JPH0343073A - 種々の温度で活性を有する特異な微生物リパーゼ及び該リパーゼを含有する洗剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の産業上の利用分野） 本発明は、特異なリパーゼ、更に詳細には、洗剤組成物
に使用するのに適したリパーゼに関する。

（従来の技術〉 良好な最近の洗剤は、布から多種の土壌を除去し得る必
要があるが、本発明は主として脂肪及び油の型のじみを
除去するという問題に向けられる。

従来の合成洗剤はビルダーとして多量のトリポリリン酸
ナトリウム（ＳＴＰＰと称する）及び関連化合物を含み
、これらのビルダーは、洗浄水のｐＨを上げ、かつ脂肪
及び油の乳化を助け、これにより布からそれらの除去を
行なう。しかしながら、近年、洗剤組成物からホスフェ
ートの除去または減少は、環境上の関心のため、洗剤製
造業者が洗剤組成物中に酵素の如き、その他の洗浄化合
物を混入する必要へと導く。

洗剤中の酵素の使用は、長年にわたって当業界に知られ
ていた。ドイツ特許第２．８３．９２３号（１９１５年
〉に於いて、ローム（Ｒｏｈｍ）は、布がタンパク質及
び脂肪を加水分解する膵臓酵素で前処理される場合に低
温で一層有効に清浄にし得ることを示した。しかしなが
ら、これらの酵素は、動物の膵臓から誘導され、洗剤に
使用するのには実用的ではなかった。タンパク質を分解
かる酵素（即ち、プロテアーゼ）及び澱粉を分解する酵
素（即ち、アミラーゼ）は、最初に、１９６０年代に、
工業用及び家庭用の洗濯洗剤及び洗濯ブレソーク（ｐｒ
ｅｓｏａｋ）　／プレスポン１組成物に広く使用された
。今日、現行の洗浄液に通常関連する温度及びｐＨで活
性であり安定である市販のプロテアーゼ及びアミラーゼ
洗剤添加剤は、容易に人手でき、ヨーロッパ、米国及び
日本で市販の洗剤中に広く使用されている。

しかしながら、従来の合成洗剤は、最高の有効性のため
非常に高い温度及びアルカリ度を使用するが、新しいプ
ロテアーゼ及びアミラーゼをベースとする洗剤は最高の
有効性のため低温及び低アルカリ度を必要とする。最近
の洗剤組成物中の少量の５ＴＰＰと現行の洗浄液に於け
る低温及び低ｐＨとの組合せ効果は、このような洗浄の
脂肪及び油洗浄力をかなり減少する。それ故、洗剤に使
用するのに適する“脂肪−しみ”加水分解酵素（即ち、
リパーゼ）に対する要求がある。

リパーゼの開発及び適用に関する研究の殆どは、食品加
工に関連していて、食品に使用されるリパーゼは洗浄水
洗剤液のｐＨ及び温度条件でうまく作用しない。更に、
食品等級のリパーゼは、洗剤組成物中に通常見られるそ
の他の成分、特にアニオン性界面活性剤（これらはそれ
らの活性を低下する）及びプロテアーゼ（これらはタン
パク質そのものであるリパーゼ侵食し、分解する）と不
適合であることがわかった（欧州特許出願第０．０９７
．８１０号を参照のこと）。

洗剤添加剤としてのリパーゼの使用に関するかなりの実
験的な研究があった（洗剤成分としてのリパーゼの総説
として、アントレー（Ａｎｄｒｅｅ）ら著、Ｊ、　Ａｐ
ｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２巻（１９８０年）２１８〜
２２９頁を参照のこと〉。近年、洗濯洗剤組成物中の使
用を目的とする幾つかのリパーゼが開発された。それら
の仔ＩＩ　Ｌよ、“アマノ（Ａｍａｎｏ）　Ｐ　　　（
日本特許第６３０３９５７９号を参照のこと）及びリボ
ラーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ　、商標）３０−Ｔ（欧州特
許出願第２５８０６８号を参照のこと）。しかしながら
、これらのリパーゼは、洗濯洗剤液には低すぎる温度及
びｐＨでそれらの最高の活性を有する。

従って、それらは、ｐＨが典型的に８．５〜１１．０の
範囲であり温度が８０℃までである洗濯洗剤液よりも、
ｐＨが約７〜８であり温度が４０℃未満であるプレソー
キング／プレスボンティング用途に良く適するようであ
る。洗剤中の使用に適するリパーゼは、洗浄液の温度及
びｐＨ範囲内でその最高の活性を有するべきであるだけ
でなく、プロテアーゼ及び界面活性剤の如き、洗剤中の
その他の成分の存在下で安定な活性を示すべきである。

（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明の主な目的は、合成洗剤の温度及びｐＨ
範囲で活性であり、しかも合成洗剤組成物と相溶性であ
るリパーゼを提供することである。

本発明の別の目的は、特異な環境から得られる微生物か
ら細胞外で生産される新規なリパーゼを提供することで
ある。

本発明の更に別の目的は、クリーナ及び脱脂剤に於ける
ような多種の方法及び用途、並びに化学方法、製薬方法
、食品加工方法、洗浄方法、及び廃物処理方法に於ける
ような生物変換用途に使用し得る、安定で、しかも洗浄
有効なリパーゼ組成物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、洗剤並びにその他の洗浄、脱
脂、及び生物変換用途に使用するのに特異的に適したリ
パーゼを生産し得る特別な天然産微生物の或種の培養菌
を選択し、分離し、培養し、増殖する方法を提供するこ
とである。

