、細胞外タンパク 質分解の結果ではないと仮定していた。これらの著者はＧｌｕ³⁸²からＳｅｒ⁴¹⁹ でＨＳＡ ｃＤＮＡをコドン最適化したが、これはｒＨＡ断片の産生に効果を有 しなかった。彼らは、ｒＨＡアミノ酸配列に存在しうるＫｅｘ２ｐプロセッシン グ部位Ｌｙｓ⁴¹³Ｌｙｓ⁴¹⁴が断片の異種カルボキシ末端に極めて近接しているが 、ｋｅｘ２宿主株（即ち、Ｋｅｘ２ｐプロテアーゼを産生しないような変異をＫ ＥＸ２遺伝子に有した株）の使用だけでなく、Ｌｙｓ⁴¹⁴に関するコドンの部位 特異的変異誘発による起こりうる開裂部位の除去でもその断片の量を減少させな いと述べた。 （S.cerevisiaeで）ｙｓｃＡ、ｙｓｃＢ、ｙｓｃＹ、ｙｓｃＳ、他の液胞プロ ティナーゼ、ｙｓｃＤ、ｙｓｃＥ、ｙｓｃＦ（ｋｅｘ２ｐに相当）、ｙｓｃα、 ｙｓｃＩＶ、ｙｓｃＧ、ｙｓｃＨ、ｙｓｃＪ、ｙｓｃＥおよびｋｅｘ１を含めて 、望ましいタンパク質産物を原則として分解できる酵母プロテアーゼは多数ある 。 Bourbonnais et al(1991)は一塩基性部位に特異的なS.cerevisiaeエンドプロ テアーゼ活性について記載しており、その例（Ａｒｇ⁴¹⁰）はアルブミンのこの 領域に存在する。この活性は酵母アスパルチルプロテアーゼ３（Ｙａｐ３）によ ることが後でわかり（Bourbonnais et al,1993）、その酵素はそれが対合塩基性 残基の箇所で開裂するという特異性の点でＫｅｘ２ｐと類似したエンドプロテア ーゼとしてEgel-Mitani et al(1990)により初めて記載された。更に研究では、 Ｙａｐ３ｐが一塩基性部位と、塩基性残基対間およびそのＣ末端側を開裂できて 、双方のタイプの部位における開裂が配列関係に依存していることを示唆した（ Azaryan et al,1993；Cawley el al,1993）。 既に開示されたように、ｒＨＡ断片のＣ末端の領域は一塩基性（Ａｒｇ⁴¹⁰） および二塩基性部位（Ｌｙｓ⁴¹³Ｌｙｓ⁴¹⁴）の双方を含んでいる。しかしながら 、Ｋｅｘ２ｐ様タンパク質分解活性がヒト細胞に存在して、一対のアルギニン残 基のＣ末端側にあるＨＳＡのプロ配列の開裂に関与するとしても、上記断片はヒ トで産生されないことが知られている。これは塩基性残基Ａｒｇ⁴¹⁰、Ｌｙｓ⁴¹³ およびＬｙｓ⁴¹⁴がこのＫｅｘ２ｐ様プロテアーゼにより認識されないことを示 し、ひいては分子のこの領域が分泌経路でプロテアーゼに接近できないことを示 唆している。このため、Ｙａｐ３ｐプロテアーゼは４５ｋＤａ断片の産生に関与 していることが予想できなかった。加えて、Egel-Mitani et al(1990，Yeast，6 ,127-137）はＭFαプロフェロモンを開裂する上でＹａｐ３ｐがＫｅｘ２ｐと類 似していることを示した。Ｋｅｘ２ｐ機能の除去だけでは産生される断片の量を 減少させないが、Ｙａｐ３ｐ機能の除去が有益であるとは考えられたなかった。 実際に、Bourbonnais et al(1993)では、ｙａｐ３株がプロソマ トスタチンをプロセッシングする上で減少した能力を有することを示し、したが って異種タンパク質の産生でｙａｐ３株を用いることから離れるように勧めた。発明の概要 上記問題の解決法は、本発明によれば、アルブミンの精製中に断片を除去する よりむしろ、初期発酵で断片の産生を避けるかまたは少くとも減少させることで ある。我々は、これまで存在することが知られた２０種以上の酵母プロテアーゼ の中から、酵母で産生されるｒＨＡの４５ｋＤ断片に主に関与しているのが事実 上Ｙａｐ３ｐプロテアーゼであることを発見した。本発明は、ｒＨＡが酵母種か ら分泌されるときに、産生される４５ｋＤａ断片の量を実質上減少させるための 方法を提供する。断片量の減少は精製プロセスでｒＨＡの回収率を改善し、しか も最終産物の品質を高くする。酵母のｙａｐ３株を用いた更にかつ完全に予想外 な効果は、それらがＹａｐ３ｐ機能を有する株よりも３０〜５０％多くｒＨＡを 産生できることである。この効果は〜１５％から３‐５％へのｒＨＡ断片の減少 によるだけでは説明できない。 このように、本発明の一面では、アルブミンが培地中に分泌されるように培地 で酵母を培養することを含む、アルブミンを産生および分泌するように遺伝子修 飾された酵母からの分泌によりアルブミンを製造するための方法を提供し、この 方法は酵母細胞が減少したレベルの酵母アスパルチルプロテアーゼ３タンパク質 分解活性を有することを特徴とする。 好ましくは、上記タンパク質分解活性は、ポリペプチドにおける一塩基性部位 におよび対合塩基性アミノ酸に特異的なエンドプロテアーゼ活性である。 適切には、酵母は機能性ＹＡＰ３遺伝子を欠いたS.cerevisiaeである。しかし ながら、本発明はS.cerevisiaeの使用に限定されず、その理由は４５ｋＤａ断片 産生の問題が他の酵母属、例えばPichiaおよびKluyveromyces でもみられ、それ らが等価なプロテアーゼ（即ち、Ｙａｐ３ｐタンパク質分解活性）を有すること を示しているからである；Clerc et al(1994),page 253参照。我々は、非Saccha romyces 属でＹａｐ３ｐのホモローグを位置決めするハイブリッド形成分析でこ のことを確認した。遺伝子は、一般的に翻訳産物の配列がＹａｐ３ｐと５０％以 上の配列同一性を有するならば、ホモローグとみなされる。非Saccharomyces 属 において、Ｙａｐ３ｐ様プロテアーゼとその遺伝子は別々に命名してもよいが、 勿論これでそれらの本質が変わるわけではない。 断片のレベルは、前記のようにＫｅｘ２ｐ機能の除去だけでは断片のレベルに 影響を与えないが、Ｋｅｘ２ｐ機能を実質上除去するだけでなくＹａｐ３ｐタン パク質分解活性も実質的に除去されるならば、更に一層減少させることができる 。