JPH0322983A - ＭＦα１リーダー配列を用いる酵母宿主によるヒト血清アルブミンＡの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は或熟ヒト血清アルブξンＡの酵母による製造方
法、及びそのための遺伝子系に関する。

この方法によれば或熟型のヒト血清アルブミンＡが細胞
外に分泌されるため、その回収・精製が簡単となり、工
業的製造のために極めて好ましい。

〔従来の技術］ 今まで、遺伝子工学的方法によりヒｌ一血清アルブミン
を製造するための方法として、大腸菌を用いる方法（！
．ａｗｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｔｉｅｓ．
　９　，　６１０３６１１４，　１９８１；　Ｌａｔｔ
ａ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　＋　１３０９
１３１４，　（１９８７）　；特開昭５８−１５０５１
７）　、枯草菌を用いる方法（Ｓａｕｎｄｅｒｓ等、Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１６１＋２９１７−２９２５
，　（１９８７）　）　、及び酵母を用いる方法（Ｅｔ
ｃｈｅｖｅｒｒｙ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４
　＋　７２６−７３（Ｌ（１９８６）　）が知られてい
る。しかしながら、これらの方法により製造される血清
アルブミンは正常なヒト血清アルブミンとはア稟ノ酸配
列を幾分異にし、また生産された血清アルブミンは不溶
化沈澱となったり、シグナルペブチドのプロセシング効
率が低い、細胞外への分泌が困難である、等の問題点を
有すると報告されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明は成熟ヒト血清アルブごンＡを可溶性の
形で、且つ天然血清アルブミンＡと同じ立体構造におい
て細胞外に分泌せしめ、これによって回収・精製を容易
にすることにより大量のヒト血清アルブａンを工業的に
製造することができる方法を提供しようとするものであ
る。

〔課題を解決するためのｆ段］ 上記の目的を達成するため、本発明は（１）ＭＦαｌの
ブレブロ配列をコードしているリーダーＤＮＡ配列と該
リーダーＤＮＡ配列の下流に存在するヒト血清アルブミ
ンＡをコードずるｃＤＮＡとを有ｔるＤＮＡ；　　（２
）ＭＦα１のプレブロ配列をコードしているリーダーＤ
ＮＡ配列、ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮＡ
、及びポリ（Ａ）配列をこの順序で有するＤＮＡ；　　
（３）酵母で機能し得るプロモーターとターξネーター
との間に前記（２）に記載のＤＮＡが発現可能な方向に
挿入されている発現プラスξド；　（４）前記（３）に
記載の発現ベクターにより形質転換された酵母；及び（
５）前記（４）に記載の酵母を培養し、成熟ヒト血清ア
ルブミンＡを産生・分泌せしめ、これを採取することを
特徴とする威熟ヒト血清アルブミンＡの製造方法を提供
する。

（具体的な記載） １．遺伝玉系 且一土 正常ヒト血清アルブミンは分子内に多くのジスルフィド
結合を含有しており、組換えＤＮＡ法によって天然物と
同じ立体構造を有する正常ヒト血清アルブミンを製造す
るには、これらのジスルフィド結合が生産宿主細胞中で
正しく形威されることが必須である．正常な立体構造の
形戒にはプロテインジスルフィドイソメラーゼ、ペブチ
ジルブロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ等の酵素
が関与していることが最近明らかになり、多数のＳ−Ｓ
結合を有し複雑な立体構造をとる蛋白質を殆ど含まない
大腸菌や枯草菌のような原核生物細胞ではたとえあって
もこのような立体構造形威（フォールディング）関連酵
素系の働きは強くないことが予想される。一方、ヒトを
はじめとする真核高等生物の細胞は数多くの複雑な高次
構造を有する蛋白質（糖蛋白質や他の修飾蛋白質も含む
）を細胞外に分泌することが知られているが、下等真核
微生物である酵母菌でも、噛乳動物の細胞で蛋白質が分
泌されるのと非常によく似た経路により蛋白質が分泌さ
れることが知られている（Ｈｕｆｆａｋｅｒ＋Ｔ．Ｃ．
ａｎｄ　Ｒｏｂｂｉｎｓ，　Ｐ．Ｗｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈ
ｅｍ．　２５Ｌ　３２０３−３２１０（１９８２）；　
Ｓｎｉｄｅｒ，　Ｍ．Ｄ．　ｉｎ　Ｇｉｎｓｂｕｒｇ，
　Ｖ．　＆　Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．（ｅｄｓ．）　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，
　Ｖｏｌ．２．Ｗｉｌｅｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．　（
１９８４），　ｐｐ．１６３４９８　）　．このため本
発明においては酵母を宿主としで使用するゆ１±１旦Ｒ
−匁 ヒト血清アルブミンが咄乳動物の肝細胞中で発現し、効
率よく分泌するためには、戒熟ヒト血清アルブミンのＮ
一末端にブレブロ配列が存在する必要がある．下等真核
微生物である酵母菌でも、噛乳動物の細胞で蛋白質が分
泌されるのと非常によく似た経路により蛋白質が分泌さ
れることが知られているので、酵母で該目的蛋白質を産
生・分泌させる場合もこのプＬ・プロ配列が目的蛋白質
の分泌の際に切除されて該目的蛋白質が戒熟型で分泌さ
れる必要があるものと思われる。このため本発明におい
ては、この様な条件を満たすブレプロ配列として酵母菌
由来の肝αｌのリーター配列を使用する。

酵母菌により異種のタンパク質を分泌させる目的で最も
高頻度に使用されるのが接合フエロモン肝α１遺伝子の
リーダー配列である。ＭＦα１遺伝子は１６５アミノ酸
残基からなるポリペブチドをコードし、そのポリベプチ
ドは８９アミノ酸からなるリーダー配列と１３アミノ酸
からなるフエロモンα−ファクター４コビー（短いスベ
ーサーベブチドにより各々隔てられ”ζいる）により構
威されている．さらにリーダー配列は２２アミノ酸から
なる疎水的なシグナルベブチド（プレペプチド）と６７
アミノ酸からなる粗水性のプロベブチドにより構威され
る。酵母菌内で合威されたα−プレブロベブチドは小胞
体膜上でシグナルベプチダーゼによりシグナルベプチド
を、またゴルジ体でアルギニン残基を含む二個の塩基性
アξノ酸の対（　一Ｌｙｓ　−　Ａｒｇ−　．　−　Ａ
ｒｇ　−　Ａｒｇ　−　）のカルボキシル基側を切断す
る膜結合性のセリンブロテアーゼＫＥＸ２によりプロベ
プチドを切断され、さらにスベーサ一部分がカルボキシ
ベプチダーゼＢ　（ＫＥＸ　１　”）及びジベブチジル
アミノペプチダーゼ（ＳＴＥ１３）により分解除去され
た後、生じたα−ファクターは細胞外に分泌される． 異種タンパク質の分泌に通常使用されているのはＭＦα
ｌのリーダー配列部分（プレブロベブチドをコードする
）で、このリーダー配列を直接戒熟異種タンパク質をコ
ードする遺伝子及びｃＤＮＡに連結させて得られるキメ
ラＤＮＡを適当な酵母菌で機能するプロモーター配列の
下流に配置して発現させる方法が採られる。正常ヒト血
清アルブミンＡを分泌させるのに用いたＭＰα１のリー
ダー配列部分は天然の酵母菌由来の配列の３′一例を一
部変更して組換ＤＮＡの作戒を容易にしたもので、この
配列を実施例２に示す． 上記の配列のＮ一末端のＭｅｔのコドンの上流にはＥｃ
ｏＲ　Ｉ粘着末端が設けられており、この制限酵素部位
により上記配列はベクターに挿入される。

また、上記ブレブロ配列のＣ一末端のＡｒｇのコドンと
してＣＧＣが採用されており、これにより５′末端をＣ
ｌａ　Ｉにより切断した成熟ヒト血清アルブミン遺伝子
と連結することができる。

ヒ　　′　　ルブごンＡ゛ ヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）
はすでにクローン化されており、その塩基配列及び該塩
基配列から推定されるア果ノ酸配列は、特願昭６３−０
３７４５３に詳細に記載されている．従って本発明にお
いては、このｃＤＮＡを含有するブラスξドｐｕｃ　−
　ＨＳＡ　．　ＣＨ等をヒト血清アルブミンＡをコード
する遺伝子の供給源として使用することができる．なお
、これらのプラスミドの作製方法を参考例として後記す
る。

ボＩＡ　　　び＾ＡＴＡＡＡシグ　ル コード配列の３′一末端の下流に存在するボリＡ配列及
びＡＡＴＡＡＡシグナルが真核生物のｍＲＮＡの安定性
に寄与すると言われている（Ｂｅｒｇｍａｎｎ及びＢｒ
ａｗｅｒｍａｎ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋ｉｓｔｒｙ＋　ｌｆ
ｉ．　２５９−２６４（１９７７）；Ｈｕｅｚら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　７８
，　９０８−９１１（１９８ｉ）　）。従って、本発明
の好ましい態様においては、ヒト血清アルプミンＡをコ
ードするｃＤＮＡの下流にこれらの配列を配置する。ボ
リＡ配列及び＾ＡＴＡＡＡシグナルとしては、例えばヒ
ト血清アルブξンＡ　ｃＤＮＡに自然に付随しているこ
れらの配列を使用することができる．これらの配列を含
有するヒト血清アルブミンＡ遺伝子はすでにクローン化
されており、特願昭６３−０３７４５３に記載されてい
る。

これらの配列の供給源として例えばλｇｔｌｌ（ＩＳＡ
−ＩＡ）を使用することができ、その作製方法を参考例
において後記する。

１旦天二ｌ二 本発明においては、酵母細胞中で機能するものであれば
いずれのプロモーターを使用することもできる．しかし
ながら本発明においては誘導可能なプロモーターではな
く構成的プロモーターを使用するのが好ましい．誘導可
能なプロモーターを使用して誘導操作を行った場合には
ヒト血清アルブξンが細胞内に急激に蓄積し、分子間ジ
スルフィド結合が形成されて非天然型の立体構造を有す
る分子が生或する可能性があるからである．弱い誘発性
を示すか又は構成性の酵母プロモーターの内、強力な活
性を持つものとしては、例えば、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ＡＤ｝Ｉ　Ｉ　）プロモーター、グリセルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモ
ーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プ
ロモーターがあり、本発明においては、ＡＤｌｌｒプロ
モーターを例にとって具体的に説明する。