これらの目的及びその他の目的、並びにそれらを達成す
る方法及び方式は、以下の発明の詳細な説明から明らか
になる。

（課題を解決するための手段〉 本発明者らは、或種の新規かつ特異なリパーゼが高濃度
のハロゲン化有機化合物を含む環境に生存する微生物の
純粋培養菌から生産し得ることを発見した。これらの環
境中で微生物の栄養素として役立ち得る、わずかな量の
脂肪及びエステル結合された油がある。かくして、これ
らの環境中の生物がこれらの特異なリパーゼを生産する
ことは、驚くべきであり予期しないことである。当業者
にとって、これらの微生物がこれらの特異的なリパーゼ
を生産することを予期する明白な理由はない。

更に驚くべきことに、これらの微生物はリパーゼを生産
するだけではなく、それらは、我々が良く知る限りでは
、洗剤用途に最も望ましい温度及びｐＨ範囲内でそれら
の最高の活性を自然に示す唯−知られたリパーゼである
リパーゼを生産する。

その他のリパーゼは洗剤に最も望ましい条件中でそれら
の最高の活性を示さないので、その他のリパーゼは同じ
洗浄効果を得るため本発明のリパーゼよりも高い濃度で
使用する必要があり、あるいはそれらはそれらが最も活
性である必要な温度及びｐＨ安定性を与えるために特別
に配合される必要がある。本発明のリパーゼが低濃度で
使用される場合には、タンパク質により普通誘発される
アレルギー反応が軽減でき、あるいは排除さえし得るこ
とがある。

本発明のリパーゼは、洗剤用途に最も望ましい温度及び
ｐＨ範囲内で、それらの最高の活性を自然に示すので、
それらが所望の温度及びｐｏ範囲内にあるようにそれら
の最高の活性を変えるような方法でリパーゼを配合する
ことは必要ではない、その結果、それらはその他の望ま
しい性質を得るように洗浄をその他の方法で配合する点
で許容範囲が大きく、それ故、−層有効な洗剤をつくる
ことができる。

本発明のリパーゼは、洗剤プロテアーゼの存在下で安定
であり、これは特にリパーゼ及びプロテアーゼの両方を
含み得る多酵素系洗剤の配合を可能にし、それ故、それ
らは脂肪／油のしみ及びタンパク質のしみの両方を有効
に侵食し得る。

益生史 本発明の特異なリパーゼは、リパーゼを生産でき、しか
も多量のハロゲン化有機化合物を含む環境中で生存し増
殖し得る微生物から誘導される。

このような微生物は、バクテリア、真菌、放線菌、及び
古代細菌の（ａｒｃｈｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の如き、
原核生物または真核生物である。バクテリア、特にグラ
ム陰性の、棒系の、非発酵性の、嫌気性の、運動性のバ
クテリア、更に特にシュードモナス属の員は、それらが
所望の酵素を更に多く生産できるので、本発明の好まし
い微生物である。このような生物が見られる環境は、例
えば過去にノ＼ロゲン化有機化合物に暴露されたことが
あるような環境である。このようなハロゲン化有機化合
物の例は、１．１−ビス（４−クロロフェニル）−２，
２゜２−トリクロロエタン（ＤＤＴ）　、２．６−ジク
ロロトルエン、２，６−ジクロロトルエン、３゜４−ジ
クロロベンゾエート、塩素化ベンゼン、ポリ塩素化ビフ
ェニル（ＰＣＢ）　、塩素化フェノール、等を含む。

これらの微生物の環境中に存在する特別な／Ｓロゲン化
有機化合物は、それらの濃度が変化するように、変化し
てもよいが、本発明に有用な全てのリパーゼは、１０．
０ｐｐｍの３，４−ジクロロベンゾエートの存在下で（
実験室試験条件下で）生存し増殖し得る微生物中に見ら
れるリパーゼ符号化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）遺伝物質に実
質的に等しい遺伝的に活性な物質から生産される。この
リパーゼ符号化遺伝的活性物質は、高度にハロゲン化さ
れた環境中に見られる微生物中に存在し得るが、それは
またこのような環境中に見られない微生物及びこのよう
な環境中に生存し増殖でき、あるいはそこで生存し増殖
し得ない微生物中に存在し得る。例えば、このような環
境中に生存し増殖し得る微生物は、−層住むのに適さな
い環境に（例えば、風または水により）移されることが
ある。また、高度にハロゲン化された環境中で生存し増
殖し得る微生物中のリパーゼ符号化遺伝物質は、市販の
リパーゼ生産に使用するのに所望されるその他の微生物
であるが、多量のハロゲン化有機化合物を含む環境中で
生存し増殖し得ないその他の微生物に、例えば組換えＤ
ＮＡ技術を用いて転移し得る。（本発明の目的のため、
このような微生物は、リパーゼ符号化物質を含む微生物
の遺伝均等物である。）また、リパーゼ符号化遺伝物質
は、試験管内で合皮でき、おそらく生存微生物中に置か
れなくても、リパーゼを生産することができ、あるいは
リパーゼそのものは試験管内で合成し得る。