Ｙａｐ３ｐの場合のように、Ｋｅｘ２ｐ機能もSaccharomyces に限定されない ；Gellissen et al(1992)参照、特に４１５〜４１６頁ではPichiaがＫｅｘ２ｐ 機能を有することを示している。Kluyveromyces lactisおよびYarrowia lipolyt ica でＫｅｘ２ｐ等価活性をコードする遺伝子がクローニングされた（Tanguy-R ougeau et al,1988 ；Enderlin & Ogrydziak,1994）。 プロテアーゼの活性を除去する適切な手段は、プロテアーゼをコードする宿主 遺伝子を壊して、それによりプロテアーゼに関する遺伝子の全部または一部を欠 いた非復帰株を作ることである（Rothstein,1983）。一方、活性は古典的変異誘 発操作によるか、または移転（transplacement）のプロセスで特異的点変異の導 入により減少または除去させることができる（Winston et al,1983）。好ましく は、酵素の活性は野生型レベルの多くて５０％、更に好ましくは２５％、１０％ または５％以下まで減少させ、最も好ましくは検出されない。Ｙａｐ３ｐタンパ ク質分解活性のレベルは、４５ｋＤａ断片の産生を調べるか、またはCawley et al(1993)でも用いられたAzaryan et al(1993)の¹²⁵Ｉ‐β_h‐リポタンパク質ア ッセイにより測定される。Ｋｅｘ２ｐタンパク質分解活性も同様に、例えばFull er et al(1989)で示されたような、公知アッセイにより測定される。 アルブミンはヒトアルブミンまたはその変種でも、いずれか他の動物からのア ルブミンであってもよい。 “変種”として、我々は保存的または非保存的な挿入、欠失および置換を含み 、このような変化はアルブミンの腫瘍的な（oncotic）、有用なリガンド結合ま たは非免疫原性を実質上変えない。特に、我々はヒトアルブミンの天然多型性変 種；Ｙａｐ３ｐにより開裂される領域を含んだヒトアルブミンの断片、例えばＹ ａｐ３ｐ開裂領域（即ち、ｎは４０３‐４１９である）を含む十分長いＥＰ ３ ２２ ０９４に開示された断片（即ちＨＳＡ（１‐ｎ）、ｎは３６９‐４１９で ある）；アルブミン（またはそのＹａｐ３ｐ開裂しうる部分）と他のタンパク質 との融合体、例えばＷＯ ９０／１３６５３に開示された種類を含めている。 “保存的置換”とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙ ｒのようなグループ内での交換を意味する。 このような変種は、下記のようなタンパク質工学および部位特異的変異誘発の 方法を用いて作ってもよい。 本発明の第二面では天然アルブミンと少くとも９０％の配列同一性を有する修 飾アルブミンを提供するが、該天然アルブミンは酵母で発現されたときにS.cere visiae酵母アスパルチルプロテアーゼ３（Ｙａｐ３ｐ）による開裂をうけやすく 、その修飾アルブミンはこのような開裂を受けにくいことを特徴する。 好ましくは、修飾アルブミンは天然アルブミンタンパク質に存在する一塩基性 アミノ酸を欠く。適切には、上記一塩基性アミノ酸はアルギニンである。好まし くは、修飾アルブミンは天然アルブミンに存在する一対の塩基性アミノ酸、特に Ｌｙｓ、Ｌｙｓ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ａｒｇ、Ｌｙｓ；またはＡｒｇ、Ａｒｇのい ずれかを更に欠いている。このため、１つの具体的態様において、天然アルブミ ンはヒトアルブミンであり、修飾タンパク質はＡｒｇ⁴¹⁰と場合により Ｌｙｓ⁴¹³Ｌｙｓ⁴¹⁴リジンの一方または双方を欠いている。例えば、修飾アルブ ミンはアミノ酸置換（change）Ｒ４１０Ａ、Ｋ４１３Ｑ、Ｋ４１４Ｑを有するヒ トアルブミンである。牛血清アルブミンにおける等価修飾は、Ａｒｇ⁴⁰⁸および ／またはＡｒｇ⁴¹¹Ｌｙｓ⁴¹²の一方または双方を置換する。当業者であれば、他 のアルブミンで一塩基性部位と塩基性残基の対を容易に特定することができる。 残基の番号付けは正常成熟ヒトアルブミンの配列に相当する。アルブミンが特 定された位置のＮ末端側で残基の正味欠失または付加を有した変種（例えば多型 体）であるならば、番号付けは２つの配列が見掛け相同性を最大にするように並 べられたときに正常アルブミンの番号位置と整合させた変種アルブミンの残基に 関する。 本発明の第三面では、このような修飾アルブミンをコードしたポリヌクレオチ ドを提供する。 ＤＮＡはアルブミンを産生するために適切な酵母（そのＤＮＡが修飾アルブミ ンに関するものか、またはＹａｐ３ｐ機能を欠いた酵母）で発現される。このた め、アルブミンをコードするＤＮＡは公知技術に従い用いられ、発現ベクターを 構築するためにここに含まれた開示から適切に修飾され、その後アルブミンの発 現および産生のため適切な酵母細胞を形質転換させるために用いられる。 アルブミンをコードするＤＮＡは、適切な宿主中に導入のため様々な他のＤＮ Ａ配列に結合させてもよい。他のＤＮＡは宿主の性質、宿主中へのＤＮＡの導入 方式と、エピソーム保持または組込みが望まれるかどうかに依存する。 通常、ＤＮＡは発現のため適正な向きおよび正しい読み枠でプラスミドのよう な発現ベクター中に挿入される。次いでベクターは標準技術で宿主中に導入され るが、通常形質転換される宿主細胞と合うように選択することが必要である。 次いで、本発明の組換えＤＮＡで形質転換された宿主細胞は、アルブミンを発 現および分泌させるために、ここで開示された教示から当業者に知られる適切な 条件下で十分な時間にわたり培養され、次いで公知のように回収することができ る。 