酵母ＡＤ｝Ｉ　Ｉ遺伝子（ＡＤＣＩ）を含む約２．　１
００塩基対の領域の塩基配列が既に決定されており、Ａ
ＤＨ　１をコードする約１．１００塩基対の配列の他に
７５０塩基対の５′側非翻訳配列と３２０塩基対の３′
側非翻訳配列が判明している（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，　
ＪおよびＨａｌｌ，　Ｂ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　
２５７，　３０１８−３０２５（１９８２））　．転写
においてＲＮＡボリメラーゼによる認識配列と考えられ
ているＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボックス（Ｔ
ＡＴＡボックス）は翻訳開始コドンＡＴＧの１２８塩基
上流（−１２８の位置）にあり、ＡＤ｝Ｉ　Ｉプロモー
ター活性は−４１０の位置にあるＳｐｈ　Ｉ　Ｅｌ織部
位より上流を欠失させても失われないといわれている（
Ｂｅｉｅｒ，Ｄ．及びＹｏｕｎｇ，？．，Ｎａｔｕｒｅ
　３００，　７２４−７２８（１９８２）　）　．ＡＤ
Ｈ　Ｉプロモーターによる転写物は通常の酵母菌で全ポ
リ（Ａ）ＲＮＡの少なくとも１％に達する（＾ｍｍｅｒ
ｅｒ，　　Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙ＋＋ｏｌ．
　　１０１＋　　１９２−２０１（１９８３））　． −え二〕」辷二Ｌ二 転写における読み越し（ｒｅａｄ−　ｔｈｒｏｕｇｈ　
）により遺伝子生戒物の量が減少する例が報告されてい
る〔例えば、Ｚａｒｅｔ，　Ｘ．Ｓ．及びＳｈｅｒｍｅ
ｎ，　Ｆ．ｌ　Ｃｅｌ１銭，　５６３−５７３．　（１
９８２）　）　．この現象を防止するためには発現され
るべき構造遺伝子の下流にターよネーターを設けるのが
好ましい。酵母ターξネーターを外来遺伝子の下流に配
置し、遺伝子の発現を上昇させた例としてはたとえばＰ
ＧＫプロモーター／夕一逅ネーターからなるサンドイン
チベクターを用いて子牛キモシンを発現させた実験があ
り、夕一ξ２ネーターの導入により数倍〜十倍程度の発
現上昇が報告されている（ＭｅｌｌｏｒらＧｅｎｅ　２
４，１−１４　（１９８３）　）　．このような目的の
ためのターξネーターとしてはさまざまな遺伝子由来の
ものが使用でき、たとえばＴＲＰ５（｝リブトファン合
戒酵素）遺伝子やＣＹＣＩ（イソ−１−チトクロームＣ
）遺伝子などのターミネーターが利用されている。

強力なプロモーターが関与する転写の場合、読み越しを
防ぐために強力なターミネーターがその下流に配置され
ている方が発現の制御に好都合と考えられる．このため
本発明においては例えば強力なプロモーターを有する遺
伝子のターミネーターであるＡＤ｝Ｉ　Ｉターミネータ
ー、ＧＡＰターミネーター等を用いるのが好ましい． さ−Ｌｌニビ４漿 以上、本発明の発現プラスミド中に含有される、発現に
直接関連する要素について説明したが、本発明の発現ブ
ラスミドは、さらに、酵母複製起点及び標識遺伝子を含
有しなければならない．酵母複製起点としては、例えば
酵母由来の２ＩｔＴａプラスミドＤＮＡの複製起点等を
使用することができる。

標識遺伝子としては、宿主に薬剤耐性を付与する遺伝子
、宿主の栄養要求性を補完する遺伝子等、常用の標識遺
伝子を用いることができる。さらに、ブラスミドの組換
え操作の際にブラスξドの複製を大腸菌中で行わせる必
要があるため、本発明のブラスミドは大腸菌複製起点及
び標識遺伝子を含有するシャトルベクターであることが
望ましい。

この様な、シャトルベクターとしての基本的要件を備え
たベクターとして市販のプラスごドｐＪＤ８２０７等を
用いることができる。このプラス果ドｐＪＤＢ２０７中
の酵母標識遺伝子は、ロイシン生合成酵素であるβ−イ
ソプロビルリンゴ酸脱水素酵素をコードするＬＥＵ　２
遺伝子である。

允曵１１表ま上 従って本発明の好ましい発現プラスξドにおいては、酵
母複製起点及び標識遺伝子並びに大腸菌複製起点及び標
識遺伝子を含んでなるシャトルベクターに、プロモータ
ー、ブレブロ配列をコードするリーダーＤＮＡ配列が連
結されたヒト血清アルブξンＡをコードする遺伝子、ボ
リＡ配列及びターミネーターがこの順序で挿入されてい
る。

２．　形１０１腹 本発明のプラスミドによる宿主酵母の形質転換は常法に
従って行うことができ、その具体例を実施例５に記載す
る。

ヒト血清アルブミンｃＤＮＡを含んだ発現ブラスミドに
より形質転換された宿主酵母菌は通常の酵母の培養法に
より培養できる．たとえばＹＰＤのような天然完全培地
やＳＤ培地に１％の酵母エキスを加えたような不完全合
戒培地でも培養できる．培養後細胞外に分泌されたヒト
血清アルブミンの回収は種々の方法で可能である。エタ
ノール、アセトン、硫酸アンモニウムなどによる分別沈
澱、等電点沈澱、限外ろ過などによる濃縮及び部分精製
を行った後に各種クロマトグラフィーや上記部分精製法
を組み合わせれば高度に分泌ヒト血清アルブ泉ンが精製
されることが期待できる。

〔発明の効果〕

酵母菌自身の前駆体タンパク質のリーダー配列を用いて
プロセシングを行わせているので、効率のよい前駆体融
合タンパク質からのプレブロベプチドの除去が可能とな
った。

また、細胞内で産生されたヒト血清アルブミンＡを含む
融合タンパク質及び成熟ヒト血清アルブミンＡのうち、
プレブロペブチドが除去された形の戒熟ヒト血清アルブ
逅ンＡのみが優先的に細胞外に分泌されるので、形質転
換体の増殖培地を出発材料にすれば前駆体ヒト血清アル
ブミンＡの混在の恐れなしに成熟ヒト血清アルブミンＡ
を選択的に回収することが容易となり、その後の精製が
きわめて容易になる． 次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る．以下の実施例において、特にことわらない限り、酵
素反応は次の条件下で行った。

ＢｃｏＲ　ｌ　　（二７ボンジーン；１２ユニット／Ｉ
Ｊ１）、Ｃｌａｌ（ニューイングランドバイオラブス；
５ユニット／Ｉｌ１）、旧ｎｄｌ［［（ニッポンジーン
；ｌ２ユニット／ｍ）、Ｎｈｅｌ（ニッポンジーン；１
５ユニット／ハ）、ｘｈｏｌ（宝酒造；ｌ２ユニット／
ハ）、及びＢａｍＨＩ　　（−ッポンジーン：３５ユニ
ット／ＩＪ１）によるＤＮＡの消化：ＤＮＡ１■、酵素
ｌｐｌ，及びＩＯＸ　ＥｃｃＲ　Ｉ緩衝液（　ｌ　Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐｔ！７．　５　）．１００ｍＭ
　ＭｇＣｈ，　５００ｍＭ　ＮａＣｌ　）　ａ　ｐｌに
滅菌蒸留水を加えて３０ｍとする．３７゜Ｃ，１時間保
温して切断を完了させる。Ｓａ＋ａｌ（ニッポンジーン
；１５ユニット／ｔｄ）の場合は、ＩＯＸ　ＥｃｏＲ　
Ｉ　ｆｌｉ街液の代りに２００ｄ　ＫＣＩ，　６　０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＦｌ７．　９）．　６　０ｍ
ＭＭｇＣｌｚを用いる，　　Ｓａｌｌ　　（−１−ッポ
ンジーン；１５ユニット／ｊｔｌ）及びｐｓｔＩ（ニッ
ポンジーン；２０ユニット／ｍ）の場合はＩＯＸ　Ｅｃ
ｏＲ　Ｉ　緩衝液の代わりに１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．　５）．　７　０　＠Ｍ　ＭｇＣ１ｇ，
１．７５Ｍ　ＮａＣｌ　．　７　０＋ｎＭ　２−メルカ
プトエタノール、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　、０．　１％ウシ
血清アルブξンを使用する。

バクテリアアルカリ性ホスファターゼ処理：ＤＮＡＩｎ
、制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉ又は旧ｎｄｎｌ各々ＩＪＩ！及
びＩＯＸ　ＥｃｏＲ　Ｘ緩衝液２バに滅菌蒸留水を加え
て２０ｕＩとし、３７゜Ｃで１時間保温した後、９０゛
Ｃ、５分間加熱して酵素を失活させる。次に滅菌蒸留水
３８ｄ、バクテリアアルカリ性ホスファターゼ２パ（宝
酒造０．５ユニット／，，７）を加えて３７゛Ｃ、１時
間保温した後、フェノール抽出を行い、得られた水層を
エタノール沈澱に用いる。

Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼ処理：たとえばベクターＤＮＡ　
１ｎ１ベクターＤＮＡと等モル量のＤＮＡフラグメント
、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（６６０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７．　５　）　　．　６　６ｍＭ　Ｍｇｃｈ
、１００ＩＩＩＭジチオスライトール、１師ＡＴＰ）３
Ｉ１ｌ及びＴ４　ＤＮ＾リガーゼｌμｌ（宝酒造、約４
００ユニット／ｄ）に滅菌蒸留水を加えて３０ｍとし１
６゜Ｃで一晩保温する。

合戒フラグメントのＴ４ボリヌクレオチドキナーゼによ
る５′−リン酸化：　５　０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃＩ（
ｐ｝Ｉ７．　６　）　　，　１　０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、
５ｍＭジチオスライトール、０．　２−＾ＴＰを含有す
る溶液（２５ｔｌ１）中でＤＮＡフラグメントの各々の
分！（約３　０　ｐｍｏｌｅｓ）を６ユニットのＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）で３７゜Ｃ、６０分
間処理することにより５′？をリン酸化する。リン酸化
されたフラグメントを含む溶液を混ぜ（計１００μｆ）
１００゜Ｃの水浴に５分間放置した後室温で放冷しアニ
ーリングを行う。

２〃のＴ４　ＤＮＡリガーゼを加え１６゜Ｃで一晩保温
し、フラグメン１間を連結し、二本鎖フラグメントとす
る． 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１反応＝ＤＮＡ１■、ＤＮＡ
ポリメラーゼｌ　　（Ｋｌｅｎｏ−フラグメント、宝酒
造３．５ユ−’−　ット／ｕ！）　１　ａｌ，　　１ｍ
Ｍ　ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，　ｄＣＴＰ，　Ｔ
ＴＰの混合物）ｌＩｉＩ及び１０Ｘ緩衝液（　　７　　
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　−　　ＨＣＩ（ｐ｝１７．５）
，　　　１ａ＋Ｍ　　ＥＤＴＡ，　　２００ｍＭＮａＣ
ｌ，　　７　０ｎ＋Ｍ　ＭｇＣｈ〕３ｍに滅菌蒸留水を
加えて全量を３０ｐ１とし、３７゜Ｃで３０分間保温す
る。

ブローブの標識： Ｉｎの合或ＤＮＡ，５　０　μＣｉのＴ−″１Ｐ−ＡＴ
Ｐ水冫容液　（３０００Ｃｉ／　　ｍｙａｏｌ　　）　
　、　　（　５　　０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣＩ　
（ｐＨ７．　５　）　，　１　０ｓＭ　ＭｇＣＩ■，　
５ｍＭ　ＤＴＴ，　１　０ユニットＴ４ボリヌクレオチ
ドキナーゼ（宝酒造）を含む１０ｌの溶液を３７℃で１
時間反応後、未反応のヌクレオチドをＮｉｃｋ−ｃｏｌ
ｕｍｎ（ファルマシア）を用い、メーカーのプロトコー
ルにのっとり除き、３１ｐ’で標識されたＤＮＡを得る
（　Ｉ　Ｘ１０”ｃｐｍ／　１ｇＤＮＡ／４００Ｊ　）
。