本発明のリパーゼを生産し、得る微生物は自然に存在す
るが、それらの自然状態では、それらは環境中の脂肪基
質または脂質基質の欠如のためリパーゼを生産するため
の明らかな要件を有さず、それらが全く自然にリパーゼ
を生産するか否かはわからない。それらがそれらの自然
状態でリパーゼを生産する場合に：ま、リパーゼは、そ
れらが単離、精製し難いので、人間には有益ではない。

微生物は、それらが実質的に純粋な菌株として単離され
た場合にのみ、洗剤用のリパーゼをつくるのに有益であ
る。このような純粋な菌株は、当業界で公知の操作を用
いて、例えば選択技術（例えば、特定のハロゲン化有限
化合物中で生存し、それるの化合物を分解する能力）を
使用することによりこれらの菌株を濃縮することと組合
せて、土壌希釈技術またはワーカツブ（１＋Ｉａｒｃｕ
ｐ）土壌塗布技術の如き技術の使用、ついでそれらの生
物学的純度を確保するためのリパーゼ生産菌株の反覆転
移及び継代培養により、得ることができる。ついで、所
望のリパーゼを生産する、これらの微生物が、好適な培
地中で増殖される。例えば、培養菌は典型的な発酵培養
液中に入れることができ、ｌＯ℃〜４５℃の範囲の温度
で約１日〜約３日保たれる。

植菌範囲は、全培養容量を基準として０．０１容量％〜
１０容量％（Ｖ／Ｖ）であり得るが、２％〜５％ｖ　／
　ｖであることが好ましい。栄養培地は、多種の有機炭
素源及び利用可能な窒素源を含んでもよい。

発酵中のリパーゼの生産を最大にするため、リパーゼ生
産誘導物質は、好適な脂肪またはアシルグリセリドの如
き油である。それは、−ａに約０．０１％〜約０．０５
％ｖ　／　ｖの量で使用される。

微生物は、精製方法を簡素化するため、酵素を細胞外で
生産することが好ましいが、細胞内生産がまた可能であ
る。

好ましい細胞外リパーゼは、まず生産細胞を使用済み生
産培地から取り除くことにより回収し得る。細胞及び細
胞残滓の除去は、遠心分離、マイクロフィルトレージョ
ン、またはその他の適当な技術により行なうことができ
る。ついで、リパーゼは、細胞を含まず、リパーゼを含
む生産培地の限外濾過により更に精製し得る。また、リ
パーゼは、硫酸アンモニウム沈殿、アフイニテイカラム
精製、等電点電気泳動、凍結乾燥、アセトンまたはエタ
ノール沈殿、等を含む多種の方法により精製し得る。（
発酵及びリパーゼ酵素から細胞の除去に関する標準技術
に関する更に詳細については、アトキンソン（Ａｔｋｉ
ｎｓｏｎ）著、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　　９９９〜１０
１５頁を参照のこと、）リパーゼ 本発明のリパーゼは、実質的に純粋な酵素タンパク質で
ある。実質的に純粋なリパーゼは、洗剤に使用するのに
必要とされる。不純物は酵素活性を低下することがある
からである。リパーゼは、脂肪及び油の主成分であるト
リグリセリドのエステル結合の如きエステル結合をグリ
セロールまたは脂肪酸に全部または部分加水分解し得る
。

１ トリグリセリド　　　　　　　グリセロール　脂肪酸く
式中、Ｒ１，Ｒ２、及びＲ１は、同じか、または異なる
有機基である〉 しかしながら、リパーゼはオリーブ油をエステル交換す
ることが知られておらず、その他のトリグリセリドまた
はその他のエステルをエステル交換すると予想されない
し、またそれらは芳香族ポリマーであるポリエステル布
を分解することが知られていなかった。

本発明のリパーゼは、約４０℃〜約８５℃、好ましくは
４０℃〜６０℃の温度で、約８．０〜約１１好ましくは
約９．０〜約１０．５のｐＨで、それらの最高の脂肪分
解活性（オリーブ油に対して測定される）を有する。こ
れらのリパーゼは、約１０．０００〜約４０，０００、
好ましくは約１５．０００〜約３５．０００の分子量を
有する。

−九ぺ：」４旧え立 リパーゼそのものは、洗剤成分として、または洗浄剤と
して使用し得るが、リパーゼを安定化し保護し、必要に
よりその活性を増強するために、まずリパーゼ組成物を
調製し、ついでリパーゼ組成物を使用して洗剤を配合す
ることが好ましい。

リパーゼｍ酸物は、約０．１重量％〜約５重景％、好ま
しくは約０．５重量％〜約１重量％（リバーづ組成物の
重量を基準とする）の活性リパーゼを約９５％〜約９９
．９％の好適な希釈剤（担体）と混合することによりつ
くることができる。希釈剤は不活性物質であってよく、
あるいはそれはリパーゼの洗浄能力並びに貯蔵中及び／
または洗浄サイクル中のその安定性を高めるように選ば
れてもよい、リパーゼ組成物が固体である場合には、二
酸化チタン、ポリオキシエタルレート、及びワックスの
如き希釈剤が使用し得る。洗剤中のその他の粒子とほぼ
同じ大きさ、一般には約０．５〜約１．５ｎであるリパ
ーゼ＆Ｉｌ威物の粒子を得るためには、組成物は押出し
、顆粒に細断することができる。