有用な酵母プラスミドベクターはｐＲＳ４０３‐４０６およびｐＲＳ４１３‐ ４１６であり、通常Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから入 手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ ４０６はYeast Integrating プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨ ＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組込む。プラスミドｐＲＳ４１３ ‐４１６はYeast Centromereプラスミド（ＹＣｐ）である。他の酵母発現プラス ミドはＥＰ‐Ａ‐２５８ ０６７、ＥＰ‐Ａ‐２８６ ４２４およびＥＰ‐Ａ‐ ４２４ １１７に開示されている。 本発明の修飾アルブミンをコードするポリヌクレオチドコード配列は、修飾ア ルブミンを産生する上で必要な追加の相違を加えてもよい。例えば、原コドンと 同様のアミノ酸をコードする異なるコドンに代えることができる。一方、置換コ ドンはアルブミンの活性または免疫原性に影響を与えないか、あるいはその活性 または免疫原性を改善し、しかもＹａｐ３ｐプロテアーゼ活性に対するその感受 性を減少させる、異なるアミノ酸をコードしていてもよい。例えば、部位特異的 変異誘発または他の技術もBotstein and Shortle(1985)に記載されたように、置 換、挿入、欠失および転位のような単一または複数変異を作るために用いること ができる。このような修飾コード配列はここに含まれる教示への公知技術の適用 により得られるため、このような修飾コード配列は本発明の範囲内に属する。 本発明の実施に有用と考えられる例示酵母属はPichia、Saccharomyces、Kluyv eromyces、Candida、Torulopsis、Hansenula（現在Pichiaに再分類されている） 、Histoplasma、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、Debaromyces 、Metschunikowia、Rhodosporidium、Leucosporidium、Botryoascus、Sporidiob olus、Endomycopsisなどである。好ましい属はPichia、Saccharomyce s、Kluyveromyces、YarrowiaおよびHansenula からなる群より選択されるもので ある。Saccharomyces sp．の例はS.cerevisiae、S.italicusおよびS.rouxiiであ る。Kluyveromyces sp．の例はK.fragilisおよびK.lactisである。Hansenula（P ichia）sp.の例はH.polymorpha（現在Pichia angusta）、H.anomala（現在P.ano mala）およびP.pastorisである。Y.lipolyticaが適切なYarrowia種の例である。 S.cerevisiaeの形質転換方法はＥＰ ２５１ ７４４、ＥＰ ２５８ ０６７ およびＷＯ ９０／０１０６３で概説されており、それらすべてが引用すること により本明細書の開示の一部とされる。S.cerevisiaeに適したプロモーターには 、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、Ｔ ＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナー ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ 、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナ ーゼ、α‐接合因子フェロモン、ａ‐接合因子フェロモンに関する遺伝子に伴う プロモーター、ＰＲＢ１プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、および５′調節 領域の一部と他のプロモーターの５′調節領域の一部または上流活性化部位との ハイブリッドからなるハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ‐Ａ‐２５８ ０６７のプロモーター）がある。 Schizosaccharomyces pombe で使用上便利な調節プロモーターは、Maundrell( 1990)で記載されたようなｎｍｔ遺伝子からのチアミン抑制プロモーターと、Hof fman & Winston(1990)で記載されたようなグルコース抑制ｆｂｐ１遺伝子プロモ ーターである。 外来遺伝子の発現のためにPichiaを形質転換させる方法は例えばCregg et al (1993)および様々なPhillips特許（例えば、引用することにより本明細書の開示 の一部とされるＵＳ ４ ８５７ ４６７）で開示され、Pichia発現キットはIn vitrogen BV,Leek,NetherlandsおよびInvitrogen Corp.San Diego,Californiaか ら市販されている。適切なプロモーターにはＡＯＸ１およびＡＯＸ２がある。 上記Gellissen et al(1992)論文とGleeson et al（1986）J.Gen.Microbiol.， 132,3459-3465 にはHansenula ベクターの情報と形質転換を含んでいて、適切な プロモーターはＭＯＸ１およびＦＭＤ１であり、一方ＥＰ ３６１ ９９１、Fl eer et al(1991)とRhone-Poulenc Rorer の他の公開文献ではKluyveromyces spp .で外来タンパク質を発現させる方法について開示していて、適切なプロモータ ーはＰＧＫ１である。 