ハイブリダイゼーション： ＤＮＡを固定した膜をハイブリダイゼーション液（　６
　ＸＳＳＣ（　Ｉ　ＸＳＳＣは０．ｌ５Ｍ　ＮａＣ１，
　０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、５
Ｘデンハート液（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１
％フイコール、０．　１％ポリビニルピロリドン）、０
．５％ＳＤＳ、１００ｕ変性サケ精子ＤＮＡ３１０ｍｇ
中で、４２゜ｃ１３時間保温する．液を捨て、プローブ
を１×１０ｂＣ９−／一加えたハイブリダイゼーション
液１０ｍｌを加え、８０’Ｃ、３分保温する。次に、４
２゜Ｃで一夜保温する．液を捨て、膜を２ｘｓｓｃによ
り室温で５分洗い、さらに２ｘｓｓｃにより６０゜Ｃで
３０分洗う． なお、酵素反応によりブラスミドを作製する場合には、
その酵素反応混合物を用いて大腸菌１１ＢＩＯＩを常法
に従って形質転換し、大腸菌標識遺伝子に依存して適切
な常法により形質転換体を選択し、目的とするプラスミ
ドを含有するクローンを例えばミニプレバレーション法
により形質転換体から抽出したＤＮＡを種々の制限酵素
で切断して電気泳動法により分析する方法（たとえばＭ
ａｒｔａｔｉｓ，Ｔ，　Ｆｒｉｒｓｃｈ，　Ｅ，　Ｆ，
　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃ
ｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　１９８２）により選択した。そして選択さ
れたクローンを培養し、菌体から常法に従ってブラスミ
ドＤＮＡを抽出することにより、所望の組換えブラスξ
ドを増幅・回収した．この方法は組換え操作の各段階に
より必要に応じて行った．合成オリゴデオキシリボヌク
レオチドを連結してＭＦαｌのプレプロペブチドをコー
ドするＤＮＡを構築するときに連結を容易にするために
、このＤＮＡ配列の中に適当な制限酵素認識配列を作る
と便利である．この目的のためにＮｈｅ　Ｉと！Ｉｉｎ
ｄＩ［Ｉ認識配列を設けた．またこの合或ＤＮＡのベク
ターへの挿入を容易にするためにコーディング配列の５
′末端側にＥｃｏＲ　ＩおよびＸｈｏ　Ｉ認識配列を設
け、さらに３′末端側にはＣｌａ　Ｉ認識配列を設けた
．門Ｆα１のプレブロペプチドのカルボキシル末端すな
わち或熟α因子の直前に存在するＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａのテトラベプチドはこれを除いても融合タン
パク質からの異種タンパク質部分のプロセシング（Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ配列の直前にあるＬｙｓ−
Ａｒｇジペブチドのカルボキシル基側で切断が起こる）
及び異種タンパク質の分泌には大きな影響を与えないと
いうヒト上皮或長因子の酵母菌による生産の報告（Ｂｒ
ａｋｅらＰｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ
ＳＡ　８１．　４６４２−４６４６．　１９８４）があ
るので、ＭＦαｌブレプロペブチド配列からこのＧｌｕ
−Ａ．ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａテトラペブチドを欠いた配
列をリーダー配列として使用した．従って、このリーダ
ー配列は合計８５個のアミノ酸残基からなる。

このリーダー配列を構築するために下記の１０本のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを合威した．Ｉ　ＡＡＴＴ
ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴ
ＴＴＡＣＴＧＣＡ２　　ＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧ
ＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧＡＧ３　ＣＴＡＧＣＡＴＴ
ＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＴＡＡＧＣＴ
ＴＧＧＡＴＡＡＡＣＧ４　ＣＧＣＧＴＴＴＡＴＣＣＡＡ
ＧＣＴＴＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡ
ＡＴＧ５　ＧＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣ
ＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＡＣＴ
ＡＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＡＣＧ６　　ＡＴＣＴ
ＴＣＴＧＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＧ
ＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＡＴＡＡ
ＡＡＣＴＧＣＡ７　　ＧＣＡＣＡＡＡＴＴＣＣＧＧＣＴ
ＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴ
ＴＡＧＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＴＧＣＴ８　
　ＡＴＣＧＡＡＡＴＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＡ
ＧＴＡＡＣＣＧＡＴＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＧＡ
ＡＴＴＴＧＴＧＣＣＧＴＴＴＣ９　　ＧＴＴＴＴＧＣＣ
ＡＴＴＴＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＴＡＡＣＧＧＧ
ＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴＡＴＴＧ
ＣＴＡＧＣＧ１０　　ＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＡＡＴＡ
ＧＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＧＴ
ＴＡＴＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＡ
ＡＡＣＡＧＣＡＡＣまずフラグメン｝６．７．８及び９
の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸
化し、次いでフラグメント５と６、フラグメント７と８
及びフラグメント９と１０を各々アニールさせたのち、
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼより連結させた．得られたフラグ
メントは両末端に各々Ｐｓｔｌ，ＥｃｏＲ　Ｉ粘着末端
配列を有し、これを利用して、Ｐｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲ
　ＩでｐＵｃ１Ｂを二重消化して得られたＤＮＡフラグ
メントと連結して組換えプラスミドｐｕｃ−ΔｒｘＦを
構築した，　ｐｔｌｃ−ΔａＰをＥｃｏＲ　Ｉで切断し
て、線状ＤＮＡとし、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処
理することにより末端が揃った平滑末端とした．この線
状ＤＮＡをＰｓｔｌで切断し、得られたＭＦｃｒｌリー
ダー配列の一部をコードするＤＮＡフラグメントとフラ
グメントｌと２をアニールさせて得た二本鎖フラグメン
トとをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。得られ
たＤＮＡフラグメントをｐＵｃ１ＢをＥｃｏＲ　ＩとＳ
ＲＩａ　Ｉで切断して得たＤＮＡフラグメントに連結し
組換えプラスミドｐＵｃ−ｃｒＦを得た，　ｐｌｌｃ−
αＦをＢｃｏＲ　ＩとＮｈｅ　Ｉで二重消化し得られた
ＭＦαｌブレブ口ペブチド配列のカルボキシル側の一部
を欠く配列をコードするフラグメントを合成オリゴヌク
レオチドフラグメント３と４をアニールさせて得た二本
鎖フラグメントとＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た．構築された二本ｔ！　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントは以
下の配列を有する。

Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｐ
ｈｅ　Ｔｈｒ　ＡｌａＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧ　　ＡＴＧ
　ＡＧＡ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　　ＡＴＴ　ＴＴＴ
　ＡＣＴ　ＧＣＡＧＡＧＣＴＣ　ＴＡＣ　ＴＣＴ　ＡＡ
Ａ　ＧＧＡ　ＡＧＴ　ＴＡＡ　　ＡＡＡ　ＴＧＡ　ＣＧ
ＴＥｃｏＲＩＸｈｏｌ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ＰｓｔｌＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ
　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　
　Ｌｅｕ　　ＡｌａＧＴＴ　ＴＴＡ　ＴＴＣ　ＧＣＡ　
ＧＣＡ　ＴＣＣ　ＴＣＣ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＴＣＡ
Ａ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＡＧＧ
　ＣＧＴ　ＡＡＴ　ＣＧＡ八ｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ
　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ
　　Ａｓｐ　　ＧｌｕＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＴＣ　ＡＡＣ
　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＡＡＣ
ＧＡ　ＧＧＴ　ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＴＧＡ　ＴＧＴ　ＴＧ
Ｔ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＣＴＴＴｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　
　Ｔｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　Ｖａｌ
　　ｌｉｅＡＣＧ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＡＴＴ　ＣＣＧ　
ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＴＣ　ＡＴＣＴＧＣ　ＣＧ
Ｔ　　ＣＴＴ　ＴＡＡ　ＧＧＣ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＣＧ
Ａ　ＣＡＧ　　ＴＡＧＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＡｓｐＧ
ＧＴ　ＴＡＣ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＡ　ＧＧ
Ｇ　ＧＡＴ　ＴＴＣ　ＧＡＴＣＣＡ　ＡＴＧ　　ＡＧＴ
　ＣＴＡ　　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＣＣＣ　ＣＴＡ　　ＡＡ
Ｇ　　ＣＴＡＶａｌ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　
　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒＧＴＴ　　ＧＣＴ　　ＧＴＴ　　ＴＴＧ　　ＣＣＡ
　　ＴＴＴ　　ＴＣＣ　　ＡＡＣ　　＾ＧＣ　　ＡＣＡ
ＣＡＡ　　ＣＧＡ　　ＣＡＡ　　ＡＡＣ　　ＧＧＴ　　
ＡＡＡ　　ＡＧＧ　　ＴＴＧ　　ＴＣＧ　　ＴＧＴＡｓ
ｆｌＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　　Ｉｌ
ｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ＾ＡＴ　　ＡＡＣ　　ＧＧ
Ｇ　　ＴＴＡ　　ＴＴＧ　　ＴＴＴ　　ＡＴＡ　　ＡＡ
Ｔ　　ＡＣＴ　　ＡＣＴＴＴＡ　　ＴＴＧ　　ＣＣＣ　
　ＡＡＴ　　ＡＡＣ　　ＡＡＡ　　ＴＡＴ　　ＴＴＡ　
　ＴＧＡ　　ＴＧＡ１１ｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　　ＩＩｓ
　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＡ
ＴＴ　　ＧＣＴ　　ＡＧＣ　　ＡＴＴ　　ＧＣＴ　　Ｇ
ＣＴ　　ＡＡＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＧＧＧＴＡＡ
　　ＣＧＡ　　ＴＣＧ　　ＴＡＡ　　ＣＧＡ　　ＣＧＡ
　　ＴＴＴ　　ＣＴＴ　　ＣＴＴ　　ＣＣＣＮｈｅ　１ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＬｙｓＧＴＡ　　
ＡＧＣ　　ＴＴＧ　　ＧＡＴ　　ＡＡＡＣＡＴ　　ＴＣ
Ｇ　　＾＾Ｃ　　ＣＴＡ　　ＴＴＴ｝１ｉｎｄｌｎ Ａｒｇ ＣＧ ＧＣＧ　　Ｃ Ｃｌａ　Ｉ この連結した二本鎖フラグメントを戒熟ヒト血清アルブ
ミン八の全長をコードするＤＮＡ配列を含む組換えプラ
スミドｐｕｃ−　ＨＳＡ−ＣＨをＥｃｏＲ　ｌとＣｌａ
ｌで二重消化して得た大きな方のフラグメントとＴ４　
［１８＾リガーゼを用いて連結し、組換えブラス壽ドｐ
Ｕｃ−αＦ−！ＩｓＡを得た。

夫益班１　ポＩＡ　　　　びＡＡＴＡ＾＾シグ　ル　　
の獲大 ヒト血清アルブミンＡｃＤＮＡのうちコーディング配列
の後半部分とポリＡ付加シグナル及びポリＡ配列を含む
３′非翻訳領域を含むブラスミドｐＵｃＨｓＡ−１’　
　（参考例４）からボリＡ付加シグナルとボリＡ配列及
びｐＵＣベクター由来の配列を含む約２００ｂｐの旧ｎ
ｄｌｌｌフラグメントを切り出し、ｐｕｃ−αＦ−ＩＳ
Ａ中のヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮ＾配列の３′末端
に存在する旧ｎｄＩ［Ｉサイトに挿入し、プラスミドｐ
υＣ−αＦ−ＩＳＡ−Ａを得た。