粒子の水和及び流動性を夫々保つための鉱油及び澱粉の
如き被覆物が、所望により顆粒剤に添加されてもよい。

（処理の詳細に関して、ノボインダストリ（Ｎｏｖａ　
Ｉｎｄｕｓｔｒｉ）の米国特許第４．１０９，９９１号
、ギストープロケーズ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）
の米国特許第４，２４２．２１９号及びノボのＰＣＴ特
許第８７０７２９２号を参照のこと。これらの特許は参
考として本明細書に含まれる。）液体またはゲルのリパ
ーゼ組成物が調製される場合には、ポリエチレングリコ
ールの如き希釈剤が使用し得る。

また、リパーゼの分解を防止するため、液体またはゲル
のリパーゼ組成物中に防腐剤を含むことが通常望ましい
。

迭−剋 本発明のリパーゼを混入する洗剤は、洗剤配合業界で公
知の多種の化学薬品を用いて調製し得る。

洗剤中の界面活性剤の存在は酵素の活性を低下すること
かあるので、土壌を可溶化するために、界面活性剤より
むしろ酵素に主として、または専ら頼る洗剤組成物は、
約３０重量％未満の界面活性剤を含むべきである。典型
的な洗剤は、例えば、本発明のリパーゼ組成物の他に、
約０．１重量％〜約４０重量％の洗剤活性有機界面活性
剤、好ましくは約１〜約５％の界面活性剤を含んでもよ
い。

洗剤活性界面活性剤の例は、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒ
ｔｚ）、ベリー（Ｐｅｒｒｙ）及びベーチ（Ｂｅｒｃｈ
）著、５ｕｒｆａｃｅＡｃｔｉｖｅ　Ａ　ｅｎｔｓ　ａ
ｎｄ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ、　　１巻（１９４９年）
及び２巻（１９５８年）並びにシック（Ｓｃｈｉｃｋ）
著、Ｎｏｎ１ｏｎｉｃ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔｓ、　　
１巻（１９６７年）に見られる。アニオン性界面活性剤
単独は、それらがリパーゼを失活する傾向があるので、
避けることが好ましい。（欧州特許第０．０９７，８１
０号を参照のこと。）アニオン性界面活性剤は、使用さ
れる場合には、ノニオン性界面活性剤またはその他の安
定剤の添加後にブレンドされるべきである。

−ａに、ノニオン性界面活性剤対アニオン性界面活性剤
の重量比は、１２：１〜ｌ：１２、好ましくは８：１〜
１：８、特に好ましくは４：１〜１：４の範囲であり得
る。洗剤Ｍｉ戒物中のノニオン性及びアニオン性の洗剤
活性界面活性剤の合計量は、約１重量％〜約３０重量％
、通常２重量％〜約２０重量％、好ましくは６重量％〜
約１６重量％の範囲であり得る。また、カチオン性界面
活性剤及び双性イオン系界面活性剤の如き、その他の界
面活性剤が含まれてもよい。

更に、洗剤は、その他の通常の洗剤成分を通常の量で含
んでもよい。それらは、ビルダー入りであってもよく　
（洗浄液のｐＨを上げ、かつカルシウムイオン及びマグ
ネシウムイオンの如きイオンを錯形成するのに役立つ、
５ＴＰＰまたは同様の成分を含む）、あるいはビルダー
入りでなくてもよく、ゼローＰ型（即ち、リンを含まず
、ビルダーを含む）のものであってもよい。洗剤は、約
１重量％〜４５重量％、好ましくは約５重量％〜３０重
量％の一種以上の有機ビルダー及び／または無機ビルグ
ーを含んでもよい。このようなビルダーの典型例は、ア
ルカリ金属のオルト−、ビロー及びトリポリリン酸塩、
アリカリ金属炭酸塩、単独またはこれらと方解石、アル
カリ金属のクエン酸塩、アルカリ金属のニトリロトリ酢
酸塩、カルボキシメチルオキシスクシネート、ゼオライ
ト、ポリアセチルカルボキシレート、等との混合物であ
る。また、洗剤は、約４重量％〜約８重量％のアルカリ
金属（例えば、ナトリウム）のケイ酸塩及び約０．５重
量％〜約１重量％のカルボキシメチルセルロースを含ん
でもよい。更に、洗剤は、約１重量％〜約３５重量％の
漂白剤または漂白剤とその活性剤とを含む漂白系を含ん
でもよい。洗剤は、起泡増進剤、発泡抑制剤、防錆剤、
土壌悲濁剤、金属イオン封鎖剤、土壌再付着防止剤（ａ
ｎｔｉ−ｓｏｉｌｒｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｇｅｎ
ｔｓ）、香料、染料、酵素の安定化剤、増白剤等を含ん
でもよい。

本発明のリパーゼの他に、洗剤はまたプロテアゼ、アミ
ラーゼ、及び／またはセルラーゼの如き？ｉ５Ｉ素を含
むことが好ましい。例えば、洗剤が血イ′夜の如きクン
バク質しみを可溶化することを可能にするためには、洗
剤中にプロテアーゼを含むことが望ましい。澱粉を単純
糖に変換することにより澱粉を可溶化するアミラーゼが
また洗剤中に含まれてもよい。

