JPH0515434B2 - - Google Patents

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JPH0515434B2
JPH0515434B2 JP56188089A JP18808981A JPH0515434B2 JP H0515434 B2 JPH0515434 B2 JP H0515434B2 JP 56188089 A JP56188089 A JP 56188089A JP 18808981 A JP18808981 A JP 18808981A JP H0515434 B2 JPH0515434 B2 JP H0515434B2
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tryptophan
dna
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acid
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Takayasu Tsuchida
Osamu Kurahashi
Nobuki Kawashima
Shigeru Nakamori
Hitoshi Ei
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Ajinomoto Co Inc
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、インドール又はアンスラニル酸を
原料とする微生物によるＬ−トリプトフアンの製
造法に関する。 インドール又はアンスラニル酸を原料とするＬ
−トリプトフアンの製造法として、バチルス・ズ
ブチリスの５−メチルトリプトフアンに耐性を有
する人工変異株を用いる方法が知られている（特
公昭53−1358）。 一方、最近上述のような人工変異による育種と
異なるところの遺伝子組換え技術をＬ−トリプト
フアン生産菌の育種に利用する試みもいくつか報
告されている。例えば、Appl.Environ.
MicrobionI.38，(2)，181−190，（1979）にはエシ
エリヒア・コリのtrp E472遺伝子をもつプラス
ミドを含有する大腸菌の特定の変異株が、約1.3
ｇ／ｌのＬ−トリプトフアンを生産したことが記
載されている。又、「日本発酵工学会 昭和55年
度大会講演要旨集170頁（1980）」にもやはりエシ
エリヒア・コリのトリプトフアンオペロンを組み
込んだプラスミドを含有するエシエリヒア・コリ
の変異株が360mg／ｌのＬ−トリプトフアンを生
産したことが記載されている。 本発明者らは、叙上のような従来のＬ−トリプ
トフアンの製造法に対し、トリプトフアンアンタ
ゴニストに耐性を有するバチルス属の変異株の染
色体より得たトリプトフアンアンタゴニスト耐性
に関与する遺伝子領域が組み込まれているベクタ
ーを含有しているバチルス属の細菌が高い収率で
インドール又はアンスラニル酸よりＬ−トリプト
フアンを生産することを知つた。 トリプトフアンアンタゴニストとは、バチルス
属の微生物の増殖を抑制するようなものである
が、その抑制はＬ−トリプトフアンが培地中に共
存すれば、全体的または部分的に解除されるよう
なものである。例えば、４−フルオロ−トリプト
フアン（以下４−FTと記す）、５−フルオロトリ
プトフアン（以下５−FTと記す）、６−フルオロ
−トリプトフアン、７−フルオロ−トリプトフア
ン、４−メチル−トリプトフアン、５−メチルト
リプトフアン、６−メチル−トリプトフアン、７
−メチル−トリプトフアン、ナフチルアラニン、
インドールアクリル酸、ナフチールアクリル酸、
β−（２−ベンゾチエニール）、アラニン、スチリ
ール酢酸、インドール、トリプトザン等がある。 トリプトフアンアンタゴニスト耐性に関与する
遺伝子の供与菌は、バチルス属のトリプトフアン
アンタゴニストに耐性を有する変異株ならどのよ
うな菌株でもよいが、耐性の程度のより高いもの
が望ましい、又多くの場合、Ｌ−トリプトフアン
生産能がより高いものを遺伝子供与菌として用い
れば、よりよい結果が得られる。 遺伝子供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、例えばJ.Bacteriol，89，1065（1965）に記載
されているような通常の方法で行うことができ
る。 ベクターDNAとしては、どのようなものでも
よい。例えば、スタフイココツカス属微生物由来
のpT127，pC194，pC221，pC223，pUB112（以
上Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：1680−1682
（1977）参照），pUB110（J.Bacteriol.，134：318
−329（1978）参照），pTP4，pTP5（以上
Microbiol Letters，５：55−59（1978）参照）、
枯草菌由来のpLS15，pLS28（以上J.Bacteriol.，
131：669−701（1977）参照，pLS13（J.