夫讃艷ｂエ　　プース々゛の ｐＵＣ−αＦ−ＨＳＡ−ＡからＭＦα１リーダー配列と
戒熟ヒト血清アルブξンＡをコードしさらにポリＡ付加
シグナル及びボリＡ配列を含むヒト血清アルブミンＡ　
ｃＤＮＡのつながった配列を含むＤＮＡフラグメントを
Ｘｈｏ　Ｉ　−ＢａｌＩｌ　ｒの二重消化により切り出
し、酵母菌のＡＤ｝Ｉ　Ｉプロモーターを含む発現プラ
スξドｐＡＨ６−１０−ＮＥＯ−ＡＴＥ（参考例８）を
Ｘｈｏ　１　−Ｂａａ＋Ｈ　Ｉによる二重消化によりＮ
ＥＯ遺伝子（アミノグルコシドホスホトランスフェラー
ゼ３’　　（１）をコードする）部分を除いた大きい方
のフラグメントと連結し、組換えプラスミドｐＪＤＢ−
ＡＤＨ−αＦ−ＫＳＡ−Ａを構築した。

このプラスミドを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ
並且ＨＢ１０．１／ρＪＤＢ−ＡＤＨ−αＦ−ＩＳＡ−
Ａは、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第
２４５３号（ＦＥＲＭＢＰ４４−５３）として、１９８
９年６月８日にブダペスト条約に基き国際寄託された。

発現ブラスミドｐＪＤＢ−＾Ｄｌｌ−αＰ−ＩＳＡ−Ａ
による酵母菌の形質転換は基本的には橋本英明、木村光
〔発酵と工業旦，　６３０−６３７（１９８５）　）の
ＫＵＲ法に従い、少し改良した方法によって行った．ま
ずＹＰＤ培地（２％ポリベブトン（Ｄｉｒｃｏ）、１％
酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）　、２％グルコース）５ｄに
ＡＨ２２株（ＭＡＴａ，　Ｉｅｕ２−３，　１ｅｕ２−
１１２，　ｈｉｓ４−５１９．　Ｃａｎｌ）のＹＰＤ培
地による一晩培養液０．　１　ｍを加え３０゛Ｃで約４
時間（濁度が００　６００で０．　５に達するまで）振
盪培養を行った。４度で２．００Ｏｒｐｍ、５分間の遠
心を行い集菌し、菌体を５．０−の０．　Ｉ　ＭＬｉＳ
ＣＮに懸濁し、そのうち１．　５　ｄを分取し、２．　
０００ｒｐ■、５分間または１０，０００ｒｐｍ　，　
　１分間の遠心で集菌した．得られた菌体を２門ＬｔＳ
ＣＮ　１　０　１、５０％ＰＥＧ４０００４６Ｊ１１に
再懸濁し、そこに１０ｕ１のＤＮＡＩ液（５〜Ｌｏｇの
ＤＮＡを含む）を加え、３０゜Ｃで一晩保温した．その
態濁液にｌＩＩ１の滅菌蒸留水を加えゆるくボルテック
スミキサーにて振盪した。

次に２．００Ｏｒｐｍ，　５分間または１０．　００Ｏ
ｒｐｍ、１分間の遠心を行い、得られた菌体を１００１
Ｊｆの滅菌蒸留水に再懸濁し、選択用の寒天培地（ＳＤ
培地＝２０ｎ／ｘｉアデニン硫酸塩、２０ｎ／ｄアルギ
ニン塩酸塩、２０ｎ／ｙｎｌメチオニン、２０Ｒ／Ｉｄ
ヒスチジン塩酸塩、２０Ｉｌｇ／Ｉ＃ｉトリブトファン
、２０躍／ＩＩ１ウラシル、３０罐／−イソロイシン、
３０ｔｒｔｔ／−リジン塩酸塩、３０ｄ／−チロシン、
５０ｎ／ｉｄフェニルアラニン、１５０ｇ／−バリン、
０．１５％アミノ酸不合イースト・ニトロゲン・べ一ス
（Ｄｉｒｃｏ）　、０．　５％硫酸アンモニウム、２％
デキストロースに１．５％の寒天を加えたもの〕にまい
た．生じたコロニー（Ｌｅｕ”　）をＳＤ培地５Ｉｄに
懸濁し、２日間３０’Ｃで振盪培養した。２．　０００
ｒｐ−５分間、４゜Ｃでの遠心により集菌し、菌体を０
．　５一の１Ｍソルビトールに再懸濁し、遠心後、菌体
を０．　５　ｄのＩＭソルビトール、０．１％２−メル
カブトエタノール、４００Ｉ４／一のザイモリエース（
Ｚｙｓｏｌｙａｓｅ−　１００　７生化学工業）に再懸
濁した。

３０℃で３０分間保温後、生成したスフェロブラストを
遠心（２，　ＯＯＯｒｐｍ、５分間）して集め、１００
ｄの溶液Ｉ　（５０傷ｈグルコース、１　０ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、２　５ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　　・ＨＣＩ（ｐＨ８．
　０））に再懸濁し、次に２００一の溶液ｎ　（０．２
ＮＮａＯＨ，　１％ＳＯＳ）を加え、よく混合した後、
氷上に５分間放置した。１５０ｔ１ｌの５Ｍ酢酸カリウ
ムを加え、よく混合し氷上に１０分間放置した後、１５
．０００ｒｐｍ　、５分間、４゜Ｃでの遠心を行い、得
た上清を新しいチューブに移した。等量のフェノール／
クロロホルム（１　：　１混合液）を加え激しく攪拌し
、遠心（１２．００Ｏｒｐｍ，　５分間）して得た水層
を新しいチューブに移し、７５０ｌＩＩのエタノールと
ボルテックス逅キサーを用いてよく混合した．混合液を
１５．００Ｏｒｐｍ　、５分間遠心し、得られた沈澱に
０．　５　ｍの７０％エタノールを加えボルテックス主
キサーを用いて振盪した後、１５．０００ｒｐｍ　、５
分間の遠心で沈澱を回収した．このＤＮＡの沈澱を真空
中で減圧乾燥し、次に３０４のＴＥ緩衝液（　１　０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣＩ　（ｐＨ８．　０　）．　ｌ
　ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した．プラスごドρＪＤＢ−
ＡＤ｝Ｉ−｝１ｓＡ−Ａを含むＡ｝！２２の形質転換株
から得られたＤＮＡ標品を各種酵素（たとえば旧ｎｄＩ
［ｌ　，　　Ｘｈｏ　Ｉ　，　ＥｃｏＲ　Ｉ　，　Ｂａ
ａ｝Ｉ　Ｉ　，Ｓａｔ　Ｉなど）単独または、組合せに
より制限酵素分解し、得られたフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
分析することによりブラスミドの構造を確認した．犬旌
班立　　　　　　に　　ヒ　　′アルブξンＳＤ（−Ｌ
ｅｕ）培地上に生じた単一のコロニーを５．０一の新鮮
なＳＯ（−Ｌｅｕ）培地に懸濁し、３０℃で２日間振盪
培養し、００，。。が約２．　０になった時点で培養液
の０．　１　ｄを５．　０　ｄのＹＰＤ培地に加えた。

これを２４時間３０″Ｃで、００．。。が約３．０にな
るまで培養した．培養液を５．ＯＯＯｒｐｍ、１０分間
、４　’Ｃで遠心し、上滑百分を回収した。上清両分に
等量の９９％エタノールを加え、混合した後３０分間４
゜Ｃに放置した。次に１２．ＯＯＯｒｐｍ、１０分間、
４゜Ｃで遠心し、沈澱物を得た．この沈澱物を１００ｍ
の１×ローディング（Ｌｏａｄｉｎｇ）　ＩＩ衝液（５
％２ーメルカブトエタノール、０．００２５％プロモフ
ェノールブルー、２％ＳＯＳ，　０．０２５Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−｝ＩＣＩ、８％グリセロール）に溶解し、そのうち
１０ＪＬｌを電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ポリアクリルアξ
ドゲル：４〜２０％濃度勾配ゲル８４（幅）Ｘ９０（高
さ）×１．０（厚み）（単位は鵡））に重層して分析し
た。

泳動は泳動緩衝液（０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐｉ｛８．　４　）、０．１９２Ｍグリシン、０．　１
％ＳＯＳ　］を用い、６０ｍＡの定電流下６０分間行っ
た．同時に泳動したマーカーは卵白リゾチーム（分子量
１４．４００）、トリブシンインヒビター（分子量２１
．５００）　、炭酸脱水酵素（分子量３１，０００）　
、オバルブミン（分子量４５，０００）　、子牛血清ア
ルブξン（分子量６６．２００）、ホスホリラーゼＢ（
分子量９２．５００）　（全”１１０−ＲＡＤ社製）で
あった。泳動終了後、常法に従いクマシー・ブリリアン
ト・ブルーにより染色し、または以下に示すようにウエ
スタンブロッティング後免疫検出を行った。泳動後、分
離された蛋白質をＳａｒｔｏｒｉｕｓ社製のセミドライ
ブ口ッターを用いてニトロセルロースフィルター（Ｂ　
１０−ＲＡＤ社）に移シた。フィルターを、１時間メタ
ノールに浸した後、５分間２　５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝Ｉ
ＣＩ（ｐＨ１０．４）　／　２　０％メタノールに浸し
泳動ゲルと密着させた。これを上記緩衝液、及び２０％
メタノールを含む０．　３　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ（ｐ
Ｈ１０．０）と２　５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｌ（ｐ
Ｈ９．　４　）　／　４　０　ｍＭ６−ア藁ノーｎ一カ
プロン酸等の緩衝液に各々浸したろ紙ではさみブロッタ
ーに装着した。６ｖの定電圧を約１．　５時間カ−４Ｊ
た後、フィルターを３％ゼラチンを含む２　０　ｓＭ　
Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　（ｐＨ　７．　５　）　／５００
ｍＭ　ＮａＣｌ（ＴＢＳ）溶液中で３７℃、１時間振盪
した後ＴＢＳ／０．０５％Ｔ＠ｅｅｎ−２０中で５分間
振盪することによりフィルターを洗浄した．次に抗ヒト
血清アルブミンウサギ抗体（カッベル社）を１％ゼラチ
ンを含むＴＢＳで２．０００倍に希釈した溶液４０Ｉｄ
中でフィルターを室温で１晩振盪した。フィルターを０
．０５％の↑ｗｅａｎ−２０を含むＴ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ
７．　５　（Ｔ−ＴＢＳ））で５分間振盪しながら洗浄
した。この操作をもう一度繰り返した後、第二抗体（西
洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を１％ゼラチンを含むＴ
ＢＳで３　．　０００倍に希釈した溶液４０ｄ中でフィ
ルターを室温で１時間振盪した．次にＴ−ＴＢＳで５分
間ずつ２回およびＴＢＳで５分間１回上述のように洗浄
した．当該バンド（ＨＳ＾）の検出は４−クロロナフト
ール３０■を１０ｄのメタノールに解かした溶液と↑Ｂ
５　５０ｄ、３０％過酸化水素３０ｍを混ぜた溶液に浸
漬することにより行い、発色反応は蒸留水で希釈するこ
とにより停止させた。結果を第４図に示す。