一例として、典型的な液体洗剤は、 （ａ）本発明のリパーゼ組成物約０．２．を量％〜約約
１量量 （ｂ）プロテアーゼ組成物（これは、活性プロテアーゼ
約０．１重量％〜約５重量％（プロテアーゼ組成物の重
量を基準とする）及び残部の希釈剤を含んでもよい）約
０．２重量％〜約ＩＭ量％、（ｃ）アミラーゼ組成物（
これは、活性アミラーゼ約０．１重量％〜約５重量％（
アミラーゼ組成物の重量を基準とする）及び残部の希釈
剤を含んでもよい）約０．２重量％〜約１重量％、（ｄ
）界面活性剤約１０重量％〜約４０重景％（ｅ）液体プ
ロピレンゲグリコールまたはソルビトールの如き、安定
剤約５重量％〜約１５重量％、（ｆ）金属イオン封鎖剤
（エチレンシア実ンテトラ酢酸またはニトリロトリ酢酸
の如きキレート剤）約０３ｍ１％〜約１５重量％、 （ｇ）水約Ｏ重量％〜約４５重景％ を含んでもよい。

典型的な固体洗剤は、 （ａ）本発明のリパーゼ組成物、約０．１重量％〜約５
重量％、好ましくは約０．２重量％〜約２重量％、 （ｂ）プロテアーゼ組成物（これは、活性プロテアーゼ
約０．１重量％〜約５重量％（プロテアーゼ組成物の重
量を基準とする）及び残部の希釈剤を含んでもよい）約
０．４重量％〜約０．８重量％、（ｃ）アミラーゼ組成
物（これは、活性アミラーゼ約０．１重量％〜約５重量
％（アミラーゼ組成物の重量を基準とする）及び残部の
希釈剤を含んでもよい）約０．４重量％〜約０．８重量
％、（ｄ）界面活性剤約１重量％〜約１０重量％、好ま
しくは約２重量％〜約４重量％、 （ｅ）ビルダー（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）
約０重量％〜約４０重量％、及び （ｆ）漂白剤（例えば、過ホウ酸ナトリウム〉約１５重
量％〜約３０重量％ を含んでもよい。

脂肪状の土壌及び油状の土壌並びにその他の土壌は、本
発明の洗剤の水溶液中で布を洗浄することにより布から
除去し得る。このような洗剤は、約り℃〜約８０℃、好
ましくは約４０℃〜約６０″Ｃの温度で使用し得る。洗
浄液のｐ）Ｉは、洗浄液１１当り約１〜約２０ｇの濃度
で約７．０〜約１１、好ましくは約９〜約１０．５であ
り得る。

本発明のリパーゼの最高の活性は、約９．０〜約１０．
５のｐＨで約４０℃〜約６０℃の温度にあるが、それら
は、勿論、洗剤以外の用途ではその他の温度及びｐＨで
使用し得る０例えば、リパーゼは、洗濯プレスボッティ
ング及びプレソーキング組成物、硬い表面のクリーナー
、オーブンクリーナー、金属及び機械の表面の脱脂、並
びにコンタクトレンズ及びその他の光学装置から脂質付
着物の洗浄に使用し得る。それらは、ドライクリーニン
グ、電気部品の洗浄、トリグリセリドの加水分解または
相互変換の如き化学変換反応、並びに脂肪物質の分解を
伴う化学合成に工業的な用途をもち得る。

また、それらは環境上の、またはプロセス流の廃物制御
に有用であり得る。また、それらは創傷壊死組織切除及
び殺菌に治療用途をもち得る。

以下の実施例は、本発明を更に説明する。

実施例１ シュードモナス属バクテリアの６つの異なる菌株を、少
なくとも約１５　Ｑｐｐｍの濃度でハロゲン化（主とし
て塩素化）有機化合物を含む部位で集めた。６つの菌株
は全て、ｌｏＯｐｐｍの３．４−ジクロロベンゾエート
を含む環境中で生存し増殖し得る。この部位の温度は約
り℃〜約３５℃であり、ｐＨは約４〜約７であったが、
予期しないことに、菌株から生産されたリパーゼは、４
０〜６０℃の温度で９．０〜１０．５のｐＨで、それら
の最高の活性を有していた。

これらの菌株の試料を、この特許出願の出願臼の前に、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンＢ　ン（ｔ
ｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃ＋！１ｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ
　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　　ＭＤ２０８
５２）に寄託し、この特許出願の特許としての発行の際
にそこから入手できる。表１は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）の登録番号、及
び各菌株に関する分類学的情報の幾つかを示す。

へ 誂 奢 甲 これらの６つのバクテリア菌株は、全て腐生性として特
徴づけられ、全てが炭化水素を分解し得る。ＡＴＣＣ番
号５３８５０は、米国特許第４．４７７．５７０号（１
９８４年１０月１６日発行、コラルオトロ（Ｃｏｌａｒ
ｕｏｔｏｌｏ）　ら名義）に記載されるＡＴＣＣ番号３
１９４４から誘導された。

６つのバクテリア菌株を単離するのに使用した技術は、
微生物が高濃度の種々のハロゲン化有機化合物（１００
０ｐｐｍまでの選択されたハロ有機化合物）の存在下に
生存する能力または炭素及びエネルギーの唯一の源とし
て選択されたハロゲン化有機化合物を利用する能力を伴
なった。リパーゼの生産の前に、培養菌をＮＢＹ培地（
例えば、ヌトリエント（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ）培養液（デ
イフコ（Ｄｉｒｃｏ））＋０．２％の酵母抽出物、（寒
天１５ｇ＃！の添加により凝固させた））で約り７℃〜
約３０℃の温度に保った。