Bacteriol.，129：1487−1494（1977）参照），
pPL，pPL2（以上J.Bacteriol.，124，484（1975）
参照）等がある。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれ
のベクターは適した制限エンドヌクレアーゼがあ
るが、それは、上記ベクターについての記載があ
る文献に開示されている。染色体DNAについて
は、制限エンドヌクレアーゼによる切断が部分的
に行われるように反応条件を調節すれば、多くの
種類の制限酵素が使用できる。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の方法が使用できる。 一方、ターミナルトランスフエラーゼを用い
て、染色体DNA断片と開裂したベクターDNAと
にデオキシアデニル酸とデオキシチシジル酸、ま
たは、デオキシグアニル酸とデオキシチシジル酸
をそれぞれ付加し、混合したのち、アニーリング
して連結せしめる方法も利用しうる。 かくして得られた染色体DNA断片とベクター
結合物の受容菌は、バチルス属の微生物ならばど
のようなものでもよいが、Ｌ−トリプトフアン要
求菌を用いれば、形質転換株を選択する際に好都
合である。もちろんインドール又はアンスラニル
酸からのＬ−トリプトフアン生産能がより高い菌
株、あるいはよりＬ−トリプトフアン生産能が高
い菌株より誘導したＬ−トリプトフアン要求菌を
用いれば、より好ましい結果が得られる。 組換えDNAを上記のようなDNA受容菌に導入
するには、例えばMolec.Gen.Genet.168，111−
115（1979）に記載されているような、通常の形質
転換法が使用できる。 形質転換株のうちより、インドール又はアンス
ラニル酸よりＬ−トリプトフアン生産能を有し、
トリプトフアンアンタゴニスト耐性に関与する遺
伝子領域が組み込まれているベクターを含有する
形質転換株を選択するには、例えば、DNA受容
菌として、Ｌ−トリプトフアン要求菌を用い、イ
ンドール又はアンスラニル酸を含む培地中又は培
地上に生育しうるような菌株を選別すればよい。
又ベクターDNA上のマーカーとして用いること
ができる形質を併せもつ菌株を選別できるような
培地を用いれば、より選別が容易である。 このようにして一旦選別されたトリプトフアン
アンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域が組み
込まれている組換えベクターは、DNA受容菌よ
り抽出後他のDNA受容菌、例えばインドール又
はアンスラニル酸よりＬ−トリプトフアン生産能
を有するDNA受容菌に導入することができる。 得られたＬ−トリプトフアン生産菌を用いてＬ
−トリプトフアンを製造するには、インドール又
はアンスラニル酸を含有する培地中にＬ−トリプ
トフアン生産菌を培養する。 使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオ
ン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機
微量栄養素を含有する通常のものである。炭素源
としては、グルコース、シユクロース、ラクトー
ス等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエ
イ、糖蜜等の糖類、酢酸、フマール酸、クエン
酸、ピルビン酸等の有機酸が用いられる。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩その他が使用できる。 インドール又はアンスラニル酸は培養当初に培
地に添加してもよいし、Ｌ−トリプトフアン生産
菌がある程度増殖してから培地に添加してもよ
い。インドール又はアンスラニル酸は、培地中の
濃度が一定限度を超えると微生物の増殖等を抑制
するので、濃度が一定限度を超えないように少量