正常ヒト血清アルブミンＡ　ｃＤＮＡを含むクローンの
ブラークハイプリダイゼーシジンによるスクリニングの
ため米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のλｇｔｌｌをベクターと
して作威されたヒト肝ｃＤＮＡライブラリイーを用いた
．λｇｔｌｌ組換え体ファージを大腸菌Ｙ　１０９０を
宿主として感染させ、形質転換ブラーク計５．５×ｌＯ
Ｓ個をＬＢ寒天培地上に形威させ組換えＤＮＡをメンプ
ランフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｌ＋社［１ｙｂｏ−ｎ
ｄ　−　Ｎ）に移した後、ｆｆ！ｐ放射性同位元素で標
識した合或オリゴヌクレオチド３種（比活性≧１０７（
ｐｓ／ｘ）をプローブとして用いスクリーニングした（
Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　■曵．
　１８０−１８２（１９７７））　．この３種のブロー
ブは各々Ｌａｗｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｔｄｓＲｅ
ｓ　９，　６１０３−６１１４（１９８１）　）によっ
て報告されたヒト血清アルブ嵩ンｃＤＮＡの配列のうち
５′非翻訳領域（翻訳開始のＡＴＧコドンより１２ヌク
レオチド上流からＡＴＧコドンの前のヌクレオチドまで
の部分）と翻訳領域（アミノ末端のメチオニンコドンす
なわちＡＴＣより９番目のアミノ酸ロイシンをコードす
る部分）を含むもの（｝Ｉｓ＾−１）、２４８番目のグ
リシンから２６０番目のロイシンをコードするもの（Ｈ
ＳＡ−　２　）、並びに５７６番目のバリンからカルボ
キシル末端５８５番目のロイシンをコードする部分とそ
れに続く６ヌクレオチドから成る３′一非翻訳領域を含
むもの（ＨＳ＾−３）と同じ配列である．これらのブロ
ーブの塩基配列を第６図に示す。このブローブの合或は
自動ＤＮＡシンセサイザーにより行い、標識は（ｙ−”
Ｐ）ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いて行った
，ＩＳＡ−２で陽性のシグナルを与えた２００個のλｇ
ｉｌｌクローンのうち４個のクローンからＤＮＡを調製
（ＢｌａｔＬｎｅｒらＳｃｉｅｎｃｅ　２０２＋１２７
９−１２８４（１９７８）　）　Ｌ、これをＥｃｏＲ　
Ｉで消化し、消化物のサザーンプロットをＩＩｓＡ−２
プローブとハイブリダイズさせた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，
　Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，５０３−５１７（１９７５）
　）　．ハイブリダイズしたフラグメ？トは３つのクロ
ーンから得られ各々１．　８　ｋｂ　，１．４ｋｂ．１
．３ｋｂの長さであった。このうち１．８ｋｂと１．３
ｋｂの長さのフラグメントをｐＵｃ１９ベクターにサブ
クローニングした．このサブクローンを１１５Ａ−１と
ＵＳＡ−３を各々プローブとしてコロニーハイブリダイ
ゼーション（ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ
　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ｔｌｓＡ
　ｌ２Ｌ．　３９６１−３９６５（１９７５）　）によ
りスクリーンした。この結果ＩＳＡ　−３のみにハイブ
リダイズするクローンλｇｔｌｌ（ＨＳ＾１−Ａ）が得
られた．このクローンの各種ＤＮＡ断片を塩基配列決定
用ベクターＭ１３ｍｐｌ８およびｓｐｌ９ＲＦ−ＤＮＡ
上に移し、グイデオキシヌクレオチドターミネーション
法（Ｓａｎｇｅｒ，　Ｆ．＋　Ｎｉｃｋｌｅｎ，　Ｓ．
および（：Ｈｌ３０ｎ，　ＡＪｌ，ｐｒ■ｃ．，ｌ１６
ｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７４＋５４６３−
５４６７（１９７７）　）により塩基配列を決定した．
一方｝ＩＳＡ−２をプローブとして行ったλｇｔｌｌク
ローンのブラークハイプリダイゼーションにおいて陽性
のシグナルを与えたクローンのうち２０個についてＩＳ
Ａ−１をブローブとして再びブラークハイプリダイゼー
ションを行い、１個の陽性のシグナルを与えるクローン
λｇｔｌｌ（｝ＩＳＡ−　ＩＩ　）を得た。

これからファージＤＮＡを調製しＥｃｏＲ　Ｉ消化物に
ついてＨＳ＾一ｌをブローブとして用い、サザーンハイ
ブリダイゼーシッンを行い１．２５ｋｂのフラグメント
（ＩＩＳＡ−　ＩＩ　）がプローブとハイブリダイズす
ることを確認した．このフラグメントの塩基配列をグイ
デオキシヌクレオチドター旦ネーション法で決定した，
　　ＩＳＡ−ＩｔはＩＳＡ−３ブローブとは交雑しなか
った．この結果ＩＳＡ−ｎはカルボキシル末端側をコー
ドする部分を欠き、ＨＳＡＩ−Ａはヒト血清ルブミンの
アミノ末端側をコードする部分を欠き、さらに３０４番
目のセリンをコードするコドン（ＴＣＡ　’）が翻訳終
止コドンのオパールコドンＴＣ．Ａに変化していること
がわかった．この２つ′のＤＮＡフラグメントの制限酵
素地図を第５図に示す．酵素認識サイトの正確な位置は
最終的な塩基配列から得た． 第５図からわかるようにＨｓＡ　Ｉ−ＡとＩＩｓＡＩＩ
の２つのＤＮＡを適当な位Ｗ（例えばＸｂａ　ＩやＰｓ
ｔｌサイト）で切断し互いに再結合すればシグナルベブ
チドやプロ配列の結合したヒト血清アルブミンの前駆体
タンパク質の全長をコードできるｃＤＮＡを構築するこ
とができる。

奎盈班表　ブースξ　ＵＣ−｝ＩＳＡ−ＣＭの　　　　
７大腸菌アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシグ
ナルベブチドと正常ヒト血清アルブミンＡが融合したタ
ンパク質をコードするＤＮＡを含むブラスミドｐＵｃ−
ｐｈｏＡ−ＨＳＡ−Ａを次の様にして造威した．ヒト肝
ｃＤＮＡライブラリイーから得たＨＳＡｃＤＮＡを含む
クローンλｇｔｌｌ（ＩＳＡ　−　Ｉ！　）からＥｃｏ
Ｒ　ＩとＸｂａ　１消化によって生じるフラグメントを
調製し、これをｐＵｃ１９ブラスミドのＥｃｏＲ　Ｉと
Ｘｂａ　Ｉとの二重消化物のうち大きな方のフラグメン
トとＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ組換えプラ
スミドｐｕｃ−ｏｓＡ−ＥＸを構築した． このブラスミドからＡｈａ　ｍとＳａｉｌの二重消化に
より生ずる小さい方のフラグメントを精製した．このフ
ラグメントは戒熟正常ヒト血清アルブミンＡタンパク質
の１２番目のＬｙｓから３５６番目のＴｈｒまでをコー
ドする．ｔｃ熟正常ヒト血清アルブξンＡタンパク質を
アごノ末端からコードする遺伝子を構築するために５′
端に相当するＤＮＡ配列を、化学合威したフラグメント
２本をア二一・ルすることにより作威した。この合戒Ｄ
ＮＡ配列はアルカリ性ホスファターゼのシグナルベプチ
ドをコードするＤＮＡ配列と融合できるように｝１ρａ
Ｉ［及びＣｌａ　Ｉ酵素切断によって生ずる粘着末端配
列ＣＧを５′端側に有し成熟正常ヒト血清アルプ果ンＡ
タンパク質の１番目のアミノ酸Ａｓｐから１１番目のア
ミノ酸Ｐｈｅをコードする配列を有している。

このアニールさせたＤＮＡ配列にＴ４ボリヌクレオチド
キナーゼを作用させて５′端をリン酸化させたものと、
ｐＵｃ−ＩＳＡ−ＥＸから生じたＡｈａ　ＩＩＩ　／　
Ｓａｌ　１二重消化物とを混合し、さらにこれに大腸菌
のマルチコビークローニングベクターの代表的なものの
一つｐＡＴ１５３　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、Ｔｗｉｇ
ｇ，　Ａ．Ｊ．及びＳｈｅｒｒａｔｔ，　Ｄ．Ｎａｔｕ
ｒｅ　２８３　２１６−２１８．　１９８０）のＣｌａ
　Ｉ／Ｓａｉｌの二重消化物のうち大きなフラグメント
と混合し、この３者をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより結合
させ、組換えブラスミドｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸを得た。

このブラスミド上で正常ヒト血清アルブミンＡの１位の
アξノ酸Ａｓｐから１１位のアミノ酸Ｐｈｅをコードす
るＤＮＡ配列がつながった．　ｐＡＴ−Ｈｓ＾一ＣＸを
ＥｃｏＲ　Ｉ　／　Ｘｂａ　ｌで二重消化し、正常ヒト
血清アルブ亀ンＡのＡｓｐ　１　〜Ｐｈｅ３５６をコー
ドするＤＮＡ配列を含む小さい方のフラグメントを得た
．一方ＵＳＡ−Ａのカルボキシル末端側をコードするｃ
ＤＮＡは、ヒト肝ｃＤＮＡライブラリイーから得たクロ
ーンλｇｔｌｌ（ＨＳｘ　Ｉ−Ａ）から外来ｃＤＮＡ配
列の挿入されているＥｃｏＲ　Ｉフラグメントを調製し
、ｐＵｃ１８ブラスミドのＥｃｏＲ　Ｉサイトに挿入す
ることにより組換えプラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−　１中
にクローニングした。

これより｝ＩＳＡ−Ａの３５８番目のアミノ酸Ｌｅｕか
らカルボキシル末端の５８５番目のＬｅｕをコードし、
さらに３′側の非翻訳領域６２ヌクレオチドを含むＸｂ
ａ　ｒ　／　Ｈ　ｉｎｄ　［１の二重消化物を調製した
。これをｐＡＴ−ＨＳＡ−ＣＸより得たＥｃｏＲ　Ｉ　
／　Ｘｂａ　Ｉ二重消化物及びｐｕｃｉｓのＥｃｏＲ　
Ｉ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ二重消化物のうち大きなフラグメ
ントと混ぜてＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行
い、戒熟正常ヒト血清アルブξンＡのｃＤＮＡ全体を含
む＆ｌｌ換えブ７　スＱドｐＵｃ−｝ＩＳＡ−ＣＨを得
た． 成熟正常ヒト血清アルブミンＡの全アミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を
第８−１図〜第８−３図に示す。

次の配列を有する４種類のオリゴヌクレオチド＝１．　
ＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣＡＴ
ＣＴＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴ２．　　ＡＧＡＡＣＡＡＧＡ
ＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＡ
ＣＴＴＣＡＴＧ３．　ＣＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣ
ＴＴＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡＣＧ４
．　　ＣＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡ
ＧＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧを、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ．Ｍ．
Ｄ．及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ．Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２１．７１９（１９８０
）に記載されているホスホアξダイト法により、自動Ｄ
ＮＡ合威機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓモ
デル３８０Ｂ）を用いて合成した．オリ，ゴヌクレオチ
ド断片をＴ４ボリヌクレオチドキナーゼにより５′−リ
ン酸化した後、アニーリングせしめ、次にＴ４　ＤＮ＾
リガーゼにより連結して、プレブロ配列をコードする一
個の二本鎖ＤＮＡを得た． 正常ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡを含むブラスミド
ｐＵｃ−ＨＳＡ−ＣＩ｛　（参考例２）を制限酵素Ｅｃ
ｏＲ　Ｉ及びＣｌａ　Ｉで二重消化して大きい方のフラ
グメントを得、これを前記の合戒ＤＮＡとＴ４　ＤＮＡ
リガーゼにより結合させブラスミドｐＵｃ−｝ＩＳＡ−
［！Ｈを作成した。