転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結およびポリアデニル化に適したシ グナルを含む真核細胞遺伝子の３′フランキング配列である。適切な３′フラン キング配列は、例えば用いられる発現コントロール配列と天然で結合される遺伝 子の配列、即ちプロモーターに相当する。一方、それらは異なっていてもよく、 その場合にはS.cerevisiae ＡＤＨ１遺伝子の終結シグナルが好ましい。 アルブミンは最初に分泌リーダー配列で発現されるが、それは選択された酵母 で有効ないかなるリーダーであってもよい。S.cerevisiaeで有用なリーダーには 接合因子αポリペプチド（ＭＦα‐１）からのものと、ＥＰ‐Ａ‐３８７ ３１ ９のハイブリッドリーダーがある。このようなリーダー（またはシグナル）は、 成熟アルブミンが周囲培地中に放出される前に酵母で開裂される。酵母株がＫｅ ｘ２ｐ活性（または相当物）を欠いている場合とｙａｐ３である場合には、Ｋｅ ｘ２ｐによりアルブミンから開裂される必要のない分泌リーダーを選択すること が有利である。このようなリーダーには特開昭６２‐０９６０８６（９１／０３ ６５１６として特許）に開示されたS.cerevisiaeインベルターゼ（ＳＵＣ２）、 酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、ＭＦα‐１のプレ配列、β‐グルカナーゼ（Ｂ ＧＬ２）およびキラー毒素；S.diastaticus グルコアミラーゼII；S.carlsberge nsis α‐ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；K.lactisキラー毒素；Candidaグル コアミラーゼのものがある。 本発明の様々な非制限態様は例により、しかも添付図面を参考にして記載され る： 図１は変異ｒＨＡ発現プラスミドの構築に関する全体スキームであり、ＨＡは ヒトアルブミンコード配列、Ｌは分泌リーダーをコードする配列、ＰはＰＲＢ１ プロモーター、ＴはＡＤＨ１ターミネーター、ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子 、およびＬＥＵ２はロイシン選択マーカーである。 図２はS.cerevisiaeにより分泌される変異ｒＨＡのWestern ブロット分析を表 した図であり、トラックＡはＤＢ１ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６（正常ｒＨＡ）か らの培養上澄を表し、トラックＢはＤＢ１ ｃｉｒ⁺ｐＡＹＥ４６４（改変１） からの培養上澄を表し、トラックＣはＤＢ１ ｃｉｒ⁺ｐＡＹＥ４６８（改変３ ）からの培養上澄を表す。 図３はｐＡＹＥ５１５の構築スキームである。 図４は非還元１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離された振盪フラスコ培養物か らの培養上澄の抗ＨＳＡWesternブロットの図として表された野生型およびプロ テアーゼ破壊株によるｒＨＡ断片産生の比較であり、トラックＡはＤＢ１ ｃｉ ｒ°ｐＡＹＥ３１６に相当し、トラックＢはＤＸＹ１０ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１ ６（ｙａｐ３株）に相当し、トラックＣはＡＢＢ５０ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６ （ｙａｐ３、ｋｅｘ２株）に相当する。 図５は図４と同様であるが、フィードバッチ発酵からの培養上澄のCoomassie Brilliant Blue染色１２．５％ＳＤＳ Phastgel（Pharmacla）について示し、即 ちトラックＤはＨＳＡ標準、トラックＥはＤＢ１ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６、ト ラックＦはＤＢ１ Δｋｅｘ２ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ５２２、およびトラックＧは ＤＸＹ１０ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ５２２に関する。 図６はｐＡＹＥ５１９の構築スキームである。発明の具体的な説明 すべての標準組換えＤＮＡ操作は、他で指摘されないかぎりSambrook et al（ 1989）に記載された通りである。ＨＳＡをコードするＤＮＡ配列は、ＥＰ ２０ １ ２３９に開示されたｃＤＮＡに由来している。 例１：ＨＳＡ ｃＤＮＡの修飾 ｒＨＡ断片の作製でエンドプロテアーゼの役割を調べるために、ＨＳＡ ｃＤ ＮＡ〔ＳＥＱ１（ＷＯ ９０／０１０６３の人工分泌リーダー配列をコードする 配列を含んでいる）〕を部位特異的変異誘発により修飾した。３つの別々な変化 をＨＳＡ配列（ＳＥＱ２）に加えた。変異原性プライマーＦＯＧ１を用いた第一 の場合ではＡｒｇ⁴¹⁰コドンだけを変化させ、それをＡｌａコドンに代えて、二 塩基性部位Ｌｙｓ⁴¹³Ｌｙｓ⁴¹⁴をそのままに残した。プライマーＦＯＧ２を用い た第二の変化では、ＬｅｕＬｅｕＶａｌからＡｌａＶａｌＡｌａに、断片のＣ末 端残基を含めた残基４０７‐４０９を変化させた。プライマーＦＯＧ３を用いた 第三の変化では、ＡｒｇＴｙｒＴｈｒＬｙｓＬｙｓ（ＳＥＱ３）からＡｌａＴｙ ｒＴｈｒＧｌｎＧｌｎ（ＳＥＱ４）に、残基４１０‐４１４を変化させた。その オリゴヌクレオチドはそうしたアミノ酸変化だけでなく、変化した配列の検出を 容易にするために変異体でＰｖｕIIまたはＳｐｅＩ制限部位を作る保存的塩基変 化についてもコードしていた。 ＨＳＡ ｃＤＮＡを含んだＭ１３ｍｐ１９クローン、ｍｐ１９．