ずつを培地に添加してもよい。 培地にはセリン、システイン、シスチン、β−
クロロアラニン、β−メトキシアラニン等のアミ
ノ酸を添加すればよりＬ−トリプトフアンの収率
が高くなることが多い。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 得られたＬ−トリプトフアン生産菌を用いてＬ
−トリプトフアンを製造する他の方法は、Ｌ−ト
リプトフアン生産菌が充分増殖した後、培養液に
又は充分増殖した後、一旦菌体を分離してその菌
体のけん濁液に、(1)アンスラニル酸と(2)リボー
ス、５−ホスホリボース、１−ホスホリボース又
は５−ホスホリボシルピロホスフエートを、又は
インドールとアラニン側鎖供与体とを添加してＬ
−トリプトフアン生成反応を行わせしめる方法で
ある。 Ｌ−トリプトフアン生産菌を増殖せしめる培地
は、先に述べた炭素源、窒素源、無機イオン更に
必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養
素を含有する通常の培地が使用できる。培地に
は、少量のアンスラニル酸又はインドールを添加
した方がよりＬ−トリプトフアン生成活性の高い
菌体が得られる場合が多い。培養方法についても
先に述べたような好気的条件下で行うとよい。 培養液にアンスラニル酸又はＬ−トリプトフア
ンを添加する場合には培養液を予め水で希釈して
もよい。菌体けん濁液を用いる場合の菌体濃度
は、0.5ｇ／dl〜５ｇ／dl（乾物換算）が良好で
ある。 菌体けん濁液を調整する水性媒体は、燐酸バツ
フアーのようなバツフアーでもよいが単に水であ
つたもよい。けん濁液には更に亜硫酸ナトリウ
ム、エチレンジアミン四酢酸、ピリドキサル燐酸
を添加すれば、より好ましい結果が得られる場合
が多い。又けん濁液にイノシンを添加しておく
と、難溶性のトリプトフアン・イノシン複合体を
形成して、トリプトフアンは反応液より除かれる
ので、反応はＬ−トリプトフアンの生成により向
うことになる。 アンスラニル酸又はインドールの培養液又は菌
体けん濁液への添加量は、アントラニル酸は0.1
〜５ｇ／dl、インドールのとき0.1〜4.5ｇ／dlで
ある。 培養液又は菌体けん濁液には更にアンスラニル
酸の場合にはリボース、５−ホリホリボース、１
−ホスホリボース又は５−ホスホリボースピロリ
ン酸が添加される。添加量は、何れも0.1〜５
ｇ／dlが良く、アンスラニル酸が基質として高濃
度に添加するときは、それに応じてこれらの添加
物濃度を高めることが望ましい。培養液又は菌体
けん濁液にインドールが添加される場合には、ア
ラニン側鎖供与体又はピルビン酸とアンモニウム
イオンが更に培養液又は菌体けん濁液に添加され
る。アラニン側鎖供与体は次の一般式で示される
ものである。 Ｘ−CH2−CH（NH2）CO2Ｈ （Ｘはヒドロキシル基、ハロゲン、アルキルメ
ルカプト基、メルカプト基、アルコキシ基、ベン
ジルオキシ基、又はチオベンジル基である） アラニン側鎖供与体及びピルビン酸の添加量は
それぞれ0.1M〜1Mである。Ｌ−トリプトフアン
生成反応は、アントラニル酸のときは、反応液を
25〜45℃、10〜48時間振盪反応させるとよい。
又、インドールのときは、反応液を、25〜45℃、
５〜48時間静置又はゆるやかに振盪反応させるの
がよい。 培養液又は反応液中に生成されたＬ−トリプト
フアンは通常の方法で分離、採取できる。 実施例 １ (1) 染色体DNAの調製 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイニン複要求性）からニトロソグアニジン変異
処理によつて誘導したトリプトフアン生産菌
AJ11713（FERM−P6193）（５−フルオロトリプ
トフアン耐性、アルギニン、ロイシン複要求性）
を原株とし、これより次の様な方法で新規トリプ
トフアン生産菌を造成した。(1)AJ11713株を１