ｐＵｃ−１１ＳＡ−ＥＨブラスξドをビｃｏＲ　Ｉで処
理し開環し、バクテリアアルカリ性ホスファターゼで５
′−リン酸基を除去後、 の配列から戒るＸｈｏｌＭ！２ｉＪｋ部位を含むＸｈｏ
　ＩリンカーとＴ４　ＤＮＡリガーゼにより結合させ環
状ブラスミドｐＵｃ−Ｘ−ＩＳＡを作成した． ヒト血清アルブξンＡのｃＤＮＡの３′側領域を含有す
るλｇｔｌｌ　ＯＩＳＡ−ＩＡ）　（参考例１、第５図
〕をＥｃｏＲ　Ｉにより消化してヒト血清アルブミンＡ
のｃＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントを得、これを
ＥｃｏＲ　１により切断したブラスミドｐＵｃ１Ｂに連
結してプラスミドｐＵＣ−ＩＳＡ−　１　’を得た。こ
のプラスミドｐＵＣＩＳＡ−　１　’をＨｉｎｄｌｌｌ
で切断しＨＳＡのボリＡ配列及びＡＡＴＡＡＡシグナル
を含む小さい方のフラグメントを得て、これを｝Ｉｉｎ
ｄｌ［Ｉ処理で開環しアルカリ性ホスファターゼで処理
して末端の５′リン酸基を除去したｐＵｃ−Ｘ−ＨＳＡ
　ニ組み込みｐＵｃ−Ｘ−ＩＳＡ−Ａブラスミドを作成
した。

量主員五　　一スミ゛ＪＤＢ−Ｎｅｏの　　　　　Ｏ基
本となる大腸菌一酵母菌シャトルベクターとして市販さ
れているプラスξドｐＪＤＢ２０７　（アマシャム）を
使用した。また、Ｎｅｏ　（アミノグルコシドホスホト
ランスフェラーゼ３’　　（１））遺伝子源として市販
されているプラスミドｐＮＥｏ　（ファルマシア）を使
用した。プラスミドｐＮＥＯを旧ｎｄＩＩＩ及びｔｉｃ
ｏＲ　Ｉにより二重消化し、大きい方のフラグメントを
得た．次に、下記の配列： ム娃土　　　　　　　　　　Ｂｉｎｄ且５′　−＾ＡＴ
ＴＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴ
ＴＣＧＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＧＡ−
　５　’を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、前記ｐ
ＮＥＯの大きい方のフラグメントにＴ４　ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結・環状化してプラスミドｐＮｅＯ−ＰＬ
を得た。

前記二本鎖オリゴヌクレオチドは５′一末端にＥｃｏＲ
　Ｉ粘着末端配列を有し、３′一末端に旧ｎｄＩＩＩ末
端を有するほか、内部に旧ｎｄｌｌ［，Ｘｈｏｌ及びＳ
ｍａ　１部位を有する。従って前記ブラスミドｐＮｅＯ
ＰＬはＮｅｏ遺伝子の上流に複数の制限酵素切断部位を
有する。次に、このブラスミドｐＮｅＯ−ＰＬを１１ｉ
ｎｄＩ［！及びＢａｇ｝Ｉ　Ｉにより二重消化し、ｌ。

４ｋｂフラグメントを得た。ブラスミドｐＪＤＢ２０７
を旧ｎｄｌ及びＢａｍＨ　Ｉにより二重消化し、２ハ酵
母複製起点及び標識遺伝子ＬＥ０　２等を含有するベク
ターフラグメントを得た．次に、これらのフラグメント
をＴ４　ＤＮ＾リガーゼにより連結することによりプラ
スミドｐＪＤＢ−ＮｅＯを得た。

酵母菌ＡＩ２２株の染色体ＯＮＡ　１００ｘを１ユニッ
トのＳａｕ３ＡＩと３７゜Ｃ，１５分反応させた（２０
０Ｉ１ｌの？　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１｛ＣＩ（ｐＨ７．
　５）．　　７ＩＩ＋Ｍ　ＭｇＣｈ＋　　５　ＯＲＩＭ
ＮａＣｌ中〕．１０Ｉｉの０．　５　Ｍ　ＥＤＴＡ　（
ｐＨ．　Ｏ　）を加え、６５゜ＣＩＯ分反応させ、酵素
を失活させた。５％シ！！糖−Ｔ　Ｅ　（Ｔ　Ｅ　：　
１　０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ｝１７．　５　）
１　ｍＭ　Ｉ！ＤＴＡＩと２０％ショ糖一ＴＥを用い、
密度勾配を全量１２＋＋ｔｌ２で作製した。この勾配の
上に上記反応液を重層し、ベックマン社のＳＷ４１ロー
ターを用い、２２κｒｐｍで１５時間、１６゜Ｃで遠心
した。

遠心後、各分画について電気泳動を行い、１５ｋｂ〜２
０ｋｂのフラグメントを含む画分に５０４の３Ｍ酢酸ナ
トリウム液（ｐＨ５．２）を加え、次に１−のエタノー
ルを加え、よく混合した後、−２０″Ｃに一夜静置し、
ＤＮＡを沈澱させた。遠心（１５κｒｐｍ、５分、４℃
）により、Ｄ　Ｎ　Ａ沈渣を回収した．この沈渣を７０
％エタノールで洗った後、減圧乾燥した．以上の操作に
より、５ＫのＤＮＡを得た。

このＤＮＡＩＩ！ｇを２ｎのＥＭＢＬ　３のアーム（Ｓ
　ｔｒａ　ｔｅｇｅｎｅ社製）、及び３５０ユニットの
７４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）と混ぜ、１６゜Ｃで一
夜反応させた〔反応液：１　０Ｊ１１の５　　０ｄ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５　　）　　，　　１　　
０ａ＋Ｍ　　ＭｇＣｌ１　０ｍＭ　ＤＴＴ，　　１ｍＭ
　ＡＴＰ）。上記反応液ｌ！Ｊ１を用い、ＧＩＧＡ−Ｐ
ＡＣＫ　Ｐｌｕｓキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ．　Ｉ
ＩＧＰ６−Ｐ）により、インビト口・バッケージング反
応を行った。

その結果、３　Ｘ　１　０’ｐｆｕの、大腸菌Ｐ　２３
９２株（ｈｓｄＲ　５１４（ｒｋ−，　ｍｋ”），　ｓ
ｕｐＥ４４．　ｓｕｐＦ５８．　ＩａｃＹＩ．ｇａｌκ
２．　ｇａｌＴ２２．　ｍｅｔＢ１，　ｔｒｐＲ５５，
　　（Ｐ２））に感染しうるファージを得た。１０００
ｐｆｕのファージを５０〆のＰ　２３９２細胞に加え、
３７゜Ｃで２０分反応させた後、２．　５　ｄのＬ−Ｔ
ｏｐ−八ｇａｒｏｓｅ　（　Ｌ　Ｂ培地（ｌ％トリプト
ン、０．　５％酵母エキス、１％ＮａＣ１）中０．７％
アガロース］と共に、直径９０ＩｎｌｌのＩ７−プレー
１−　（ＬＢ培地＋１．５％寒天）にまいた。このよう
なプレートを５枚用意し、３７゜Ｃにて一夜培養し、ブ
ラークを形威させた。プラークの形威されたプレートを
１時間４゜Ｃで保存した。

ｌｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（アマシャム）をアガロース面に密
着させ、室温に２分静置した。膜をアガロースからはが
し、接着面を上に、０．　５　Ｎ　Ｎａｉｌ，　　Ｉ　
Ｍ　ＮａＣ１を浸した。３ＭＭフィルター（Ｗｈａｔｍ
ａｎ）上に５分間置いた。膜を０．　５Ｍ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　（ｐＨ７．　２　）　　．　１．　５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌに浸した３ＭＭフィルター上に移し、５分静置した
．２ｘｓｓｃ液で膜を洗い、風乾させた。

風乾した膜をサランラップで包み、Ｕｖ照射し、ＤＮＡ
を膜に固定した．この膜を、ＡＤＣＩ遺伝子の翻訳領域
のアミノ末端よりｌＯ残基に相当する塩基配列を化学合
威したブローブＡＤＨ（５’ＡＴＧＴＣＴ　ＡＴＣ　Ｃ
ＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＴ
Ｔ）とハイブリダイズさせた。膜を洗浄後サランラップ
に包み、Ｘｌ？Ａ−　５フィルム（コダック社）に密着
させ、Ｉｎｔｅｎ−ｓｌｆｙ　ｓｃｒｅｅｎを用い、−
７０゜Ｃにて５時間露光させた． 現像後、ハイブリダイゼーシジンシグナルを与えたプラ
ークをパスツールピペットの先でかきとり、１００Ｉ１
１のＴＭ液（　１　０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ
Ｈ　７．　５　）１　０ｍＭ　ＭｇＣ１＊）に懸濁し、
室温に２０分間静置した．懸濁液０．　５　ｌ１ｌをｌ
ｄのＴＭ液で希釈し、そのうち５ｄを前述した方法で大
騙菌Ｐ　２３９２に感染させ、直径９０閣のプレートに
まきプラークを形成させた．形威させたブラークは、再
度上記のようにブラークハイプリダイゼーションを行い
、単一ブラークからなるボジチイブクローンを得た。ポ
ジティブプラークをバスツールピペットの先でかきとり
、５０バのＰ　２３９２細胞に加え、３７゜Ｃで２０分
間静置した後、液を２−のＬＢ培地、１０ｍＭ　ＭｇＳ
Ｏ４に加え、３７゜Ｃで６時間振とう培養した。

クロロホルムを１００ｕ１加え、ボルテックスξキサー
にかけ完全に溶菌させた。２．　５０Ｏｒｐｍで５分遠
心し、上清を得た。この上清中に１０１０オーダーのフ
ァージが含まれていた。この上清８００Ｉｌ１に１００
ｌの５ＭＮａＣ１を加え、次に５４０ｕｔのイソブロバ
ノールを加えよくまぜ、−２０゜Ｃで２０分間静置した
。遠心し、得た沈渣を５００　ｍの７０％エタノールで
洗い、２００　ｕｌのＴＥに溶解させた。