リパーゼを生産するため、培養菌を凝固されたＮ　Ｂ　
Ｙ維持培地から新しいＮＢＹ維持培地に移し、２７℃〜
３０℃で保温した。細胞を充分に増殖した後、それらを
歩容量の液体生産培地に移し、この培地はＮＢＹＳＭ９
ＧＯＣまたはＭ９ＧＯＣＹのいずれかであった。（Ｍ９
ＧＯＣは、０．１％グルコース、０．０５％オリーブ油
、及び５％カサミノ酸、＋　６　ｇ　／　ｌ　ＮａＪＰ
Ｏｌ、３　ｇ　／　ｔｉ　ＫＨｚｐｏａ、０．５　ｇ／
　ＩｔＨａＣｌｌｌ　ｇ／　Ｉ　Ｎ１１ａＣ１，２ｒｍ
ｌ／　１のＭｇ５Ｏ，の１Ｍ溶液、及び０．１　ｍ　ｌ
　／　１のＣａＣ１゜の１Ｍ溶液を含む０Ｍ９ＧＯＣＹ
は、Ｍ９ＧＯＣ＋０．０２％酵母抽出物である。）細胞
を２７〜３０℃で保温し、ついで培養菌を大容量の適当
な生産培地に移しスケールアップした。６つの菌株の幾
つかに、少量のアシルグリセリドを含むリパーゼ生産誘
導物質（例えば、オリーブ油）を添加して、リパーゼの
生産を促進及び／または増大した。微生物の増殖及びリ
パーゼの生産を経時的に監視した。リパーゼ活性が所望
の水準に達した時（これはオリーブ油分析により監視し
た）に、発酵を終了した。この分析は、オリーブ油基質
に対するリパーゼの酵素加水分解活性を測定する。

表２は、規格化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）酵素活性（％
）対２５℃に於けるオリーブ油に対する６つの菌株のリ
パーゼ調製のｐＨを示し、表３は規格化酵素活性（％）
対ｐｕａ、ｏに於いて基質としてオリーブ油を用いてこ
れらの６つの菌株からのリパーゼ調製の温度を示す。活
性は、リパーゼがトリグリセリド（例えば、オリーブ油
に含まれるトリグリセリド）をそれらの相当する遊離脂
肪酸及びグリセロールに加水分解する能力を云う、活性
（％）は、１００％の値を、遊離脂肪酸を中和するのに
最大量のアルカリ　（ＮａＯＨ）を必要とした点に帰属
することにより、夫々のリパーゼ調製に関して計算した
。ついで、そのリパーゼ調製に関するその他のデータ点
を、この最高値を参照して計算して、夫々の調製に関す
る規格化活性値（％）を得た。

：ｌ　−−−一−−〜−−−−〜 Ｉｊ＋３ト　　哨Φ　−哨　青い　寸前　η哨＝１〜−
〜〜〜〜−−〜〜 ；ｌ　”’　””　ＩＯＣ１００（ＯＷ　−〜ロロ　ｗ
ｒ＋　口Ｏｏω　ω０　師ト ニ１〜°°°　〜−°〜〜〜〜〜 二ｌ　−一　−〜−−−〜−−−〜 １−」− 規格化酵素活性（％） 対温度 ５３８４９　　　　　　　８　　　３７　　　１００　
　９５　　　５７５３８５０　　　　　　　１　　　２
８　　　２２１００　　　６７５３８５２　　　　　　
１０　　　　１５　　　３０　　７８　　１００５３８
５１　　　　　　　８　　　１２　　　４４１００　　
　７４５３８４８　　　　　　　１０　　　４７　　　
８３１００　　　５３５３８５３　　　　　　　１７　
　　３４　　　５７　　　？７　　１００表２及び表３
は、６つの菌株により生産されたリパーゼが９．０〜１
０．５のｐＨで４０℃〜６０℃の温度範囲内でそれらの
最高の活性を有していたことを示し、これらの値は共に
最近の酵素系洗浄に望ましい範囲、即ち８．５〜１１の
ｐＨで８０℃までの温度の範囲内にある。

表４は、この実施例のリパーゼ調製物と三つの市販の洗
剤リパーゼの最高のｐＨ（及び温度範囲とを比較する。

これらの６つの菌株のリパーゼ活性の典型的な説明に関
する図面を参照して、ＡＴＣＣ番号５３８４９からのリ
パーゼ調製に関してオリーブ油に対する２５℃の規格化
酵素活性を、ノボ・インダストリからの市販のりポラー
ゼ（ＴＭＩ　３　Ｑ　　Ｔに関する酵素活性と比較した
。図面は、本発明のリパーゼが、通常の洗剤洗浄液範囲
内の約９〜約１０のｐｆｌでその最高の活性に達したが
、一方リボラーゼ（ＴＩ″）３０−ＴがこのｐＨ範囲で
わずかに約４０％の活性を示したことを示す。

上記の実験に於いて、合成油（例えば、トリブチリン）
よりむしろ、オリーブ油を使用した。何となれば、オリ
ーブ油の主成分は、人の皮脂から生じる洗濯しみの如き
普通の油状及び脂肪状の洗濯しみの主成分と一層近似す
るからである。（皮脂そのものは、これらの試験に必要
な量で一致したロフトの皮脂を得ることが難しいので、
この試験に使用しなかった。基質としてオリーブ油を用
いて得られた酵素活性分析結果は、成る程度の信頼度で
もって、人の皮脂のしみに対する活性を推定でき、当業
者をして、オリーブ油を加水分解し得るリパーゼがまた
皮脂を同様に加水分解し得るようであると結論させる。