の「Bact−Penassay Broth」（商品名 Difco
製）中30℃で約２時間振盪培養を行ない対数増殖
期の菌体を集菌後通常のDNA抽出法（J.Bac.89，
1065（′65））により染色体DNAを抽出、精製し最
終4.1mgを得た。 (2) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 Ｌ−トリプトフアン生産能を支配する遺伝子領
域をクローニングするため、その担体（ベクタ
ー）となる自己増殖DNAとしてカナマイシン耐
性（Kmr）、ネオマイシン耐性（Nmr）プラスミ
ドの１種pUB110を用いた。(1)で得た染色体
DNA10μｇとベクターDNA5μｇをそれぞれと
り、各々に制限エンドヌクレアーゼの１種EcoR
を37℃１時間作用させてDNA鎖を切断した。
65℃10分の熱処理後両反応液を混合し、ATP及
びジチオスライトール存在下T4フアージ由来の
DNAリガーゼにて10℃、24時間DNA鎖の連結反
応を行なつた。 (3) トリプトフアン生産遺伝子を担つたプラスミ
ドによる形質転換 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求性）からニトロソグアニジン変異
処理によつて誘導したトリプトフアン要求株
AJ11712を「Penassay Broth」（Difco）に接種
し30℃にて一晩振盪培養を行ない第培養培地
（グルコース0.5ｇ／dl，（NH4）2SO4 0.2ｇ／dl，
KH2PO4 0.6ｇ／dl，K2HPO4 1.4ｇ／dl，
MgSO4・7H2Ｏ 0.02ｇ／dl、クエン酸ナトリウ
ム0.1ｇ／dl、酵母エキス0.2ｇ／dl，Ｌ−トリプ
トフアン10mg／dl，Ｌ−アルギニン25mg／dl，Ｌ
−ロイシン５mg／dl）に接種し37℃にて４時間振
盪培養を行なつた後、さらに第培養培地（グル
コース0.5ｇ／dl，（NH4）2SO4 0.2ｇ／dl，KH2
PO4 0.6ｇ／dl，K2HPO4 1.4ｇ／dl，
MgSO4・7H2Ｏ 0.12ｇ／dl、クエン酸ナトリウ
ム0.1ｇ／dl、酵母エキス0.02ｇ／dl，Ｌ−アル
ギニン５mg／dl，Ｌ−ロイシン0.5mg／dl）へ接
種し37℃1.5時間振盪培養を行なうことによつて
いわゆるコンピチニトな（DNA取込能を有する）
細胞を調製した（参考文献：C.
Anagnostopoulos，J.Spizizen：J.Bacteriol.，
81，741（1961））。このコンピテント細胞懸濁液に
(2)で得たDNA（トリプトフアン生産遺伝子を担つ
たプラスミドDNAが含まれる）の溶液を加えて
37℃でさらに２時間振盪培養を行なつて形質転換
反応を完了させた後、細胞懸濁液をカナマイシン
5μｇ／ml含有最小培地プレート（KH2PO4 0.6
ｇ／dl，K2HPO4 1.4ｇ／dl，（NH4）2SO4 0.2
ｇ／dl、クエン酸ナトリウム0.1ｇ／dl，
MgSO4・7H2Ｏ 0.02ｇ／dl、グルコース0.5
ｇ／dl（PH7.2）を基本最小培地とし、これに寒
天２％及び使用菌の栄養要求物質Ｌ−アルギニ
ン、Ｌ−ロイシンを各々10ml／dl添加する。）に
塗沫し37℃で培養した。３日後に上記培地上に３
個のコロニーが出現したので、これを釣菌し各ク
ローンをそれぞれ純粋に分離した。得られた形質
転換株はいずれも用いた受容菌AJ11712と異なつ
てトリプトフアン非要求性である。このことは染
色体DNA上のトリプトフアン生合成系遺伝子領
域がpUB110プラスミド上のDNAに挿入させて
生じた新規プラスミドDNAを取込んだ細胞のみ
がコロニーとして選択されてきたことを意味す
る。 (4) トリプトフアン生合成系遺伝子領域を担う
pUB110の抽出 (3)で得られたクローンのうちAJ11714（FERM
−P6194）を用いてC.I.Kadoらの方法（J.Bac.