１ｍ（６０ユニット／Ｉｌ１〕のＤＮａｓｅ　Ｉ　　（
宝酒造）と、２ｕ！のＩＭ　ＭｇＣＩ，を加え、３７゜
Ｃで３０分反応させた．　　１００ｍのＴＥ飽和フェノ
ールを加え、ボノレテックスミキサーで冫昆合した。１
２Ｋｒｐｍ、５分遠心し、得られた水層をフェノール／
クロロホルム（１　：　１）で一回抽出した。得られた
水層に２０ＩＩ！の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）
を加え、さらに５００ｐ１のエタノールを加え、遠心し
てＤＮＡを沈澱させた。得られた沈渣を７０％エタノー
ルで洗った後、減圧乾燥させ、そして５０ｐ１のＴＥに
溶解した．この操作で１４相当のファージＤＮＡが得ら
れた。得られた溶液２０μに、２．２バのｌＯ倍濃度Ｅ
ｃｏＲ　Ｉ緩衝液（０．　５　Ｍ　ＮａＣ１　，　０．
　５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７．　５　）　　．
　７　０＋＋＋Ｍ　ＭｇＣｌｚ）を加え、ｌｊ１！（５
ユ−１−７ト／ハ）のＥｃｏＲＩ（ニッポンジーン）と
１バのｌｏｎｇ／ｄのＲＮａｓｅＡ　（Ｓ　ｉｇｍａ　
）を加え、３７゜Ｃで１時間反応させた。反応後、０．
７％アガロース電気泳動を行い、常法に従い、ＤＮＡバ
ンドをＨｙｂｏｎｄ　Ｎ膜にブロッティングした。ＤＮ
Ａの結合したＨｙｂｏｎｄ−Ｎ膜は、プラークハイプリ
ダイゼーションと同一の条件でハイブリダイゼーション
を行った．このようにして得られたいくつかのクローン
のうち、λ−ＭＤＩでは、８．４ｋｂのＥｃｏＲ　Ｉフ
ラグメントにブローブが結合することが分かった．残り
のＤＮＡ？９液のうち２０ｍを、前述の条件下で、Ｅｃ
ｏＲ　Ｉにより切断し、Ｏ．・７％アガロースゲル電気
泳動でフラグメントを分離した。８．　４　ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲ１フラグメントを含むアガロース断片を切り出し、
グラスパウダー法（Ｇｅｎｅ　Ｃｌｅａｎ”，　Ｂｉｏ
−１０１社）により、ＤＮＡをアガロースから分離、精
製した。

１０バのＴＢ中に溶出されたＤＮＡを、ＥｃｏＲ　１で
切断したｐｌＪｃｌ９と連結反応させ（　３　Ｑ　ｎｇ
　ｐｌＪｃｌ９，５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ｝
１７．５　）　　．　ｔ　ＯｗＭ　ＭｇＣｌｇ　，　１
　０靖ＭＤＴＴ．１一門＾ＴＰ．３５０ユニットＴ４　
ＤＮＡリガーゼ／３０ｕｌ中、ｌ６゜Ｃ、２時間〕、反
応液５ｊｌ！を用いて大騙菌ＪＭ１０７を形質転換させ
た．形質転換した大腸菌を５　０　ｎ／　ｄ　Ｘ　−Ｇ
ａｌ　（　５−ブロモー４一クロロ−３−インドリルー
β一Ｄ−ガラクトシド）、５ｍｌＰＴＧ（イソブロビル
ーβ−Ｄ−チオガラクトビラノシド）、５０Ｉ！ｇ／Ｉ
ｄアンピシリンを含むＬ一プレート（Ｘ−Ｇプレート）
にまき、コロニを形威させた．発色していないクローン
を５０眉／ｄアンピシリンを含む５ＩＩｉのＬＢ培地に
接種し、３７゜Ｃで一夜培養し、菌を増殖させた。ごニ
プレパレーション法によりＤＮＡを調製し、最終的に得
られたエタノール沈澱を５０ｄのＴＥに溶解させた。調
製したＤＮＡの内５バをＥｃｏＲ　Ｉで切断し（５　　
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５　　）　　　
．　　７ｓＭ　　ＭｇＣ１ｇ　　，　　５　　０ｍＭ　
ＮａＣ１　，　１　ｍｇ／ｄ　ＲＮａｓｅＡ　，　５ユ
ニットＥｃｏＲ　１／１５Ｊ）、０．７％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、８．４ｋｂのＥｃｏＲ　ｌフラグメ
ントがｐＵＣに挿入されていることを確かめた．さらに
、サザーン法により、このフラグメントがブローブと結
合することを確かめた。このようにして得られたクロー
ンｐＥｃＯ８．４のＤＮＡを精製し、０．５■をＳａｕ
３＾ｌで完全分解し（　５　０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　（ｐＨマ．５），５０ａ＋ＭＮａＣ１　．　７　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ，、４ユニットＳａｕ３ＡＩ／　１　５　
１中、３７゜Ｃ、２時間）、０．７％アガロースゲル電
気泳動によりＤＮＡフラグメントを分離した。

１，　６　ｋｂフラグメントを含むアガロース断片より
、ＣｅｎｅＣＩｅａｎ”により、ＤＮＡを１０ｌｌＩＴ
Ｅ中に回収した。

これをＢａｍＨ　Ｉで切断したｐＵｃ１１９と連結反応
させ、反応液の５１１１を用い、大腸菌１’ｌＶ１１８
４を形質転換した。形質転換した大腸菌をＸ−Ｇプレー
トにまき、コロニーを形成させた。発色しないコロニー
のＤＮＡをξニブレパレーションで調製し、分析を行っ
た。５ｍＤＮＡをＥＣＯＲ　Ｉと旧ｎｄＩ［［で切断し
たもの（５ユニットＥｃｏＲ　Ｉ、５ユニット旧ｎｄＩ
ｎ）、及び６ユニットＳｐｈ　Ｉで切断したものをそれ
ぞれゲル電気泳動で分析し、前者においては１．６ｋｂ
のフラグメント、後者においては、１．Ｏｋｂのフラグ
メントを生ずるクローンを選別した．このようにして得
られたクローン、ｐＳａｕ　１．　６のＤＮＡを調製し
、以下の実験に用いた． ＤＮＡ５ｆｆをＳｅａ　ＩとＳａｃ　Ｉで切断した［１
０ｍＭＴｒｉｓ−｝ＩＣＩ（ｐＨ７．　５　）　　，　
２　０ｍＭ　ＫＣＩ　，　７ｄ　ＭｇＣｌｚ、２０ユニ
ットＳｓａ　ｌ、２０ユ−’−７１Ｓａｃｌ／５０メ，
３７゜Ｃ、２時間〕．反応終了後、フェノールークロロ
ホルムで抽出し、エタノール沈澱にヨリＤＮＡを回収し
た。ＤＮＡ沈渣を５　０　ｐｌのＥｘｏ　Ｉ［［緩衝液
（５　（ｌｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．　０　）
　　，　　１００ａＭ　ＮａＣＩ　，５ｍＭ　ＭｇＣ１
ｇ　，　１　０ｍＭ　２−メルカブトエタノール）に溶
解させた．もう一本のチューブに５０ＪＩＩのＭＢ緩衝
液（４０勤門酢酸ナトリウム（ｐＨ４．　５　）、１０
０ｍＭ　ＮａＣｌ　，　２ｍＭ　ＺｎＣ１ｇ　，　１　
０％グリセロール〕を入れ水中に置いた，ＤＮＡ液に１
８０ユニットのｆ！ｘｏ　ｍヌクレアーゼ（宝酒造）を
加え、３７゜Ｃに保温した．酵素添加後３０秒ごとに５
１１１をサンプリングし、ＭＢ緩衝液の入ったチューブ
に移した。゛サンプリング終了後、氷上のチューブを６
５゜Ｃ１５分保温し、次に３７゜Ｃに冷し、５０ユニッ
トのマング・ビーンヌクレアーゼを加え、３７℃、３０
分保温した．反応後、この液をＴＥで飽和させたフェノ
ールで抽出し、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した．回
収したＤＮＡを３０バのＴＥに溶解させた．　　ｌＩ１
１をとり２μのＩＯＸライケーション液（５００＠Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ　７．　５　）　．　１００
ａＭ　ＭｇＣＩｘ　，１００ｍＭ　ＤＴ７　．　１　０
　ｓ＋Ｍ　ＡＴＰ）を加え、ｌ６パのＴＥ，１ｉｌ１の
７４　ＤＮＡリガーゼ（３５０ユニット／ｔ１１）を加
え、１６゛Ｃで一夜保温した．次に、７０゛Ｃにて１０
分間保温し、リガーゼを失活させた後、０．２ＭＫＣＩ
を２バ、Ｓｅａ　ｌをｌＩｌｌ（１０ユニット／ｌｔｌ
）加え、３７゜Ｃ、１時間保温した．次に７０゜Ｃにて
５分間保温し、水中に移した。

これを用い、ＭＶ１１８４を形質転換させ、形質転換体
を一夜３７゜Ｃで培養し、コロニーを形威させた．コロ
ニーからＤＮＡを調製し、欠失変異が生じているクロー
ンを検出した．次に、欠失の起こっているクローンの一
本鎮ファージＤＮＡ−ｔ−調製した。

ファージＤＮＡは、７−ＤＥＡＺＡ−ジデオキシ・シー
クエンシングキット（宝酒造）を用い、メーカーマニュ
アルに従い、配列決定を行い、ＡＴＧまた上流−１０ｂ
ｐまで欠失したクローンｐＤＢ６−１０を得た。ｐＤＥ
６〜１０のＤＮＡを調製し、１罐ＤＮＡをＥｃｏＲ　Ｉ
で完全消化し、１００ハのＴＥに溶解させた．この冫容
液２Ｉ１１に１００ｎｇのＸｈｏリンカー（ＡＡＴＴＧ
ＣＴＣＧＡＧＣ）を加え、１ｉ１１のｉｏｘライゲーシ
ッン液、１４のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（３５０ユニット
）及び６　ｐｌの滅菌蒸留水と混合し、計１０バの反応
液中で連結反応させた（１６゜Ｃ、２時間）。７０“Ｃ
にて１０分間保温し酵素を失活させ、ｌｊ１ｌの０．　
５　Ｍ　ＮａＣ１，　５ユニソトのＥｃｏＲ　ｌを加え
、３７゜Ｃ３０分間保温した後、これを用いて、大腸菌
ＭＶ１１８４を形質転換させた．得られたコロニーから
ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲ　Ｉで切断されず、Ｘｈｏ　
Ｉで切断されるクローンを選別した。このようにしてｐ
ＤＢ６−　１０　（Ｘｈｏ）　（プロモータ一カセット
ベクター）を得た． このベクターｐＤＥ６−１０　（Ｘｈｏ）を含有する大
腸菌Ｅｓｃｈｅｒｋｃｈ：ａ　ｃｏｌｉ　？ＩＶ１１８
４／ｐＤＥ６−１０（Ｘｈｏ）は工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第１０３１１号（ＦＥＩ？Ｍ　
Ｐ−１０３１１）として寄託されている．ｐＥｃＯ８．
　４　　ｉ　ｎを４ユニットのＢａｌｌで切断した（　
１　０＋Ｍ　Ｔｒｔｓ−｝ＩＣＩ（ｐＨ７．　５　）　
，　７ｍＭ　ＭｇＣｈ／２０ｄ．３１℃、１時間）．次
に、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌを３４加え、４ユニットのｓｐｈ
　ｌを加え、１時間３７゜Ｃに保温した．反応後０．　
７％アガロースゲル電気泳動を行い、ｌｋｂのフラグメ
ントを分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎでＤＮＡを抽出した
。回収したＤＮＡを、ｓｐｈ　ＩとＳ醜ａｌで切断した
ｐＵｃ１１８と連結反応させ、ＭＶ１１８４を形質転換
させた．形質転換クローンからＤＮＡを調製し、フラグ
メントの挿入されたクローンを捜した．このＤＮＡを調
製し、ｌＩｌＩＺＤＮＡをＳｐｔ＋　Ｉ及びＨｉｎｄｌ
ｌｌで切断し（　Ｉ　ＸＥｃｏＲ　Ｔ緩衝液、４ユニッ
トＳｐｈｌ，１２ユニットＨｉｎｄｌＥ）　、１．　２
％アガロースゲル電気泳動を行い、０．３３ｋｂフラグ
メントを単離し、そしてＧｅｎｅ　ＣｌｅａｎによりＤ
ＮＡを抽出した．これを、プラスミドｐＭＭＴＶ−ＰＬ
Ｉを＋１ｉｎｄＩｎ及びＳｐｈ　Ｉにより二重消化して
得られた５．マｋｂフラグメント５０ｎｇと連結反応（
全反応溶液量２０Ｉ１ｌ）させた。