７（ＥＰ ２ ０１ ２３９；図２）の一本鎖ＤＮＡを、製造業者の指図に従いIn Vitro Mutag enesis System,Version 2(Amersham International plc)を用いて変異誘発反応 用の鋳型として用いた。個々のプラークを選択および配列決定して、変異の存在 について確認した。次いで二本鎖ＲＦ ＤＮＡを予想された変化のあるクローン から作り、変異のあるＤＮＡをＸｂａＩ／ＳａｃＩ断片で切り出した（図１）。 これはｐＡＹＥ３０９（ＥＰ ４３１ ８８０；図２）の対応野生型断片を置換 するために用いた。プラスミド内における変異ＸｂａＩ／ＳａｃＩ断片の存在は 、適宜にＰｖｕIIまたはＳｐｅＩで切断することによりチェックした。これらの ＨｉｎｄIII 断片を切り出し、発現ベクターｐＡＹＥ２１９（図１）中に挿入し て、プラスミドｐＡＹＥ４６４（改変１、Ｒ４１０Ａ）、ｐＡＹＥ４７０（改変 ２、Ｌ４０７Ａ、Ｌ４０８ＶおよびＶ４０９Ａ）およびｐＡＹＥ４６８（改変３ 、Ｒ４１０Ａ、Ｋ４１３Ｑ、Ｋ４１４Ｑ）を作製した。これらの発現プラスミド は、後にＡＤＨ１転写ターミネーターを続けた変異ＨＡコード配列と枠内で融合 されたＨＳＡ／ＭＦα１リーダー配列（ＷＯ ９０／０１０６３）の発現を行う S.cerevisiae ＰＲＢ１プロモーター（ＷＯ ９１／０２０５７）を含んでいる 。プラスミドは、複製機能を示す２μｍプラスミドの部分と、形質転換株選択用 のＬＥＵ２遺伝子も含んでいる。 ｐＡＹＥ４６４、ｐＡＹＥ４７０およびｐＡＹＥ４６８を形質転換によりS.ce revisiae ＤＢ１ ｃｉｒ⁺（ａ、ｌｅｕ２；Sleep et al,1990）中に導入し、 個々の形質転換株をＹＥＰＳ（１％ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ｗ／ｖペプトン、２ ％ｗ／ｖスクロース）１０ｍｌ中３０℃で３日間増殖させ、その後上澄をｒＨＡ 断片の存在について抗ＨＳＡWestern ブロットにより試験した。Western ブロッ トでは断片がｐＡＹＥ４６４保有株によりなお産生されることを明らかに示した が、そのレベルは野生型ｒＨＡを発現するコントロールと比較してやや減少して いた。プラスミドｐＡＹＥ４７０における変異は、断片の形成に影響を有しない ようであった。しかしながら、ＤＢ１ ｃｉｒ⁺ｐＡＹＥ４６８ではＨＳＡ関連 バンドの新たなパターンを示し、断片がほとんどまたは全くない。 ＤＢ１ ｃｉｒ⁺ｐＡＹＥ４６４およびＤＢ１ ｃｉｒ⁺ｐＡＹＥ４６８の各々 の１例について、醗酵槽中最少培地でフィードバッチ培養により高細胞密度まで 増殖させた（Collins,1990）。簡単に言えば、１０l 作業容量の醗酵槽に５０ m l/l の濃縮塩混合液（表１）、１０ ml/l の微量元素溶液（表２）、５０ ml/ l のビタミン混合液（表３）および２０g/l のスクロースを含有した初期バッチ 培地で５l まで満たした。１００ ml/l の塩混合液、２０ ml/l の微量元素溶液 、１００ ml/l のビタミン溶液および５００g/l のスクロースを含有した等容量 のフィード培地を計量ポンプで醗酵槽に接続された別のリザーバーに保った。ｐ Ｈは水酸化アンモニウムまたは硫酸の自動添加により５．７±０．２で維持し、 温度は３０℃に維持する。スターラー速度は１v/v/min 空気流速度で＞２０％空 気飽和の溶解酸素率を示すように調整した。 醗酵槽に緩衝最少培地〔Yeast 窒素ベース（アミノ酸なし、硫酸アンモニウム なし、Difco）１．７g/l、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄５g/l、クエン酸一水和物６．０９g/ l、Ｎａ₂ＨＰＯ₄２０．１６g/l、スクロース２０g/l、ｐＨ６．５〕で増殖させ たS.cerevisiaeの一夜培養物１００ｍｌを接種した。初期バッチ発酵を炭素源が 消費されるまで進行させてから、計量ポンプのスイッチを入れ、フィードの添加 をWang et al（1979）により開発されたものに基づくアルゴリズムを用いてコン ピューター制御した（マイクロＭＦＣＳシステム、B.Braun,Melsungen,Germany ）。質量分析器は、発酵からの排ガスをモニターして、セットした増殖速度（例 えば０．１ｈ^-1）を維持するようにフィードの添加をコントロールするために、 コンピューターコントロールシステムと併用した。バイオマスへの炭素基質の最 大変換は呼吸係数を１．２以下に維持することで行い（Collins,1990）、こうす ると約１００g/l 細胞乾燥重量の細胞密度が得られる。培養上澄をCoomassie 染 色ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびWestern ブロットにより野生型ｒＨＡ産生株の場合と 比較した。これらは、一塩基性Ａｒｇ⁴¹⁰の除去（ｐＡＹＥ４６４）が有用な量 まで断片のレベルを減少させるが、双方の存在しうるプロテアーゼ部位の除去（ ｐＡＹＥ４６８）だと４５ｋＤａ断片をほぼ消失させることを示した（図２）。 存在しうるＫｅｘ２ｐ部位Ｌｙｓ⁴¹³Ｌｙｓ⁴¹⁴の除去効果の不在（Sleep et a l,1990およびここで記載されていない他の研究でも確認）はＡｒｇ⁴¹⁰の除去と 組み合わされていないので複雑な原因であることを示唆したが、上記データはｒ ＨＡ断片の生成が内部タンパク質分解攻撃によることを示唆した。変異ｒＨＡと 共に断片の量の減少は、原則として、プロテアーゼ開裂部位の除去によるのでは なく、分子の折りたたみの動力学上における変化の影響によるものであった。 例２：ＹＡＰ３遺伝子の破壊 酵母アスパルチルプロテアーゼ３をコードするＹＡＰ３遺伝子はＹＡＰ３コー ド配列の部分を効果的に欠失させる遺伝子破壊プロセス（Rothstein,1983）によ り変異させ、それにより活性ＹＡＰ３ｐの産生を妨げた。 