145．3.1365（′81））に基づいたフエノールによる
DNA抽出法により菌体のDNAを抽出しアガロー
スゲル電気泳動によりプラスミドDNAと染色体
DNAを分離しプラスミドDNAを含むアガロース
ゲルよりトリプトフアン生合成系遺伝子領域を担
うpUB110の抽出に透析して精製した。こうして
得られた新規プラスミドを(3)で述べたのと同様の
方法によつて今度は原株のAJ11713（トリプトフ
アン非要求性でトリプトフアンを生産する）へ形
質転換法により挿入しKmr株AJ11715（FERM−
P6195）を得た。 (5) 新規トリプトフアン生産菌によるＬ−トリプ
トフアン生産 (4)で得られたAJ11714，AJ11715をアントラニ
ル酸を添加した培地で培養した結果を第１表に示
す。培養は500mlフラスコ中にトリプトフアン生
産培地（グルコース８ｇ／dl，NH4Cl １ｇ／
dl，KCl 0.2ｇ／dl，KH2PO40.1％、MgSO47H2
Ｏ 0.04ｇ／dl、「カザミノ酸」0.4％、FeSO4・
4H2Ｏ １mg／dl，MnSO4・4H2Ｏ １mg／dl，
Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン各20mg／dl，
CaCO3 ４％，PH7.0（KOH））を20mlずつ分注し
菌体を接種後30℃、96時間振盪培養して行なつ
た。尚、AJ11714とAJ11715のときは、カナマイ
シン5μｇ／mlを生産培地に添加してある。又、
アントラニル酸は培養開始後48時間目に0.5％添
加した。他方、インドールは48〜96時間のあいだ
に、少量ずつフイードし、全量で0.5％添加した。
対照として原株AJ11713を同様の条件で発酵を行
なつた。またAJ11713，AJ11714，AJ11715を用
いて同条件でアントラニル酸およびインドールを
添加せずに培養した結果を第１表に示す。 【表】 実施例 ２ 第２表に示す各菌株を各々、下記組成の500ml
容肩付フラスコに入れた培地60mlに１白金耳接種
し、31℃にて20時間培養した。 「カザミノ酸」５ｇ、酵母エキス２ｇ、コーン
スチープリカー20ml，KH2PO4 0.5ｇ，
MgSO4・7aq0.5ｇ，FeSO4・4H2Ｏ 10mg，
MnSO4・4H2Ｏ 10mg、水１、PH7.0。培養液
１を遠心分離して菌体を集め、これを、アンス
ラニル酸20ｇ，５−ホスホリボシルピロホスフエ
ート20ｇを含有する0.1％−NH4Cl−NH4OH
緩衝液（PH8.0）１に添加し、37℃にて20時間
振盪しながら反応させたところ、反応終了液中第
２表に示すようにＬ−トリプトフアンが生成し
た。 第２表菌株 Ｌ−トリプトフアン蓄積(ｇ/) AJ11713 2.1 AJ11714 6.8AJ11715 9.7 実施例 ３ 第３表に示す各菌株を各々下記組成の培地60ml
に１白金耳接種し、31℃にて20時間培養した。
「カザミノ酸」５ｇ、酵母エキス２ｇ、コーンス
チープリカー20ml、KH2PO4 0.5ｇ，MgSO4・
7aq0.5ｇ，FeSO4・4H2Ｏ 10mg，MnSO4・4H2
O10mg、水１，PH7.0。 尚、AJ11714とAJ11715のときは、カナマイシ
ンを5μｇ／ml添加して培養した。 培養液１を遠心分離して菌体を集め、これを
第３表の化合物のほかにNa2SO3 0.1ｇ／dl，
EDTA 0.3ｇ／dl、ピリドキサルリン酸0.01ｇ／
dl、イノシン5.4ｇ／dl，（PH8.5）の組成をもつ
反応液100mlに懸濁し、30℃で48時間反応を行な
つた。第２表に結果を示した。 【表】

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ トリプトフアンアンタゴニストに耐性を有す
    るバチルス属の変異株の染色体より得たトリプト
    フアンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領域
    が組み込まれているベクターを含有し、インドー
    ル又はアンスラニル酸よりＬ−トリプトフアン生
    産能を有するバチルス属細菌を培養し、培地中に
    生成蓄積されたＬ−トリプトフアンを採取するこ
    とを特徴とする、微生物によるＬ−トリプトフア
    ンの製造法。
JP56188089A 1981-11-24 1981-11-24 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法 Granted JPS5889194A (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP56188089A JPS5889194A (ja) 1981-11-24 1981-11-24 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法
US06/444,151 US4588687A (en) 1981-11-24 1982-11-24 Method for producing L-tryptophan by fermentation
DE8282306254T DE3278569D1 (en) 1981-11-24 1982-11-24 L-tryptophan-producing microorganisms
EP82306254A EP0080378B1 (en) 1981-11-24 1982-11-24 L-tryptophan-producing microorganisms

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JP56188089A JPS5889194A (ja) 1981-11-24 1981-11-24 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法

Publications (2)

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JPS5889194A JPS5889194A (ja) 1983-05-27
JPH0515434B2 true JPH0515434B2 (ja) 1993-03-01

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ID=16217506

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