反応後、大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させ、アンビシリ
ンを含むし−プレート（Ｌ−ａ＋ｉｐプレート）上でコ
ロニーを形成させた。コロニーよりＤＮＡを調製し、制
限酵素分析により挿入ＤＮＡを調べ、目的とするフラグ
メントが挿入されたクローンを得た。そのクローンから
ＤＮＡを調製し、その０．５ｎを旧ｎｄｌ［Ｉで切断し
た。７０℃５分保温して、氷上に移し、１ｎの１ｍＭ　
ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
Ｐを各々１ｍＭ含む）、と２ユニットのＤＮＡポリメラ
ーゼＩ　（κｌｅｎｏ−フラグメント）（宝酒造）を加
え、３７゜Ｃで３０分間保温した．フェノール・クロロ
ホルムで除蛋白後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた，
ＤＮＡを１０Ｉ１１の１×ライゲーシツン液に溶かし、
３５０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを加え、ｌ６゜Ｃで
一夜保温した．７０゜ＣでｌＯ分間処理し、リガーゼを
失活させた後、０．　５　Ｍ　ＮａＣｌを１．２〃、｝
１ｉｎｄＩ［１を１２ユニット加え、３７゜Ｃで３０分
間処理した．これを用い、大腸菌ＪＭｌ０７を形質転換
させた，　　Ｌ−ａｍｐプレートに形威されたコロニー
の一部をＬ−ａｍｐ液体培地（Ｌ−ａｍｐプレートから
寒天を除いたもの）中で培養し、得られた菌体からＤＮ
Ａを調製し、旧ｎｄｌ［Ｉサイトが失われたものを得た
．次に０．　５　ｎ　ＤＮＡを４ユ−１−　ットのＢａ
ｒａＨ　１、１２単位のｓｐｈ　Ｉで切断した（　１　
０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１−ＩＣＩ　（ｐＨ７．　５　）
　　．　１５０ｄ　ＮａＣ１　．　７ｍＭ　ＭｇＣｌｇ
）。１．　４％アガロースゲル電気泳動で、０．３４ｋ
ｂのＤＮＡフラグメントを分離し、Ｇｅｎｅ　Ｃｌｅａ
ｎでＤＮＡを１０ｌｌＩのＴＥ中に回収した．これを３
０ｎｇのｐＴＡ１５３を、Ｂａｇ｝ｌ　１及びｓｐｈ　
Ｉで切断して得た３．５ｋｂフラグメントと連結反応さ
せた． 反応液で大騙菌ＪＭ１０７を形質転換させ、Ｌ−ａｍｐ
プレートにコロニーを形威させた．コロニーの一部をＬ
−ａｓｐ液体培地中で培養し、得られた菌体からＤＮＡ
を調製し、０．４２ｋｂのサイズＢａｍｔｌ　Ｉ　−　
Ｓａｌ　Ｉ二重消化物（ＤＮＡフラグメント）を与える
クローンをさがした．クローンから得られたＤＮＡ０．
５Ｋを、ＢａｓＨ　Ｉ及びＳａｉｌで切断し、１．４％
アガロースゲル電気泳動により、０．４２ｋｂフラグメ
ントを分離し、Ｇｅｎｅ　Ｃｌｅａｎにより５〃のＴＥ
中に回収した。これを、Ｂａｇ｝Ｉ　Ｉ　　　Ｓａｌ　
ｌで切断した１０ｎｇのｐｌＪｃ−１１９と連結反応さ
せた．反応液１パを用い、大腸菌ＭＶ１１８４を形質転
換させ、ＸＧプレートにまき、コロニーを形成させた．
白色のコロニーより、ＤＮＡを調製し、フラグメントの
挿入されたものを得た（ｐＵｃ−ＡＴＥ　ｉターミネー
ターカセット・ベクター）． このベクターｐＬＩＣ−ＡＴＥを含有する大腸菌Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ並旦門Ｖ１１８４　（ｐｔｌｃ−ＡＴ
Ｅ）は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１０３１０号（ＦＥＲ？Ｉ　Ｐ−１０３１０）として寄
託されている。

プロモーターカセットベクターｐＤＥ６−　１０　（Ｘ
ｈｏ）０．　５　ｎを旧ｎｄＩ［Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで切
断し、０．　７％アガロースゲル電気泳動により１．　
６　ｋｂのフラグメントを分離した。一方、ｐＪＤＢ−
Ｎｅｏ　Ｏ．　５　ｎを旧ｎｄｌＩＩ及びＸｈｏ　Ｉで
切断し、８ｋｂフラグメントを分離した．両者を連結し
大腸菌ＪＭｌ０７に導入し、アンピシリン耐性コロニー
を得た。コロニーよりＤＮＡを得、挿入フラグメントを
（ｉ！認した（ｐＡＨ６−　１０−　Ｎｅｏ　）。

ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ　０．　５　Ｉ！ｇをＢａｍ｝ｌ　ｌ
及びＳａｌ　１で切断し、約８ｋｂのフラグメントを分
離した．一方１ｎのｐＵＥ−ＡＴＥをＢａｗｌ　Ｉ及び
Ｓａｌ　Ｉで切断し、０．４２ｋｂのフラグメントを分
離した。両者を連結し、形成されたプラスξドにより大
腸菌Ｊ旧０７を形質転換させ、アンビシリン耐性コロニ
ーを得た。これらのコロニーよりＤＮＡを調製し、目的
のブラスミドｐＪＤＢ−Ｎｅｏ−＾ＴＥを有しているこ
とを確かめた。ｐＪＤＢ−Ｎｅｏ−ＡＴＥ　０．　５　
／Ｉｇを旧ｎｄＩｎ及びＸｈｏ　ｌで切断し、約８ｋｂ
のフラグメントを得た。一方、ｐＤＥ−６−１０（χｈ
ｏ）より、１．　６　ｋｂのＨｉｎｄＩｌｒ−Ｘｈｏ　
Ｉフラグメントを回収した．両者を連結し、形成された
ブラスミドにより大腸菌ＪＭ１０７を形質転換させた。

アンビシリン耐性コロニーのＤＮＡを調べ、目的のプラ
スミド（ｐＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−ＡＴｔｉ）を有して
いるクローンを見つけた。

このベクターを含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉＪＭｌ０７／ｐＡＩＩ６−　１０−　Ｎｅｏ
−ＡＴＥは工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第１０３０９号（ＦＥＲＰＩＰ−１０３０９）として
寄託されている． ４，図面の簡単な説明 第ｌ図はプラス藁ドｐＵＣ一αＦの作製の過程を示す。

第２図はブラスξドｐＵｃ−αＦ−ＩＳＡ−Ａの作製の
過程を示す． 第３図は発現ブラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−αＦ−ＨＳ
八−Ａの作製の過程を示す． 第４図は、本発明の発現プラスミドｐＪＤＩｌ−ＡＤＨ
−αＦ−｝ＩＳＡ−Ａにより形質転換された酵母培養物
の、細胞抽出物（レーンｌ）、上清画分（レーン２）、
及び対照としてのヒト血・漬由来のＩＳＡのエエスタン
プロット図である。

第５図はこの発明の正常ヒト血′清アルブミンＡの全体
をコードするｃＤＮＡ（ＨＳＡｃＤＮＡ）　、並びにこ
のｃＤＮＡＯ造威に使用された、３′末端側をコードす
るｃＤＮＡ　（ｔ｛Ｓ＾−ＩＡ）及び５′末端側をコー
ドするｃＤＮＡ（ＩＳＡ−　ｎ　）の制限酵素地図を示
す。

第６図は、ヒト血清アルブミンＡのｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した３種のブローブの塩基配列を示す． 第７図は、プラスミドｐＬｌｃ−＋ｔｓ＾−ＣＩ１の作
製の過程を示す。

第８−１図〜第８−３図は、ヒト血清アルブミン八の全
体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。

第９図は、ブラスξドｐｔｌｃ−Ｘ−ＩＳＡ−Ａの作製
の過程を示す。

第ｌＯ図はプラスミドｐＪＤＢ−Ｎｅｏ作製の過程を示
す． 第１１−１図及び第１１−２図は本発明のＡＤ｝ｌ　Ｉ
プロモーターカセットベクターｐＤＥ６−１０（Ｘｈｏ
）の作製の過程を示す。

第１２−１図及び第１２−２図は、ＡＤＨＩター旦ネー
ターカセットベクターｐＵｃ−ＡＴＨの作製の過程を示
す． 第１３図は、酵母用発現ベクター（ＡＤＨ　Ｉサンドイ
ンチベクター）ρＡＨ６−１０−Ｎｅｏ−＾ＴＥの作製
の過程を示す。

特許出願人 東亜燃料工業株式会社 特許出願代理人 弁理士　青　木 弁理士　石　田 弁理士　福　本 弁理士　山　口　昭 弁理士　西　山　雅 第８−１回 し八八　一し−　＾＾−　１．ｔＬ−’ｉ−　　Ｔｕｌ
ａ　　’ｌ’Ｌ＝’ｉ’　　ＬｙｕＬ　　八Ａ八　Ｌ八
し　ＭｔＡ　　し↓Ｃ　　ＡＡ（ｉ　　’ｌ“しｒ第８
−２回 第８−３回 ＧＡＴ　ＭＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣ　ＴＧ（．：　ＴＴＴ　
！ｊＵＬ：　（ｊＡ（ｊ　ＣｉＡ＆　（ｊもｌ’　／Ｖ
仏八八八し五１−５８８一 Ｕ」 第１頁の続き ［株］Ｉｎｔ　ｅｌ．’ 識別記号 庁内整理番号 −５９１−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＭＦα１のプレプロ配列をコードしているリーダー
   ＤＮＡ配列と該リーダー配列の下流に存在するヒト血清
   アルブミンＡをコードするｃＤＮＡとを有するＤＮＡ。 ２、ＭＦα１のプレプロ配列をコードしているリーダー
   ＤＮＡ配列、ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮ
   Ａ、及びポリ（Ａ）配列をこの順序で有するＤＮＡ。 ３、前記プレプロ配列が次の式： Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐ
   ｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＶａｌＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ
   　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　
   ＡｌａＰｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈ
   ｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＡｌａ　Ｇｌｎ　
   Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｉ
   ｌｅ　Ｇｌｙｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ
   　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　ＶａｌＡｌａ　Ｖ
   ａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅ
   ｒ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　
   Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＩｌｅＡｌ
   ａ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ
   　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＶａｌＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌ
   ｙｓ　Ａｒｇ で表わされる、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。 ４、酵母で機能し得るプロモーターとターミネーターと
   の間に請求項２に記載のＤＮＡが発現可能な方向に挿入
   されている発現プラスミド。 ５、請求項４に記載の発現プラスミドにより形質転換さ
   れた酵母。 ６、請求項５に記載の酵母を培養し、成熟ヒト血清アル
   ブミンＡを産生・分泌せしめ、これを採取することを特
   徴とする成熟ヒト血清アルブミンＡの製造方法。