ＹＡＰ３遺伝子の５′および３′末端のＰＣＲ増幅に適した４種のオリゴヌク レオチド（Egel-Mitani et al,1990）を、Applied Biosystems 380B Oligonucle otide Synthesiser を用いて合成した。読者を助けるために、我々はＳＥＱ１５ としてＹＡＰ３遺伝子の配列を含めたが、その５４１‐２２５０はコード配列で ある。 ５′末端 ３′末端 ＰＣＲ反応を行って、S.cerevisiaeゲノムｃＤＮＡ（Clontech Laboratories Inc.）からのＹＡＰ３遺伝子の５′および３′末端を個別に増幅させた。条件は 次の通りであった：２．５μg/mlゲノムＤＮＡ、５μg/mlの各プライマーで４０ サイクルにわたり、９４℃で６１秒間変性、３７℃で１２１秒間アニーリング、 ７２℃で１８１秒間伸長させ、その後４℃浸漬し、製造業者の勧めに従いPerkin -Elmer-Cetus Thermal Cycler およびPerkin-Elmer-Cetus ＰＣＲキットを使用 した。産物はゲル電気泳動で分析したところ、予想サイズであることがわかった 。５′断片をＳｐｈＩで切断し、ｐＵＣ１９ＨＸ（ＨｉｎｄIII を欠いたｐＵＣ １９）のＳｐｈＩ部位中にクローニングして、ｐＡＹＥ５１１（図３）を得たが 、その方向はＹＡＰ３がｐＵＣ１９ＨＸポリリンカーのＫｐｎＩ部位に転写され るようになっている。３′ＹＡＰ３断片をＨｉｎｄIIIおよびＡｓｐ７１８（Ｋ ｐｎＩのアイソシゾマー）で切断し、ＨｉｎｄIII／Ａｓｐ７１８で切断された ｐＵＣ１９中に結合させて、ｐＡＹＥ５１２を得た。プラスミドＤＮＡ配列決定 をインサートで行って、望ましい配列がクローニングされたことを確認した。次 いでｐＡＹＥ５１２のＨｉｎｄIII／Ａｓｐ７１８をｐＡＹＥ５１１の対応部位 中にサブクローニングしてｐＡＹＥ５１３（図３）を得たが、ＹＡＰ３の５′お よび３′領域はそれらの間にユニークＨｉｎｄIII部位を有して正しい向きをと っている。ＵＲＡ３遺伝子をＨｉｎｄIII断片としてＹＥｐ２４（Botstein et a l,1979）から単離し、その後この部位中に挿入して、ｐＡＹＥ５１５（図３）を 得たが、そこではＵＲＡ３がＹＡＰ３の５′および３′領域に隣接していて、Ｙ ＡＰ３の反対方向に転写される。 株ＤＢ１ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６（Sleep et al,1991）のｕｒａ３誘導体を ランダム化学的変異誘発と５‐フルオロオロチン酸耐性の選択により得た（Boek e et al,1987）。その株を緩衝最少培地１００ｍｌで一夜増殖させ、細胞を遠心 により集め、その後滅菌水で１回洗浄した。次いで細胞を滅菌水１０ｍｌに再懸 濁し、そのうち２ｍｌを別の１５ｍｌ Falcon管に入れた。次いでＮ‐メチル‐ Ｎ′‐ニトロ‐Ｎ‐ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）の５mg/ml 溶液を次のように 管に加えた：０μl、２０μl、４０μl、８０μl または１６０μl。次いで細胞 を３０℃で３０分間インキュベートし、その後遠心して、滅菌水で３回洗浄 した。最後に、細胞を１ｍｌＹＥＰ（１％ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ｗ／ｖBacto ペプトン）に再懸濁し、４℃で貯蔵した。変異原性処理から生き延びた細胞のパ ーセンテージは、２％ｗ／ｖスクロース含有ＹＥＰプレート上にサンプルの希釈 物を塗布して、３０℃で３日間インキュベートすることにより決定した。約５０ ％生存率を示した処理からの細胞を２％ｗ／ｖスクロース含有ＹＥＰプレート上 で増殖させ、その後２％ｗ／ｖスクロース含有ＹＮＢ最少培地上でレプリカ培養 し、５‐フルオロオロチン酸（１ mg/ml）およびウラシル（５０μg/ml）で補充 した。この培地で増殖できるコロニーを精製し、それらがウラシル補充なしだと 増殖できずに、この欠陥が形質転換によるＵＲＡ３遺伝子の導入で直せることを 試験して確かめた。１つのこのような株、ＤＢＵ３ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６を ｐＡＹＥ５１５のＳｐｈＩ／Ａｓｐ７１８ ＹＡＰ３‐ＵＲＡ３‐ＹＡＰ３断片 で形質転換し、Ｕｒａ⁺コロニーについて選択した。いくつかの形質転換株の切 断ゲノムＤＮＡのサザンブロットをＹＡＰ３遺伝子の５′および３′末端でプロ ービングして、ＹＡＰ３遺伝子の破壊を確かめた。２形質転換株のＹＥＰＳ振盪 フラスコ上澄の抗ＨＳＡ Westernブロットでは、ＹＡＰ３の破壊がｒＨＡ断片レ ベルを著しく減少させることを示した。 ＤＸＹ１０ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６と表示される、ＤＢＵ３ ｃｉｒ°ｐＡ ＹＥ３１６の１つのｙａｐ３誘導体を、最少培地で高細胞乾燥重量までフィード バッチ発酵により数回増殖させた。上澄をCoomassie 染色ＰＡＧＥおよび抗ＨＳ Ａ Westernブロットで試験したところ（図４および５）、ｒＨＡ ４５ｋＤａ断 片レベルの減少は明白であり、分解産物の量の評価はＹＡＰ３親でみられたレベ ルの１／３〜１／５である。産生されたｒＨＡの量はｙａｐ３変異で悪影響をう けず、実際にＤＸＹ１０ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６はＹＡＰ３相当物、ＤＢ１ ｃｉｒ°ｐＡＹＥ３１６よりも３０〜５０％多くｒＨＡを産生することがわかっ た。ＨＡ配列からのリーダー配列の開裂が１対の塩基性残基に対してＣ末端側に あるという事実にもかかわらず、ｒＨＡは正しいＮ末端を有することがわかった 。 