また、オリーブ油実験の結果は、オリーブ油に組成が似
ている、その他の脂肪、油、及び脂質に外挿し得る。事
実、実験は、本発明の６つの菌株が多種の油及び脂肪を
加水分解するのに活性であることを示した。表５は、栄
養寒天十〇、２％酵母抽出物の培地、ＡＣ培地（デイフ
コ）及びＰＣ培地（ＩＮ中に５ｇのペプトン、１０ｍｌ
のグリセロール）中でその他の油状物または脂肪物質を
用いるリパーゼ活性試験の結果を示す。全ての培地は、
ニル・ブルー・スルフェート（Ｎｉｌｅ　Ｂｌｕｅ　Ｓ
ｕｌｆａｔｅ）（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　
Ｐ、ゲルハート（Ｇｅｒｈａｒｄｔ）　＋主編集者、Ａ
ＳＭ、ワシントンＤＣ。

１９８１年、４３８頁を参照のこと）を含んでいた。試
験操作は、脂肪がリパーゼにより加水分解される際に生
しる色の変化に基いた。

哉−−１ ５３８５３＋ ５３８４９　　　　　　　＋ ５３８４８　　　　　　　＋ ５３５８１　　　　　　　＋ ５３８５２　　　　　　＋ ５３８５０　　　　　　　＋ ＋　　　　　　　　　＋ ＋＋／− 十＋ 十＋ （＋ ＋十 ５００％ビーフ−５０％ボーク ＋＝試験した全ての培地で観察された活性−一活性が観
察されなかった ＋／−−試験した培地の幾つかで観察された活性多くの
異なる脂肪及び脂質に対するこれらの６つの菌株の脂肪
分解活性の広い範囲は、本発明のリパーゼが実際の洗濯
条件下で実世界の多種の脂質／脂肪のしみを除去するの
に成功しそうであることを示す。

実施例２ 合成皮脂及びダストで汚された布（綿／ポリエステル；
３インチ（７，６ａｍ）　Ｘ　４インチ（１０ｃｍ）；
サイエンティフィック・サービシズ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
　１ｃＳｅｒｖｉｃｅｓ）、　Ｎ　Ｊ　）の見本を、下
記の条件を用いて洗浄した。水（１５０ｐｐｍ硬度；　
Ｃａ：Ｍｇ　モル比２：１）２００ｍｊ７及び０．２　
Ｍのトリス〈ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、
ｐＨ９，５を含むフラスコを４０℃に予め温めた。実施
例１のようにして調製された凍結乾燥された上澄または
“リポラーゼ”３０−Ｔ”を添加した。必要により、ｐ
Ｈを９．５に再調節した。二つの汚れた布見本を夫々の
フラスコに添加し、１５０ｒｐｍで撹拌した。

３０分後に、洗浄液をデカントし、毎回２００ｍｊ？の
室温の蒸留水を用いて見本を２回すすいだ。

見本を空気乾燥した。布の反射率を、マクベス（Ｍａｃ
ｂｅｔｈ）分光光度計（ＵＶ光を除外した、日光スペク
トル）を用いて４６０ｒｏｎで測定した。表６は、その
結果を示す。