発酵ブロスを遠心して細胞を除去し、その後次のようにアフィニティクロマト グラフィー精製に付した。培養上澄をCibacron Blue F3GA Sepharoseカラム(Pha rmacia)に通して、その後ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸グリシン緩衝液で洗浄し た。次いでｒＨＡを２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸グリシン、ｐＨ８．０でカ ラムから溶出させたところ、それは純度＞９５％であった。それは当業界で知ら れる技術により更に精製してもよい。 一方、アルブミンは血清または発酵培地からアルブミンを精製するための様々 な公知技術、例えばＷＯ ９２／０４３６７、Maurel et al(1989)、Curling(19 80)およびＥＰ ５２４ ６８１に開示された技術により培地から精製してもよ い。 例３：ｙａｐ３株におけるＫＥＸ２遺伝子の破壊 Ｙａｐ３およびＫｅｘ２ｐ活性を双方とも欠いた株を作製するために、酵母株 ＤＸＹ１０ ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１６）のｌｙｓ２誘導体をランダム化学的変 異誘発とα‐アミノアジペート耐性の選択により得た(Barnes and Thorner,1985 )。細胞を例２のように変異誘発させ、その後２％ｗ／ｖスクロース含有ＹＮＢ 最少培地に塗布し、唯一窒素源として２ mg/mlＤＬ‐α‐アミノアジペートおよ び３０μg/mlリジンで補充した。この培地で増殖できるコロニーを精製し、それ らがリジン補充なしだと増殖できずに、この欠陥が形質転換によるＬＹＳ２遺伝 子の導入で直せることを試験して確かめた。次いでこの株はＫＥＸ２コード配列 の部分を効果的に破壊する遺伝子破壊のプロセスにより変異させ、それにより活 性Ｋｅｘ２ｐの産生を妨げた。ＫＥＸ２遺伝子の配列をＳＥＱ１４としてここに 再現しているが、その１３２９‐３７７３はコード配列である。 ＫＥＸ２遺伝子の５′および３′末端のＰＣＲ増幅に適した４種のオリゴヌク レオチド(Fuller et al,1989)を、Applied Biosystems 380B Oligonucleotide Synthesiser を用いて合成した。 ５′末端 ３′末端 ＰＣＲ反応を行って、S.cerevisiaeゲノムｃＤＮＡ（Clontech Laboratories Inc.）からのＫＥＸ２遺伝子の５′および３′末端を個別に増幅させた。条件は 次の通りであった：２．５μg/mlゲノムＤＮＡ、５μg/mlの各プライマーで４０ サイクルにわたり、９４℃で６１秒間変性、３７℃で１２１秒間アニーリング、 ７２℃で１８１秒間伸長させ、その後４℃浸漬し、製造業者の勧めに従いPerkin -Elmer-Cetus Thermal Cycler およびPerkin-Elmer-Cetus ＰＣＲキットを使用 した。産物はゲル電気泳動で分析したところ、予想サイズであることがわかった （５′産物の場合０．９ｋｂおよび３′産物の場合０．６２ｋｂ）。５′産物を ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、３′産物をＨｉｎｄIIIおよびＳａｌＩ で切断して、その後２つの断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断されたｐＵＣ １９ＨＸ中に一緒にクローニングした。次いでS.cerevisiae ＬＹＳ２遺伝子(B arnes & Thorner,1985)を含んだ４．８ｋｂＨｉｎｄIII断片を得られたプラスミ ド中にＨｉｎｄIII（即ち２つのＫＥＸ２断片間）のところで挿入して、ｐＡＹ Ｅ５１９（図６）を形成させた。 ＤＸＹ１０ ｃｉｒ°（ｐＡＹＥ３１６）のｌｙｓ２誘導体、ｌｙｓ２‐１６ をｐＡＹＥ５１９の６．０ｋｂ ＫＥＸ２‐ＬＹＳ２‐ＫＥＸ２断片で形質転換 し、Ｌｙｓ⁺コロニーについて選択した。いくつかの形質転換株の切断ゲノムＤ ＮＡのSouthernブロットをＫＥＸ２遺伝子の５′および３′末端でプロービング して、ＫＥＸ２遺伝子の破壊を確かめた。これら形質転換株のＹＥＰＳ振盪フラ スコ培養上澄の抗ＨＳＡ Westernブロットでは、下記例４でＫＥＸ２のみの破壊 効果の欠如にもかかわらず、ｙａｐ３株におけるＫＥＸ２の破壊がｒＨＡ断片レ ベルを更になお減少させることを示した。１つのこのような株ＡＢＢ５０で産生 されるｒＨＡの分析では、リーダー配列が不正確にプロセッシングされて、異常 Ｎ末端になることを示した。 株ＡＢＢ５０（ｐＡＹＥ３１６）をそのプラスミドから直して（Sleep et al, 1991）、類似プラスミドｐＡＹＥ５２２で形質転換させたところ、ハイブリッド リーダー配列はS.cerevisiaeインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー配列に置き換 わって、コードされるリーダーおよびＨＳＡ配列とのジャンクションが下記の通 りになった： ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ↓ＤＡＨＫＳ （ＳＥＱ１３） インベルターゼリーダー ＨＳＡ この構築体では、ＨＳＡからリーダー配列の開裂がＫｅｘ２プロテアーゼの活 性に依存していない。株ＡＢＢ５０（ｐＡＹＥ５２２）は同様に非常に低いレベ ルのｒＨＡ断片と共にｒＨＡを産生することがわかったが、この場合だとＮ末端 は血清由来ＨＳＡのものに相当しており、即ちリーダー配列の効率的で正確な除 去があった。 例４：ＫＥＸ２遺伝子単独の破壊（比較例） 例３に開示された場合と同様の方法により、ＫＥＸ２遺伝子をS.cerevisiaeで 破壊した。この株はＹａｐ３ｐタンパク質分解活性を有しており、したがって本 発明の範囲内に属さなかった。この株をフィードバッチ発酵で増殖させたとき、 産生されたｒＨＡは完全ＫＥＸ２遺伝子を有する株で産生された場合と同様の断 片量を含有していた。加えて、ｒＨＡの全体レベルも減少しており、リーダー配 列は正確にプロセッシングされずに、異常Ｎ末端を生じた。 例５：Pichiaで相当プロテアーゼの同定 前記のように、非Saccharomyces 酵母も同様にｒＨＡの望ましくない断片を産 生し、したがってＹａｐ３ｐタンパク質分解活性を有している。我々はプローブ としてS.cerevisiae ＹＡＰ３遺伝子を用いてPichia angusta ＤＮＡのSouthe rnハイブリッド形成を行うことによりこれを確認した。特異的ＤＮＡ断片を同定 したところ、P.angusta にＹａｐ３ｐタンパク質分解活性が存在するだけでなく 、ＹＡＰ３遺伝子の特異的ホモローグも存在することを示した。 ＹＡＰ３ホモローグの検出に用いられたSouthernハイブリッド形成の方法は、 標準操作(Sambrook et al,1989)を用いてPichia ＤＮＡのゲノムＤＮＡライブ ラリーから遺伝子配列をクローニングするために応用することができる。Pichia sp.におけるＹＡＰ３ホモローグの破壊も、Saccharomyces について上記で用い られた場合と同様の技術を用いて行うことができる(cregg and Madden,1987)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＮ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＡ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． アルブミンが培地中に分泌されるように培地で酵母を培養することを含 む、アルブミンを産生および分泌するように遺伝子修飾された酵母からの分泌に よりアルブミンを製造するための方法であって、該酵母細胞が減少したレベルの 酵母アスパルチルプロテアーゼ３タンパク質分解活性を有することを特徴とする 方法。 ２． タンパク質分解活性が、ポリペプチドにおける一塩基性部位におよび一 対の塩基性アミノ酸に特異的なエンドプロテアーゼ活性である、請求項１に記載 の方法。 ３． 酵母がS.cerevisiaeである、請求項１または２に記載の方法。 ４． 酵母が機能性ＹＡＰ３遺伝子またはそのホモローグを欠く、請求項１、 ２または３に記載の方法。 ５． 酵母細胞が減少したレベルのS.cerevisiae Ｋｅｘ２ｐタンパク質分解 活性を更に有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 ６． アルブミンがヒトアルブミンである、請求項１〜５のいずれか一項に記 載の方法。 ７． アルブミンをコードするポリヌクレオチド配列と、第一ポリヌクレオチ ド配列から発現されたアルブミンを酵母から分泌させる分泌シグナルをコードす る第二ポリヌクレオチド配列とを含んだ酵母細胞の培養物であって、該酵母細胞 が減少したレベルの酵母アスパルチルプロテアーゼ３タンパク質分解活性を有す ることを特徴とする培養物。 ８． アルブミンがヒトアルブミンである、請求項７に記載の培養物。 ９． 酵母がS.cerevisiaeである、請求項７または８に記載の培養物。 １０． シグナルが、酵母からアルブミンの放出前に、酵母により開裂される 、 請求項７〜９のいずれか一項に記載の培養物。 １１． 酵母細胞が減少したレベルのＫｅｘ２ｐタンパク質分解活性を更に有 する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の培養物。 １２． 分泌シグナルがＫｅｘ２ｐ以外のプロテアーゼによりアルブミンから 開裂される、請求項１１に記載の培養物。 １３． 天然アルブミンと少くとも９０％の配列同一性を有する修飾アルブミ ンであって、該天然アルブミンは酵母で発現および分泌されたときに酵母アスパ ルチルプロテアーゼ３（Ｙａｐ３ｐ）による開裂をうけやすく、このような開裂 を受けにくいことを特徴とする修飾アルブミン。 １４． 天然アルブミンタンパク質に存在する一塩基性アミノ酸を欠く、請求 項１３に記載の修飾アルブミン。 １５． 一塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項１３または１４に記載 の修飾アルブミン。 １６． 天然アルブミンに存在する一対の塩基性アミノ酸を更に欠く、請求項 １４または１５に記載の修飾アルブミン。 １７． 一対のアミノ酸がＬｙｓ、Ｌｙｓ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ａｒｇ、Ｌｙｓ ；またはＡｒｇ、Ａｒｇである、請求項１６に記載の修飾アルブミン。 １８． 天然アルブミンがヒトアルブミンであり、修飾タンパク質がＡｒｇ^{41 0} を欠き、場合により残基４１３および４１４が各々リジンまたはアルギニンで はない、請求項１３に記載の修飾アルブミン。 １９． アミノ酸置換Ｒ４１０Ａ、Ｋ４１３Ｑ、Ｋ４１４Ｑを有するヒトアル ブミンである、請求項１８に記載の修飾アルブミン。 ２０． 請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の修飾アルブミンをコードす るポリヌクレオチド。 ２１． 請求項２０に記載されたポリヌクレオチドと、修飾アルブミンが酵母 で発現されるような転写シグナルと、そして修飾アルブミンが酵母から分泌され るように上記ポリヌクレオチドと隣接する更なるポリヌクレオチドとを含む酵母 。