表６ ５３．４ ５３．４ “リパーゼＴＸ３０−Ｔ”　　　２５０　　　　　　４
９．８５００　　　　　　　４８、８ ＊ＬｔＪ＝室温で最高活性のｐＨで標準オリーブ油分析
により測定される、毎分発生され る脂肪酸のマイクロモル数として定義 されるリパーゼ単位 ａ、４０分洗浄、ｐＨ９の緩衝液 す、１２０分洗浄、ＰＨ９の緩衝液 衣６は、本発明のリパーゼが市販のリパーゼよりもこの
洗浄試験で良好に作用したことを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のリパーゼ調製物の規格化酵素活性 （％） を市販の洗剤リパーゼの規格化酵素 活性と比較するグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）実質的にＡＴＣＣ登録番号５３８４８、５３８４
   ９、５３８５０、５３８５１、５３８５２、５３８５３
   を有するバクテリア、それらの遺伝的均等物、及びこれ
   らの混合物からなる群から選ばれた、リパーゼ符号化遺
   伝物質を有するバクリテアの生物学的に純粋な培養菌。 （２）請求項１記載のバクテリアのリパーゼ符号化遺伝
   物質に実質的に等しい遺伝的に活性な物質。 （３）（ａ）１００ｐｐｍの３，４−ジクロロベンゾエ
   ートの実験室環境中で生存し、増殖し得る、原核微生物
   または真核微生物の中でリパーゼ符号化遺伝物質に実質
   的に等しい遺伝的に活性な物質を含むリパーゼ生産微生
   物を選択し、（ｂ）上記のリパーゼ生産微生物を好適な
   栄養培地中で増殖し、 （ｃ）上記のリパーゼ生産微生物を誘導して上記のリパ
   ーゼを生産し、ついで （ｄ）上記の栄養培地及び細胞残滓から上記のリパーゼ
   を分離し単離し、それにより上記のリパーゼを実質的に
   純粋な形態で得ることを特徴とする、約８．０〜約１１
   のｐＨで約２０℃〜約８５℃で最高の脂肪分解活性を有
   するリパーゼを実質的に純粋な形態で調製する方法。 （４）上記のリパーゼ生産微生物がバクテリアである、
   請求項３記載の方法。 （５）上記のバクテリアが、グラム陰性の、棒形の、非
   発酵性の、好気性で、かつ運動性である、請求項４記載
   の方法。 （６）上記のバクテリアがシュードモナス属のバクテリ
   アである、請求項５記載の方法。（７）上記のバクテリ
   アが、実質的にＡＴＣＣ登録番号５３８４８、５３８４
   ９、５３８５０、５３８５１、５３８５２、５３８５３
   を有するバクテリア、それらの遺伝的均等物、及びこれ
   らの混合物からなる群から選ばれた菌株である請求項６
   記載の方法。 （８）上記のリパーゼ生産微生物が上記のリパーゼを細
   胞外で生産する、請求項３記載の方法。 （９）アシルグリセリドリパーゼ生産誘導物質約０．０
   １〜約０．０５％ｖ／ｖが上記の培地に添加される、請
   求項３記載の方法。 （１０）上記の最高の脂肪分解活性が約４０℃〜約６０
   ℃の間で、約ｐＨ９．０〜約ｐＨ１０．５の間にある、
   請求項３記載の方法。 （１１）約８．０〜約１１のｐＨで約２０℃〜約８５℃
   の温度で最高の脂肪分解活性を有する、実質的に純粋な
   形態のリパーゼであって、 上記のリパーゼが、１００ｐｐｍの３，４−ジクロロベ
   ンゾエートの実験室環境中で生存し増殖し得る原核微生
   物または真核微生物のリパーゼ符号化遺伝物質に実質的
   に等しい遺伝的に活性な物質から生産されることを特徴
   とする、上記のリパーゼ。 （１２）上記の微生物がバクテリアである、請求項１１
   記載のリパーゼ。 （１３）上記のバクテリアがグラム陰性の、棒形の、非
   発酵性の、好気性で、かつ運動性である、請求項１２記
   載のリパーゼ。 （１４）上記のバクテリアがシュードモナス属から選ば
   れる、請求項１３記載のリパーゼ。 （１５）上記のバクテリアが、実質的にＡＴＣＣ登録番
   号５３８４８、５３８４９、５３８５０、５３８５１、
   ５３８５２、５３８５３を有するバクテリア、それらの
   遺伝的等価物、及びこれらの混合物からなる群から選ば
   れる、請求項１４記載のリパーゼ。 （１６）上記の微生物が真菌である、請求項１１記載の
   リパーゼ。 （１７）上記の微生物が放線菌である、請求項１１記載
   のリパーゼ。 （１８）上記の微生物が古代細菌である、請求項１１記
   載のリパーゼ。 （１９）約１０，０００〜約４０，０００の分子量を有
   する、請求項１１記載のリパーゼ。 （２０）上記の最高の脂肪分解活性が、約９．０〜約１
   ０．５のｐＨで約４０℃〜約６０℃の間にある、請求項
   １１記載のリパーゼ。 （２１）（ａ）請求項１１記載のリパーゼ約０．１〜約
   ５重量％、及び （ｂ）希釈剤約９５〜約９９．９重量％を含むことを特
   徴とするリパーゼ組成物。 （２２）請求項２１記載のリパーゼ組成物を含むことを
   特徴とする顆粒剤。 （２３）約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍの粒径を有する請
   求項２２記載の顆粒剤。 （２４）溶液またはゲルの形態の請求項２１記載のリパ
   ーゼ組成物。 （２５）（ａ）請求項１５記載のリパーゼ約０．１重量
   ％〜約５重量％、及び （ｂ）希釈剤約９５重量％〜約９９．９重量％を含むこ
   とを特徴とするリパーゼ組成物。（２６）（ａ）洗剤活
   性の有機界面活性剤、及び （ｂ）少量であるが土壌除去有効量の請求項２１記載の
   リパーゼ組成物 を含むことを特徴とする洗剤。 （２７）約１重量％〜約３５重量％の漂白剤を含む、請
   求項２６記載の洗剤。 （２８）約１重量％〜約４５重量％のホスフェートビル
   ダーを含む請求項２６記載の洗剤。 （２９）（ａ）洗剤活性の有機界面活性剤、及び （ｂ）少量であるが土壌除去有効量の請求項２５記載の
   リパーゼ組成物 を含むことを特徴とする、洗剤。 （３０）（ａ）請求項２１記載のリパーゼ組成物、 （ｂ）プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、及びそ
   れらの混合物からなる群から選ばれた酵素、及び （ｃ）約０．１重量％〜約４０重量％の界面活性剤 を含むことを特徴とする洗剤。 （３１）（ａ）請求項２１記載のリパーゼ組成物約０．
   ２％〜約１％ （ｂ）約０．１％〜約５％のプロテアーゼを含むプロテ
   アーゼ組成物約０．２％〜約１％、 （ｃ）約０．１％〜約５％のアミラーゼを含むアミラー
   ゼ組成物約０．２％〜約１％、 （ｄ）界面活性剤約１０％〜約４０％、 （ｅ）安定剤約５％〜約１５％、 （ｆ）金属イオン封鎖剤約０％〜約１５％、 （ｇ）水約０％〜約４５％ を含むことを特徴とする液体洗剤。